CN112824879A - 经由表面增强拉曼光谱法对核酸进行测序 - Google Patents

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CN112824879A CN202011304650.7A CN202011304650A CN112824879A CN 112824879 A CN112824879 A CN 112824879A CN 202011304650 A CN202011304650 A CN 202011304650A CN 112824879 A CN112824879 A CN 112824879A
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Abstract

本申请公开了经由表面增强拉曼光谱法对核酸进行测序。一种用于执行准确的无标记长读取DNA测序的表面增强拉曼光谱法(SERS)装置。拉曼传感器具有由等离子体纳米结构限定并由至少一个激光器激发的热点。固定的DNA聚合酶可用于将待测序的DNA模板链拉过所述热点。

Description

经由表面增强拉曼光谱法对核酸进行测序
交叉引用
本申请要求2019年11月20日提交并且标题为“Sequencing Nucleic Acids viaSurface Enhanced Raman Spectroscopy”的美国临时申请号62/938,264的优先权，其整个公开内容通过引用并入本文中以用于所有目的。
发明内容
本公开涉及表面增强拉曼光谱法(SERS)传感器或装置，以及使用来执行准确的无标签或无标记长读取DNA测序的方法。更具体地，本公开涉及利用SERS来鉴定各个核苷酸的装置和方法。
为了鉴定各个核苷酸，DNA模板链通过由激光器激发产生并且通过等离子体(例如，金)纳米结构的谐振增强的拉曼热点。
在一个特定实施方式中，本公开提供一种对DNA链进行测序的方法。所述方法包括：使所述DNA链通过拉曼传感器的由等离子体纳米结构界定并由至少一个激光器激发的纳米通道热点；通过拉曼标记图来鉴定在第一时间段存在于所述通道中的所述DNA链的第一区段的核苷酸，并且通过第二拉曼标记图来鉴定在第二时间段存在于所述通道中的所述DNA链的第二区段的核苷酸；以及将经鉴定的所述第一区段的核苷酸与经鉴定的所述第二区段的核苷酸进行比较以鉴定变化。
在另一特定实施方式中，提供了另一种对DNA链进行测序的方法。所述方法包括：使所述DNA链通过拉曼传感器的由等离子体纳米结构界定并由至少一个激光器激发的纳米通道热点；鉴定在第一时间段存在于所述通道中的所述DNA链的第一区段的至少一个核苷酸的拉曼标记图，并且鉴定在第二时段存在于所述通道中的所述DNA链的第二区段的至少一个核苷酸的第二拉曼标记图；将所述第一区段的拉曼标记图与所述第二区段的第二拉曼标记图进行比较以鉴定所述拉曼标记图中的变化；以及使所述拉曼标记图中的所述变化与单个核苷酸相关。
本发明内容被提供来以简化形式引入在下面在具体实施方式中进一步描述的一些构思。本发明内容不旨在标识所要求保护的主题的关键特征或必要特征，也不旨在用于限制所要求保护的主题的范围。从对以下详细描述的阅读中，这些及各种其他特征和优点将是显而易见的。
附图说明
从以下具体实施方式最好地理解所描述的技术，该具体实施方式描述了结合附图阅读的各种实施方式。
图1是核苷酸的拉曼光谱的图形表示。
图2是拉曼传感器装置的示意图。
图3A和图3B是具有示例光输入布置的拉曼传感器装置的示意图。
图4A、图4B和图4C是具有锥形纳米通道的拉曼传感器装置的示意图。
图5A、图5B和图5C是用于拉曼传感器的各种激光器装置的示意图。
图6是拉曼传感器装置的另一示意图。
图7是一组核苷酸的SER光谱的图形表示。
图8是替代拉曼传感器装置的示意图。
图9A是平面内耦合至检测器的纳米结构的系统的示意图；图9B是平面外耦合至检测器的纳米结构的系统的示意图。
图10A是具有等离子体纳米结构激发的传感器的系统的示意图；图10B是具有等离子体纳米结构激发的传感器的系统的另一示意图。
图11是具有多个环形谐振器以对输出光进行滤波的传感器的系统的示意图。
具体实施方式
当前的DNA测序方法在序列读取长度、灵敏度和运行时间方面面临局限性。较高的灵敏度或信噪比将改善长读取的测序准确性。待测序的DNA链的长度受到标记使用限制；大多数标记未给出强信号并且需要多个分子同时地生成信号。随着序列长度增加，各个分子信号失去同步，从而限制准确序列的长度。由于需要在每个碱基并入之后暂停以获得光信号和/或除去标签，所以运行时间长。能在经由无标记系统使用实时测序情况下改善这个。
在以下描述中，参考形成其一部分的附图，并且在附图中通过图示的方式示出了至少一个具体实施方式。以下描述提供附加具体实施方式。应当理解，在不脱离本公开的范围或精神的情况下，可以设想并做出其他实施方式。因此，以下详细描述将不在限制性意义上进行。虽然本公开不限于此，但是将通过对在下面提供的示例(包括图)的讨论来获得对本公开的各个方面的领会。在一些情况下，附图标记可以具有由小写字母构成的相关子标记以表示多个类似的部件中的一个。当在未指定子标记的情况下参考附图标记时，引用旨在指的是所有此类多个类似的部件。
表面增强拉曼光谱法(SERS)是可用于基于分子独特的拉曼散射光谱来鉴定分子的超灵敏光学检测方法。DNA具有四个核苷酸(腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T))，每个核苷酸在由激光器激发时发射具有独特频率的拉曼散射光子。图1示出了在514.5nm的激发波长下的核苷酸腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T)的拉曼光谱的曲线图100。在图1中鉴定出可以被用于核苷酸鉴定的示例峰：对A来说为721cm-1，对C来说为776cm-1，对G来说为643cm-1，而对T来说为1680cm-1。
DNA链中的核苷酸(A、C、G、T)仅相隔0.34nm；由于此间距小，所以使用常规SERS来一次观察并鉴定仅一个核苷酸是不可行的。然而，已经试图使用SERS来在用对SERS更敏感的标签或其他标识符标记时鉴定单个核苷酸。
所提出的下述解决方案通过使用SERS来鉴定各个未标记或未加标签的核苷酸而实现高度准确的测序。所提出的方法是无标记的，从而实现快速测序和长读取长度。当前的测序方法无法提供准确性、长读取长度能力和速度的所有三种质量。可如下所述使用SERS以在优雅解决方案中一起提供这三种质量。
在本公开中，描述了拉曼传感器或装置，该拉曼传感器或装置具有通过激光器激发而形成并且通过聚焦等离子体(例如，金、银)纳米结构的谐振而增强的拉曼“热点”通道。未标记或未加标签的DNA模板链通过热点通道来抽出或馈入。随着DNA模板链移动通过热点，测量各个核苷酸的拉曼光谱。在一些实施方式中，在第一时间点测量存在于热点通道中的第一组核苷酸的拉曼光谱，并且在继第一时间点之后的第二时间点测量存在于热点通道中的第二组核苷酸的拉曼光谱。两个拉曼光谱被比较以确定什么核苷酸离开了热点并且什么核苷酸进入了热点。
在一些实施方式中，装置包括DNA聚合酶，该DNA聚合酶复制被测序的模板链。通过聚合酶的复制动作将模板链拉过热点通道。在一些实施方式中，附加地或可替代地使用二次力，例如，电力或电压差，以帮助使链通过纳米结构之间的热点通道。
可以将传感器认为是“芯片上”系统。
图2通常图示了用于对DNA模板链进行测序的SERS传感器200。传感器200具有样品装载室202和次级或样品接收室204。连接两个室202、204的是纳米通道205。尽管纳米通道205被示出为具有一长度，但是纳米通道205可以仅仅是两个室202、204之间的孔口，由分开两个室202、204的平面所限定的区域，或者纳米通道205可以是通过物理壁在一些或所有侧界定的通道。纳米通道205的合适的长度和宽度在宽范围内。在一些实施方式中，纳米通道205的宽度在1nm至100nm或1nm至50nm的范围内，但是小于1nm的纳米通道是已知的并且是合适的。在一些实施方式中，纳米通道的宽度是0.2nm至2nm。
一对纳米结构210a、210b位于纳米通道205的相反侧，可操作地连接至一对波导212a、212b。纳米结构210将拉曼信号聚焦到纳米通道205中的小区域(例如，1-10nm宽)。典型地，纳米结构210的锥形或尖头端间隔开不大于纳米通道205的宽度的距离；换句话说，纳米结构210的尖端之间的距离可能小于或与纳米通道205宽度相同。在一些实施方式中，纳米结构210的尖端在其之间具有0.2nm至5nm的距离。
纳米结构210可以是各种形状中的任一种，诸如三角形(如在图2中一样)、棒棒糖、其他尖头表面设计等。两个相对地定位的三角形纳米结构类似领结，而两个相对地定位的棒棒糖纳米结构类似哑铃。纳米结构210可以是二维或三维的。锥形或尖头纳米结构210对于聚焦信号特别有用。图3A图示了纳米结构的各种替代设计。
纳米结构的形状和大小被选取为使得，结合纳米通道的尺寸、波导中光的模式和光的波长，发生在纳米结构之间的间隙中创建电磁热点的谐振。典型地，纳米结构的最大尺寸在100nm至2000nm的范围内。
可通过增加输出纳米结构的大小来改善纳米结构和传感器的效率，使得传感器被更好地优化以将低能等离子体激元转换成光子并将其耦合至波导。图3B图示了具有输入纳米结构310a和输入波导312a以及输出纳米结构310b和输出波导312b的传感器的一部分，同时指示了光的方向。或者，可优化输出波导尺寸以更高效地承载低能红移光。
纳米结构210是等离子体纳米结构并且可以由金、银、铂或另一种等离子体材料或等离子体和其他材料的组合制成。
在一些实施方式中，存在纳米结构210的不止一个对。例如，三个纳米结构210可以彼此成120度角围绕纳米通道205等距布置；作为另一示例，四个纳米结构210可以彼此成90度角围绕纳米通道205等距布置。在其他实施方式中，多个纳米结构210不等距地隔开。多个纳米结构210可以在同一平面中或者可以不在同一平面中。
可以在等离子体纳米结构210的上游添加附加纳米结构或其他结构以创建较长的纳米通道205，以在DNA链到达等离子体纳米结构210之前使DNA链线性化。在一些实施方式中，纳米通道可以是锥形或其他形状以促进使DNA链从中通过。图4A示出了具有第一锥形纳米通道405a的装置400a，图4B示出了具有另一锥形纳米通道405b的装置400b，并且图4C示出了具有急剧地变细的纳米通道405c的装置400c。
在纳米通道205的区域中，至少一个激光器220被聚焦在纳米结构210中的至少一个上；图2示出了两个激光器220a、220b，每个激光器被聚焦在纳米结构210上。在一些实施方式中，对于每对纳米结构使用多个激光器220；因此，对于两对(四个)纳米结构，使用至少四个激光器。
激光器220指向纳米结构210和/或它们之间的间隙，以跨纳米结构210产生等离子体激元并且在纳米通道205中创建拉曼热点。激光束具有比纳米结构210的端部大得多的直径或冲击面积。热点中的任何材料(例如，核苷酸)将由激光器激发并发射拉曼散射光子。
激光器220可以是例如固态激光器、气体(例如，氙)激光器、液体激光器等，或在例如600nm、800nm、1064nm波长下工作的任何类似的光源。如果存在多个激光器220，则它们可以具有相同或不同的波长；如果不同，则波长将相差至少几个100nm。激光器220可以是可调谐激光器、连续激光器或脉冲激光器。激光器220可以是偏振的。功率为1mW至100mW的激光器220是合适的。在一个特定实施方式中，激光器是边缘发射半导体激光器。
辅助光源(例如，可见光或其他光)可以用于刺激光子发射。此辅助源可以是例如单个固定激光器、多个激光器或可调谐激光器或脉冲激光器。
多个激光器220可以被定位为平行于或垂直于纳米结构并且可以在同一平面或分离平面上。作为一个示例，三个平面激光器220可以彼此成120度角围绕纳米通道205等距布置；作为另一示例，四个激光器220可以彼此成90度角围绕纳米通道205等距布置。在其他实施方式中，多个平面激光器220不等距地隔开。尽管多个激光器220可能不是平面的，但是所有激光器220的焦点在同一区域中以形成“热点”。
在一些实施方式中，如图2中所示，可以使用波导212来将激光束引导到纳米结构210。图5A、图5B和图5C示出了利用波导来将光引导到纳米结构的三个实施方式。
在图5A中，定位(例如，胶合)在波导端部处的激光器与波导仔细地对准。在传感器(例如，晶片)的衬底中可以存在沟槽以接收激光器，使得其输出面与波导对准。可使用耦合器来将来自激光器的输出面的光收缩到通道波导的最终大小。如果激光器的模式与换能器不对应，则可以使用模式转换器。波导中的光可以是横向磁的(TM)或横向电的(TE)。
图5B示出了外部激光器的使用，其中来自外部激光器的光耦合至通道波导。可在形成波导的同时使光栅耦合器图案化。可对于多个波导使用具有分离器的单个外部激光器而不是多个激光器，每个波导具有它自己的换能器。
在图5C中，外部激光器用于直接照射换能器，而无需利用波导。
无论是激光器还是其他光源配置，都测量由核苷酸散射的所得拉曼光子或光(因此，称为拉曼光谱)并且鉴定核苷酸。斯托克斯散射光子、反斯托克斯散射光子或两者都可以被用于核苷酸鉴定。拉曼散射光子可以由反射镜或透镜收集和/或聚焦以促进核苷酸的鉴定，或者散射光可以由波导收集。光可以由光电倍增管、光电二极管阵列、电荷耦合器件、电子倍增电荷耦合器件等检测和定量。可以对所得拉曼散射光子进行滤波，使得仅具体频率的光子被检测到。在下面提供了有关对拉曼散射光子进行滤波的示例。在一些实施方式中，可以存在光学谐振器以增加来自所检测到的光子的信号。
返回图2，拉曼热点的长度可以是纳米通道205的整个长度或者可以小于纳米通道205的整个长度。热点的长度基于激光器220相对于纳米结构210的焦点。热点的长度可以是例如1-10nm长。
可将SERS传感器200作为微流体芯片上实验室系统或“芯片上”系统来提供。芯片上实验室是在上面完成一个或若干实验室功能或化学反应的集成电路(“芯片”)的常见术语。芯片不能超过几平方厘米。芯片上实验室处理极小流体体积(例如，测量为例如微升、纳升或皮升)并且常常被称作微流体系统。在数字微流体中，芯片上实验室具有可在上面通过精确地控制的电压施加来操纵流体液滴(例如，液体液滴)的疏水性“芯片平台”。
芯片可以由两个或更多个可分开的部分形成：一个部分包含拉曼探测器、纳米结构210和激光器220，另一部分包含形成室202、204和纳米通道205的毛细管。或者，纳米结构210可能在具有纳米通道205的第二部分中。此类构造将使得能够重新使用昂贵的电子和光子件并且处置流体区域。平台可以具有覆盖流体区域的盖板。通过利用平台的物理结构，可跨平台精确地移动流体(DNA模板链样品)，例如通过由DNA聚合酶拉动。在一些实施方式中，可通过施加到平台的电压或电场例如通过平台中的网格来跨平台移动流体。
在使用传感器200时，存在于样品装载室202中的DNA模板链通过由纳米结构210和激光器220形成的热点来抽出或馈入通过纳米通道205。聚焦在纳米结构210上的激光器220增强从散射光子获得的拉曼光谱或谐振，从而允许每个单独的核苷酸通过其拉曼光谱来鉴定。
DNA模板链可通过DNA聚合酶被抽出从样品装载室202通过纳米通道205至次级室204。DNA聚合酶可以每秒约70-75个核苷酸或每核苷酸约14毫秒的速率将DNA模板链拉过纳米通道205。然而，这可以取决于例如DNA聚合酶的类型、传感器和/或系统的温度而改变。
在图6中，几乎以卡通方式示意性地图示SERS传感器600。在图6中示出了仅传感器600的某些特征；应当理解，传感器600包括如关于图2所描述的其他特征(例如，激光器)。
传感器600具有样品装载室602、次级室604和在其之间的纳米通道热点605。此纳米通道热点605通过激光器激发来产生并且通过金属(例如，金)纳米结构610的谐振来增强。在一些实施方式中，纳米结构610限定两个室602、604之间的区别。样品装载室602位于纳米通道热点605的上游并且次级室604位于纳米通道热点605的下游。
DNA聚合酶630(图示为Pac ManTM型形状)复制待测序的DNA模板链640。DNA模板链640未被加标签、标记，或者别无他法为被鉴定或彼此区分开的核苷酸。DNA聚合酶630可以被固定，例如，在次级室604的表面上或否则在纳米通道热点605的下游。所复制的互补链650被示出为接近DNA聚合酶630。由DNA聚合酶630复制模板链640的动作在链640上施加张力或力并且将链拉过拉曼纳米通道热点605。随着每个核苷酸通过纳米通道热点605，每个核苷酸取决于其身份而产生独特的拉曼信号。
在使用传感器600时，将载体溶液(包含待测序的模板DNA链640)添加到样品装载室602。将包含游离核苷酸A、C、G和T的溶液添加到次级室604。然后可以使用例如电场或电泳或磁泳来将模板链640穿过纳米结构610之间的纳米通道605。一旦模板链640已穿过间隙并已到达次级室604，模板链640就遇到固定的DNA聚合酶630。模板链640与聚合酶630结合，该聚合酶然后通过一次一个将来自溶液的核苷酸并入到生长互补链650中来创建模板链640的副本；参见例如图6，其示出了形成互补链650的DNA聚合酶630。此时，可除去任何施加的场。
DNA聚合酶630对模板链640的动作将单链模板链640的剩余部分拉过纳米通道热点605。模板链640通过传感器区域(即，热点605)的迁移是通过聚合酶的并入速率平滑地控制的。随着模板链640被从样品装载室602拉过纳米通道热点605到次级室604中，链640的一部分在拉曼热点605中。纳米通道热点605中的链的这个部分将随着链640被拉过而改变。
因为核苷酸相隔固定距离(即，0.34nm)，所以在任何给定时间在纳米通道热点605中将存在一定数量的核苷酸，该数量基于纳米通道热点605的长度。随着DNA聚合酶630并入一个核苷酸，它将模板链640拉过纳米通道热点605，使得随着一个核苷酸离开纳米通道热点605，一个核苷酸进入纳米通道热点605。存在于纳米通道热点605中的模板链640的新区段(因此为序列)将与先前区段(因此为序列)相差一个核苷酸；离开纳米通道热点605的一个核苷酸被进入纳米通道热点605的一个核苷酸替换。尽管来自第二组或套核苷酸的核苷酸与第一组或套核苷酸相差仅一个核苷酸，但是它们具有不同次序，移位了一个核苷酸。
存在于纳米通道热点中的核苷酸发射拉曼散射光子，然后可对其进行滤波和检测。核苷酸A、C、G、T中的每一个均发射具体频率的拉曼光子(参见图1)。在每个所选频率下的信号强度的振幅可用于确定在任何给定时间存在于热点中的每个核苷酸的量。热点中的新序列与热点中的先前序列之间的信号振幅变化可用于确定哪一个核苷酸离开了热点并且哪一个核苷酸加入了热点。
图7示出了若干示例序列的SER光谱曲线图700。第一十核苷酸链被示出为702，核苷酸为(ACA ACC CCC A)。第二十核苷酸链被示出为704，核苷酸为(TCA ACC CCC A)，仅一个核苷酸与第一链702不同。第三条线706表示链702和链704的光谱的差异。在721cm-1、776cm-1、1436cm-1和1643cm-1处的强度差被标记，并且直接对应于取代核苷酸所预期的频率，在此示例中，T取代A，示出由于存在T而在1643cm-1处增加，并且由于丢失A而在776cm-1处减小。
另外在图7中示出了T12(即，12个Ts的DNA序列)和A12(即，12个As的DNA序列)的光谱以用于更好地鉴定峰。
注意，将观察每个核苷酸两次：一次随着它进入热点，而一次随着它离开热点；这样的双重测量改善了准确性。另外，双重测量减轻了当离开核苷酸的身份碰巧与进入核苷酸的身份相同并且峰振幅不改变时可能出现的检测困难。在这种情况下，信号处理可考虑周转率和后续振幅变化以便鉴定所述核苷酸。
为了进一步改善准确性，可以在系统中串联设置若干SERS热点，使得每个核苷酸通过若干热点。图6图示了串联具有若干SERS热点以使得能够对每个核苷酸进行多次检测以改善准确性的传感器600。
在图8中，几乎以卡通方式示意性地图示SERS传感器800。再次，在图8中示出了传感器800的某些特征；应当理解，传感器800包括如关于图2所描述的其他特征(例如，激光器)。
传感器800具有样品装载室802、次级室804和在其之间的至少一个纳米通道热点805，特别地为串联布置的三个热点805a、805b、805c。每个纳米通道热点805通过激光器激发来产生并且通过金属(例如，金)纳米结构810的谐振来增强。在此特定实施方式中，三对纳米结构810被图示为一对纳米结构810a、810b、一对纳米结构810c、810d和一对纳米结构810e、810f。三对纳米结构810沿着纳米通道的长度定位，使得纳米通道限定两个室802、804之间的区别。样品装载室802位于纳米通道和热点805的上游，而次级室804位于纳米通道和热点805的下游。
DNA聚合酶830(图示为Pac ManTM型形状)复制待测序的DNA模板链840。DNA聚合酶830可以被固定，例如，在次级室804的表面上或否则在纳米通道热点805的下游。所复制的互补链850被示出为接近DNA聚合酶830。由DNA聚合酶830复制模板链840的动作在链840上施加张力或力并且通过热点805拉动链840。
与传感器600一样，随着模板链840被从样品装载室802拉过纳米通道热点805到次级室804中，链840的一部分在每个热点805a、805b、805c中。模板链840中的每个核苷酸将最终通过多个热点805中的每一个，从而确保对链840中的每个核苷酸进行多次测量，改善准确性。
也设想了各种附加及替代实施方式和设计。
在一些实施方式中，DNA模板链是线性单链(如图所示，例如在图6中为模板链640或者在图8中为模板链840)，然而在其他实施方式中进入热点的链是双链。除了从一个光谱测量到后续光谱测量的差异是两个(互补)核苷酸以外，双链被以与单链相同的方式测序。
单链或双链可以在一端或两端包含衔接子序列。与衔接子序列互补的引物可以与单模板链杂交以在单模板链的一端或两端创建短双链区域。
在另一实施方式中，不是使用DNA聚合酶来将DNA链拉过热点，而是可以使用核酸外切酶。固定核酸外切酶会随着DNA链一次一个依次除去核苷酸而将DNA链拉过纳米通道。在使用核酸外切酶的实施方式中，不需要与聚合酶一样将游离核苷酸添加到次级室。
在另一实施方式中，可以使用RNA聚合酶或核酸外切酶代替DNA聚合酶或DNA核酸外切酶，以便对RNA或DNA进行测序。
在一些实施方式中，不是使用DNA聚合酶或核酸外切酶来将DNA链拉过热点，而是可以使用电流或电压差来将链拉过热点或帮助拉动。可以附加地或可替代地使用其他电泳源以及另一力源，例如机电源。
可以在一些实施方式中使用磁场来发起和/或促进DNA链迁移通过纳米通道。可以将磁珠附着到DNA链的一端，使得它可以对所施加的磁场做出响应并被引导通过通道。应注意，任何这种磁珠未被用于鉴定它所附着的核苷酸或其他组分，而是被仅仅用作运输促进剂。
如以上所指示的，可以对拉曼散射光子进行滤波，使得仅具体频率的光子被检测到。可以利用任何数量的环形谐振器、波导、衍射光栅、棱镜、边缘滤波器、陷波滤波器、带通滤波器、定向耦合器、MZI(马赫-曾德尔干涉仪)滤波器、AWG(阵列波导光栅)等执行这种滤波。
图9A和图9B示出了相对于纳米结构的检测定向的示例。在图9A中，传感器900a具有第一等离子体纳米结构910a和第二等离子体纳米结构910b源束920和检测束930在同一平面(例如，导光平面)中并且纳米结构910与纳米结构910之间的纳米通道正交。在另一实施方式中，如在图9B中一样，检测器或检测束相对于等离子体结构可在平面外。在图9B中，传感器900b在与第一等离子体纳米结构910a和第二等离子体纳米结构910b相同的平面中具有源920，然而此检测束940在纳米结构910的平面外。
传感器可以是“芯片上传感器；芯片上实施方式的示例被示出在图10A和图10B中。图10A示出了如何可将半导体激光器用作源并且如何可将光经由耦合器耦合到波导并将滤波器耦合到等离子体纳米结构以进行激发。可以对所得拉曼散射光子进行滤波，使得仅具体频率的光子被检测到。也能如图10B中所示的那样在平面外实现这种滤波和检测。
在图10A中，示出了串联具有多个SERS传感器1000的系统。图10A示出了至少三个传感器1000：传感器1000a、传感器1000b......和传感器1000x。传感器1000具有第一或输入侧1001和第二或输出侧1003。待测序的DNA链通过的纳米通道1005存在于在第一侧1001与第二侧1003之间。每个传感器1000在第一侧1001和第二侧1003具有多个纳米结构1010。
在每个传感器1000中，耦合器1012将来自激光器1011(例如，芯片上激光器)的光耦合到窄波导1014，然后空间滤波器1016将来自一个波导通道1014的光功率划分到多个通道1018中，在此实施方式中划分到五个通道1018中。所有这些通道1018然后与通过纳米通道1005的模板DNA链相互作用。
在纳米结构1010的尖端处产生的拉曼信号被耦合到将信号承载到滤波器1020的传出波导1019。取决于拉曼信号的具体类型，滤光器1020将光引导至具体检测器1022或者实现检测器的具体响应。基于此检测到的拉曼信号，随着DNA连续地流动，产生与样本相关联的DNA序列的具体图案。
类似地，在图10B中，示出了串联具有多个SERS传感器1050的系统。图10B示出了至少三个传感器1050，例如，传感器1050a、传感器1050b......和传感器1050x。传感器1050具有第一或输入侧1051和第二或输出侧1053。待测序的DNA链通过的纳米通道1055存在于在第一侧1051与第二侧1053之间。每个传感器1050在第一侧1051和第二侧1053具有多个纳米结构(在图10B中未调出)。
在每个传感器1050中，耦合器1062将来自激光器1061(例如，芯片上激光器)的光耦合到窄波导1064，然后空间滤波器1066将来自一个波导通道1064的光功率划分到多个通道1068中，在此实施方式中划分到五个通道1068中。所有这些通道1068然后与通过纳米通道1055的模板DNA链相互作用。
在纳米结构的尖端处产生的拉曼信号被耦合至在纳米通道1055之上的滤波器层1070。检测器层(未看见)存在于滤波器层1070之上。取决于拉曼信号的具体类型，滤波器1070将光引导至在滤波器1070之上的检测器层。基于此检测到的拉曼信号，随着DNA连续地流动，产生与样本相关联的DNA序列的具体图案。
芯片上实施方式的另一更具体示例被示出在图11中，该图示出了连续地具有多个SERS传感器1100的系统，每个SERS传感器具有刀耦合器。图11示出了至少三个传感器1100，例如，传感器1100a、传感器1100b......和传感器1100x(例如，x＝200)。取决于拉曼位移所需的传感器的数量，系统的总宽度可以是例如20至80mm。在每个传感器1100中，在图11中示出了仅传感器1100的某些特征；应当理解，传感器1100包括如关于上述传感器所描述的其他特征。
图11的传感器1100具有第一或输入侧1101和第二或输出侧1103。待测序的DNA链通过的纳米通道1105存在于在第一侧1101与第二侧1103之间。每个传感器1100被示出为在第一侧1101和第二侧1103具有多个纳米结构1110。
在每个传感器1100中，刀耦合器1112将来自激光器(例如，芯片上激光器)的光耦合到窄波导1114，然后空间滤波器1116将来自一个波导通道1114的光功率划分到多个通道1118中，在此实施方式中划分到五个通道1118中。所有这些通道1118然后经由等离子体纳米结构1110与通过纳米通道1105的模板DNA链相互作用。存在于通道1118中的可以是例如类似IBEX的偏振旋转器和/或类似箭头的近场换能器(NFT)。
在纳米结构1110的尖端处产生的拉曼信号被耦合至将信号承载到滤波器1120的传出波导1119，该滤波器可以是许多环形谐振器、衍射光栅、棱镜、边缘滤波器、陷波滤波器、带通滤波器、定向耦合器、MZI(马赫-曾德尔干涉仪)滤波器、AWG(阵列波导光栅)等中的任一种。在图11中，此滤波器1120是环形谐振器；取决于拉曼位移所需的通道的数量，环形谐振器的数量为例如4到10。
取决于拉曼信号的具体类型，滤光器1120将光引导至具体检测器1122或者实现检测器的具体响应。基于此检测到的拉曼信号，随着DNA连续地流动，产生与样本相关联的DNA序列的具体图案。检测器可以是例如硅光电检测器；取决于拉曼位移所需的通道的数量，检测器的数量为例如4,000至10,000。
总之，本文描述的是利用SERS来使用具有创建热点的聚焦等离子体纳米结构的拉曼传感器鉴定DNA链(例如，模板链)或RNA链的各个核苷酸的方法。传感器可包括固定的DNA聚合酶，其复制被测序的模板链。通过聚合酶的复制动作将链拉过通过激光器激发产生并且通过由于纳米结构而导致的谐振增强的拉曼热点。
以上说明书和示例提供了对本发明的示例性实施方式的结构和使用的完整描述。以上描述提供了具体实施方式。应当理解，在不脱离本公开的范围或精神的情况下，可以设想并做出其他实施方式。因此，以上详细描述将不在限制性意义上进行。虽然本公开不限于此，但是将通过对所提供的示例的讨论来获得对本公开的各个方面的领会。
除非另外指示，否则表达特征大小、量和物理性质的所有数字将被理解为由术语“约”修饰，而不管是否紧接存在术语“约”。因此，除非相反指示，否则所阐述的数值参数是可取决于寻求由本领域的技术人员利用本文公开的教导获得的期望性质而变化的近似值。
如本文所使用的，除非内容另外清楚地规定，否则单数形式“一”、“一个”和“该”包含具有复数指示物的实施方式。如本说明书和所附权利要求书中所使用的，除非内容另外清楚地规定，否则术语“或”通常以其包括“和/或”的意义使用。
空间相关术语，包括但不限于“底部”、“下部”、“顶部”、“上部”、“在...下面”、“在...下方”、“在...上方”、“在...之上”、“在...上”等，如果在本文中使用，则是为了描述的容易而利用的以描述(一个或多个)元件与另一元件的空间关系。除了在图中描绘并在本文中描述的特定定向之外，此类空间相关术语还包含装置的不同定向。例如，如果图中描绘的结构被翻过来或翻转，则先前描述为在其他元件下方或下面的部分然后将在那些其他元件上方或之上。
由于可在不脱离本发明的精神和范围的情况下做出本发明的许多实施方式，所以本发明存在于下文所附的权利要求书中。此外，在不脱离本公开或所引用的权利要求的情况下，可以将不同实施方式的结构特征组合在又一实施方式中。
进一步的示例
示例1.一种对DNA链进行测序的方法，包括：
使所述DNA链通过拉曼传感器的由等离子体纳米结构界定并由至少一个激光器激发的纳米通道热点；
通过拉曼标记图来鉴定在第一时间段存在于所述通道中的所述DNA链的第一区段的核苷酸，并且通过第二拉曼标记图来鉴定在第二时间段存在于所述通道中的所述DNA链的第二区段的核苷酸；以及
将经鉴定的所述第一区段的核苷酸与经鉴定的所述第二区段的核苷酸进行比较以鉴定变化。
示例2.如示例1所述的方法，其中使所述DNA链通过包括使DNA模板链通过。
示例3.如示例2所述的方法，其中使所述DNA模板链通过包括经由DNA聚合酶拉动所述DNA模板链。
示例4.如示例3所述的方法，其中经由所述DNA聚合酶拉动所述DNA模板链包括从多个单独的游离核苷酸构建互补链。
示例5.如示例1所述的方法，其中使所述DNA链通过包括经由DNA核酸外切酶拉动所述DNA链。
示例6.如示例1所述的方法，还包括通过电泳或磁泳来将所述模板链移动至所述纳米通道。
示例7.如示例1所述的方法，其中使所述DNA链通过包括使所述DNA链通过拉曼传感器的由两个金等离子体纳米结构界定的纳米通道热点，每个金等离子体纳米结构均由激光器激发。
示例8.一种对DNA链进行测序的方法，包括：
使所述DNA链通过拉曼传感器的由等离子体纳米结构界定并由至少一个激光器激发的纳米通道热点；
鉴定在第一时间段存在于所述通道中的所述DNA链的第一区段的至少一个核苷酸的拉曼标记图，并且鉴定在第二时段存在于所述通道中的所述DNA链的第二区段的至少一个核苷酸的第二拉曼标记图；
将所述第一区段的所述拉曼标记图与所述第二区段的所述第二拉曼标记图进行比较以鉴定所述拉曼标记图中的变化；以及
使所述拉曼标记图中的所述变化与单个核苷酸相关。
示例9.如示例8所述的方法，其中使所述DNA链通过包括使DNA模板链通过。
示例10.如示例9所述的方法，其中使所述DNA模板链通过包括经由DNA聚合酶拉动所述DNA模板链。
示例11.如示例10所述的方法，其中经由所述DNA聚合酶拉动所述DNA模板链包括从多个单独的游离核苷酸构建互补链。
示例12.如示例8所述的方法，其中使所述DNA链通过包括经由DNA核酸外切酶拉动所述DNA链。
示例13.如示例8所述的方法，还包括通过电泳或磁泳来将所述模板链移动至所述纳米通道。
示例14.如示例8所述的方法，其中使所述DNA链通过包括使所述DNA链通过拉曼传感器的由两个金等离子体纳米结构界定的纳米通道热点，每个金等离子体纳米结构均由激光器激发。
示例15.一种表面增强拉曼光谱法(SERS)传感器，包括：
样品装载通道，所述样品装载通道用于接收待测序的DNA链；
由至少两个等离子体纳米结构限定的SERS热点，每个等离子体纳米结构使激光被聚焦在其上，所述SERS热点被调整大小以通过其中接收所述DNA模板链；
拉曼光谱仪，所述拉曼光谱仪可操作地连接至所述SERS热点以测量来自所述DNA链的核苷酸的拉曼光谱；以及
次级室，所述次级室在所述SERS热点的下游。
示例16.如示例15所述的SERS传感器，其中所述样品装载室用于接收待测序的DNA模板链并且所述次级室在其中具有固定的DNA聚合酶。
示例17.如示例15所述的SERS传感器，还包括可操作地连接至所述拉曼光谱仪的至少一个滤光器。
示例18.如示例15所述的SERS传感器，包括四个等离子体纳米结构，所述四个等离子体纳米结构被布置为两对。
示例19.如示例18所述的SERS传感器，其中等离子体纳米结构的第一对在等离子体纳米结构的第二对的上游，其中每对等离子体纳米结构使激光被聚焦在其上从而限定SERS热点。

Claims (10)

1.一种对DNA链进行测序的方法，包括：
使所述DNA链通过拉曼传感器的由等离子体纳米结构界定并由至少一个激光器激发的纳米通道热点；
通过拉曼标记图来鉴定在第一时间段存在于所述通道中的所述DNA链的第一区段的核苷酸，并且通过第二拉曼标记图来鉴定在第二时间段存在于所述通道中的所述DNA链的第二区段的核苷酸；以及
将经鉴定的所述第一区段的核苷酸与经鉴定的所述第二区段的核苷酸进行比较以鉴定变化。
2.如权利要求1所述的方法，其中使所述DNA链通过包括使DNA模板链通过。
3.如权利要求1所述的方法，其中使所述DNA链通过包括经由DNA核酸外切酶拉动所述DNA链。
4.如权利要求1所述的方法，还包括通过电泳或磁泳来将所述模板链移动至所述纳米通道。
5.如权利要求1所述的方法，其中使所述DNA链通过包括使所述DNA链通过拉曼传感器的由两个金等离子体纳米结构界定的纳米通道热点，每个金等离子体纳米结构均由激光器激发。
6.一种对DNA链进行测序的方法，包括：
使所述DNA链通过拉曼传感器的由等离子体纳米结构界定并由至少一个激光器激发的纳米通道热点；
鉴定在第一时间段存在于所述通道中的所述DNA链的第一区段的至少一个核苷酸的拉曼标记图，并且鉴定在第二时段存在于所述通道中的所述DNA链的第二区段的至少一个核苷酸的第二拉曼标记图；
将所述第一区段的所述拉曼标记图与所述第二区段的所述第二拉曼标记图进行比较以鉴定所述拉曼标记图中的变化；以及
使所述拉曼标记图中的所述变化与单个核苷酸相关。
7.如权利要求6所述的方法，其中使所述DNA链通过包括使DNA模板链通过。
8.如权利要求7所述的方法，其中使所述DNA模板链通过包括经由DNA聚合酶拉动所述DNA模板链。
9.如权利要求8所述的方法，其中经由所述DNA聚合酶拉动所述DNA模板链包括从多个单独的游离核苷酸构建互补链。
10.一种表面增强拉曼光谱法(SERS)传感器，包括：
样品装载通道，所述样品装载通道用于接收待测序的DNA链；
由至少两个等离子体纳米结构限定的SERS热点，每个等离子体纳米结构使激光被聚焦在其上，所述SERS热点被调整大小以通过其中接收所述DNA模板链；
拉曼光谱仪，所述拉曼光谱仪可操作地连接至所述SERS热点以测量来自所述DNA链的核苷酸的拉曼光谱；以及
次级室，所述次级室在所述SERS热点的下游。
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CN1878875A (zh) * 2003-09-26 2006-12-13 英特尔公司 使用表面增强拉曼散射(sers)进行dna测序的方法和设备
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