JP2018046846A - オプトフルイディックチップ上での増幅なしでの核酸検出のための方法 - Google Patents

オプトフルイディックチップ上での増幅なしでの核酸検出のための方法 Download PDF

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Abstract

【課題】ウィルス及び他の生物の特異的な核酸の存在を、核酸増幅することなしに検出する方法の提供。
【解決手段】反共振反射光学導波路（ＡＲＲＯＷｓ）を含む、平面状液体コア集積光学導波路を備えたオプトフルイディックプラットフォームにおいて、ウィルスなどの特異的な核酸配列に対する、フルオロフォア及び消光剤を備えたヘアピン構造を有する分子ビーコン等で標的配列にハイブリダイズすることにより、光学的シグナルによって検出する。
【選択図】図１

Description

相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づいて、２０１０年１１月１９日に出願された「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ−Ｆｒｅｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｎ Ｏｐｔｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｃｈｉｐｓ」と題する米国仮特許出願第６１／４１５，４８２号（代理人整理番号ＵＣＳＣ−００１５ （ＳＣ２０１１−２６２））の利益を主張し、その内容は参照することによって本明細書にその全体が組み込まれる。
技術分野
本発明は、概して、集積光学の分野に関し、より具体的には、改良された顕微鏡装置を必要としない光学粒子検出のためのオプトフルイディックプラットフォームに関する。オプトフルイディックプラットフォームは、核酸の特異的検出のための平面状液体コア集積光学導波路を含むことができる。光学導波路は、ＡＲＲＯＷｓ又はＡＲＲＯＷｓ導波路として知られている、反共振反射光学導波路を採用することができる。
背景技術
核酸試験（ＮＡＴ）は、分子診断（ＭＤｘ）の急速に成長する分野の本質的部分である。これによって、ゲノムレベルでの患者特異的診断が、また同様に、病原体の完璧な同定、例えば異なるウィルス株の間での区別化も、可能になる。
ウィルス及び他の生物の核酸試験のための現在のゴールデンスタンダードは、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）とその後の配列決定である。ＲＴ−ＰＣＲは、高度に熟練した操作者、高価な試薬及び厳しく制御される反応環境を必要とする。このことは主として、読み出しに十分大きなシグナルを作成するため、ウィルス性核酸の増幅を必要とするためである。これらの制限は、迅速で、敏感で、信頼性があり、かつ定量的な、増幅なしのウィルス検出のための新しいタイプの診断機器に関する決定的な必要性を示唆する。
概要
我々は、平面状オプトフルイディックス−同じ小型化システム中に集積された光学的要素及び流体学的要素両方の組み合わせ−に基づく核酸試験に対する異なるアプローチを導入する。このアプローチは、核酸の特異的検出のために平面状液体コア集積光学導波路を使用する。この新規戦略は、コストがかかり、かつ時間を消費する標的の増幅を必要とすることなく、小（マイクロリットル）試料体積から、蛍光ラベル化された核酸を検出するために十分な感度を有するコンパクトな平面状デバイスの構築を可能にする。光学的機能及び流体学的機能の鉛直方向の機能的な集積に関する同時の強調によって、標準的なファイバー光学及びマイクロ流体学を用いての検出要素のインターフェース連結が可能になる。これら革新的な観点の組み合わせは、臨床の現場、バイオ医薬、分析化学及び他の分野での多数の適用のための、融通の利くポイント・オブ・ケアウィルス分析に対する基幹的な障害を除去する。
本発明の現在の好ましい一実施態様において、オプトフルイディックチップは、光学粒子検出のための自蔵式平面状オプトフルイディックプラットフォームを含むように構築されている。更なる一実施態様において、オプトフルイディックプラットフォームは、中空コア反共振反射光学導波路（ＡＲＲＯＷｓ）、中実コアＡＲＲＯＷｓ及び流体貯蔵部を含むことができる。オプトフルイディックプラットフォームの種々の要素の構成によって、液体が中空コアＡＲＲＯＷｓ中へと導入されること、そして、そのピコリットル未満の体積が単一粒子検出のために光学的に励起されること、を可能にできる。
一実施態様において、液体溶液は、オプトフルイディックプラットフォーム中へ導入されることができ、光学的励起されてシグナルを発生させることができる。発生したシグナルは、例えば、フォトダイオードを用いて回収されることができ、分析されることができる。この分析は、核酸に取り付けられたフルオロフォアによって発生する蛍光シグナルの存在の決定を含むことができ、これは液体溶液中に含まれる単一核酸粒子の存在を示すことができる。フルオロフォアの一例として、特定の核酸に特異的な分子ビーコンが、調製され、オプトフルイディックプラットフォーム中へと導入されることができる。こうして、発生したシグナルは、特異的核酸の存在を示すことができる。一実施態様において、回収したシグナルは、蛍光相関分光法といった技術を使用してさらに分析されることができる。
本発明の例示的実施態様の他の観点は以下に説明される。
図１は、平面状オプトフルイディックプラットフォームを示す。（ａ）は、概略図で示した配置図、導波路断面及び完成したチップのイメージを示す。（ｂ）は、液体コア導波路の作出のための鍵となるマイクロ素子製造工程を示す。 図２は、（ａ）分子ビーコン、（ｂ）蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）のコンセプトを示す。 図３は、オンチップウィルス検出を示す。（ａ）Ａｌｅｘａ染料でラベル化したＱ−βファージカプシド、（ｂ）ＡＲＲＯＷチャネル中のウィルスを用いて記録された蛍光シグナルを示す。バーストは、単一粒子検出事象を示す（挿入図：緩衝液ベースライン）。（ｃ）蛍光ゆらぎの相応する自動相関Ｇ（τ）を示し、単一未満の（sub-single）粒子感受性（Ｇ（０）＞１）及び理論との優れた一致（赤線：実線）を示す。 図４は、オンチップの増幅なしのウィルス検出を示す。（ａ）ＨＰＶ−１８ゲノムの株特異的セグメント（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/9626069?report=graph&log$=seqview）、（ｂ）５′及び３′末端にそれぞれ蛍光ラベル（Ｆ、ＴＹＥ６６５）及び消光剤（Ｑ、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ）を有するヘアピンビーコン構造、（ｃ）１０ｐＭ標的濃度でのオンチップビーコン検出に関する蛍光シグナル（赤色：実線）（挿入図：バックグラウンド）、（ｄ）蛍光シグナル対、励起体積中の標的濃度／分子数。
例示的実施態様の詳細な説明
オプトフルイディックスは、マイクロスケールでの光学及び流体学、典型的には液体の相互作用を取り扱う、迅速に成長する分野である。最近では、主要な研究トレンドは、特に生物学及びバイオ医薬における、流体によって定義される光学デバイス、液体中の光学粒子操作、及び、光学粒子検出及び分析を含む。
我々は、光と試料検体の間の相互作用を最大化する液体コア光学導波路を基礎とする、増幅なしの核酸試験に対するオプトフルイディックアプローチを発明した。中空コア反共振反射光学導波路（ＡＲＲＯＷｓ）の作出に基づいて、我々は、極めて高い感度を有するが、しかし、改良した顕微鏡装置を必要としない光学粒子検出のための、自蔵式の平面状オプトフルイディックプラットフォームを開発した。中空コア導波路の形成のための製造工程と一緒に、プラットフォームの基礎的なレイアウトが、図１に示されている。
図１の中央下の走査電子イメージは、５×１２μｍの中空コア寸法を有するかかる導波路の断面図を示す。さらに、中実コアＡＲＲＯＷ導波路（図１ａの右下のＳＥＭ参照）は、液体コアの種々の点に連結されている。これは、メインチャネル中への液体及び光のための別個のアクセスパスを作出し、かつ、ピコリットル未満の体積での光学励起領域を定義して、単一分子感度を達成するためにも使用できる。図１ａは、励起光（緑色：オプトフルイディックプラットフォームに入る方向の矢印）が、液体コアへと、直交して交差する中実コアＡＲＲＯＷを介して入る典型的な実験レイアウトを描写する。発生した光（赤色：オプトフルイディックプラットフォームから出る方向の矢印）は、チップ面内で垂直に回収されて、検出のためチップ縁へと案内されている。チャネル末端の流体貯蔵部によって、容易なチャネル充填及び電極挿入が動電学的粒子運動を誘発可能にする。図１ａの左下の写真は、コンパクトなサイズの完成したオプトフルイディックチップを描写する。
図１ｂに示した製造プロセスは、（ｉ）シリコン基材上へ正確な厚さの誘電層（例えばＳｉＯ2及びＳｉＮ）を堆積すること、（ｉｉ）犠牲材料（例えばＳＵ−８）を所望の中空コア形状へパターンニングすること、（ｉｉｉ）更なるＡＲＲＯＷ案内層を用いて前記犠牲層を被覆すること、及び、（ｉｖ）プラズマエッチングによってその末端を暴露した後に化学的エッチングで犠牲コアを除去すること、を含む。これは、マイクロスケールの正確性でもって、種々の光学的及び流体学的レイアウトを定義するために柔軟に使用することができる。
図１に示したプラットフォームは、種々の分子の検出及び分析、例えば、単一の染料分子の蛍光検出、リポソーム及びリボソームの蛍光相関分析及びローダミン６Ｇ分子の表面増強ラマン検出、のために首尾よく使用されている。
本発明の開示は、ウィルスの増幅なしの分子診断のためのオプトフルイディックプラットフォームの使用を導入する。
かかる方法は、好適な光学的読み出し機構及び十分な検出感度の両方を必要とする。
光学的ウィルス検出
光学的検出法は、ウィルス検出において大きな役割を担なっている。それらのうち、蛍光ベースの技術が主である。典型的には、光学的励起後に、より長波長で光を効率的に再放出する染料分子又は半導体量子ドットが、標的物質に取り付けられる。ウィルス検出のために使用され、かつ、この適用に関連のある２つの改良した蛍光方法が、分子ビーコン（molecular beacon）とＦＲＥＴ検出である。図２ａは、分子ビーコンの原理を描写しており、これは、その末端に蛍光染料及び消光剤分子を備えている短い配列のオリゴヌクレオチドである。「オフ」状態では、ビーコンはヘアピンを形成し、フルオロフォアと消光剤とを極めて近接に配置し、蛍光を妨げる。ＤＮＡ又はＲＮＡ標的上のマッチング配列に結合すると、ビーコンが開き、ハイブリダイズし、これにより、今や消光していない染料からの蛍光発光を生じる。ビーコンは、低いバックグラウンドシグナル（ヘアピンコンフォメーションにおいては蛍光シグナルなし）及び単一塩基対ミスマッチに対する高い感度という利点を有する。欠点は、特に酵素及びタンパク質の存在下でのアンフォールディングの可能性である。ビーコンは、適切なヌクレオチド配列が提供されると、市販される。
遺伝材料の同定に適用される蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の原理は図２ｂに示してある。２つの染料分子（ドナーＤ、アクセプターＡ）が、短いヌクレオチド配列に取り付けられている。ドナーとアクセプターの間での非放射性エネルギー移動は、ドナーのみが励起される場合であっても、アクセプター蛍光を生じることがある。このエネルギー移動の効率は、前記２つの染料の近接性に強力に依存し、かつ、測定可能なアクセプターシグナルは、マッチング配列を有する標的に両方のプローブが結合する場合にだけ観察される（下）。
分子ビーコン及びＦＲＥＴ検出の双方とも、高い特異性で検出可能な蛍光シグナルを作出する。さらに、両方の技術は、単一分子分析のために、及び、蛍光主体のウィルス検出のために、首尾よく使用されている。
分子ビーコン及びＦＲＥＴは、どのように核酸特異的光学シグナルがオプトフルイディックチップ上の検出のために作出されることができるかに関する２つの例である。
集積チップ上での高感度検出
増幅なしの検出のための第２の鍵となる要件は、単一粒子レベルで生物学的試料の蛍光を検出する能力である。この文脈において特に興味がもたれるのは、超高感度ウィルス検出の我々の最近の実証である。溶液中の蛍光ラベル化したＱ−Ｅバクテリオファージウィルス（図３ａ）は、中空コアチャネルの１つの末端で液体貯蔵部を介して我々のオプトフルイディックチップ中へと導入され、液体コア導波路及び中実コア導波路の間での交点で光学的に励起された。発生したシグナルは、液体コア導波路に沿って回収されており（図１参照）、純粋な緩衝溶液が試験される場合には存在しない単一ウィルス粒子によって、（図３ｂ）、明らかな蛍光バーストが生じる（図３ｂへの挿入図）。単一粒子感度が、蛍光相関スペクトルによって確認される（図３ｃ）。ここでは１より高いシグナルが、励起体積中の１未満の単一粒子を示している。相関シグナルによって、Ｑ−βに関して報告された値と良好な一致を示した検出粒子の拡散係数を我々が抽出することも可能になり、さらに、ウィルス粒子の成功した検出を確証する。
現在のところ、このことは、顕微鏡の使用なしでのチップ上の単一ウィルス検出の唯一の実証であり、かつ、高感度バイオ粒子検出のための適切な方法としての平面状オプトフルイディック検出を確立する。しかし、第２の必要なステップは、ウィルスタイプ及び株の特異的検出を実証することである。そのために、我々は、ヒトパピローマウィルスＨＰＶ−１８のＬ１遺伝子に特異的な分子ビーコンを設計した。ＨＰＶゲノム内の関連する領域及び３０量体のビーコン構造は、それぞれ図４ａ及び図４ｂに示されている。分子ビーコンを、種々の濃度のマッチングオリゴヌクレオチドと混合した。ビーコンの結合を、短期間加熱（９５℃）及びその後の冷却期間（５０℃で３分間）によって容易にした。ビーコン蛍光を、次いで、６３３ｎｍでの２ｍＷのレーザー光で励起し、図１ａに示すように検出した。生じるシグナルは、図４ｃに描写されており、１０ｐＭの最低濃度でさえ、標的なしのネガティブバックグラウンド（挿入図）と比較した場合に明らかなビーコン蛍光及びその後の光退色を示す。図４ｄは、標的濃度に対するシグナル依存性及び励起体積中の相応する平均分子数を示す。両者は線形挙動を示し、単一分子感度を有する平面状オプトフルイディックＡＲＲＯＷプラットフォーム上での分子ビーコン蛍光を使用したウィルス性ＤＮＡ検出のための我々の能力を明白に実証する。
我々は、これら結果がオプトフルイディックデバイス中で核酸を特異的に検出する能力を明らかに示す一方で、図４のデータが、チャネル内容物が移動しない「静止」配置において測定されたことに気づいた。増幅なしの核酸検出器のための好ましい実施は、励起点を過ぎて移動する検体液体の移動する流の内で核酸を検出することであろう。
上述の発生シグナルは、光センサー、例えば光検出器を用いて回収されることができる。例えば、フォトダイオードが、液体コア導波路に沿って発生した蛍光シグナルを捕捉し、かつ、蛍光バースト分析のために及び特異的核酸の存在の決定のために使用される電流又は電圧に変換すべく、使用されることができる。さらなる一例として、発生した光を電気に変換するためにアバランシェフォトダイオードも使用されることができる。光に対し高感度の半導体であるので、アバランシェフォトダイオードは、発生した光の高度に正確なシグナル表示を提供すべく構成されることができる。

Claims (31)

  1. 平面状オプトフルイディックプラットフォームを提供すること、
    前記平面状オプトフルイディックプラットフォーム中へ、核酸粒子含有液体溶液を導入すること、
    導入された前記液体溶液を、前記平面状オプトフルイディックプラットフォームを用いて光学的に励起させ、シグナルを発生させること、
    発生したシグナルを回収すること、及び
    前記発生したシグナルが、前記核酸粒子のうちの１の核酸粒子に取り付けたフルオロフォアによって生じさせた蛍光を含むことを決定すること
    を含む核酸試験法。
  2. さらに、
    核酸粒子不含の純粋な緩衝溶液を前記平面状オプトフルイディックプラットフォームへと導入し、かつ励起すること、及び
    前記純粋な緩衝溶液に相応する発生したシグナルを回収すること
    を含む請求項１記載の方法。
  3. 前記発生したシグナルが蛍光を含むことを決定することが、前記液体溶液に相応する発生したシグナルを、前記純粋な緩衝溶液に相応する発生したシグナルに対して比較することを含む請求項２記載の方法。
  4. さらに、前記発生したシグナルを用いた蛍光相関スペクトルの作出を含む請求項１記載の方法。
  5. 前記蛍光相関スペクトル中の予め決定した閾値を超えるシグナルが、励起体積中の１より少ない単一粒子を示す請求項４記載の方法。
  6. 前記蛍光相関スペクトルが、検出した粒子の拡散係数を抽出するよう構成されている請求項４記載の方法。
  7. 蛍光シグナルが単一核酸粒子の指標である請求項１記載の方法。
  8. 前記核酸がウィルス由来である請求項１記載の方法。
  9. 前記平面状オプトフルイディックプラットフォームが、複数の平面状の液体コア集積光学導波路を含む請求項１記載の方法。
  10. 前記平面状オプトフルイディックプラットフォームが、複数の中空コア反共振反射光学導波路（ＡＲＲＯＷｓ）、前記中空コアＡＲＲＯＷｓの種々の点に連結された複数の中実コアＡＲＲＯＷｓ、前記中空コアＡＲＲＯＷｓ中へ液体溶液を導入するための手段、前記中空コアＡＲＲＯＷｓへ励起光を提供するための手段、及び、発生した光を回収するための手段を含む請求項１記載の方法。
  11. 前記平面状オプトフルイディックプラットフォームが、複数の中空コア反共振反射光学導波路（ＡＲＲＯＷｓ）、前記中空コアＡＲＲＯＷｓの種々の点に連結するよう構成された複数の中実コアＡＲＲＯＷｓを含み、前記中空コアＡＲＲＯＷｓ及び前記中実コアＡＲＲＯＷｓが、前記中空コアＡＲＲＯＷｓへの液体溶液及び光のための複数の別個のアクセスポイントを提供し、かつ、ピコリットル未満の体積で光学励起領域を定義して、単一分子感受性を達成するように構成されている請求項１記載の方法。
  12. 前記平面状オプトフルイディックプラットフォームが、複数の中空コア反共振反射光学導波路（ＡＲＲＯＷｓ）、前記中空コアＡＲＲＯＷｓの種々の点に連結するよう構成された複数の中実コアＡＲＲＯＷｓ、前記中空コアＡＲＲＯＷｓ中へ液体溶液を少なくとも導入するように構成された前記中空コアＡＲＲＯＷｓの末端にある複数の流体貯蔵部、前記中空コアＡＲＲＯＷｓに垂直に交差する中実コアＡＲＲＯＷｓを通して中空コアＡＲＲＯＷｓに励起光を入れるための１のパス、及び、前記平面状オプトフルイディックプラットフォーム平面中で垂直方向に発生した光を回収するためのかつ回収した光を検出のために前記平面状オプトフルイディックプラットフォームの縁へと案内するための１のパス、を含む、請求項１記載の方法。
  13. 前記液体溶液の導入が、前記平面状オプトフルイディックプラットフォーム中に含まれる複数の液体貯蔵部の使用を含む請求項１記載の方法。
  14. 前記導入された液体溶液の励起が、前記平面状オプトフルイディックプラットフォームに入る励起光の使用を含む請求項１記載の方法。
  15. 前記発生した光の回収が、前記平面状オプトフルイディックプラットフォームに対して垂直に発生し、かつ、前記平面状オプトフルイディックプラットフォームの縁へと案内される光の回収を含む請求項１記載の方法。
  16. 前記液体溶液が、特異的核酸を検出するために構成されている請求項１記載の方法。
  17. 前記液体溶液が、マッチングオリゴヌクレオチドと混合した核酸配列に特異的な分子ビーコンを含む請求項１６記載の方法。
  18. さらに、前記オリゴヌクレオチドに対する分子ビーコンの結合を含み、前記結合が、前記液体溶液の加熱及びその後の冷却期間によって容易になる請求項１７記載の方法。
  19. さらに、前記液体溶液中に特異的核酸配列が存在することを決定するために、前記発生したシグナルに基づくビーコン蛍光のプロットの作出を含む請求項１６記載の方法。
  20. 前記液体溶液の導入が、平面状オプトフルイディックプラットフォーム中に含まれる光学的励起点を通過して移動する流れとしての前記液体溶液の導入を含む請求項１記載の方法。
  21. 前記導入された液体溶液の光学的励起が、レーザー光の使用を含む請求項１記載の方法。
  22. 前記発生したシグナルの回収が、光検出器の使用を含む請求項１記載の方法。
  23. 前記発生したシグナルの回収が、フォトダイオードの使用を含む請求項１記載の方法。
  24. 前記発生したシグナルの回収が、アバランシェフォトダイオードの使用を含む請求項１記載の方法。
  25. １の平面状オプトフルイディックプラットフォーム、
    前記平面状オプトフルイディックプラットフォーム中へ、核酸粒子含有液体溶液を導入するための手段、
    前記平面状オプトフルイディックプラットフォームを用いて前記導入された液体溶液を光学的に励起して、シグナルを生じるための手段、及び
    前記発生したシグナルを回収するための手段
    を含む単一核酸粒子検出システム。
  26. さらに、前記発生したシグナルが蛍光バーストを含むことを決定するための手段を含み、前記発生したシグナルのプロットの経時分析を含む請求項２５記載のシステム。
  27. 前記平面状オプトフルイディックプラットフォームが、平面状液体コア集積光学導波路を含む請求項２５記載のシステム。
  28. 前記平面状オプトフルイディックプラットフォームが、複数の中空コア反共振反射光学導波路（ＡＲＲＯＷｓ）、前記中空コアＡＲＲＯＷｓの種々の点に連結された複数の中実コアＡＲＲＯＷｓ、前記中空コアＡＲＲＯＷｓ中へ液体溶液を導入するための手段、中空コアＡＲＲＯＷｓへ励起光を提供するための手段、及び、発生した光の回収のための手段を含む請求項２５記載のシステム。
  29. 前記液体溶液の導入のための手段が、平面状オプトフルイディックプラットフォーム中に含まれる複数の液体貯蔵部を含む請求項２５記載のシステム。
  30. 前記導入された液体溶液の励起のための手段が、前記平面状オプトフルイディックプラットフォーム中への励起光の注入のための手段を含む請求項２５記載のシステム。
  31. 前記発生した光の回収のための手段が、前記平面状オプトフルイディックプラットフォームの縁で、前記平面状オプトフルイディックプラットフォームに対して垂直方向に発生した光を回収するための手段を含む請求項２５記載のシステム。
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