JP4947900B2 - 分光分析システムおよび方法 - Google Patents

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Description

関連出願
本願は、現在係属中の、「SPECTROSCOPIC ANALYSIS SYSTEM AND METHOD」と題されるの2002年9月30日に提出された米国特許出願第10/262,349号の一部継続出願である(代理人整理番号42390.P14241)。第10/262,349号特許出願は参照として本明細書に組み入れられている。
背景
分野
本発明の態様は、ラマン分光法で試料を分析することに関する。特に、態様は、分光分析チャンバー内に含まれる関心対象の1つの核酸誘導体を含有する試料を誘導ラマン分光法またはコヒーレント反ストークスラマン分光法で分析することに関する。
背景情報
デオキシリボ核酸(DNA)の配列決定は、医学的診断、薬物発見および疾患の治療の分野において商業的に重要な多数の用途を有している。サイズによって分離された蛍光標識DNA分子の検出に基づいた既存のDNA配列決定方法は、配列決定することができるDNAの鎖長による制限がある。典型的には、500〜1,000塩基のDNA配列しか一度に決定することができない。これは、鎖長が数万または場合によっては数十万の塩基であることもある遺伝子と呼ばれるDNAの機能単位の鎖長よりはるかに短い。現在の方法を使用すると、完全な遺伝子配列の決定は、遺伝子の多数のコピーを作製し、オーバーラップするフラフメントに切断して配列決定し、その後オーバーラップするDNA配列を完全な遺伝子に集成するということが必要である。この方法は面倒で、費用がかかり、効率が悪く、時間がかかる。それはまた、典型的には、安全性および廃棄物の処理の問題を生ずる可能性がある蛍光または放射性標識の使用を必要とする。
さらに最近では、DNAチップの特定の位置に取り付けられた、規定の配列の短いオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを含むDNA配列決定方法が開発された。このような方法は、短いDNA配列を推測する、または試料中の特定のDNA分子の存在を検出するために使用することができるが、長いDNA配列の同定には好適ではない。
本発明は、本発明の態様を例示するために使用される以下の説明および添付の図面を参照することによって最もよく理解することができる。
詳細な説明
ラマン分光法で試料を分析するための分光分析システムおよび方法を本明細書において説明する。以下の説明において、数多くの具体的な詳細が記載されている。しかし、本発明の態様はこれらの具体的な詳細がなくても実施することができることが理解される。例えば、実施者は、本明細書に開示されている具体的なチャンバーではない分光分析チャンバーを使用してもよい。別の例として、実施者は、本明細書に開示されている具体的な誘導ラマンおよびコヒーレント反ストークスラマン分光法ではない別の分光学技法を使用してもよい。他の例では、本発明の説明の理解を不明瞭にしないために、既知の構造および技法は詳細に示されていない。分光学の技術分野および本明細書に開示されているチャンバーを製造する技術分野には一般に高いレベルの技術が存在することが認識されている。
本発明の態様はDNA配列決定と併用して使用することができる。1つの例示的なDNA配列決定方法は、例えば、酵素を使用することによってDNA分子を小さいヌクレオチド成分に順番に分解し、次いでヌクレオチドを分析して同定し、元のDNA分子中のヌクレオチドの配列順序を決定することに関係してもよい。自然ラマン分光法がヌクレオチドの同定に試みられている。自然ラマン分光法において、ヌクレオチドを含有する試料は放射線に曝露され、ヌクレオチドの振動特性による自然ラマン散乱効果により、ヌクレオチドと相互作用する放射線の小部分が散乱される。
残念なことに、自然ラマン分光法では、希釈溶液中のヌクレオチドから散乱される光学的信号は一般に非常に弱く、結果として光学的信号を検出する確率が一般に低くなり、この方法は感度が悪く、正確でなく、信頼できない。多数回の測定を実施し、データの平均化を実施することによって、この方法の精度を改善する努力がなされているが、これはさらに時間がかかり、迅速なDNA配列決定環境では望ましくない場合がある。発光または蛍光特性を増強するために、ヌクレオチドに蛍光発色団などの化学的部分を結合することによって、光学的信号の強度を改善する努力もなされている。高い信頼性で一定にこれらの部分を結合することには問題が残されている。化学的部分またはこれらの緩衝溶液は不安定である場合がある。化学的部分は全く結合しない場合もある。結合する部分が異なる特徴を有し、ヌクレオチドに異なる分光学的応答をさせる場合もある。このような問題は、ヌクレオチドを正確に高い信頼性で同定することを困難にする。また、化学的部分を結合する方法は余分な時間および複雑さを分析に加える。これらの問題は本明細書に開示されている方法およびシステムによって克服することができる。
図1は、本発明の態様による、共鳴増強型誘導ラマン分光分析に基づいて試料を同定するための方法を示す。本発明の方法により、試料のフィンガープリントまたはシグニチャーとして作用する分光学的データに基づいて試料を同定することができる。簡単に説明すると、本発明は、ブロック110において関心対象の1つの分子の溶液を共鳴分光分析チャンバーに添加する段階と、ブロック120〜160において共鳴増強型誘導ラマン分光法で試料を分析する段階と、ブロック170において分析に基づいて試料を同定する段階とを含む。1つの分子の分析はいくつかの適用からなる局面であり、限定されない。他の適用は、複数の分子を分析する段階に関係してもよい。本発明のいくつかの態様において、共鳴増強型誘導ラマン分光法は、ブロック120において共鳴チャンバー内に含まれる試料を照射する段階と、ブロック130において試料から放射線を散乱させる段階と、ブロック140においてチャンバー内で散乱した放射線を共鳴させる段階と、ブロック150においてチャンバーから散乱する放射線を照射または透過する段階と、ブロック160において照射される散乱放射線を検出する段階とを含んでもよい。一局面において、本発明の方法は核酸配列決定法と協同して使用することができ、DNAまたはRNA分子を配列決定する努力において、核酸配列決定システムから収容される試料中の1つの核酸誘導体を同定する段階を含むことができる。
図2は、本発明の態様による、試料を同定するために試料の共鳴増強型誘導ラマン分光分析を実施するのに好適な分光分析システム200の断面図を示す。システムは、電磁放射線源210、流体通路270、分光分析チャンバー250(破線で示す)および電磁放射線検出器290を備える。試料230はチャンバーに含まれる。試料の共鳴増強型分光分析中、電子放射線源は、試料を特徴づけて同定するために使用することができる情報を含有するラマン非弾性散乱放射線285の出力を形成するために、入力または励起放射線215を提供してチャンバー内の試料を照射する。誘導ラマン分光法の場合には、入力放射線はレーザーなどの電磁放射線源からの可視、紫外または近赤外スペクトル放射線であってもよく、出力放射線は対応する誘導ラマン非弾性散乱放射線であってもよい。出力放射線は検出器に検出されて、試料または試料の1つ以上の成分を同定するために使用することができる。
最初に、方法100のブロック110を参照すると、液体、気体または混合流体を含んでもよい試料230をチャンバー250に添加する。図2に例示するシステムにおいて、試料は流体通路を流動することによってチャンバーに添加される。通路は固体材料内の空隙または中空の空間であり、例えば、流体を搬送するための任意のチューブ、パイプ、ダクトまたは導管であってもよい。通路の断面は円形、卵形、四角形、長方形または他の形状であってもよい。流体通路は、試料供給源に接続して分析対象の試料を収容する試料流入口275と、試料目的地に接続して分析後の試料を排出する試料流出口280を有する。試料は流入口に収容され、通路を流動し、チャンバー内に流入し、分析され、その後チャンバーから流出し、流出口を通過して適切な目的地に流動することができる。流入口と流出口間の圧力差または通路内のポンプなどの適当な駆動力を提供することによって流動させることができる。一例として、核酸誘導体の希釈水溶液は、加圧注入によって加圧されている核酸配列決定システムから収容されて、特定の核酸誘導体を同定するために通路を流動することによってチャンバーに添加することができる。または、試料は流体通路を流動させるのではなく、シリンジなどの流体ポンプを用いてチャンバーの開口部を介して添加し、その後シリンジを用いて除去することができる。さらに他の実施例において、試料が電気的に荷電している場合には、電場によって提供される力の適用下においてチャンバーに添加することができ、または試料が磁気的である(例えば、磁気部分が結合されている)場合には、磁場によって提供される力によってチャンバーに添加することができる。
必要ではないが、チャンバーはマイクロサイズ化されていてもよい。マイクロサイズ通路、マイクロ流体通路（fluid channel）等という用語は、断面長、例えば、管状パイプの場合の直径が約1ミリメーター(mm、1メーターの1000分の1)未満であることをいうために使用される。しばしば、マイクロサイズ通路は、約10〜500マイクロメーター(μm。1メーターの百万分の1)の範囲内の断面長を有する場合もある。これらの長さを適切な釣り合いで表現する助けとするために、人間の毛髪の断面径は約100マイクロメーターである。これらの小型化した通路は、小規模サイズの試料を取扱うのに有用であることが多く、多数の通路を小型の基板内に構築することができるが、これは必要ではない。
しばしば、通路およびチャンバーは固体基板内に配置することができる。固体基板の好適な材料には、セラミック(例えば、アルミナ)、半導体(例えば、シリコンまたはヒ化ガリウム)、ガラス、石英、金属(例えば、ステンレス鋼またはアルミニウム)、ポリマー(例えば、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート(PMMA)、ポリメチルシロキシン、ポリジメチルシロキサン(PDMS)またはポリテトラフルオロエチレン(テフロン(登録商標))およびこれらの材料の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。当然のことながら、多数の他の材料を使用することができることも理解される。これらの特定の材料のうち、ある種のガラス、石英およびポリマー(例えば、PMMAおよびポリカーボネート)は、少なくとも可視スペクトルにおいて実質的に透明であることが知られている。これらの材料および他の材料の近赤外または紫外における透明性は文献で入手可能であり、不用な実験を行わなくても容易に求めることができる。これらの透明な材料を基板として使用することができる。または、透明でない材料を基板として使用し、関連する放射線の十分な透過を可能にするウィンドウとして透明な材料を使用することができる。ウィンドウに好適な材料には、先に記載した透明な材料ならびにサファイア、フッ化マグネシウムおよびフッ化カルシウム結晶などの他の材料が挙げられる。1つの例示的の基板はステンレス鋼基板に形成された通路および腔、(化学的な適合性の改善のための)テフロン(登録商標)などの不活性な材料を内張りした通路および腔表面ならびに放射線のチャンバー内への透過を可能にするためにチャンバー内に形成されているこれらまたは他の透明な材料からなる1つ以上の透明なウィンドウを含む。または、ステンレス鋼基板は、試料との十分な適合性を有し、テフロンコーティングを省くことが適当であると思われるガラス、石英またはセラミックと取り替えてもよい。さらに別の例として、ポリマーを使用して、製造費削減の助けとし、成型、ホットエンボス加工および他の製造技法を利用することが望ましい場合がある。例示的な基板には、1つ以上のウィンドウおよびリフレクタが挿入され取り付けられている、成型またはエンボス加工された通路およびチャンバーハウジングを含むポリジメチルシロキサンを挙げることができる。
マイクロミリング、レーザーアブレーションおよび集束イオンビームミリングなどの種々のマイクロ加工方法を使用して、セラミック、ガラス石英、半導体、金属およびポリマーの基板に通路を形成することができる。マイクロ流体通路を製造する方法は、例えば、米国特許第5,904,824号、同第6,197,503号、同第6,379,974号、同第6,409,900号および同第6,425,972号に記載されている。また、半導体加工技術分野において通常使用されるフォトリソグラフィーエッチングを使用して、半導体、石英、ガラス、ならびにある種のセラミックおよび金属の基板に通路を形成することができる。例えば、リアクティブプラズマを使用して、シリコン基板に数百ミクロンの深さおよび滑らかな垂直側壁を有する通路をエッチングすることができる。異なる化学性に基づいたフォトリソグラフィーエッチングを同様に使用して、ポリマー材料に通路を形成することができる。また、成型、射出成型、スタンピング、ホットエンボス加工および他の方法を使用して、ポリマー材料およびある種の金属に通路を形成することができる。通路を形成するのに好適な他の技法およびマイクロ加工に関するさらに別の背景情報は、1〜1368ページからなる、University of Norte Dameから入手可能な、2001年9月27日発行のMohamed Gad-el-Hakによる「The MEMS Handbook」(ISBN/ISSN:0849300770)において入手可能である。
本発明の態様によるチャンバーは、分析用試料を含む空洞共鳴器と、第1の周波数を有する第1の放射線(例えば、レーザーからの入力励起放射線)を空洞内に透過させ、第2の周波数を有する第2の電気放射線(誘導ラマン放射線の出力ビーム)を空洞外へ透過させる少なくとも1つのウィンドウと、所定の周波数の放射線(例えば、誘導放射線)を反射するために空洞のハウジングに取り付けられている複数のリフレクタ(例えば、誘電性多層膜ミラー)とを含む。
図2および特定のチャンバー250を参照すると、空洞共鳴器は、リフレクタ235と部分反射リフレクタ245の間の流体通路内の領域である。チャンバーは、試料の添加を可能にするリフレクタ235、245(示してある)の最も左の端の流入開口部と、分析後の試料の除去を可能にするリフレクタ235、245(示してある)の最も右の端の流出開口部を有する。試料はチャンバーを通過して連続的に流動してもまたはチャンバー内で停止してもよい。または、チャンバーは通路の行止まりに位置して試料を添加および除去する共通の流入-流出開口部を使用してもよい。
方法100(図1)のブロック120を参照して、試料がチャンバー内に入ると、試料は照射される。図2に例示するシステムにおいて、放射線源210は入力放射線215をチャンバーに提供し、位置づけられている試料を照射する。好適な放射線源には、このような放射線源に取り付けられているコヒーレント光線源、レーザー、発光ダイオード(LED)、ランプおよび光ファイバーケーブルが挙げられる。単色放射線は関連するオフセットスペクトル信号の検出を促進するので、強力な単色または準単色放射線を提供する放射線源は、弱いまたは広域スペクトル放射線を提供するものより好ましいことが多い。放射線源210は、ある周波数を低下するフィルターまたはモノクロメーターを備えてもよい。放射線源はまた、放射線をチャンバーに方向を変えるまたは集束するレンズ、ミラーまたは他の装置を備えてもよい。これらの装置は、「The Photonics Directory(商標)：The Photonics Buyers' Guide To Products and Manufacturers」に掲載されている業者を含む数多くの供給元から市販品を購入できる。この指導書は、放射線源、放射線検出器、分光計、分光分析ソフトウェアおよび数多くの他の補助装置(例えば、レンズ、波長選択装置等)の業者リストを含む。Photonics Directory(商標)はLaurin Publishingから利用可能で、現在はウェブサイト：www.photonics.com/directory/index.asp.においてオンラインで利用可能である。レーザー(放射線の誘導発光による光線増幅)を使用して、共鳴増強ラマン分光法に好適な波長を有するコヒーレント光および単色光の高強度ビームを提供することができる。波長可変レーザー、ガスレーザー、固体レーザー、半導体レーザー、レーザーダイオード、VCSEL(Vertical-Cavity Surface-Emitting Laser)および量子キャビティレーザーを含む多数の異なる種類のレーザーが好適である。レーザーを使用して、可視、しばしば緑、赤または近赤外および紫外型の放射線を含む、ラマン分光法に好適な周波数または波長の放射線を提供することができる。多数の核酸誘導体を含む関心対象と思われる多数の分子が紫外スペクトル内または紫外スペクトル近辺に共鳴波長を有する。例えば、DNA塩基であるアデニンは、約267ナノメーター(nm、1メーターの10億分の1)に最大に近い共鳴波長を有する。従って、励起波長としての紫外スペクトルは比較的強力な信号を提供することができる。励起放射線として紫外線を使用する場合に生ずる可能性のある欠点は、強度に依存して、紫外線が関心対象の分子に損傷を与え、紫外領域に共鳴波長を有する他のシステム成分および化合物由来のバックグラウンドノイズを誘導することがあるということである。紫外範囲のレーザーおよび関連する光学系は他より高価である傾向もある。別の選択肢は近赤外または可視励起放射線の使用である。信号は、紫外線と比較するとやや強度が弱いこともあるが、ほとんどの物質はこれらのスペクトル周波数の範囲外に共鳴波長を有するので、バックグラウンドノイズを比較的少なくすることができる。この特定のレーザーは必要ではないが、本発明者らはアルゴン-イオンレーザーを使用して、波長約514ナノメーターの放射線を提供し、このようなレーザーはDNAヌクレオチドのラマンスペクトルを識別するのに好適であることを見出した。この特定のレーザーはSanta Clara、CaliforniaのCoherent Inc.およびMountain View、CaliforniaのSpectra-Physics, Inc.から市販されている。このレーザーは、検出を可能にし、分子を損傷しない十分な強度で操作することができる。一例として、レーザーは、分子の安定性に依存して、約100 W〜100 kWの範囲のエネルギーで操作することができる。他の好適なレーザーには、633ナノメーターの波長の放射線を提供する10 mWヘリウム-ネオンレーザー、785ナノメーターの波長の近赤外の放射線を提供する線形偏光50 mWダイオードレーザーおよび他のレーザーが挙げられる。
図2を参照すると、チャンバーは、チャンバー内に位置づけられている試料を照射することができる入力放射線を放射線源から少なくとも1つのウィンドウを介して空洞内に収容する。例示する特定のチャンバーは、リフレクタ235、245の左端の空洞に開口しているインレットウィンドウ220を介して、流体通路壁を透過する透過放射線225を収容する。インレットウィンドウは、特定の励起放射線に対して少なくとも部分的に透明である空洞ハウジングの一部、リフレクタに隣接する位置、リフレクタ間の空間もしくはギャップ、放射線の一部が通過することができる不完全もしくは有限リフレクタ、レンズ、電気光学デバイスまたは空洞に取り込みもしくは空洞から放出される放射線を規定し、方向づけ、ガイドする導波管(例えば、光ファイバー材料または周回モード)であってもよい。好適な電気光学デバイスには、レーザーモジュレーターおよびポッケルセルが挙げられる。ポッケルセルは、Q-スイッチとしてしばしば使用される固体電気光学デバイスである。電場または他の信号は、セルの複屈折を改良またはスイッチするためにデバイスに適用される。これにより、セルを通過する放射線の透過率を改良し、オンオフすることができる。従って、電気光学デバイスは、デバイスを介してチャンバー内に透過するおよび／またはチャンバーから透過する光線の透過を可能にするために、適当な電流を適用することによって開くまたは閉じることができるウィンドウとして作用することができる。電気光学デバイスおよびポッケルセルは、他の業者の中でもDanbury ConnecticutのConoptics, Inc.から市販されている。光線をチャンバーに取り込みおよび／またはチャンバーから放出させるために実際の可動型シャッターを開閉することができることも考慮される。MEMS(マイクロエレクトロケミカル)デバイスに通常使用されるヒンジ式部材をシャッターに使用することができる。
先に考察するように、透過した入力放射線225は空洞内に導入され、入力放射線の一部もしくは反射した入力放射線の一部または両方が試料を照射する。図1の方法100のブロック130を参照すると、放射線の一部は試料によって散乱される。本明細書において使用する「散乱放射線」等という用語は、分子などの試料物質に衝突し、吸収され、放出または放射された光線または他の放射線の光子を言うために使用される。散乱される光子のほとんどは弾性的に放出され、散乱される放射線はエネルギーまたは周波数の変化がない。この放射線はRayleigh散乱放射線として知られている。散乱される光子の一部は、わずかであることが多いが、非弾性的に放出され、エネルギーの交換および周波数の変化がある。これらは既知の現象である。ストークス散乱放射線は、分子がエネルギーを損失し、周波数が低下する散乱をいうが、反ストークス散乱放射線は、分子がエネルギーを獲得し、周波数が増加する散乱をいう。物質によるこのような光線の散乱はラマン分光法として知られている。図3は、Rayleigh、ストークスおよび反ストークス放射線を概念的に例示している。ストークス放射線および反ストークス放射線は、典型的には、Rayleigh放射線より低い強度を有し、それぞれ、Rayleigh放射線より低いおよび高い周波数で存在する。本明細書において使用するストークス放射線および反ストークス放射線は非弾性散乱放射線と集合的に呼ばれる。
非弾性散乱放射線の周波数または波長の変化は、試料または試料に含有される関心対象の分子の特定の特徴に基づく。すなわち、入力放射線の周波数と非弾性散乱放射線の周波数の差は試料に特有である。例えば、分子との非弾性衝突によって散乱される光子の周波数は分子の極性、振動、回転および配向の特徴に依存しうる。この理由は量子力学によって説明される。簡単に説明すると、光子は分子を基底振動状態から高エネルギーまたは仮の振動状態に励起することができ、非弾性散乱放射線の放射によって低エネルギーの振動状態に緩和され、最終的に基底状態に緩和することができる。この過程のさらに別の背景情報および他の振動分光法のトピックスに関するさらに別の背景情報は、John Wiley & Sons, Ltd.発行の、John ChalmersおよびPeter R. Griffithsによる、「The Handbook of Vibrational Spectroscopy」において入手可能である。任意の事象において、関心対象の分子によって非弾性的に散乱される光線の周波数シフトは、分子の極性、振動、回転および配向特徴のフィンガープリントまたはシグニチャーを含む情報を組み入れる。
先に考察するように、分子の希薄溶液から自然に散乱される放射線を検出するまたは高い信頼性で検出することは困難であり、可能性が低いことが多い。従って、図1の方法100のブロック140を参照すると、本発明者らは、試料の共鳴増強分光分析を実施するために、空洞内で放射線を共鳴させるためのシステムおよび方法を発見した。共鳴シグナルは、自然のシグナルより検出が強力で、容易である。有利なことに、これにより、関心対象の分子の希薄溶液を正確に、高い信頼性で検出し、同定する可能性および信頼性を改善することができる。
図2の特定のチャンバー250は、強度を増加または増幅するために、空洞内に放射線を閉じ込めて共鳴させるための、リフレクタおよび部分反射リフレクタを含む共鳴チャンバーである。非弾性散乱放射線は、強度を増加し、チャンバー内に位置づけられている試料の検出および同定を助けるために共鳴させることができる。リフレクタは、空洞内で放射線を内部反射するために、通路のハウジングに組込まれていてもまたは取り付けられていてもよい。試料によって非弾性的に散乱される放射線またはリフレクタ235によって反射される入力放射線225の一部は部分反射リフレクタ245によって反射され、空洞内で共鳴させることができる。リフレクタと垂直な光学軸に十分に平行に反射されない放射線部分は速やかにチャンバーから去ることができる。リフレクタは、ずれた放射線の迅速な除去を可能にするために、リフレクタ間の間隔より短い長さを有することができる。このように、特定の周波数または周波数の範囲を共鳴する以外に、チャンバーは、チャンバー内に蓄積する放射線の方向を効果的に選択し、それによって放射線の強いコヒーレントビームを可能にする。空洞は、共鳴を促進する形状およびサイズを有することができる。本明細書において使用する共鳴は、特に明記しない限り、反射によるチャンバーの放射線の強化を言い、分子内の電子の励起状態と混同するべきではない。例示するように、チャンバー250は、共通の光学軸を中心とし、チャンバー内で共鳴される放射線の波長に比例するまたは少なくともそれに基づいており、入射放射線と反射放射線の位相間に非-破壊的な関係を提供する特定の所定の距離をおいて互いに向かい合って平行のリフレクタを備える。リフレクタ間の距離が照射野の波長の約半分の倍数である場合には、部分波は実質的に構造的に重なり、そうでない場合にはそれらはあまり構造的でなくまたは破壊的に重なることがある。特定のリフレクタは、共鳴周波数の最頻値に光線速度をかけた積の約2分の1を、空洞に充填する媒体の屈折率で割り、チャンバー内で共鳴される特定の放射線の周波数で割った距離をおいてもよい。コヒーレントラマン分光法は可視、近赤外および紫外型の励起放射線を使用することができ、非弾性散乱放射線は励起放射線よりオフセットされるだけであるので、空洞は、望ましい特定の励起放射線に依存して、可視、紫外および近赤外型の実質的に任意の波長を有する非弾性散乱放射線を共鳴するように設計することができる。励起放射線の特定の選択は、レーザーおよび検出器の費用、特定の放射線を検出する検出器の能力、関心対象の分子の共鳴および安定性、関心対象でない他の吸収分子または種によって生じる疑似信号またはノイズ等に依存しうる。
チャンバーは、関心対象の分子(例えば、特定のヌクレオチド)または関心対象の分子のセット(例えば、ヌクレオチドのセット)の非弾性散乱放射線を共鳴するように設計することができる。一例として、514ナノメーターのアルゴン-イオンレーザーによる励起によって発生する図4に示すストークススペクトル(以下にさらに詳細に考察されている)を考えてみる。一番下のデオキシチミジン一リン酸分子のスペクトルは、約1350 cm-1のストークスラマンシフトに顕著なピークを有する。このシフトは、514ナノメーターの励起波長については、19455cm-1(すなわち、107/514=19455)の励起波長からオフセットされており、約18105 cm-1(すなわち、19455-1350)の実際のストークスラマン波数になる。これは、522ナノメーター(すなわち、107/18105)の波長に相当する。このストークス散乱放射線は、光学的信号を増幅し、検出を改善するために、チャンバー内で共鳴されうる。図2に示す特定のリフレクタは、この552ナノメーターの散乱放射線については、共鳴周波数の最頻値に光線の速度をかけた積の約2分の1を空洞に充填した媒体の屈折率で割り、チャンバー内で共鳴される特定の放射線の周波数で割った距離をおいてもよい。別の例として、チャンバーは、この波長の放射線および他の関心対象の分子の非弾性散乱放射線の波長を共鳴するように設計してもよい。本発明の一態様において、リフレクタ間の所定の距離は、関心対象の複数の分子のラマンスペクトルの顕著なピークに対応する波長の関数である(例えば、図4のピークを参照されたい)。関数は平均、加重平均または他の組み合わせ関数であってもよい。
リフレクタ235および部分反射リフレクタ245は誘電性多層膜ミラー、金属ミラーまたは分光法、レーザー、光学もしくは光ファイバー分野において普通に使用される他のリフレクタであってもよい。分布型ブラッグミラー(Distributed Bragg Reflector)(DBR)が一例である誘電性多層膜ミラーは、異なる屈折率を有する材料の交互層の積み重ねまたは積層物を含む干渉系ミラー構造物である。層の厚さは、層で反射される波が互いに同調し、重なるように、反射される放射線の波長に比例しうる。リフレクタは、屈折率が小さい材料と大きい材料の交互層を含んでもよい。誘電体または絶縁体は、交互層の少なくとも1つにしばしば使用され、他の層は異なる誘電体、非-誘電体、半導体または他の材料であってもよい。誘電体ミラーの限定するものではない例には、各々反射される放射線(例えば、非弾性散乱放射線)のほぼ1/4波長(すなわち、波長の1/4)の厚さを有するシリコン(Si)とシリコンの酸化物(例えば、二酸化シリコン、SiO2)の複数の交互層、例えば、SiO2/Si/SiO2が挙げられる。反射率を改善するためにさらに多数の交互層を加えてもよい。部分反射リフレクタ235は、リフレクタ245より比較的多くの入射放射線を透過するために、リフレクタ245より層の総数が少なくてもよい。誘電体ミラーの限定するものではない別の例には、1/4波長の厚さのヒ化ガリウム(GaAs)、ストレス対応型SiO2/Si3N4/SiO2三層膜(交互誘電体層)および約1500オングストロームの金が挙げられる。すなわち、このミラーは誘電体干渉系ミラーと金属ミラーの両方を含む。誘電性多層膜ミラーの数多くの他の例が文献に記載されている。誘電性多層膜ミラーは、しばしば約99〜99.9%またはそれ以上の高い反射率を達成することができる。これらのミラーは、良好なゲインおよび強い強度を迅速に得るために使用することができる。
誘電性多層膜ミラーは、関心対象の分子(例えば、特定のヌクレオチド)または関心対象の分子のセット(例えば、ヌクレオチドのセット)の非弾性散乱放射線の波長に比例する厚さを有する層を含んでもよい。例えば、層は、DNAについては一塩基核酸誘導体のセットの平均反ストークスまたはストークス散乱放射線のほぼ1/4波長の厚さを有してもよい。これにより、例えば、DNA配列決定に関連して、誘導体の全セットの共鳴増強分光分析を実施するために1つの空洞共鳴器を使用することができ、空洞から透過される、誘導体特異的な周波数シフト情報を組み入れた共鳴強化ビームに基づいてセットの特定の誘導体を同定することができる。別の例として、層は、アルゴン-イオンレーザーの514ナノメーター放射線に暴露されたデオキシチミジン一リン酸分子の552ナノメーターのストークス散乱放射線のほぼ1/4波長の厚さを有してもよい。他の厚さを他の分子および励起放射線に適用することができる。
誘電性多層膜ミラーは数多くの供給元から購入しても、または製造してもよい。SuperMirrors(商標)は、California州IrvineのNewport Corporationから購入可能な好適な誘電性多層膜ミラーの例である。SuperMirrors(商標)を入手して、チャンバーのハウジングに取り付けてもよい。または、誘電性多層膜ミラーは、半導体加工分野において普通に使用される技法によって製造することができる(例えば、米国特許第6,320,991号または同第6,208,680号を参照されたい)。別の例として、SiおよびSiO2の交互層を含む誘電体ミラーは、半導体加工分野において普通に使用される従来の化学蒸着または物理蒸着技法によって蒸着してもよい。例えば、低圧化学蒸着(LPCVD)技法を使用して、厚さが制御された高品質の層を提供することができる。または、蒸発、スパッタリングまたは分子線エピタキシーなどの物理蒸着技法を使用して層を形成することができる。別の形態として、化学蒸着によって厚いシリコン層を形成し、二酸化シリコン層をほぼ同じ厚さまでシリコン層から熱的に成長させることができる。当然のことながら、化学および物理蒸着技法を使用して他の材料を蒸着することもできる。
リフレクタおよび部分反射リフレクタは、どちらかが、金属ミラーであってもよい。好適な金属には、特に、アルミニウム、金、銀、クロムおよびそれらの合金、混合物またはそれらの組み合わせが挙げられる。以降において、金属という用語は純粋な金属だけでなく、合金、混合物または組み合わせを含む。好適な金属ミラーはNewport Corporationから入手可能である。金属ミラーも、従来の化学蒸着および物理蒸着技法によって製造することができる。例えば、分子線エピタキシー蒸着によって金の層を空洞壁に蒸着することができる。金属ミラーは、約90〜95%またはわずかに大きいが、通常約99%より大きくない範囲の反射率を提供することができる。
反射される放射線は空洞内で共鳴され、他の非弾性散乱事象を刺激または誘導することができる。刺激される事象は自然の散乱事象より迅速にまたは高い確率で生じることができ、共鳴対応によるラウンドトリップゲインがなくなる飽和または平衡に達するまで、チャンバー内で非弾性散乱放射線の強度を構築することができる。最高約百ミリワットの強度を得ることができると考えられる。このような共鳴増強誘導型ラマン分光法は、希薄な溶液中の関心対象の1つの分子でさえも高い可能性で、正確に、高い信頼性で検出し、同定することを可能にするはずである、増幅され、強力で、周波数シフトしたコヒーレントビームを提供することができる。関心対象の1つの分子を分析する必要はなく、他の態様においては、任意の望ましい数の関心対象の分子を含有する試料を分析することができる。
これまでに異なる種類の試料を分析することができることが明らかなはずである。本明細書において使用する試料という用語は、単独または蒸気、気体、溶液、固体もしくは吸着剤(例えば、金属粒子またはコロイド凝集物)と共に分析される1つ以上の分子、原子またはイオンをいう。試料は、関心対象の1つ以上の分子を含有する希釈溶液を含むことができる。生物分子、核酸配列決定に関連する分子、薬剤、殺虫剤、除草剤、ポリマー、汚染物質等の実質的に任意の分子が、特定の実施に依存して関心対象であってもよい。例えば、核酸配列決定に関連する関心対象の生物分子を分析する場合には、タンパク質、タンパク質断片または核酸誘導体を含有する水溶液または他の溶液を分析することができる。核酸誘導体という用語は、核酸、核酸断片、ヌクレオチド、ヌクレオシド(例えば、アデノシン、シチジン、グアノシン、チミジン、ウリジン)、塩基(例えば、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル)、プリン、ピリミジンまたはこれらの分子の1つの誘導体を指すために使用される。1つの例示的な試料は、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、およびウラシルからなる群から選択される1つの塩基を有する1つの核酸誘導体の溶液を含む。
タンパク質は、細胞の数多くの重要な反応、構造および制御を提供する。核酸は、どのタンパク質を合成するかについての細胞情報を提供する。核酸は、ホスホジエステル結合で接続されたヌクレオチドの鎖状ポリマーである。核酸はデオキシリボ核酸(DNA)であっても、リボ核酸(RNA)であってもよい。ヌクレオチドは、リン酸基、ペントース(炭素数5の糖分子)および塩基の3つの部分からなる。ヌクレオシドは、リン酸基のない塩基と糖である。ヌクレオチドおよびヌクレオシド共に塩基はアデニン(A)、シトシン(C)、グアニン(G)、チミン(T)およびウラシル(U)である。アデニン、シトシンおよびグアニン塩基は、DNAおよびRNAの両方に見られ、チミンは通常DNAだけに見られ、ウラシルは通常RNAだけに見られる。従って、DNAのヌクレオシドはデオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシシチジンおよびデオキシチミジンを含むが、RNAのヌクレオシドはアデノシン、グアノシン、シチジンおよびウリジンを含む。同様に、DNAのヌクレオチドはデオキシアデノシン一リン酸、デオキシグアノシン一リン酸、デオキシシチジン一リン酸、デオキシチミジン一リン酸(または塩の形態、デオキシアデニレート、デオキシグニレート、デオキシシチジレートおよびチミジレート)を含むが、RNAのヌクレオチドはアデノシン一リン酸、グアノシン一リン酸、シチジン一リン酸、ウリジン一リン酸(または塩の形態、アデニレート、グアニレート、シチジレートおよびウリジレート)を含む。RNAでは、ペントースはリボースであるが、DNAではペントースはデオキシリボースである。シトシン、チミジンおよびウラシル塩基はピリミジン塩基であり、炭素および他の原子、この場合では窒素を含有する1つの複素環を含有する。アデニンおよびグアニン塩基はプリン塩基であり、これも窒素を含有する1対の融合した複素環を含有する。核酸および／またはタンパク質の配列を決定することができるということは、医学的診断、疾患の治療および薬物の発見の分野において大きな商業上の重要性がある。当然のことながら、これらは、本発明者らによって開発されたシステムおよび方法によって分析することができる種類の試料および分子の例である。
図1の方法100およびブロック150への参照を続けると、共鳴後、散乱された放射線はチャンバーから照射または透過されうる。図2を参照すると、チャンバーは、放射線をチャンバーから放出して、検出させることができる少なくとも1つのウィンドウを備えることができる。特定のチャンバー250は、この特定の例において、部分反射リフレクタ245を備える、アウトレットウィンドウ260を備える。部分反射リフレクタは、共鳴を実施するのに十分な反射率と、検出可能なレベルの入射放射線を検出器290に透過させられるのに十分な透過率を有する不完全または有限リフレクタである。リフレクタ235は、空洞内において強度を十分に増幅するために、部分反射リフレクタ245より大きい総反射率を有することができるが、これは必要ではない。一例において、リフレクタ235は、入力励起放射線および非弾性散乱放射線の高い反射率、例えば、両方の約99%より大きい(例えば、約99.9%)反射率を有することができるが、部分反射リフレクタ245は非弾性散乱放射線に十分な透過率、例えば、約1%より少なくない透過率(または約99%を超えない反射率を有することができる。当然のことであるが、空洞ハウジングに組み入れた透明材料、リフレクタ235のポッケルセル、空間、空隙、スリット、ピンホールもしくは他の開口部またはシャッターなどの代わりの種類のアウトレットウィンドウも使用することができる。さらに、別の代替物として、放射線をチャンバー内に透過し、チャンバーから透過するために1つのインレット-アウトレットウィンドウを使用することができる。
部分反射リフレクタ245に入射する共鳴放射線240の少なくとも一部は、アウトレット放射線285として空洞およびチャンバーから出る。出力放射線は、チャンバー内の試料についての周波数-シフト情報を組み入れている非弾性散乱放射線を含む。出力放射線の強度は、部分反射リフレクタの反射率、チャンバーの共鳴特性、ならびに吸収、散乱および回折による損失に依存する。チャンバーは、出力放射線の高強度を達成して試料の正確な検出および同定を可能にするように設計されることが多い。
図1の方法100を再度参照すると、出力放射線285の非弾性散乱放射線の少なくとも一部はブロック160で検出される。電磁放射線検出器290が簡略化したフォーマットで示されており、広義的に解釈されるべきである。しばしば、出力放射線はレンズおよび波長選択装置を通過することができる。レンズは、チャンバーから放射される放射線を収集し、方向づけ、集束することができる。レンズまたはチャンバーからの光線は、特定の周波数または周波数範囲を強調、選択、分離または単離する波長選択装置を通過することができる。波長セレクターは、関心対象の放射線(例えば、非弾性散乱放射線)を他の放射線(例えば、弾性的散乱放射線および励起放射線)と識別するために使用することができる。好適な波長選択装置には、特に、プリズム、モノクロメーター、フィルター(例えば、吸光度、帯域、干渉またはフーリエ)、ダイクロイックフィルター、ダイクロイックミラーおよびデマルチプレクサーが挙げられる。
放射線がチャンバーから出て任意のレンズ、波長選択装置等を通過すると、生じた放射線は、分光光度計、光学的マルチチャネルアナライザ(OMA)または他の放射線検出装置に達することができる。これらの放射線検出装置は、受け取った放射線を、同じ情報の少なくとも一部を捕獲し表す、対応する電気信号に変換する光変換機を使用することが多い。例示的な光変換機には、電荷結合素子(CCD)、光トランジスタ、光電子増倍管、光ダイオードまたはこれらの素子の1つ以上のアレイが挙げられる。
放射線検出装置はラマン分光光度計を含んでもよい。分光光度計は、光線の波長および強度を測定する既知の放射線検出装置である。分光光度計は数多くの供給元から購入可能である。好適なラマン分光光度計の1つは、Acton MassachusettsのActon Research Corporation社製のSpectraPro 300i Spectometerである。好適である別の分光光度計は、Ann Arbor、MichiganのKaiser Optical Systems, Inc.(ウェブサイト:www.kosi.com/)社製のRAMANRXN1 Analyzerである。この分光光度計は、放射線の高感度検出を提供するために、電子冷却式(thermoelectrically cooled)電荷結合素子(CCD)アレイを使用している。任意に、この分光光度計は、放射線源などのInvictus NIRレーザー、SuperNotch(登録商標)フィルター、ホログラフィックレーザーバンドパスフィルターおよびHoloSpecホログラフィックイメージングスペクトログラフと共にも入手することができる。操作を含むこの分光光度計のさらに別の背景情報は製造供給元から入手可能である。当然のことながら、他の分光光度計も使用することができる。
しばしば、分光光度計は、周波数または波長対強度を示すスペクトルを形成することができる。図4は、本発明の態様による、4つのDNAヌクレオチドの各々の希釈倍率が高い試料水溶液のストークスラマンスペクトルを示す。明確にするために、4つのスペクトルは、垂直軸方向に互いにオフセットまたは移動されている。上から下に向かって、スペクトルはデオキシアデノシン一リン酸、デオキシシチジン一リン酸、デオキシグアノシン一リン酸およびデオキシチミジン一リン酸である。スペクトルは、レーザーからの514ナノメーターの放射線を試料に照射する段階と、ラマン分光光度計で出力非弾性散乱放射線を検出する段階とを含む、試料に自然ラマン分光分析を実施することによって形成される。自然スペクトルは、信号の強度が相応して弱いことを除いて、共鳴増強ラマンスペクトルと実質的に同様であるはずである。図は、任意の単位の強度対センチメーターの逆数の単位のラマン波長シフト(励起放射線からのストークスオフセット)を示す。示すように、スペクトルは各々、対応するヌクレオチドを同定するスペクトルの明確な特徴、顕著なピークまたはフィンガープリントバンドを有する。例示的な顕著なピークとして、一番上のスペクトルでは1630 cm-1、次のスペクトルでは1440 cm-1、下から2番目のスペクトルでは800 cm-1、一番下のスペクトルでは1350 cm-1が挙げられる。
最後に図1の方法100を参照すると、試料はブロック170で同定することができる。試料は、測定したスペクトルを、既知の試料の多数の所定のスペクトルを含むスペクトルライブラリーと比較し、測定したスペクトルがライブラリーの対応する所定のスペクトに十分に近い場合には既知の試料の1つとして試料を同定することによって同定することができる。出力放射線の結果として放射線検出器によって形成される電気信号は、電気信号に表されているラマンフィンガープリントまたはシグニチャーをライブラリー内の具体的なフィンガープリントまたはシグニチャーに関連させることができる分光分析命令およびライブラリー(例えば、データベース)を用いて適当にプログラムされているコンピュータシステムに提供することができる。例えば、分光光度計の場合には、フィンガープリントが十分に同じであるかどうか(すなわち、試料がデータベース中で同定された試料と同じアイデンティティーを有するかどうか)を判定するために、試料のスペクトル(またはあるバンド)を同定した他の試料の分光データと比較または対比することができる。ラマン分光法によりヌクレオチドを同定するための種々の方法は当技術分野において既知である(例えば、米国特許第5,306,403号、同第6,002,471号または同第6,174,677号を参照されたい)。試料のアイデンティティーはメモリーに記憶され、さらに分析してもまたは他の目的に使用することもできる。
図1の方法100を参照すると、この方法を実施する別の方法は、ブロック110において試料をチャンバーに添加する段階と、ブロック120において試料に関連する非弾性散乱波長と実質的に同じ周波数または波長を有する短く、完全に既知のパルスの放射線を試料に照射する段階と、ブロック130〜150において、それぞれ、空洞からの放射線を散乱、共鳴、照射する段階と、次いでブロック160において放射線を検出し、チャンバー内の非弾性散乱光線の減衰時間を表示する段階とを含んでもよい。減衰時間は試料を同定するためのフィンガープリントまたはシグニチャーとして使用することができる。当然のことであるが、他の方法も考慮される。
図5は、本発明の態様により試料を同定するために、試料の共鳴増強分光分析を実施するのに好適な分光分析システム500の断面図を示す。本発明のシステムは、放射線源510、基板505、流体通路570、分光分析チャンバー550および放射線検出器590を備える。試料530はチャンバー内に含まれる。通路とチャンバーは基板内に形成され、接続されている。特定のチャンバーは球状の空洞共鳴器と、インレットウィンドウ520と、第1、第2、第3および第4の曲線状リフレクタ535A〜Dと、アウトレットウィンドウ560を備える。試料は、通路の流入口575に添加され、次いでチャンバーの空洞に流動し、分光学的に分析され、次いでチャンバーから出て試料アウトレット580を通過して流動することができる。
球状の空洞共鳴器は、空洞の内側方向に放射線を反射するのを助けることができる凹面で形成されている。球状という用語は、球形に類似または近似しているが、必ずしも完全な球形ではない形状をいうために使用される。当然のことであるが、球状の形状は必要ではなく、他の空洞ではチャンバーハウジングの一部だけが凹面(例えば、球状または放物線的に凹面)であっても、または空洞は円筒形の空間(例えば、流体通路より径が大きい)、多角体の空間、6面体の空間、立方体の空間または任意の他の規則的もしくは不規則な形状の空間であってもよい。
空洞は流体通路のワイドスポットとして作用し、特定の実施に便利な容積を有することができる。典型的には、空洞は約1ミリリッター(mL、1リッターの1000分の1)を超えない容積を有する。または、さらに小型の空洞が望ましい場合には、空洞はマイクロサイズの空洞または約1マイクロリッター(μL、1リッターの百万分の1)を超えない容積を有する微小空洞であってもよい。例えば、容積は約500ナノリッター(nL、1リッターの10億分の1)、約100 nL、約1 nLまたはそれ以下であってもよい。
放射線源510からの入力励起放射線515は、基板、インレットウィンドウ520を通過して、空洞内に入るように方向付けられる。特定のインレットウィンドウ520は、インレット放射線515に対して少なくとも部分的に透明である、第2のリフレクタと第3のリフレクタ535B〜Cの間の空洞ハウジングの領域を含む。インレットウィンドウは第2のリフレクタと第3のリフレクタの間の空間、例えば、十分に透明な基板の一部であっても、または第2と第3のリフレクタの間の部分反射リフレクタまたは透明な材料であってもよい。入力放射線の少なくとも一部は放射線を照射し、非弾性的に散乱される。リフレクタ535A〜Dは非弾性散乱放射線を限定し、この特定の態様では、入力放射線の多くが内面反射によってチャンバーの内側に限定される。反射された放射線の一部は、試料を再度照射し、再度非弾性的に散乱されることによって非弾性散乱放射線をさらに誘導することができる。図8に考察するものなどの本発明の別の態様において、アウトレットウィンドウは、空洞から入力励起放射線を除去するために使用することができる。
出力放射線585はアウトレットウィンドウ560を通過して空洞を去り、少なくともある程度の共鳴増強により誘導された非弾性散乱放射線を含む。アウトレットウィンドウは、アウトレットウィンドウを通過するインレット放射線の透過を低下するために、入力放射線の通路およびその主要な反射通路から離れたところに位置づけられる。当然のことながら、これは必要ないが、波長選択装置は、透過される任意のこのような放射線を除去するために使用することができる。
図6は、本発明の態様による、球状チャンバー650の別の断面図を示す。チャンバーは、チャンバー550の特徴ならびにインレットウィンドウ620またはアウトレットウィンドウ660の交互の位置676、677、678および679を示す。例として、アウトレットウィンドウは、位置676〜679の少なくとも1つに再配置されても、またはインレットウィンドウは位置676〜679の1つに再配置されてもよい。試料630はチャンバー内に位置づけられる。図6は、それぞれ、図7Aおよび7Bの図を示す切断線7A-7Aおよび7B-7Bも示す。
図7A〜7Bは、本発明の態様による、図6のチャンバー650の組み立てを示す。図7Aは、図6に示す切断線7A-7Aから見たチャンバーの上面の平面図を示す。チャンバー650の上部の半球状の空間750Aおよび半円筒形空間770A(円筒形の通路空間の半分)を基板705A内に形成することができる。一例において、これらの空間750A、770Aは、フォトリソグラフィーおよびエッチングによって石英またはガラス基板に形成することができる。アジテーションによる異方性エッチングは、結晶面をエッチングすることによって、チャンバー750Aのほぼ球状の凹面および通路770Aの凹状の円筒面を形成するために使用することができる。別の例において、これらの空間は、成形またはエンボス加工によってPDMSなどのポリマー材料に形成することができる。
半球状の空間750Aの内側面はリフレクタ735B〜D(図6の図のリフレクタ635B〜Dに対応する)を含む。リフレクタは、その後に形成される、異なる反射率を有する適当な厚さの材料の交互蒸着層(例えば、SiおよびSiO2)によって形成することができる。蒸着は半球全体にわたってもよく、この場合にはインレットウィンドウ720および出口ウィンドウ760は、これらの蒸着層の一部を除去して部分反射リフレクタを形成することによって、またはこれらの層を全て除去して透明な石英ウィンドウを形成することによって形成することができる。これらの層は、レーザーアブレーション、エッチングまたは層を除去するための他の従来の技法によって除去することができる。または、ウィンドウ720および760のサイズおよび位置をパターニングしたマスクを使用して、非-ウィンドウ部分に誘電性多層膜ミラー層を選択的に蒸着することができる。PDMSポリマーの場合には、サファイア、石英または他の透明なウィンドウをポリマーに成形してもまたはポリマーに穴を開け、ウィンドウを固定して挿入してもよい。
図7Bは、図6に示す切断線7B-7Bから見たチャンバー650の底部の平面図を示す。チャンバー650の底部の半球状の空間750B、半円筒形の空間770Bおよびリフレクタ735Bは、図7Aについて記載するように、シリコン基板などの基板705B内に形成することができる。これらの構造物の形成後、ウェーハ接着方法、例えば、酸化面の高温融合によってまたは接着剤を用いて基板705Aを基板705Bに接着することができる。
図8は、本発明の態様による、位置合わせしたシード放射線815Bおよび横方向の放射線815Aの形態の入力励起放射線を収容するように構成された分光分析チャンバー850の平面図を示す。横方向の入力励起放射線は任意の好適な周波数を有することができる。横方向の放射線の方向は、出力放射線885の方向および共鳴の方向に対して横方向の垂直である。これにより、分子831を照射しない横方向の放射線886の一部はチャンバーを出ることができる。これは、出力非弾性散乱放射線885の検出を助けることができる。シード放射線は部分反射リフレクタ845を介してチャンバーに加えられる。シード放射線は、特定の試料から非弾性的に散乱される放射線と同じ周波数を有することができ、その試料がチャンバー内に含まれる場合には散乱を誘導することができる。シード放射線の方向は反対であるが、出力非弾性散乱放射線885の方向に並ぶ。これにより、部分反射リフレクタを透過されるシード放射線は反射され、共鳴されることが可能になる。放射線検出器は、既知の強度の入力シード放射線に対する出力放射線の強度のゲインまたは増加を測定するように構成することができ、ゲインまたは増加は誘導された散乱に起因しうる。
従って、図1の方法100を続いて参照すると、ブロック110において試料を照射する段階は、試料に入力横方向放射線と、異なる周波数を有する入力シード放射線を照射する段階を含むことができる。同様に、ブロック160において放射線を検出する段階は、シード放射線に対するゲインを検出する段階を含むことができる。シード放射線の周波数は、異なる分子に対応して所定の周波数セットの中で変動して、チャンバー内の試料がこれらの周波数の1つに対応する分子を含有するかどうかを判定することができる。例えば、アデニンの非弾性散乱周波数のシード放射線を提供することができる。シード放射線に対するゲインがほぼゼロである場合には、誘導散乱は見られず、試料はアデニンを含有しなかったと結論づけることができる。次いで、ゲインがゼロでなく、試料が特定の塩基を含有する可能性があることを示すまで、シード放射線の周波数を他のヌクレオチド塩基に対応する周波数に調整することができる。周波数のどれによってもゲインがゼロでなくならない場合には、その試料をチャンバーから除去し、別の試料を添加することができる。
図8において考察するシードおよび横方向入力放射線の概念は、図5〜6に示すものと同様の分光分析システムに適用することができる。例えば、入力横方向励起放射線はウィンドウ620を介してチャンバー内に透させすることができ、入力シード放射線はウィンドウ660を介してチャンバー内に透過させることができ、散乱放射線はウィンドウ660を介してチャンバーから透過させることができる。試料を照射しない入力横方向放射線部分は位置679のウィンドウを介して除去することができる。
従って、誘導ラマン分析を使用する本発明の態様では、関心対象の1つの分子の検出および正確な同定を可能にする程度に信号強度を増加または増幅する助けとなる共鳴増強誘導散乱事象を生じることによって、非弾性散乱誘導ラマン放射線を光学的に増幅することができる共鳴チャンバー内に関心対象の1つの分子を位置づけることができる。一例として、関心対象の1つの核酸誘導体を、向かい合う2つのリフレクタを有する共鳴チャンバーに位置づけることができる。第1のリフレクタは励起放射線および非弾性散乱ラマン放射線の反射率が高いが、第2のリフレクタは励起放射線の反射率は高く、非弾性散乱ラマン放射線の透過率が十分である。一局面において、高い反射率は約99%を超えてもよいが(例えば、99.5%〜99.9%)、十分な透過率は、反射率が99%を超えない。向かいあう2つのリフレクタは、非弾性散乱ラマン放射線を共鳴するのに十分な距離が置かれている。この距離は、1つの核酸誘導体の非弾性散乱ラマン放射線または異なる誘導体を同定するためにチャンバーを使用できるように複数の核酸誘導体の非弾性散乱ラマン放射線に基づいて決定することができる。
従って、関心対象の1つの分子を含有する試料を誘導ラマン分光法で分析することができる。誘導ラマン分光法以外に、別の好適な形態のコヒーレントラマン分光法は、コヒーレント反ストークスラマン散乱現象を使用する、コヒーレント反ストークスラマン分光法(CARS)である。自然ラマンおよび表面増感ラマン分光法(SERS)などの多数の他の形態のラマンは、ランダムおよび非コヒーレント非弾性散乱放射線の自然放射に関係する。一方、CARSは、本質的に、方向性の高い、コヒーレント出力非弾性散乱放射線信号を形成する。誘導ラマンにおけるような共鳴によるのではなく、干渉性は、位相整合された放射線の振幅の干渉性ビルドアップによって提供される。本明細書において使用するCARSは、時間分解CARS、走査型(scanned)CARS、OPO CARS、MAD CARS、PARS等の種々の形態のCARSを含む。CARS放射線信号は、関心対象の1つの分子の検出も可能なほど十分に干渉性で、強度が強い。CARS出力信号のスペクトルの形状および強度は試料のスペクトル特徴を含み、試料を同定するために使用することができる。従って、本発明は、核酸配列決定と合わせて、1つの核酸誘導体を分析し、同定するためにCARSを使用することを考慮する。
CARSは4波混合分光法である。CARS中、チャンバー内の試料は、関係、w3=2w1-w2によって第1および第2の周波数に関連する第3の波長(w3)を有するコヒーレント反ストークス散乱放射線を試料に照射させるために、重複し、位相整合されている(すなわち、それらは空間的および時間的に重複している)第1の波長(w1)を有する第1の放射線およびしばしば、第2の波長(w2)を有する第2の放射線が照射され、励起される。
図9は、本発明の態様により、試料の1分子を分析するために使用するCARS方法のエネルギーダイアグラムを示す。分子のエネルギーをy軸にプロットし、CARS方法の進行をx軸にプロットする。簡略化のために、考察は1つの光子に言及しているが、実際面ではしばしば、少なくとも1つであるが、しばしば多数の光子を含有する放射線が試料を分析するために使用される。最初に、分子は、波長(w2)920の第2の光子の放射を誘導するために、波長(w1)910の第1の光子で干渉作用により励起される。第1の光子は、しばしば、分子を照射するためにチャンバーに方向付けられるレーザービームパルスとして提供される。示すように、第1の光子は、分子を基底振動状態950から低い仮の状態970に励起する。放射される第2の光子は、分子を仮の状態870から低い励起振動状態960に下げる。励起振動状態は、基底振動状態とラマンシフト(w4)の振動遷移分だけ異なる。分子は自然または誘導放射によって第2の光子を放射することができるが、コヒーレント誘導放射がCARSでは使用される。しばしば、分子は、第2の光子の誘導放射を誘導するために、波長(w2)の別の光子で暴露される。誘導放射は自然放射とより比較的確率が高く、検出および分子の同定を促進する高いCARS信号強度を生ずることができる。誘導放射は、しばしば、第2の波長(w2)を有する第2の放射線を、第1の放射線(第1の光子)による照射と同時にチャンバーを照射することによって誘導される。
低い励起振動状態960の分子は、その後、波長(w1)930の第3の光子が照射される。レーザービームパルスによる照射もこの光子を提供することができる。第3の光子は、分子を励起振動状態960から高い仮の状態980に励起する。分子の振動は位相が振動し、構造的に干渉する。分子は波長(w3)の第4の光子を放射して、高い仮の状態から基底振動状態に戻る。第4の光子の波長は、第1および第3の光子の2倍マイナス放射される第2の光子の波長である(すなわち、w3=2w1-w2)。本質的に、CARSは、2つの(w1)光子を(w2)光子および(w3)光子に不均化または分割する。位相整合条件はコヒーレントCARS信号の方向を決定する。以下にさらに考察するように、本発明は、分子の検出および同定を促進するために、種々の幾何学的構成のビームを使用してこの特性を利用し、入力励起ビームからコヒーレントCARS信号を空間的に単離する助けとすることを考慮する。
これらの光子に試料を暴露する異なる方法が既知である。1つの方法において、試料に、波長w1の第1のレーザービームパルスと、波長w2の第2のレーザービームパルスと、波長(w1)の第3のレーザービームパルスを同時に照射することができる。実際には、第1のレーザービームパルスは、同じ波長(w1)を有するので、第3のレーザービームパルスとしても作用することができる。マルチレーザーから同時のレーザービームパルスを提供する電子機器は市販されている。このような同期電子機器には、Coherent(Santa Clara、CA)社製のSynchroLockまたはSpectra-Physics(Mountain View、CA)社製のLok-to-Clokが挙げられる。または、別の方法において、試料に波長(w1)のレーザービームを連続的に照射し、波長(w2)のレーザービームのパルスまたはスキャンを間欠的に照射することができる。差(w1-w2)が試料の分子振動の波長、例えば、振動遷移(w4)に実質的に一致または整合すると、CARS信号の強度は著しく増強されることが多い。ある範囲の波長(w2)または差(w1-w2)のスペクトルを発生させてもよい。しばしば、(w2)を継続的に、変化、変更または走査し、(w1)を一定に維持し、同時に対応するCARS信号を記録する。または、(w1)を継続的に変化、変更または走査し、(w2)を一定に維持し、同時に対応するCARS信号を記録する。別の態様において、望ましい(w1-w2) を得るために、(w1)および(w2)を継続的に変化、変更または走査し、対応するCARS信号を記録する。1つの方法において、可変式の広帯域色素レーザーを望ましい範囲の波長にわたって走査する。別の方法は、全範囲の周波数を同時にカバーする広帯域ストークスレーザーを使用することに関係する。または、(w1-w2)をスキャンするために、光学パラメータ式発振器の信号およびアイドラービームを使用することができる。
CARS方法のためには、エネルギーおよび運動量の保存を効率的に生じさせることが必要である。CARS中、出力信号は、振幅の干渉性加算によって構築される。CARS4波混合方法では、出力コヒーレント放射線の十分な強度を得るために、入力励起放射線および出力コヒーレント反ストークス放射線の波動ベクトルに位相整合条件を与えることが望ましいことが多い。振幅は実質的に同期しているべきであり、すなわち、波長(w1)の2つの到来波の合計と波長(w2)および(w3)の出力波の合計の間に整合する位相を提供するようにビームを整列させる。位相整合条件が満足されると、出力反ストークス波の強さまたは強度は最大近くになるはずである。これにより、試料は、自然ラマン分光法で期待されるような弱く、ランダムに散乱する信号ではなく、しばしば所定の方向を有する方向性の高い平行コヒーレントビームとして、コヒーレント共鳴増強反ストークス散乱放射線を照射または放射する。CARS信号の所定の方向により、励起放射線から幾何学的または階層的に分離することができる種々の構成が可能になる。
共線CARS形状、BOX CARS形状、フォールデッド(Folded) BOX CARS形状およびUSED CARS形状を含む、数多くの従来の位相整合ビーム構成または形状が当技術分野において既知である。これらのいずれかを使用できる可能性がある。さらに、本発明者らは、入力励起放射線からCARS放射線信号を分離または単離する助けとする構成を使用することを考慮している。図11〜13は、本発明の種々の態様により、位相整合されている場合に、放射線検出末端において励起ビームからCARS信号を空間的に分離および単離する助けとすることができる励起放射線ビームの例示的な構成を示す。有利なことに、これらの例示的な構成において、CARS信号ビームは、放射線検出末端において励起ビームから空間的に分離および単離され、試料の同定を促進することができる。当技術分野における通常の技術レベルおよび本発明の教示内容の利益を有する当業者には他の構成が明らかである。
図10は、本発明の態様による、クロス-ビーム構成を示す。クロス-ビーム構成では、入力第1(w1)および第2放射線(w2)は、それらがチャンバー内の試料1030を照射し、その後互いにおよび試料から放射されるコヒーレント反ストークス散乱放射線(w3)から離れるように、互いに対してある角度でチャンバー1050に提供される。この方法では、この構成は入力放射線を出力コヒーレント散乱放射線から分離する助けとなり、波長選択またはフィルタリングを回避することができる。チャンバーは、本明細書に開示する他のチャンバーと同様であってもよい。チャンバーは共鳴チャンバーであってもよいが、必要ではなく、リフレクタを含むまたは共鳴を促進するサイズもしくは形状を有してもよいが、必要ではない。
図11は、図10に示すものと同様のクロス-ビーム構成の運動量保存を示す。位相整合条件はコヒーレント反ストークス放射線の方向を決定する。4波混合方法のエネルギーおよび運動量保存のために、位相整合条件が、入力および反ストークス出力波の波動ベクトルに与えられる。位相整合条件が十分に満足されると、出力の強さは最大近くになり、コヒーレント反ストークス光子の方向および運動量は励起光子の方向および運動量に関連する。これは図11においてグラフで示されており、第1の励起波長の2つのベクトル(2kw1)と第2の励起波長の1つのベクトル(kw2)が組み合わされてコヒーレント反ストークス放射線のベクトル(kw3)を与える、すなわち、数学的にはkw3=2kw1-kw2である。ベクトルの長さは光子の運動量を表す。励起放射線の方向の構成により、CARS信号光子は入力励起光子から幾何学的に分離されうる。これは放射されたCARS光子の検出を促進することができる。
図12は、本発明の態様による、前方散乱型の構成を示す。この構成では、コヒーレント放射線は入力放射線から分離されず、フィルターなどの波長選択装置を使用してコヒーレント放射線を単離することができる。
図13は、本発明の態様による、後方散乱型の構成を示す。この構成では、クロス-ビーム構成のように、コヒーレント放射線は入力放射線から分離される。この構成におけるコヒーレント放射線の強度は、サンプルサイズが励起波長に対して小さい場合には、前方散乱型構成の強度とほぼ等しいことが多いが、さらに強い信号を得るためには、前方散乱型構成と適当な波長選択装置を使用することが望ましいことがある。
図14は、本発明の態様を実施することができる核酸配列決定システム1401を示す。核酸はサンプリングシステム1402に提供することができる。サンプリングシステムは、核酸の1つの核酸誘導体を除去または誘導するために酵素または核酸の他の切断物質(cleaver)を含むことができる。一例において、システムは、鎖の末端から1つずつ1つのヌクレオチドを除去することによって核酸鎖を切断するエキソヌクレアーゼ酵素を含むことができる。サンプリングシステムは、試料を調製する、例えば、核酸誘導体の水溶液を希釈し、任意の添加剤を供給する装置も備えることができる。試料は、例えば、流体通路1470を介して分光分析システム1400に添加することができる。分析システムは、核酸誘導体を同定するために、本明細書の別の箇所に記載されているように、試料のラマン分光分析を実施する。例えば、分析システムは、試料が、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、およびウラシルを含む群から選択される1つの塩基を含有するかどうかを判定することができる。核酸誘導体のアイデンティティーは、入力核酸の順に並べた配列の一部としてメモリーに記憶され、医学的な問題を解決するため、例えば、疾患を診断もしくは治療するためまたは他の目的に使用するために配列の一部として分析することができる。
一般的に記載されているが、以下の実施例は、本発明の特性の一部を例示し、本発明の実用的な利点を実証するためおよび当業者が本発明を使用できるために本発明の特定の態様として提供されている。これらの実施例は単に例示として解釈されるべきであることが理解される。
実施例
実施例1：ラマン検出およびナノ粒子を使用する核酸配列決定
図15に例示する本発明のある態様は、反応チャンバー1501の固定面に結合することができる1つ以上の1本鎖核酸分子1509を配列決定することに関係する。反応チャンバー1501は、核酸分子1509の未結合末端から一度に1つのヌクレオチドを逐次的に除去する1つ以上のエキソヌクレアーゼを含有することができる。
ヌクレオチド1510が放出されると、それらはマイクロ流体通路1502を下方に移動して、ナノ通路1503またはマイクロ通路1503に流入し、検出装置を通過することができる。検出装置は、励起ビームを放射するレーザーなどの励起源1506を備えることができる。励起ビームは、電子が高いエネルギー状態に励起されるように、放出されたヌクレオチド1510と相互作用することができる。電子が低いエネルギー状態に戻ることによって生じるラマン放射スペクトルは、分光光度計、モノクロメーターまたはCCDカメラなどの電荷結合素子(CCD)などのラマン分光検出器1507によって検出することができる。
励起源1506および検出器1507は、ヌクレオチド1510がナノ通路1503またはマイクロ通路1503のナノ粒子1511領域を通過するとき励起され、検出されるように配置することができる。ナノ粒子1511は、ラマン検出のための「ホットスポット」を形成するために架橋することができる。ナノ粒子1511ホットスポットにヌクレオチド1510を通過させることによって、ラマン検出の感度は数桁増加されうる。または、ヌクレオチドは共鳴チャンバーに流入することができる。
反応チャンバー、微小流体通路およびマイクロ通路の製造
Borofloatガラスウェーハ(Precision Glass & Optics、Santa Ana、CA)を濃HF(フッ化水素酸)中で短期間事前エッチングし、洗浄してから、プラズマ支援化学蒸着(PECVD)システム(PEII-A、Technics West、San Jose、CA)においてアモルファスシリコン犠牲層を蒸着することができる。ウェーハにヘキサメチルジシラザン(HMDS)を下塗りし、フォトレジスト(Shipley 1818、Marlborough、MA)をスピンコーティングし、ソフト-ベークした。コンタクトマスクアライナー(Quintel Corp. San Jose、CA)を使用して、1つ以上のマスクデザインを有するフォトレジスト層を露出させ、露出したフォトレジストを、Microposit現像濃縮液(Shipley)と水の混合物を使用して除去することができる。現像後のウェーハをハード-ベークし、露出したアモルファスシリコンを、PECVDリアクタでCF4(四フッ化炭素)プラズマを使用して除去することができる。ウェーハを濃HFで化学的にエッチングして、反応チャンバー1501、微小流体通路1502およびマイクロ通路1503を製造することができる。残りのフォトレジストを剥離し、アモルファスシリコンを除去することができる。
ナノ通路1503はこのプロトコールの変法によって形成することができる。標準的なフォトリソグラフィーを使用して、ミクロンスケールの形状の集積チップを形成することができる。薄層のレジストをチップにコーティングすることができる。原子間力顕微鏡／走査型トンネルプローブチップを使用して、幅5〜10 nmの帯状のレジストをチップ表目から除去することができる。チップを希HFで短時間エッチングして、チップ表面にナノメータースケールの溝を形成することができる。本発明の限定するものではない例において、径500 nm〜1μmの通路1503を製造することができる。
ダイヤモンドドリルビット(Crystalite、Westerville、OH)を用いてアクセスホールをエッチング後のウェーハに開けることができる。プログラム式真空炉(Centurion VPM、J. M. Ney、Yucaipa、CA)においてエッチングし、穴を開けた2枚の相補的なプレートを互いに熱的に接着することによって完成品のチップを製造することができる。反応チャンバー1501、微小流体通路1502およびナノ通路1503またはマイクロ通路1503を組込んだチップの別の例示的な製造方法は米国特許第5,867,266号および同第6,214,246号に開示されている。エキソヌクレアーゼおよび／または核酸1509が反応チャンバー1501から出ないように、反応チャンバー1501と微小流体通路1502の間に分子量カットオフ2,500ダルトンのナイロンフィルターを挿入することができる。
ナノ粒子の製造
銀ナノ粒子1511はLeeおよびMeisel(J. Phys. Chem. 86: 3391-3395, 1982)によって製造することができる。金ナノ粒子1511はPolysciences, Inc.(Warrington、PA)、Nanoprobes, Inc.(Yaphank、NY)またはTed-pella Inc.(Redding、CA)から購入することができる。限定するものではない例において、60 nmの金ナノ粒子1511を使用することができる。5、10または20 nmなどの他のサイズのナノ粒子1511も使用することができることを当業者は理解している。金ナノ粒子1511は、鎖長5 nm〜50 nmの範囲のアルカンジチオールと反応させることができる。このリンカー化合物は、アルカンの両端にチオール基を有して金ナノ粒子1511と反応することができる。リンカー化合物に対して過剰量のナノ粒子1511を使用することができ、大きいナノ粒子凝集物を形成しないように、リンカー化合物をナノ粒子1511に徐々に添加することができる。室温において2時間インキュベーション後、1 Mスクロース中で超遠心分離することによってナノ粒子1511凝集物を1つのナノ粒子1511から分離することができる。電子顕微鏡は、この方法によって製造される凝集物は、凝集物あたり2〜6のナノ粒子1511を含有することを明らかにしている。凝集したナノ粒子1511は、微小流体流動によってマイクロ通路1503に供給することができる。マイクロ通路1503の末端に狭窄(constriction)またはフィルターを使用して、ナノ粒子凝集物1511をその場に保持することができる。
核酸の調製およびエキソヌクレアーゼ処理
ヒト染色体DNAはSambrookら(1989)に従って精製することができる。Bam H1で消化後、ゲノムDNA断片をpBluescript(登録商標) IIファージミドベクター(Stratagene, Inc.、La Jolla、CA)のマルチクローニングサイトに挿入し、大腸菌(E. coli)内で増殖させることができる。アンピシリンを含有するアガロース培地で培養後、シングルコロニーを選択し、配列決定のために増殖することができる。ヘルパーファージを重感染させることによってゲノムDNA挿入物の1本鎖DNAコピーをレスキューすることができる。プロテイナーゼK：ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)の溶液中で消化後、DNAをフェノール抽出し、次いで酢酸ナトリウム(pH 6.5、約0.3 M)および0.8容量の2-プロパノールを添加して沈殿させることができる。DNAを含有するペレットを、Tris-EDTA緩衝液中で再懸濁させて、使用時まで-20℃で保存することができる。
ゲノムDNA挿入物に隣接して位置する、既知のpBluescript(登録商標)配列に相補的なM13順方向プライマーは、Midland Certified Reagent Company(Midland、TX)から購入することができる。プライマーは、オリゴヌクレオチドの5'末端に結合するビオチン部分を含有するように共有結合により修飾することができる。ビオチン基は、(CH2)6スペーサーを介してプライマーの5'-リン酸に共有結合することができる。ビオチン-標識したプライマーは、pBluescript(登録商標)ベクターから作製したssDNA鋳型分子へのハイブリダイゼーションが可能である。プライマー-鋳型複合体は、Dorreら(Bioimaging 5: 139-152, 1997)によりストレプトアビジンコーティングしたビーズに結合することができる。適当なDNA希釈において、1つのプライマー-鋳型複合体は1つのビーズに結合する。1つのプライマー-鋳型複合体を含有するビーズを配列決定装置1500の反応チャンバー1501に挿入することができる。
プライマー-鋳型は修飾したT7 DNAポリメラーゼ(United States Biochemical Corp.、Cleveland、OH)と共にインキュベーションすることができる。反応混合物は、未標識デオキシアデノシン-5'-三リン酸(dATP)およびデオキシグアノシン-5'-三リン酸(dGTP)、ジゴキシゲニン標識デオキシウリジン-5'-三リン酸(ジゴキシゲニン-dUTP)およびローダミン標識デオキシシチジン-5'-三リン酸(ローダミン-dCTP)を含有することができる。重合反応を37℃において2時間進行させることができる。ジゴキシゲニンおよびローダミン標識核酸の合成後、鋳型鎖を標識核酸から分離し、鋳型鎖、DNAポリメラーゼおよび組込まれなかったヌクレオチドを反応チャンバー1501から洗い流すことができる。または、重合に使用する全てのデオキシヌクレオシド三リン酸は未標識であってもよい。他の代案において、相補鎖の重合を行わないで1本鎖核酸を直接配列決定することができる。
エキソヌクレアーゼ活性は、反応チャンバー1501にエキソヌクレアーゼIIIを添加することによって開始することができる。反応混合物はpH 8.0、37℃において維持することができる。ヌクレオチド1510が核酸の3'末端から放出されると、微小流体流動によって、微小流体通路1502を下方に移動されうる。マイクロ通路1503の入り口において、1対の電極1504、1505によって形成されている電位の傾きを使用して、ヌクレオチド1510を微小流体通路1502からマイクロ通路1503内に誘導することができる。ヌクレオチド1510がナノ粒子1511を通過すると、または共鳴チャンバー内に入ると、レーザー1506からの励起放射線に暴露することができる。以下に開示するように、ラマン放射スペクトルをラマン検出器1507によって検出することができる。
ヌクレオチドのラマン検出
実施例2に開示するラマン検出装置を使用することができる。ラマン検出器1507は、検出器1507を通過して移動するdATP、dGTP、ローダミン-dCTPおよびジゴキシゲニン-dUTPのシングルヌクレオチド1510を検出し、同定することができる。標識ヌクレオチド検出の時間経過のデータを蓄積して分析し、核酸の配列を得ることができる。別の態様において、検出器1507は1つの未標識ヌクレオチドを検出し、同定することができる。
実施例2：ヌクレオチドのラマン検出
方法と装置
限定するものではない例において、ラマン検出装置の励起ビームは、近赤外波長(750〜950 nm)のチタン：サファイアレーザー(CoherentによるMira)または785 nmもしくは830 nmのガリウムアルミニウムヒ素ダイオードレーザー(Process InstrumentsによるPI-ECLシリーズ)によって発生させた。パルスレーザービームまたは連続ビームを使用した。励起ビームはダイクロイックミラー(Kaiser OpticalによるホログラフィックノッチフィルターまたはChromaもしくはOmega Opticalによる二色性干渉フィルター)を介して透過されて、回収されるビームと共線幾何学を形成することができる。透過したビームは顕微鏡対物(Nikon LUシリーズ)を通過し、ラマンアクティブな基板または標的分析物(ヌクレオチドまたはプリンもしくはピリミジン塩基)が位置する共鳴チャンバーに集束した。
分析物からのラマン散乱光線は同じ顕微鏡対物によって収集され、ダイクロイックミラーを通過してラマン検出器に達した。ラマン検出器は、集束レンズ、スペクトログラフおよびアレイ検出器を備えた。集束レンズは、スペクトログラフの入射スリットを介してラマン散乱光線を集束した。スペクトログラフ(Acton Research)は、波長によって光線を分散させるグレーティングを備えた。分散された光線はアレイ検出器 (RoperScientificによる背面照射型で、厚い空乏型のCCDカメラ) に画像を形成した。アレイ検出器は、データ転送および検出器機能の制御のためにコンピュータに接続されているコントローラ回路に接続した。
表面増強ラマン分光法(SERS)では、ラマンアクティブ基板は金属をコーティングしたナノ構造物からなった。LeeおよびMeisel(J. Phys. Chem., 86: 3391, 1982)の方法によってサイズが5〜200 nmの範囲の銀ナノ粒子を製造した。または、試料を金属ナノ粒子と混合して、顕微鏡対物の下方のアルミニウム基板に置いた。以下の考察はアルミニウム基板上の固定試料を想定している。検出される分子数は照射した試料の光学的なコレクションボリュームおよび照射した試料の平均濃度によって決定された。
シングルヌクレオチドも、マイクロ流体通路を使用してSERSによって検出することができる。本発明の種々の態様において、マイクロ流体通路(幅約5〜200μm)を介してヌクレオチドをラマンアクティブ基板に送達することができる。微小流体通路は、Andersonら(「Fabrication of topologically complex three-dimensional microfluidic systems in PDMS by rapid prototyping」、Anal. Chem. 72: 3158-3164, 2000)に開示されている技法を使用して、ポリジメチルシロキサン(PDMS)を成形することによって製造することができる。銀ナノ粒子の存在下においてSERSを実施する場合には、ヌクレオチド、プリンまたはピリミジン分析物をLiCl(最終濃度90μM)およびナノ粒子(最終濃度0.25 Mの銀原子)と混合した。室温の分析物溶液を使用してSERSデータを収集した。
結果
上記に開示するシステムを使用して、ヌクレオシド一リン酸、プリンおよびピリミジンをSERSによって分析した。表1は、関心対象の種々の分析物の例示的な検出限界を示す。
（表１）ヌクレオシド一リン酸、プリンおよびピリミジンのSERS検出
Figure 0004947900
条件はアデニンヌクレオチドのみに最適化した。LiCL(最終濃度90μM)は、アデニンヌクレオチドの最適なSERS検出を提供することが測定された。他のヌクレオチドの検出は、NaCl、KCl、RbClまたはCsClなどの他のアルカリ金属のハロゲン化物塩を使用することによって促進することができる。特許請求の範囲に記載されている方法は使用した電解質溶液に限定されず、MgCl2、CaCl2、NaF、KBr、LiI等などの他の種類の電解質溶液も有用となりうることが考慮される。強いラマン信号を示さない電解質溶液はヌクレオチドのSERS検出ではわずかな干渉しか提供しないことを当業者は理解している。上記に開示されているラマン検出システムおよび方法は1分子のヌクレオチドおよびプリン塩基を検出し、同定することができたことを結果は実証している。これは、シングルヌクレオチドレベルにおける未標識ヌクレオチドのラマン検出を実証している。
実施例3. ヌクレオチド、プリンおよびピリミジンのラマン放射スペクトル
実施例2のプロトコールを、示した改良を加えて使用して関心対象の種々の分析物のラマン放射スペクトルを得た。図16は、表面増強が存在せず、ラマン標識を使用しない場合の4つのヌクレオシド一リン酸の各々の100 mM溶液のラマン放射スペクトルを示す。LiClは溶液に添加しなかった。10秒のデータ収集時間を使用した。低濃度のヌクレオチドは、収集時間を長くし、表面増強を用い、標識ヌクレオチドを使用するかおよび／または電解質溶液を添加して検出することができる。励起は514 nmにおいて生じた。以下の図の各々は、785 nmの励起波長を使用した。図16に示すように、未増強ラマンスペクトルは、4つの未標識ヌクレオシド一リン酸の各々の特徴的な放射ピークを示した。
図17は、LiClおよび銀ナノ粒子が存在する場合の1 nmのグアニン溶液のSERSスペクトルを示す。グアニンは、Nucleic Acid Chemistry、パート1、L. B. TownsendおよびR. S. Tipson(編)、Wiley-Interscience、New York、1978、に考察されているように、酸処理によってdGMPから得た。SERSスペクトルは、100ミリ秒のデータ収集時間を使用して得た。
図18は、酸加水分解によってdCMPから得た10 nMのシトシン溶液のSERSスペクトルを示す。1秒の収集時間を使用してデータを収集した。
図19は、dTMPの酸加水分解によって得た100 nMのチミン溶液のSERSスペクトルを示す。100ミリ秒の収集時間を使用してデータを収集した。
図20は、dAMPの酸加水分解によって得た100 pMのアデニン溶液のSERSスペクトルを示す、データは1秒で収集した。
図21は、dATP(下のトレース)およびフルオレセイン標識dATP(上のトレース)の500 nM溶液のSERSスペクトルを示す。dATP-フルオレセインは、Roche Applied Science(Indianapolis、IN)から購入した。図は、フルオレセイン標識によるSERS信号の強力な増加を示す。
実施例4：1分子の共鳴増強ラマン検出
共鳴チャンバー内の1分子から発生されるラマン散乱光線のエネルギーは、種々の既知の放射線検出装置によって検出することができることをこの実施例は実証している。結果は、Natick、MassachusettsのThe MathWorks, Inc.製のMATLAB(登録商標)を使用して本発明者らが実施したシミュレーションに基づいている。
図22は、本発明の一態様により、光学的共鳴チャンバー内にそれぞれ含まれる1分子(曲線AおよびB)または共鳴増強のない自由空間に位置づけた1分子(曲線C)から発生されるラマン散乱光線のエネルギーを比較するプロットを示す。ジュール単位のエネルギーは、x軸に秒を単位としてプロットした時間に対して、y軸にプロットした。
曲線AおよびBは、光学的共鳴チャンバー内に保存されたラマン散乱光線のエネルギーを時間の関数としてプロットした。両方の曲線について、光学的共鳴チャンバーは、さらに大きい共鳴増強および検出のためのさらに強力な信号を提供するために、励起光線およびラマン散乱光線を共鳴することができる。シミュレーションは、励起光線およびラマン散乱光線の空洞線質係数を約106と想定した。さらに高い空洞線質係数が既知である。例えば、約109の空洞係数がSpillaneら、Nature、415:621-623(2002)によって報告されている。シミュレーションは、ラマン散乱断面積を約10-29cm2と想定した。励起光線は1Wの連続波として提供した。時間ステップは100ナノ秒であった。
曲線AおよびBを作製するために、広く異なるラマン利得係数を有する異なる仮想的な分子を使用した。ラマン利得係数は、本質的に、誘導ラマン放射を発生する分子の可能性を定量する。曲線Aは、シリコンに典型的である、約20×10-8 cm/Wの比較的高いラマン利得係数を有する分子に基づいている。曲線Bは、ラマン利得係数がゼロの分子に基づいている。従って、曲線AおよびBは、それぞれ、核酸誘導体を含むほとんどの分子の誘導ラマン挙動の上限付近および下限付近を提供する。所定の期間に発生される累積的なラマン散乱光線のエネルギーを曲線Cにプロットする。曲線Cでは共鳴増強はない。
示すように、共鳴チャンバー内の1分子から発生されるラマン散乱光線のエネルギーは、自由空間(共鳴増強がない)に位置づけられた分子のエネルギーよりかなり大きい。誘導ラマンプロセスが誘導されるとき(曲線A)、最も大きいエネルギーが観察された。誘導ラマン(曲線A)のエネルギーは、共鳴を伴わないエネルギー(曲線C)と比較して約8桁大きかった。誘導ラマンプロセスが誘導されない場合でも、共鳴された自然ラマンプロセス(曲線B)のエネルギーは、共鳴を伴わない(曲線C)エネルギーと比較して約6桁大きかった。検出に利用可能なエネルギーのこのような増強は極めて重要である。
10-20 Jの破線は、種々の市販の高品質放射線検出装置の典型的な検出レベルを示す。アバランシェフォトダイオード、光電子増倍管および強化電荷結合素子は、典型的には、少なくともこのような感度を有する。曲線AおよびBにおいて光学的共鳴チャンバー内で発生されるラマン散乱光線は、約100ミリ秒以内で示した検出レベルを超える。一方、光学的共鳴を伴わない(曲線C)の自由空間の分子からのラマン散乱光線のエネルギーは、1秒を超えても検出レベル未満のままである。従って、これらのシミュレーションによって実証するように、共鳴チャンバー内の1分子から発生されるラマン散乱光線のエネルギーは、種々の既知の放射線検出装置によって検出することができる。重要なことに、これは、自然ラマン(曲線B)および誘導ラマン(曲線A)の両方に当てはまる。
実施例5: 多数の分子の共鳴増強ラマン検出
この有望な実施例は、1つだけの分子の代わりに複数の分子を使用することによって実施例4に報告するものよりはるかに大きい検出エネルギーを達成する方法を実証する。この方法では、複数の分子を共鳴チャンバーに導入することができる。例えば、少なくとも100または少なくとも1000の分子を共鳴チャンバーに導入する。一局面において、望ましい放射線検出装置を用いて、特定の種類の分子の検出を可能にするのに十分な分子を導入することができる。同定の助けとするために、分子の大部分または圧倒的多数が同じ種類であるように含ませることが適当である場合もある。
総検出エネルギーは、一般に、共鳴チャンバー内の分子を追加するごとに増加する。従って、分子を追加するごとに、共鳴チャネルチャンバー内のラマン散乱光線の総エネルギーはさらに増加されるはずである。しばしば、共鳴チャンバー内で発生されるラマン散乱光線の総エネルギーは、最初は、少数の分子では実質的に直線的に増加し、次いで大多数の分子ではさらに劇的に(非直線的に)増加する。この方法では、複数の分子を使用してより強力なラマン放射信号を提供することができる。
従って、分光分析チャンバーおよびそのようなチャンバー内で試料を分析する方法が開示されている。本発明はいくつかの態様に関して記載されているが、本発明は記載されている態様に限定されるのではなく、特許請求の範囲の精神および範囲内で改良および変更を加えて実施することができることを当業者は理解している。サイズ、材料、形状、形態、機能ならびに操作、組み立ておよび使用方法の変更を含む、本発明の一部の最適な寸法的な関係は当業者に容易に理解されると思われ、図面に例示され、本明細書に記載されているものとの等価な関連物全てが本発明に含まれることが意図されていることが理解されるべきである。従って、本明細書は限定するものではなく、例示的であると考えられるべきである。
本発明の態様による、共鳴増強分光分析に基づいて試料を同定するための方法を示す。 本発明の態様による、流体通路にチャンバーを含む分光分析システムの断面図を示す。 Rayleigh、ストークスおよび反ストークス放射線を示す。 本発明の態様による、4つのDNAヌクレオチドの希釈水溶液のストークスラマンスペクトルを示す。 本発明の態様による、流体通路に接続されている回転楕円チャンバーを含む分光分析システムの断面図を示す。 本発明の態様による、流体通路に接続されている回転楕円チャンバーの別の断面図を示す。 本発明の態様による、図6に示すチャンバーの切断線7A-7Aの上側の図を示す。 本発明の態様による、図6に示すチャンバーの切断線7B-7Bの下側の図を示す。 本発明の態様による、散乱放射線と同じ周波数を有する位置あわせした周波数に適合したシード放射線の形態の励起放射線と、散乱放射線と異なる周波数を有する横方向の周波数に適合していない放射線を収容するように構成されている分光分析チャンバーの平面図を示す。 本発明による、試料を分析するために使用するコヒーレントラマンおよび反ストークスラマン分光方法のエネルギーレベルダイアグラムを示す。 本発明の態様による、コヒーレント反ストークスラマン分光法を実施するためのクロス-ビーム構成を示す。 本発明の態様による、図10に示すものと同様のクロス-ビーム構成のための運動量保存を示す。 本発明の態様によるコヒーレント反ストークスラマン分光法を実施するための前方散乱構成を示す。 本発明の態様による、コヒーレント反ストークスラマン分光法を実施するための後方散乱構成を示す。 本発明の態様を実施することができる核酸配列決定システムを示す。 表面増感ラマン分光法(SERS)、表面増感共鳴ラマン分光法(SERRS)、共鳴増強ラマン分光法(例えば、誘導ラマン分光法)および／またはコヒーレント反ストークスラマン分光法(CARS)検出のための例示的な装置および方法を示す。 100ミリ秒のデータ収集時間を使用した、100 mM濃度の4つ全てのデオキシヌクレオシド一リン酸(dNTP)のラマンスペクトルを示す。 Nucleic Acid Chemistry、パート1、L. B. TownsendおよびR. S. Tipson(編)、Wiley-Interscience、New York、1978、による核酸処理によってdGMPから得られる1 nMグアニンのSERS検出を示す。 100 nMシトシンのSERS検出を示す。 100 nMチミンのSERS検出を示す。 核酸処理によってdAMPから得られる、100 pMアデニンのSERS検出を示す。 フルオレセインで共有結合により標識したデオキシアデニン三リン酸(上のトレース)および未標識のdATP(下のトレース)の500 nM溶液のSERSスペクトルの比較を示す。 本発明により、光学的共鳴チャンバー内にそれぞれ含まれる(曲線AおよびB)または共鳴増強を行わない自由空間に位置づけれられている(曲線C)1つの分子から発生されるラマン散乱光線のエネルギーを比較するプロットを示す。

Claims (7)

  1. 以下の段階を含む、試料における複数の関心対象の分子のアイデンティティーを決定する方法；
    少なくとも２つの知られた関心対象の分子に対してストークスラマンシフトを決定する段階；
    共鳴チャンバー内の試料を励起する段階であって、該チャンバーは、リフレクタおよび部分反射リフレクタを含み、少なくとも２つの光線源を有し、
    該少なくとも２つの光線源が２つの方向に照射され、シード放射線が第一の方向を向き、横方向放射線が第２の方向を向き、第１の方向は第２の方向と垂直であり、該横方向放射線は共鳴の方向に対して垂直であり、前記シード放射線および横方向放射線は異なる周波数を有し、該シード放射線が非弾性散乱放射線と同じ周波数であり、
    レフレクタの間の所定の距離が、前記少なくとも２つの知られた関心対象の分子のラマンスペクトルの顕著なピークに対応する波長の加重平均であって、該所定の距離が、チャンバー内で共鳴される放射線の波長の半分の倍数である距離であり、
    それにより選択的に試料から非弾性的に放射線を散乱させる段階；
    非弾性散乱放射線の強度を増幅するために、リフレクタおよび部分反射リフレクタの間の非弾性散乱放射線を共鳴させる段階；
    チャンバーから増幅された非弾性散乱放射線を透過させる段階；
    透過した増幅された非弾性散乱放射線を検出する段階；および
    検出された、透過した増幅された非弾性散乱放射線が、関心対象の少なくとも２つの知られた分子のうちの一つに対応するかどうかを決定する段階。
  2. 前記分離した、透過した増幅された非弾性散乱放射線を検出する段階が、シード放射線の強度に対するゲインを検出する段階を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記二種類のリフレクタは、共鳴チャンバー内において互いに向かい合って平行に備えられ、共通の光学軸を中心とする、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記二種類のリフレクタが、誘電性多層膜ミラーである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
  5. 前記誘電性多層膜ミラーが、前記少なくとも２つの関心対象の分子の分離した非弾性散乱放射線の波長に基づく厚さを有する層を含む、請求項４に記載の方法。
  6. 前記分離した非弾性散乱放射線を透過させる段階が、部分反射リフレクタのアウトレットウィンドウを通して、分離した増幅された非弾性散乱放射線を透過する段階を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
  7. 前記共鳴チャンバーが、チャンバー内に放射線を透過させ、チャンバーから分離した増幅した非弾性散乱放射線を透過させるための、少なくとも一つのウィンドウを含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
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