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Die Erfindung betrifft ein Substrat und ein Verfahren zum Verwenden eines solchen Substrats. Das beschriebene Substrat dient insbesondere zum Einsatz in einer Analysekartusche.
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Stand der Technik
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Eine Analysekartusche ist dazu vorgesehen, einen biochemischen Prozess in einer typischerweise nur einmal verwendbaren Einheit durchzuführen. Hierzu wird die Analysekartusche mit einer Probe bestückt und in ein Analysegerät eingelegt. In dem Analysegerät wird der Prozess gesteuert und ausgewertet. Nach Abschluss des Prozesses wird die Kartusche aus dem Analysegerät entfernt. Die hierin vorgestellte Analysekartusche wird insbesondere im Rahmen eines sogenannten Lab-on-Chip-Systems eingesetzt.
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Ein Lab-on-Chip-System bezeichnet ein mikrofluidisches System, das die gesamte Funktionalität eines makroskopischen Labors auf einem nur plastikkartengroßen Kunststoffsubstrat unterbringt. Mit dieser Technologie lassen sich geringste Mengen einer Flüssigkeit auf einem einzigen Chip vollständig und automatisch analysieren. Der Transport der Proben zwischen den verschiedenen Reaktions- und Analysekammern findet mithilfe von Kapillarkräften oder besonders bevorzugt durch aktives Pumpen statt. Aktives Pumpen wird durch elastische Membranen ermöglicht, die durch Beaufschlagung mit mechanischen Kräften oder Drücken wiederum Ventilfunktionen und Pumpfunktionen bereitstellen können. Die vorgestellte Kartusche, die auch als Microarray-Chip bezeichnet werden kann, ist eine wesentliche Komponente eines solchen Lab-on-Chip-Systems.
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Offenbarung der Erfindung
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Vor diesem Hintergrund werden ein Substrat nach Anspruch 1 und ein Verfahren gemäß Anspruch 11 vorgestellt. Ausführungsformen ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen und aus der Beschreibung.
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Das vorgestellte Substrat kann bspw. in einer Analysekartusche angeordnet sein und ist dazu eingerichtet, zumindest abschnittsweise mit einem Anregungsstrahl beleuchtet zu werden. Das Substrat weist weiterhin eine Vielzahl von Aufnahmebereichen auf, die zur Aufnahme von Proben, die zur analysieren sind, dienen. Typischerweise fluoreszieren die Proben durch den Anregungsstarhl angeregt und emittieren eine Strahlung bzw. Fluoreszenzstrahlung, die von einem Detektionssystem erfasst und ausgewertet wird, um die Probe bzw. die Proben zu analysieren.
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An einer dem Anregungsstrahl zugewandten Oberfläche des Substrats ist zusätzlich mindestens ein modifizierter Bereich vorgesehen, der ebenfalls zumindest abschnittsweise von dem Anregungsstrahl zu beleuchten ist, wobei der mindestens eine modifizierte Bereich ausgebildet ist, auf den einfallenden Anregungsstrahl Licht für eine indirekte Beleuchtung eines weiteren Bereichs des Substrats auszusenden. Auf eine Anregung des modifizierten Bereichs durch den Anregungsstrahl hin emittiert der modifizierte Bereich Licht für eine indirekte Beleuchtung eines weiteren Bereichs des Substrats. Dies erfolgt bspw. entweder über eine Reflexion oder eine Fluoreszenz.
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Der genannte weitere Bereich kann sich auf der dem Anregungsstrahl zugewandten Seite bzw. der dem Anregungsstrahl zugewandten Oberfläche des Substrats befinden.
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Das Substrat, das hier gesondert betrachtet wird, kann bspw. von festen und/oder flüssigen Materialien mit Brechzahl größer 1 eingeschlossen sein, die durch eine planare Oberfläche parallel zur Oberfläche des Substrats gegenüber der Umgebungsluft abgegrenzt sind. So kann das Substrat bspw. in einer Analysekartusche aufgenommen sein. Ein Analysekartusche mit einem solchen Substrat wird hierin ebenfalls vorgestellt.
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Es wird somit hierin eine insbesondere ein Substart für eine mikrofluidische Analysekartusche und ein Verfahren zum Verwenden eines solchen Substrats vorgestellt. Dabei wird dargelegt, wie durch geeignete Merkmale des Substrats die Lichtstreuung in einem beleuchteten Bereich so zu verstärken oder dort auftreffendes Licht gezielt in vorteilhafte Richtungen umzulenken ist, so dass die vorstehend beschriebene indirekte Beleuchtung durch Strahlen maximiert wird. In einer Ausführungsform ist hierzu eine lokal begrenzte Fläche auf dem Substrat vorgesehen, die eine starke Lichtstreuung aufweist und eine indirekte Beleuchtung generiert.
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Ein Vorteil dieser indirekten Beleuchtung ist, dass ihre Form, Ausdehnung und Position unabhängig von der genauen Form, Ausdehnung und Position der direkten Beleuchtung sind, so lange nur die besagte Fläche voll ausgeleuchtet ist. Insbesondere erlaubt diese die zuverlässige Beleuchtung einer größeren Fläche als das direkte Anregungslicht vor allem, wenn man dessen Positionsunsicherheit berücksichtigt.
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Mit dem hierin verwendeten Begriff Assay wird allgemein eine Untersuchungsprozedur im Sinne einer Abfolge von Einzelreaktionen zum Nachweis bestimmter Substanzen bezeichnet.
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Weitere Vorteile und Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus der Beschreibung und den beigefügten Zeichnungen.
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Es versteht sich, dass die voranstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
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Figurenliste
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- 1 zeigt in schematischer Darstellung den relevanten Teil, insbesondere die Probenkammer mit dem darin liegenden Substrat, einer Analysekartusche nach dem Stand der Technik.
- 2 zeigt eine Ausführung eines Substrats in einer Draufsicht.
- 3 zeigt in schematischer Darstellung eine Ausführung einer Kartusche.
- 4 zeigt ein Substrat, das in einer Kartusche der hierin vorgestellten Art eingesetzt wird.
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Ausführungsformen der Erfindung
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Die Erfindung ist anhand von Ausführungsformen in den Zeichnungen schematisch dargestellt und wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Zeichnungen ausführlich beschrieben.
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1 zeigt eine Analysekartusche, die insgesamt mit der Bezugsziffer 10 bezeichnet ist. Die Darstellung zeigt ein Substrat 12, eine Probenkammer 14 und ein transparentes Fenster 16.
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Das Substrat 12 weist Aufnahmebereiche 20 auf, die zur Aufnahme von Proben, die fluoreszierende Eigenschaften haben, vorgesehen sind. Diese Proben absorbieren also Licht eines Wellenlängenbereichs λ1 und strahlen daraufhin Licht eines anderen Wellenlängenbereichs λ2, wobei gilt λ2 > λ1, ab. Es sind zahlreiche Beispiele bekannt, bei denen in solchen Anordnungen Fluorophore genutzt werden, um bestimmte Moleküle, bspw. DNA-Fragmente, nachzuweisen, wobei jeder der genannten Bereiche anders funktionalisiert und ggf. auch mit verschiedenen Fluorophoren markiert ist.
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Bei der hier gezeigten Ausführung besteht das Substrat 12 aus Silizium und die genannten Aufnahmebereiche 20 sind Vertiefungen mit 100 bis 300 µm Durchmesser und 100 bis 300 µm Tiefe, die mit einer wässrigen Probelösung zu befüllen und mit einer darüberliegenden Ölschicht zu versiegeln sind. In den einzelnen Vertiefungen laufen individuelle PCR (Polymerase Chain Reaction, Polymerase-Kettenreaktion) oder verwandte Prozesse ab, deren Verlauf oder Endzustand mit jeweils einem oder mehreren Fluoreszenzmarkern verfolgt werden kann.
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Im Allgemeinen kann das Substrat 12 aber aus fast jedem beliebigen Material bestehen. Die Aufnahmebereiche 20 können eine beliebige geometrische Form und Anordnung haben und sich entweder vom übrigen Substrat 12 durch geometrische Abweichungen, wie bspw. Plateaus oder Vertiefungen, unterscheiden oder sich lediglich durch eine lokale Beschichtung auszeichnen.
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Das Substrat 12 befindet sich in der Probenkammer 14, die mit einer Flüssigkeit 22 befüllt ist. Diese Flüssigkeit 22 enthält eine Probe oder besteht aus einer Probe, die mittels des Substrats 12 untersucht werden soll. Bei der gezeigten Ausführung besteht die Flüssigkeit 22, die auch als Probenflüssigkeit bezeichnet wird, aus einer wässrigen Lösung in den genannten Vertiefungen. Darüber geschichtet befindet sich ein Öl 24 in der Probenkammer 14, das einen Stoffaustausch zwischen den Vertiefungen unterbindet.
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Die Beleuchtung und Betrachtung des Substrats 12 ist durch das insbesondere planare, transparentes Fenster 16 möglich, wobei das Fenster 16 die Probenkammer 14 begrenzt. Bei der gezeigten Ausführung handelt es sich um eine 0,5 bis 1 Millimeter dicke Polycarbonat-Schicht. Diese gehört zu der im Spritzguss gefertigten Oberseite der Kartusche 10.
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Das Substrat 12 wird durch die Scheibe 16 und Probenkammer 14 hindurch mit Anregungslicht, das durch ein Strahlenbündel 30 repäsentiert ist, beleuchtet, wobei die Beleuchtung aufgrund des Strahlprofils auf bestimmte Bereiche 32 der Substratoberfläche begrenzt ist. Andere Bereiche 34 werden nicht bzw. nicht direkt beleuchtet. In dem speziellen Fall wird ein kreisrunder Fleck mit ca. 5 Millimetern Durchmesser beleuchtet. Das Strahlenbündel 30 trifft, wie dargestellt wird, unter 45 Grad auf. Angedeutet ist die Brechung der Strahlen beim Eintritt in die Polycarbonat-Schicht der Kartusche 10.
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Wird ein Aufnahmebereich 20, der mit der fluoreszierenden Probe versehen ist, von dem Anregungslicht getroffen, so emittiert diese Fluoreszenzstrahlung 36 im Wellenlängenbereich λ2, die zumindest anteilig durch das Fenster 16 zu einem hier nicht näher ausgeführten Detektionssystem gelangt. In der gezeigten Ausführung ist eine Digitalkamera mit Bandpassfilter als Teil des Detektionssystems auf die Analysekartusche 10 gerichtet.
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Bei dem in 1 skizzierten Konzept sind die Aufnahmebereiche 20 auf dem Substrat 12 angeordnet. Dieses Substrat 12 ist in der Analysekartusche 10 angeordnet, typischerweise eine Einwegkomponente aus Kunststoff, die wiederum durch eine geeignete Mechanik in das Analysegerät eingezogen und unter einer dort vorhandenen Optik platziert wird. Es ist offensichtlich, dass die genaue Position eines beleuchteten Bereichs auf dem Substrat 12 unvorhersehbaren Abweichungen unterliegt. Dies ist bedingt durch Fertigungstoleranzen, mechanischen Verschleiß und Temperaturausdehnung. Hinzu kommt noch eine mögliche Dejustage der Optik oder unbemerkte Deformationen durch Stöße oder unsachgemäße Lagerung. Die resultierende Gesamttoleranz muss bei Auslegung der Aufnahmebereiche 20 einkalkuliert werden, es gibt also nur einen verhältnismäßig kleinen Kernbereich des Substrats 12, der in jedem Fall beleuchtet wird.
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2 zeigt ein Substrat 50 entsprechend dem Substrat 12 aus 1, das in diesem Fall 6*6 mm groß ist und 250 µm große Aufnahmebereiche 52 mit 350 µm Periode angeordnet sind. Ein 5 mm durchmessender Beleuchtungsfleck 54 weist eine Fläche auf, die ausreichend ist, um ca. 158 Aufnahmebereiche 52 anzuregen. Dieser trifft das Substrat 50 aber nur mit einer gewissen Toleranz. Wird diese mit berücksichtigt, so bleibt nur ein deutlich kleinerer Kernbereich 56, der in jedem Fall beleuchtet wird, in diesem Fall nur die 37 Aufnahmebereiche 52 innerhalb des Kernbereichs 56. Es ist also nur für eine verhältnismäßig kleine Anzahl an Aufnahmebereichen eine Beleuchtung sichergestellt.
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Ein weiterer Nachteil ist die fehlende Flexibilität hinsichtlich der Substratauslegung. Die Größe des beleuchteten Bereichs ist durch die Optik und damit das Analysegerät gegeben, das einen sehr viel längeren Produktzyklus als die Kartusche hat. Sofern sich die Optik nicht automatisiert regulieren lässt, was den technischen Aufwand deutlich erhöhen würde, muss jede neue Kartusche mit dem gegebenen Beleuchtungsfleck 54 auskommen.
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In der Praxis wird bei Beleuchtung des Substrats 50 mit Anregungslicht immer auch eine Lichtstreuung auftreten. Diese entsteht jedoch innerhalb eines Mediums mit Brechzahl >1 und kann in der Kartusche wie in einem Lichtleiter eingeschlossen werden.
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3 zeigt eine Ausführung der hierin vorgestellten Analysekartusche, die insgesamt mit der Bezugsziffer 100 bezeichnet ist. Die Darstellung zeigt ein Substrat 112, eine Probenkammer 114 und ein transparentes Fenster 116.
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Wie in 3 skizziert ist, können für an dem Substrat 112 durch einen Anregungsstrahl 130 an einer dem Anregungsstrahl 130 zugewandten Oberfläche 146 des Substrats 112 entstehendes Streulicht drei Fälle unterschieden werden, die durch repräsentative Strahlen 132, 134, 136 dargestellt sind:
- Nur ein vergleichsweise kleiner Anteil, der Strahl 132, der nahezu senkrecht zu dem Fenster 116 bzw. Sichtfenster aus der Analysekartusche 100 tritt, kann trotz Ablenkung gemäß Snell-Gesetz in die Detektionsvorrichtung gelangen. Dieser Anteil bzw. Strahl 132 wird dort durch geeignete Bandpass- oder Kantenfilter vom Fluoreszenzlicht getrennt.
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Das Snell Gesetz besagt:
Streulichtstrahlen, wie bspw. der Strahl
134, die einen größeren Winkel zur Grenzflächennormale aufweisen, werden bei Verlassen des Fensters
116 umso mehr von der Normalen weggebrochen. Je nach Abstand und Apertur der Detektionsoptik gelangen diese nicht mehr zum Detektionssystem. In diese Kategorie fallen übrigens auch direkte Reflexionen an einem blanken Substrat. Dies bedeutet, dass der Einfallswinkel gleich dem Ausfallswinkel ist, vorausgesetzt, das Substrat
112 ist parallel zu dem Fenster
116 angeordnet.
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Streulichtstrahlen, dargestellt durch den Strahl 136, deren Winkel zur Fensternormalen den Grenzwinkel für Totalreflexion überschreiten, können die Kartusche 100 nicht verlassen und werden an der Oberfläche des Fensters 116 zurück in Richtung Substrat 100 reflektiert. Dieses Licht kann nun indirekt beleuchtete Bereiche 140 auf dem Substrat 112 erreichen, die von dem Anregungslicht bzw. dem Anregungsstrahl 130 nicht direkt beleuchtet werden.
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Es werden dabei und im Folgenden die Brechzahldifferenz zwischen Flüssigkeit in der Probenkammer 114 und dem Material des Fensters 116 und damit die Brechung und Fresnel-Reflexe an der betreffenden Grenzfläche vernachlässigt.
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Es ist nunmehr vorgesehen, durch geeignete Merkmale des Substrats 112 die Lichtstreuung in einem direkt beleuchteten Bereich 142 so zu verstärken oder dort auftreffendes Licht gezielt in vorteilhafte Richtungen umzulenken, so dass die vorstehend beschriebene indirekte Beleuchtung durch Strahlen, wie bspw. den Strahl 136, maximiert wird.
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Hierzu ist in einer ersten Ausführung eine lokal begrenzte Fläche auf dem Substrat 112 vorgesehen, die eine starke Lichtstreuung bewirkt und auf diese Weise eine indirekte Beleuchtung erzeugt.
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Ein besonderer Vorteil dieser indirekten Beleuchtung ist, dass ihre Form, Ausdehnung und Position unabhängig von der genauen Form, Ausdehnung und Position der direkten Beleuchtung sind, so lange nur die besagte Fläche voll ausgeleuchtet ist. Insbesondere erlaubt sie die zuverlässige Beleuchtung einer größeren Fläche als das direkte Anregungslicht, vor allem, wenn man dessen Positionsunsicherheit berücksichtigt.
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2 stellt die Aufsicht auf ein Substrat 50 mit Aufnahmebereichen 52 dar. Der durch das Anregungslicht beleuchtete Bereich, der Beleuchtungsfleck 54, ist durch einen Kreis markiert. Wie diskutiert wurde, unterliegen die genaue Lage und Ausdehnung dieses Beleuchtungsflecks 54 einer Unsicherheit, unter deren Berücksichtigung nur ein Teilbereich, der Kernbereich 56, des Substrats 50 mit Sicherheit beleuchtet wird.
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4 zeigt ein Substrat 150, das in einer Analysekartusche der hierin vorgestellten Art zum Einsatz kommt. Das dargestellte Substrat 150 weist nun mindestens einen modifizierten Bereich 152 auf, der mit einer diffus reflektierenden Oberfläche ausgestattet ist. Im einfachsten Fall handelt es sich um weiße Farbe, bspw. auf Basis von Titandioxid-Partikeln.
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Das dort auftreffende Licht wird in alle Richtungen gestreut und zu einem Großteil nach den Gesetzen der Totalreflexion zurück auf das Substrat 150 gelenkt. Dieser Effekt führt zu einer indirekten Bestrahlung des Substrats 150, deren Form und Ausdehnung von der genauen Ausgestaltung des modifizierten Bereichs 152 abhängt. Es ergibt sich somit ein indirekt beleuchteter Bereich 154 auf dem Substrat 150. Dieser indirekt beleuchtete Bereich 154 ist somit ein weiterer Bereich im Sinne des Anspruchs 1, auf den Licht, das durch das auf den modifizierten Bereich 152 auftreffende Licht bewirkt bzw. ausgesendet wird, trifft. Dieser indirekt beleuchtete Bereich 154 bzw. dieser weitere Bereich ist hier auf der dem auftreffenden Licht zugewandten Seite des Substrats 150 vorgesehen, dies ist aber nicht in jedem Fall erforderlich.
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Maßgeblich ist hierbei der kritische Winkel für das Medium, in dem das Streulicht entsteht. Für Polycarbonat mit n = 1,58 liegt der kritische Winkel bei arcsin(1/1,58) = 39,3°, zur Grenzflächennormalen hin gemessen. Sphärisch aufintegriert bedeutet das bei isotroper Lichtstreuung, dass 77% des Streulichts in der Kartusche bleiben.
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Als besonderer Vorteil ist an dieser Stelle zu betonen: Sofern der modifizierte Bereich 152, der diffus streuend wirkt, vollständig beleuchtet wird, ist der indirekt beleuchtete Bereich 154 unabhängig von der genauen Position des Beleuchtungsflecks bzw. des direkt beleuchteten Bereichs (Bezugsziffer 142 in 3). Dessen vorstehend erwähnte Positionsunsicherheit, die den effektiven verlässlichen Beleuchtungsbereich so stark einschränkt, ist nun aufgehoben.
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In 4 sind weiterhin ein Abstand d 160, ein Winkel αTIR 162, ein erster Radius r16 164 und ein zweiter Radius r17 166 bezeichnet. Aufnahmebereiche sind mit Bezugsziffer 180 bezeichnet. Diese Aufnahmebereiche dienen dazu, Proben, die fluoreszieren, aufzunehmen.
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Es generiert somit ganz allgemein, wobei ohne Beschränkung auf
4 verwiesen wird, ein in diesem Fall kreisförmiger modifizierter Bereich
152 mit Radius r
16 164 einen indirekt beleuchteten Bereich154, der einen ringförmigen Bereich mit einem Innenradius r
17 166 darstellt, wobei gilt:
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Der indirekt beleuchtete Bereich 154 liegt dabei konzentrisch zu dem reflektierenden, modifizierten Bereich 152. Der Winkel αTIR 162 ist dabei ein Grenzwinkel für die Totalreflexion und der Abstand d 160 die Distanz zwischen dem Substrat 112 und der Kartuschenoberfläche 170.
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Liegen N Materialschichten mit den Brechzahlen n
i und Dicken d
i vor, so ist der innere Radius:
Hierbei geht der Grenzwinkel für die Totalreflexion gegenüber Luft mit n = 1 ein, der sin
-1(1/n
i) beträgt.
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Der äußere Radius des indirekt beleuchteten Bereichs 154 ist weniger scharf definiert als der innere Radius, da er nicht nur von einem kritischen Winkel bestimmt wird und die Intensität mit dem Radius nicht sprunghaft, sondern sanfter abfällt. Bis zu welchem Radius die Intensität noch ausreichend ist, um die fluoreszierenden Bereiche anzuregen, hängt von der konkreten Anwendung ab.
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Dies wird nachstehend an einem konkreten Beispiel unter Bezugnahme auf 4 erörtert:
- Es wird ein modifizierter Bereich 152 mit 2,4 mm Durchmesser angenommen. Die Brechzahlunterschiede zwischen der Kammer und dem Fenstermaterial werden vernachlässigt und es wird angenommen, dass über dem Substrat 150 eine d = 1,7 mm dicke Materialschicht mit n = 1,58 (Polycarbonat) liegt, mit einem Grenzwinkel von αTIR = 39,3°. Der indirekt beleuchtete Bereich 154 hat dann einen Innendurchmesser von r17 = 2 * 1,7 mm * tan(39,3°) - 1,2 mm = 1,58 mm, d. h. geringfügig mehr als der modifizierte Bereich 152. Nach außen fällt die Intensität sanft ab und der äußere Radius ist stark davon abhängig, nach welchem Kriterium man seine Ausdehnung angibt. Auch davon abgesehen ist seine quantitative Vorhersage schwierig, weil auch die Intensitäten u. a. von den Streueigenschaften des modifizierten Bereichs 152 abhängen. Es ist aber davon auszugehen, dass die Intensität bis zu einem Radius von r17 + r16 in der gleichen Größenordnung wie bei r17 liegt. Mit anderen Worten, der Ring des indirekt beleuchteten Bereichs 154 sollte eine Breite von mindestens r16 haben, also etwa 1,2 mm. In diesem indirekt beleuchteten Bereich 154 liegen nunmehr nicht mehr 37 sondern 124 Aufnahmebereiche 180 vor, mit einem Durchmesser von jeweils 250 µm und einer Periode von 350 µm.
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Es ist nicht erforderlich, aber ggf. zweckmäßig, wenn der modifizierte Bereich 152 in seiner Ausdehnung mit dem in jedem Fall beleuchteten Bereich bzw. Kernbereich (Bezugsziffer 56 in 2) übereinstimmt. Ist er deutlich kleiner, so ist der indirekt beleuchtete Bereich 154 schmaler als nötig. Ist er deutlich größer, so kann man sich nicht auf seine vollständige Ausleuchtung verlassen und die Unsicherheit überträgt sich auf den indirekt beleuchteten Bereich 154. In diesem Fall würde der besondere Vorteil verlorengehen, dass der indirekt beleuchtete Bereich 154 unabhängig von der genauen Lage des Beleuchtungsflecks (Bezugsziffer 142 in 3) ist.
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In einer weiteren Ausgestaltung sind auch im modifizierten Bereich 152 Aufnahmebereiche 180 angeordnet, wobei diese überlagert oder nebeneinander mit streuenden Regionen angeordnet sein können. Die dadurch erzielte starke Lichtstreuung in diesem Bereich würde dort jedoch eine Auswertung erschweren, da eine Trennung der Wellenlängen vorgenommen werden müsste. Außerdem wäre hier angeregtes Fluoreszenzlicht deutlich stärker als im indirekt beleuchteten Bereich 154, würde aber nach denselben Mechanismen wie das Anregungslicht 130 durch Totalreflexion in die indirekt beleuchteten Bereiche 154 geleitet und das Signal dort beeinträchtigen bzw. kontaminieren.
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Eine weitere Ausführung sieht vor, anstelle einer isotrop streuenden Schicht, wie bspw. eine weiße Farbe, auf dem Substrat reflektierende Facetten zu generieren, die das einfallende Anregungslicht bzw. den einfallenden Anregungsstrahl 130 bevorzugt in die Raumrichtungen reflektieren, die zur Totalreflexion in der Kartusche geeignet sind. Hierbei ist die Einfallsrichtung des Anregungslichts bzw. Anregungsstrahls 130, einschließlich der Beugung beim Eintritt in das Fenster 116, zu berücksichtigen. Dabei ist allerdings ein höherer Fertigungsaufwand in Kauf zu nehmen. Ein Vorteil ist eine bessere Lichtausbeute, insbesondere weniger Verluste für Austrittswinkel > αTIR, und ein schärfer definierter indirekter Beleuchtungsbereich. Dieser muss nicht kreisförmig sein.
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Diffraktive Strukturen, wie bspw. Gitter und Hologramme, können ebenfalls eine Alternative zu einer statistisch streuenden Fläche sein. Diese sind jedoch wellenlängenabhängig und nur bedingt für Multiplex-Assays mit verschiedenen Anregungswellenlängen geeignet. Allerdings sind sie leichter als Facetten zu fertigen.
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Eine weitere Ausführungsform sieht vor, den modifizierten Bereich
152 durch einen fluoreszierenden Bereich auszubilden, d. h. einen Fleck aus einem fluoreszierenden Farbstoff vorzusehen. Dieser zeichnet sich dadurch aus, dass er den Anregungsstrahl
130 der Wellenlänge λ
0 absorbiert und Fluoreszenzlicht der Wellenlänge λ
1 abstrahlt. Diese Wellenlängen sind so gewählt, dass die bereits bekannten Proben in den Aufnahmebereichen
180 λ
1 aber nicht λ
0 absorbieren. Bei Anregung durch λ
1 emittieren sie eine Fluoreszenzstrahlung mit λ
2. Insgesamt gilt:
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Die Kamera des Detektionssystems sieht nur λ2 und von außen eingestrahlt wird λ0.
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Diese Ausführungsform hat alle beschriebenen Merkmale, hinzu kommt jedoch der Vorteil, dass die Beleuchtungssituation definierter wird. In der zuvor beschriebenen Ausführungsform werden die fluoreszierenden Bereiche entweder direkt vom Anregungsstrahl 130, von gestreutem Anregungsstrahl 136 oder von beidem zusammen beleuchtet. Dies macht die von der Kamera als Messgrößen erfassten Fluoreszenzintensitäten der Aufnahmebereiche 180 ggf. schwer interpretierbar. Wird auch eine indirekte Beleuchtung über ein Fluoreszenzkonzept realisiert, so gibt es nur noch den einen Anregungskanal:
- - λ0 regt ausschließlich den modifizierten Bereich 152 an,
- - der modifizierte Bereich 152 emittiert λ1 und regt damit Aufnahmebereiche 180, die fluoreszierende Proben enthalten, an,
- - die Proben in den Aufnahmebereiche 180 werden allein über λ1 angeregt und emittieren λ2,
- - die Kamera sieht nur λ2.
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Bei dieser weiteren Ausführungsform ist gegenüber den zuvor erörterten Ausführungsformen allerdings zu beachten, dass die drei genannten Wellenlängen sowie die Anregungs- und Fluoreszenzspektren ein schlüssiges Gesamtkonzept gemäß der vorstehenden Beschreibung ergeben. Dies kann insbesondere bei Multiplex-Assays mit mehreren Fluoreszenzfarbstoffen herausfordernd sein, da das beschriebene Konzept hier jeweils noch einen zusätzlichen Farbstoff einführt und die gesamte zur Verfügung stehende spektrale Bandbreite, typischerweise 400 bis 1000 nm, begrenzt ist.