KR20150073919A - 표면―증강 라만 산란에 기초한 고속 및 고감도 미량 분석용 유무기 나노섬유 복합체 기판 및 이를 이용한 분석방법 - Google Patents

표면―증강 라만 산란에 기초한 고속 및 고감도 미량 분석용 유무기 나노섬유 복합체 기판 및 이를 이용한 분석방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 표면-증강 라만 산란(Surface Enhanced Raman Scattering,SERS)에 기초한 물질의 미량 분석을 위한 유무기 나노섬유 복합체 기판에 관한 것으로, 보다 상세하게는 다양한 라만 염료(Raman dye)에 의해 유도된 금속 나노입자들의 응집체들이 가교결합성 고분자 하이드로겔 성질을 가진 나노섬유 내부에 다양한 밀도로 균일하게 함입된 나노섬유 복합체 기판 및 이의 제조방법, 그리고 이들의 응용에 관한 것이다.

Description

표면―증강 라만 산란에 기초한 고속 및 고감도 미량 분석용 유무기 나노섬유 복합체 기판 및 이를 이용한 분석방법{INORGANIC―ORGANIC NANOFIBER COMPOSITE SUBSTRATES FOR FAST AND SENSITIVE TRACE ANALYSIS BASED ON SURFACE ENHANCED RAMAN SCATTERING AND THE METHOD USING THE SAME}
본 발명은 표면-증강 라만 산란(Surface Enhanced Raman Scattering,SERS)에 기초한 물질의 미량 분석을 위한 유무기 나노섬유 복합체 기판 및 이를 이용한 분석방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 다양한 라만 염료(Raman dye)에 의해 유도된 금속 나노입자들의 응집체들이 가교결합성 폴리머 하이드로겔 성질을 가진 나노섬유 내부에 다양한 밀도로 균일하게 함입된 나노섬유 복합체 기판 및 이의 제조방법, 그리고 이들의 응용에 관한 것이다.
오늘날 환경오염 문제가 심각해지면서 각종 중금속 및 유기인계 화합물과 같은 환경오염 물질의 조기 검출에 대한 필요성이 증대되고 있다. 또한, 국제사회에서 테러에 의한 위협이 고조되면서 탄저 및 사린과 같은 각종 바이오테러 물질의 조기 검출에 대한 필요성 또한 증대되고 있다. 따라서, 필드(field)에서 상기와 같은 위험물질을 신속하고 정확하게 검출하여 그 확산을 차단하는 것은 매우 중요한 과제가 아닐 수 없으며, 이러한 각종 화학물질의 극미량 분석 기술의 개발은 환경 모니터링, 법과학 및 국토방위 분야에서 매우 중요한 문제로 대두되고 있는 실정이다.
기존의 환경 오염물질 등의 분석 기술은 복잡한 전처리 과정을 필요로 할 뿐만 아니라, 이동이 불가능하거나 매우 불편한 대형의 분석장비를 필요로 하여, 분석시 오랜 시간과 노력이 소요된다는 단점이 있었다.
이와 관련하여, 근래에는 표면 증강 라만산란(Surface Enhanced Raman Scattering,SERS)은 높은 민감도(sensitivity)로 인해 화학물질(chemical)을 탐지하고 생화학적으로 분석하는 방법으로 각광받고 있다.
이 분야에서는 믿을만한 SERS 기질로 이용할 수 있는 특정 구조에 대한 연구가 계속되고 있다. 금 및 나노입자들을 원하는 모양 및 형상으로 만들기 위해서, 이온빔 리소그래피, 전자빔 리소그래피, 나노스피어 리소그래피 및 진공 증발에 관심을 두고 있고, 작은 나노입자를 나노클러스터로 모으는 방법이 이용되고 있다. 이 기술들은 재현성 높은 SERS를 가지는 금 및 은 나노입자의 나노클러스터를 만드는 데 이용된다.
그러나 이 기술들은 비용이 많이 들고 대량 생산이 어려운 문제점이 있다. 경제적이고 안정적이며 믿을 수 있는 SERS 기질을 만들기 위해서 실리콘 나노와이어 어레이로 은 나노입자를 코팅하거나[Zhang, M. L., C. Q. Yi, et al. 2008 Applied Physics Letters 92(19); 및 Zhang, B. H., H. S. Wang, et al. 2008 Advanced Functional Materials 18(16): 2348-2355], 금 나노입자를 가지는 다공성 알루미늄 막[Ko, H. and V. V. Tsukruk 2008 Small 4(11): 1980-1984.], 할로우 금 나노구체 및 나노쉘과 컨쥬게이션된 항체[Lee, S., H. Chon, et al. 2009, Biosensors & Bioelectronics 24(7): 2260-2263]에 대한 기술이 보고되었다. 그러나 분자 진동의 증강이 높게 일어나서 편재화된 플라스몬 중심의 수가 적어지기 때문에 증강 효과가 효과적으로 일어나지 않는 단점이 있다.
현재, SERS에 사용 가능한 기판은 라만 산란의 증강 및 검출에 다양한 결함을 가지고 있다. 라만 산란 신호는 일반적으로, 특히 플랫(flat) 기판에서 매우 약하다. 약한 라만 신호는 라만 산란 신호를 검출하고 측정하는 것을 어렵게 하여, 따라서 분자 종을 검출하고 확인하는 것을 어렵게 한다. 더욱이, 사용할 수 있는 기판이 라만 산란 신호를 증강시키더라도, 증강된 라만 산란 신호는 대개 기판의 국부적인 에어리어(localized area)에만 있으며 기판 표면에 걸쳐 균일하지 않다. 국부적인 증강된 라만 산란 신호의 에어리어는 기판 표면의 전 에어리어와 비교하면 기하급수적으로 작다. 라만 산란 신호의 에어리어 및 기판 표면의 에어리어의 큰 격차는 신호를 찾아 위치시키는 것을 부담스럽게 하며 따라서 분자 종을 검출하고 확인하는 것을 부담스럽게 한다.
이에 본 발명자들은 라만 염료(Raman dye)에 의해 유도된 금속 나노입자들의 응집체들을 제조하고, 이 금속 나노입자 응집체들을 전기유체역학적 분사 (electrohydrodynamic (EHD) jetting) 방법을 이용해서 가교결합성 폴리머 하이드로겔 성질을 가진 나노섬유 내부에 다양한 밀도로 균일하게 함입시킨, 새로운 유무기 나노섬유 복합체 기판을 제조함으로써, 라만 염료에 의해 유도된 표면-증강 라만 산란에 의한 내부 표준 신호(Internal standard signal)를 기준으로 분석 물질에 대한 신호 세기를 효과적으로 비교 및 검출할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
Lee, C.H., Tian, L.M., Abbas, A., Kattumenu, R. & Singamaneni, S. Directed assembly of gold nanorods using aligned electrospun polymer nanofibers for highly efficient SERS substrates. Nanotechnology22 (2011). Jin, X. & Hsieh, Y.L. Anisotropic dimensional swelling of membranes of ultrafine hydrogel fibers. Macromolecular Chemistry and Physics206, 1745-1751 (2005). Lee, K.Y., Jeong, L., Kang, Y.O., Lee, S.J. & Park, W.H. Electrospinning of polysaccharides for regenerative medicine. Adv Drug Deliver Rev61, 1020-1032 (2009). Park, T.G., Yoo, H.S. & Kim, T.G. Surface-functionalized electrospun nanofibers for tissue engineering and drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews61, 1033-1042 (2009). Zhang, B.H. et al. Large-area silver-coated silicon nanowire arrays for molecular sensing using surface-enhanced Raman spectroscopy. Advanced Functional Materials18, 2348-2355 (2008). Li, D.P., Frey, M.W. & Baeumner, A.J. 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본 발명의 목적은 표면-증강 라만 산란에 기초한 고속 및 고감도 미량 분석용 유무기 나노섬유 복합체 기판 및 이의 제조 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 나노섬유 복합체 기판을 이용하여 표면-증강 라만 산란(Surface Enhanced Raman Scattering,SERS)에 의한 물질 분석 방법을 제공하는데 있다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은
가교결합성 폴리머 하이드로겔 나노섬유 내부에, 라만 염료에 의한 금속나노입자들의 응집체(클러스터)가 균일하게 분포되어 있는 것을 특징으로 하는, 표면-증강 라만 산란 분석용 나노섬유 복합체 기판을 제공한다.
가교결합성 폴리머로는 폴리(아크릴아미드-코-아크릴레이트)[poly(acrylamide-co-acrylic acid, poly(AAm-co-AA)], 폴리(N-이소프로필 아크릴아미드-코-스테아릴 아크릴레이트)[Poly (N-isopropyl acrylamide-co-stearyl acrylate), Poly(NIPAm-co-SA)], 폴리(N-이소프로필 아크릴아미드-코-알릴아민)[poly(N-isopropylacrylamide-co-allylamine), poly(NIPAM-co-AA)], 및 아크릴 부분(acrylic moiety)을 가지는 poly(NIPAM-co-AA) 등을 사용할 수 있고, 본 발명의 일 실시예에서는 폴리(아크릴아미드-코-아크릴레이트)[poly(acrylamide-co-acrylic acid, poly(AAm-co-AA)]을 사용하였다.
특히, 상기 가교결합은 물리적, 화학적 또는 광개시적으로 이루어질 수 있는데, 바람직하게는 자외선(UV) 광개시적으로 이루어지는 것이 좋다.
또한, 금속 나노입자의 응집에 사용되는 라만 염료는 로다민6G, 로다민 B 이소티오시아네이트(RBITC), 아데닌, 4-아미노-피라졸(3,4-d)피리미딘, 2-플루오로아데닌, N6-벤조일아데닌, 키네틴, 디메틸-알릴-아미노-아데닌, 제아틴(zeatin), 브로모-아데닌, 8-아자-아데닌, 8-아자구아닌, 6-머캅토퓨린, 4-아미노-6-머캅토피라졸로(3,4-d)피리민딘, 8-머캅토아데닌, 및 9-아미노-아크리딘 등을 사용할 수 있고, 본 발명의 일 실시예에서는 로다민 B 이소티오시아네이트(RBITC)를 사용하였다.
금속 나노입자는 은, 금, 구리, 및 이들의 혼합물 등으로부터 선택될 수 있는데, 바람직하게는 은(실버) 나노입자를 사용할 수 있다.
상기 금속 나노입자는 1~00 nm의 직경 크기를 가지는 것이 바람직하고, 상기 금속 나노입자 응집체(클러스터)는 60~100 nm의 직경 크기를 가지는 것이 바람직하다.
본 발명은 다른 구체예로써, 다음을 포함하는 상기 표면-증강 라만 산란 분석용 나노섬유 복합체 기판 제조방법을 제공한다:
(i) 시드(seed) 금속 나노입자를 라만 염료에 의해 응집하여 금속 나노클러스터(nanocluster)를 형성하는 단계;
(ii) 상기 금속 나노클러스터(nanocluster)를 코팅시키는 단계;
(iii) 전기수력적 분사(Electrohydrodynamic jetting) 방법을 통해 가교결합성 폴리머 하이드로겔 나노섬유에 상기 금속 나노클러스터를 함입시키는 단계; 및
(iv) 가교결합성 폴리머 하이드로겔을 가교결합시키는 단계.
각 단계에서 사용되는 주요한 구성성분에 대한 설명은 앞서 설명한 바와 같다.
(ii)단계에서, 상기 금속 나노클러스터(nanocluster)의 코팅은 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin), BSA(bovine serum albumin), 인슐린(insulin), 콩단백질, 카제인, 젤라틴 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질로 코팅할 수 있는데, 이를 통해 금속 나노클러스터를 안정화시키는 효과를 수득할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 BSA(bovine serum albumin)로 은 나노클러스터를 코팅하였다.
그리고, (iii) 단계에서, 가교결합성 폴리머 하이드로겔 나노섬유에 상기 금속 나노클러스터를 함입시킬 때, 라만 염료 종류와 농도 조절; 금속나노입자 응집체들의 밀도 조절; 또는 전기유체역학적 분사 조절을 통해, 다양한 밀도로 금속 나노입자들의 응집체를 고르게 분포시킬 수 있는 장점이 있다.
또한, 본 발명은 또 다른 구체예로서, 표면-증강 라만 산란 분석용 나노섬유 복합체 기판을 이용하여 수용액 상에서 분석물질을 검출하는 것을 특징으로 하는, 표면-증강 라만 산란 분석방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 다음의 분석방법을 제공한다:
가교결합성 폴리머 하이드로겔 나노섬유 내부에 라만 염료에 의한 금속나노입자들의 응집체(클러스터)가 균일하게 분포되어 있는 것을 특징으로 하는, 표면-증강 라만 산란 분석용 나노섬유 복합체 기판을 준비하고; 그리고
상기 나노섬유 복합체 기판을 분석 물질이 포함된 용액에 침지시켜서 분석 물질을 검출하는;
단계를 포함하는 표면-증강 라만 산란 분석방법.
상기 나노섬유 복합체 기판은, 상기 금속나노입자들의 응집체들을 둘러싸는 상기 폴리머 사이에 가교결합이 형성되어 상기 금속나노입자들의 응집체와 상기 폴리머 사이에 네트워크가 형성될 수 있다.
상기 방법은, 상기 기판 내 존재하는 라만 염료에 의해 유도된 표면-증강 라만 산란에 의한 일정한 내부 표준 신호(Internal standard signal) 세기를 기준으로 비교 분석할 수 있어 효과적이다.
본 발명의 분석방법은 분석물질이 0.01~6ppm, 바람직하게는 0.5~6ppm 의 농도로 존재하는 경우에, 즉, 극미량의 경우에도 검출 가능하므로, 더욱 유용하게 활용될 수 있다.
상기 분석물질은 발암 물질일 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.
상기 나노섬유 복합체 기판을 상기 분석 물질이 포함된 용액에 침지시키면, 상기 분석 물질이 상기 나노섬유 복합체 기판을 통해 확산되어 상기 금속 나노입자 응집체들 표면에 흡착함으로써 분석 물질을 검출할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 말라카이트 그린(malachite green, MGITC)을 대상으로 분석을 수행하였다.
본 발명은 가교결합성 폴리머 하이드로겔 나노섬유 내부에 라만 염료에 의한 금속나노입자들의 응집체(클러스터)가 균일하게 분포되어 있는 것을 특징으로 하는, 표면-증강 라만 산란 분석용 나노섬유 복합체 기판과 이의 응용에 관한 것으로, 라만 염료에 의한 금속나노입자들의 응집체의 분포 밀도를 분석 물질에 따라 다양하게 조절할 수 있고, 표면-증강 라만 산란에 의해 일정한 세기를 나타내는 라만 염료에 의한 내부 표준 신호(Internal standard signal)를 기준으로 삼아, 분석 물질에 대한 라만 신호 세기를 비교 분석함으로써 효과적으로 검출하는데 유용하다.
도 1(A)는 표면-증강 라만 산란에 기초한 고속 및 고감도 바이오센싱 및 물질의 미량분석을 위해 다양한 라만 염료(Raman dye)에 의해 유도된 금속나노입자들의 응집체들을 제조하고, 도 1(B)는 금속나노입자 응집체들을 전기수력학적(전기유체역학적) 분사 (electrohydrodynamic (EHD) jetting) 방법을 이용해서 고분자 하이드로겔 성질을 가진 나노섬유 내부에 다양한 밀도로 균일하게 함입시킨 새로운 유무기 나노섬유 복합체 기판 제조 방법에 대한 본 발명의 모식도이다. 도 1(C)는 수용액 상에 존재하는 MGITC를 유무기 나노섬유 복합체 기판을 이용하여 정량 및 정성 분석하는 모식도이다.
도 2(A)는 라만 염료(RBITC)에 의해 은 나노입자 응집체가 형성되는 동안의 UV-Vis 스펙트럼을 나타낸 그래프이다. 도 2(B)는 Dynamic light scattering (DLS)를 이용하여 은 나노입자 응집체의 크기를 분석한 그래프이다. 도 2(C, D)는 은나노 입자, 은 나노 입자의 응집체의 투과 전자현미경 사진이다. 도 2(E, F)는 은나노입자 응집체의 형성동안 배양 시간에 따른 라만 신호 변화 및 주요 라만 피크 강도를 응집반응시간에 대해 나타낸 그래프이다.
도 3(A)는 UV crosslinkable-poly(acrylamide-co-acrylic acid); UV-P(AAm-co-AA)의 탄소 이중결합 (C=C)을 이용하여 UV 가교결합하는 모식도이다. 도 3(B)는 NMR을 통하여 분석한 UV-P(AAm-co-AA) 스펙트럼이며, 도 3(C)는 UV를 조사하기 전 조사 후 나타나는 UV-P(AAm-co-AA)의 라만 신호를 측정한 것이다.
도 4(A)는 고분자 방사액에 은나노 응집체 입자 농도가 0.4 w/v % 포함 되어 있을 때 전기 방사시간에 따라 나타나는 나노섬유 기판의 표면-증강 라만 산란 신호의 변화 그래프 및 도 4(B)는 각각의 시간에 따른 주요 라만 피크 (1646 cm-1)에서 나타난 강도를 나타낸 것이다. 도 4(C)는 나노섬유 내 은나노 응집체 입자의 농도 증가에 따른 표면-증강 라만 산란 신호의 변화 및 도 4(D)는 각각의 농도에 따른 주요 라만 피크 (1646 cm-1)에서 나타난 강도를 나타낸 것이다.
도 5(A)는 다른 용매(물, 에탄올, 아세톤)에서의 유무기 나노섬유 복합체 기판의 표면-증강 라만 산란 신호의 변화 그래프 및 도 5(B)는 무작위로 14번의 라만 산란 신호를 측정 후 주요 라만 피크 (1646 cm-1)에서 나타난 강도에 따라 나타낸 그래프이다. 도 5(C) 및 5(D)는 다양한 pH 5?pH 12) 및 염 농도(0.02 M ? 0.1 M) 안에서 라만 산란 신호를 측정 후 주요 라만 피크 (1646 cm-1)에서 나타난 강도에 따라 나타낸 그래프이다.
도 6(A-D)는 (A-D) 상이한 배율, 7.5, 10.0, 12.5 및 15.0 w/v% 폴리머 농도에서 0.4 w/v% 농도로 은 나노입자 응집체 입자를 포함한 폴리머 나노섬유의 SEM 이미지이다. 도 6(E-F)는 수용액상에서 팽윤된 나노섬유를 통하여 분석 물질들의 확산을 측정할 수 있는, 나노 섬유의 팽창 비율을 추정하기 위한 (E) 건조상태, (F) 팽윤상태에서의 유무기 나노섬유 복합체 기판의 공초점 레이져 주사 현미경 사진이다.
도 7은 유무기 나노섬유 복합체 기판에 함입된 은나노 응집체의 양에 따른 TEM 사진이다 [은나노 응집체 입자 농도 (A, B) 0.2 w/v % (C, D) 0.4 w/v % (E, F) 0.8 w/v %].
도 8(A)는 말라카이트 그린 (MGITC)이 팽윤된 하이드로겔인 유무기 나노섬유 복합체 기판 내부를 통해 확산되어 금속나노입자 응집체 표면에 흡착하여 그의 농도에 따른 표면-증강 라만 산란 스펙트럼 및 도 8(B)는 RBITC의 내부 표준 신호(Internal standard signal)에 따른 라만 신호 세기와 발암 물질인 MGITC의 농도에 따른 라만 신호 세기와의 관계 그래프이다.
"나노입자(Nanoparticles)"란 입자의 크기가 1 ~ 1000 nm 크기의 범주에 속하는 입자이며, "마이크로입자(Microparticles)"란 1 ~ 1000 μm의 크기의 입자를 말한다.
"금속 나노클러스터(nanocluster)"란, 금속 입자들이 모여서 응집된 응집물을 의미하는 용어로서 이 분야에서 일반적으로 사용되는 용어이다.
"폴리머 또는 고분자"는 한 종류 또는 수 종류의 구성 단위가 서로에게 많은 수의 화학결합으로 중합되어 연결되어 있는 분자로 되어 있는 화합물이다. 구성 단위를 단량체(單量體)라고 하고, 중합도에 따라 이량체, 삼량체 등이라고 한다. 중합도가 큰 거대 분자를 고중합체라고 하고, 고분자 화합물(분자량이 1만 이상의 화합물)과 같은 의미로 사용되는 경우가 많다. 본 명세서에서도 폴리머와 고분자의 용어가 혼용되어 사용되고 있다.
"하이드로겔"은 분자 사슬간의 가교결합을 통한 3차원의 망상구조를 가진 수팽윤 고분자로서 다량의 물을 함유할 수 있으며 물에 녹지않는 성질을 가진 고분자 복합체이다. 하이드로겔이 뛰어난 흡수성을 나타내는 것은 고분자 사슬 안에 친수성 그룹들이 있기 때문이고 이들의 가교결합을 통해서 흡수된 물들이 사슬 사이에 존재할 수 있게 되는 것으로 이와 같은 흡수체계는 화학적인 작용과 물리적인 작용의 동반작용에 의해 이루어지게 된다.
"라만 산란(Raman scattering)"이란 입사되는 광자의 에너지(hv)가 분자의 진동 상태를 변화시키면서 다른 주파수의 에너지(hv')로 비탄성 산란되는 현상이다. 이러한 라만 산란은 광자와 상호작용하여 산란을 유도하는 분자 구조에 따라 고유의 광자 에너지 변화 형태를 나타내므로, 분자의 검출, 확인 및 분석이 가능하다. 이러한 라만 신호를 강화하여 고감도 검출을 하기 위하여 사용되는 기술 중 하나가 표면강화 라만 산란법(Surface Enhanced Raman Scattering 또는 Surface Enhanced Raman Spectroscopy)이다. 표면강화 라만 산란법은 극미세 구조물을 이용하여 국소적으로 전자기장을 강화하여 라만 신호를 증폭시키는 기술이다
"분석물 또는 분석 대상"이란 용어는 검출 및/또는 확인하고자 하는 모든 원자, 화학물질, 분자, 화합물, 조성물 또는 응집물을 의미한다. 이러한 분석물의 비제한적인 예로는, 아미노산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 글리코프로테인, 리포프로테인, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 핵산, 당, 탄수화물, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드, 지방산, 지질, 호르몬, 대사산물, 사이토카인, 케모카인, 수용체, 신경전달물질, 항원, 알레르겐, 항체, 기질, 대사산물, 보조인자, 억제제, 약물, 약학물, 영양물, 프리온, 독소, 독물, 폭발물, 살충제, 화학무기제, 생체유해성 제제, 방사선동위원소, 비타민, 헤테로사이클릭 방향족 화합물, 발암물질, 돌연변이유발요인, 마취제, 암페타민, 바르비투레이트, 환각제, 폐기물 및/또는 오염물을 들 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 환경 오염원 중 하나인 말라카이트 그린을 분석하였다.
"표지" 또는 "라벨"는 직접 또는 간접적으로 시약, 예를 들어 핵산 프로브 또는 항체에 컨쥬게이팅 되거나 융합되고 컨쥬게이팅 되거나 융합된 시약의 검출을 용이하게 하는 화합물 또는 조성물을 의미한다. 표지는 그 자체가 검출될 수 있거나 (예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 효소 표지의 경우에, 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변형을 촉매 할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.
본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다.
이하 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다.
본 발명은 표면 증강 라만 산란(Surface enhanced Raman scattering, SERS) 분석에 사용하는 기판에 관한 것이다.
표면 증강 라만 산란(Surface enhanced Raman scattering, SERS)-기반 검출 방법은 고감도 분석법으로 각광을 받고 있다. 분석물 함유 용액 및 라만 리포터가 붙은 면역-금 나노입자가 연속적으로 첨가되고, 리포터 분자의 특징적인 SERS 피크의 세기(intensity) 변화를 측정하여 특정 마커를 정량적으로 분석할 수 있다. 리포터 분자가 거친 금속 표면에 흡착되고 여기광(레이저 광)에 노출되면, 측정 접점(hot spot junction)이라고 알려진 리포터 분자의 SERS 활성 사이트에서 전자기적이고 화학적인 증강이 발생하여 SERS 신호가 대폭 증가한다(Kneipp, J. et al., 2006. Nnao Lett. 6, 2225-2231). 이 증강 효과는 종래 라만 및 형광 검출법이 가지는 단점인 저감도성의 문제를 해결한다.
SERS는 단일분자 수준에서 생체이미징 및 생체신호를 고감도로 측정할 수 있는 기술로 발전해 왔다. 나노 구조 금속 표면에 흡착된 서로 다른 분자들의 라만 신호는, 은, 금, 구리 등의 경우에 매우 높게 나타난다. 거친 금속 기질 표면에 라만 활성 분자들이 흡착되면, 그들의 SERS 신호는 증가한다. 그 이유는 측정 접점(hot spot junctions)의 매우 편재화된 플라스몬 중심에서 발생하는 전자기 및 화학 증강 현상 때문이다. 전자기현상은, 거친 금속 기질 또는 금속 응집체 표면과 연관된 국소 표면 플라스몬 공명과 관련이 있다. 반면, 화학 증강은 직접적 전하 이동 또는 홀-쌍 발광(hole-pair excitation process)과 연관되어 있다.
단일분자 수준을 감지하기 위해서는 SERS 신호가 엄청나게 증강되어야 한다. 단일 분자의 SERS 감지를 위해 은 콜로이드성 나노입자 응집체가 처음 사용되었다[Nie, S. M. and S. R. Emery 1997 Science 275(5303): 1102-1106.]. 이후의 연구 결과들을 통해, 은 나노클러스터가 초감도 감지를 위해 가장 적합하다는 것이 알려졌다[Kneipp, J., H. Kneipp, et al. 2006, Nano Letters 6(10): 2225-2231.]. 만약 라만 리포터 분자가 나노클러스터의 접점에 존재한다면, 신호 세기가 엄청나게 증가한다[Chen, J. W., Y. Lei, et al. 2008, Analytical and Bioanalytical Chemistry 392(1-2): 187-193.]. 입자들 사이의 거리, 금속 플라스몬 영역의 고유 특징, 나노입자의 크기와 농도 그리고 레이저 강도는 신호 증강을 조절하는 중요한 파라미터이다.
SERS 기질 또는 기판으로 이용할 수 있는 특정 구조에 대한 연구가 계속되고 있다. 금 및 나노입자들을 원하는 모양 및 형상으로 만들기 위해서, 이온빔 리소그래피, 전자빔 리소그래피, 나노스피어 리소그래피 및 진공 증발에 관심을 두고 있고, 작은 나노입자를 나노클러스터로 모으는 방법이 이용되고 있지만, 이러한 기술들은 비용이 많이 들고 대량 생산이 어려운 문제점이 있고, 서로 다른 화학 및 생물 환경에서의 나노클러스터의 안정성이 매우 중요하다.
또한, 대부분 화학물질 미량분석용 화학센서로 종래 개발된 표면-증강 라만 산란 기판 자체에는 라만 염료에 의해 유도된 표면-증강 라만 산란에 의한 내부 표준 신호(Internal standard signal)가 존재하지 않으므로, 내부 표준에 따른 재현성있는 미량 분석이 어려움이 존재한다.
현재 개발된 표면-증강 라만 산란 기판의 경우, 검출 가능한 부분이 제한적이기 때문에 미량 분석에 필요로 하는 핵심 기술에 한계가 있어 왔다.
그러나, 본 발명의 표면-증강 라만 산란 분석용 나노섬유 복합체 기판은 이러한 요구를 만족시키는 새로운 개념의 기판으로써, 분석 물질의 고속 및 고감도 미량 분석이 가능하고, 화학적 안정성, 데이타 재현성을 실현할 수 있다.
즉, 본 발명자들은 고속 및 고감도 미량 분석 및 바이오센싱을 위해 금속나노입자들을 다양한 라만 염료(Raman dye)에 의해 유도된 금속 나노입자들의 응집체(클러스터)들을 제조하고, 이 금속나노입자 응집체들을 전기수력학적(전기유체역학적) 분사 (electrohydrodynamic (EHD) jetting) 방법을 이용해서 고분자(폴리머) 하이드로겔 성질을 가진 나노섬유 내부에 다양한 밀도로 균일하게 함입시켜 화학적으로 안정화시키고, 폴리머 하이드로겔 성질을 가진 새로운 유무기 나노섬유 복합체 기판의 팽윤된 구조 (swollen sturucture)를 통하여 분석 물질이 확산되는 방법을 통해서, 위험 약물의 검출이 가능한 고속 및 고감도 미량 분석이 가능할 뿐만 아니라, 화학적 안정성, 데이타 재현성을 실현하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서
가교결합성 폴리머 하이드로겔 나노섬유 내부에, 라만 염료에 의한 금속나노입자들의 응집체(클러스터)가 균일하게 분포되어 있는 것을 특징으로 하는, 표면-증강 라만 산란 분석용 나노섬유 복합체 기판 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 기판은 가교결합성 폴리머 하이드로겔 성질을 가진 나노섬유 내부에, 라만 염료(Raman dye)에 의해 유도된 금속 나노입자들의 응집체인 나노 클러스터들을 균일한 밀도로 함유하고 있다.
특히, 수성 환경 (Aqueous conditions)에서 유무기 나노섬유 복합체 기판을 안정시키기 위해, 폴리머 하이드로겔 나노섬유는 물리적, 화학적 또는 광개시적으로 가교결합을 형성하는데, 예를 들어, 열적 가교결합 (Thermal chemical crosslinking) 또는 높은 온도에서의 표면-증강 라만 산란 신호의 손실을 최소화하는 광개시 화학결합 (Photo-initiated chemical crosslinking)을 이용해서 가교결합을 형성하고 수용액 상에서 팽윤되는(swollen) 특성을 가진다.
이러한 팽윤된 하이드로겔 기판 내부를 통해, 수용액 상에 용해되어 있는 분석 물질들이 확산 (Diffusion) 되어 금속나노입자 응집체 표면에 흡착함으로써, 라만 염료에 의해 유도된 표면-증강 라만 산란 신호에 기초해서 물질들의 고속 및 고감도 미량 분석이 가능한 것이다.
이 때, 본 발명의 표면-증강 라만 산란 기판 자체에 존재하는 라만 염료에 의해 유도된 표면-증강 라만 산란에 의한 내부 표준 신호(Internal standard signal)의 일정한 세기를 기준으로 하여, 분석 물질에 대한 라만 신호 세기를 비교 분석함으로써 분석물을 효과적으로 검출할 수 있다.
본 발명의 표면-증강 라만 산란 분석용 나노섬유 복합체 기판을 제조하기 위해, 일 구체예로서 하기의 방법으로 제조할 수 있다:
(i) 시드(seed) 금속 나노입자를 라만 염료에 의해 응집하여 금속 나노클러스터(nanocluster)를 형성하는 단계;
(ii) 상기 금속 나노클러스터(nanocluster)를 코팅시키는 단계;
(iii) 전기수력적 분사(Electrohydrodynamic jetting) 방법을 통해 가교결합성 폴리머 하이드로겔 나노섬유에 상기 금속 나노클러스터를 함입시키는 단계; 및
(iv) 가교결합성 폴리머 하이드로겔을 가교결합시키는 단계
상기 제조방법은 도 1에 개략적인 모식도로 도시하였다.
이하, 상기 방법을 보다 구체적으로 설명하면서, 본 발명을 더욱 상세히 기술토록 한다.
'시드(seed) 금속 나노입자'는 금속 나노 클러스터를 만들기 위한 종자(seed)가 되는 금속입자를 의미하고, 상기 금속은 은, 금, 구리, 및 이들의 혼합물 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 일 실시예서는 은(실버) 나노입자를 사용하였다.
본 발명에서는 시드 금속 나노입자의 응집(aggrigation)은 라만 염료(Raman dye)에 의해 이루어진다. 즉, 라만 염료에 의해 시드 금속 나노입자들의 응집체, 즉 나노 클러스터를 제조한다. 본 발명 명세서에서는 응집체 또는 클러스터의 용어를 혼용하여 사용하고 있다.
라만 염료는 라만 활성 유기 화합물을 의미하며, 이 기술분야에서 널리 사용되는 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있다. 본 발명에서 상기 라만 염료는 다양하게 포함될 수 있다. 구체적인 예를 들면, 로다민6G, 로다민 B 이소티오시아네이트(RBITC), 아데닌, 4-아미노-피라졸(3,4-d)피리미딘, 2-플루오로아데닌, N6-벤조일아데닌, 키네틴, 디메틸-알릴-아미노-아데닌, 제아틴(zeatin), 브로모-아데닌, 8-아자-아데닌, 8-아자구아닌, 6-머캅토퓨린, 4-아미노-6-머캅토피라졸로(3,4-d)피리민딘, 8-머캅토아데닌, 및 9-아미노-아크리딘 등을 들 수 있으나 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는 로다민 B 이소티오시아네이트(RBITC)를 사용하였다.
라만 염료에 의해 응집시킨 금속 나노클러스터(nanocluster)의 크기는 10~1000 nm일 수 있으며, 60~100 nm가 더욱 바람직하다.
예를 들어, 상기 시드 나노입자 각각의 크기가 1에서 100 nm 이고 상기 나노클러스터 크기가 10~1000 nm일 때 라만 신호가 최대가 된다.
다음으로, 상기 금속 나노클러스터(nanocluster)를 코팅함으로써 안정화(stabilization)시킨다.
금속 나노클러스터를 코팅하는 단백질의 종류에는 제한이 없으며 이 기술분야에서 널리 사용되는 것이라면 어느 것이나 사용할 수 있다. 예를 들면, 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin), BSA(bovine serum albumin), 인슐린(insulin), 콩단백질, 카제인, 젤라틴 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 일 실시예서는 BSA(bovine serum albumin)로 나노 클러스터를 코팅하여 안정화시켰다.
이하는 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 (i) 및 (ii) 단계의 공정 모식도이다.
Figure pat00001
상기 그림은 본 발명의 실시예에 따른 은 나노클러스터, 은나노입자 응집체 (AgNCs) 형성의 메커니즘을 나타낸다. 6 ~ 13 nm 범위의 직경을 가지는 최초 시드 입자가, 응집제 및 라만 리포터로서 상이한 유기 염색약을 도입함으로써 응집되었다. 상기 입자들은, 이미 존재하는(preexisting) 은 시드의 표면에서 소듐 시트레이트 삼염기 디하이드레이트에 의해 감소된 은 이온으로부터 동시에 성장하였다. 그리고 BSA로부터 안정화제를 첨가하여 상기 클러스터를 안정화시켰다.
이어서, 상기 코팅된 금속 나노클러스터(nanocluster)를 전기수력적 공동분사(Electrohydrodynamic co-jetting) 방법을 통해 가교결합성 폴리머 하이드로겔 나노섬유에 균일하게 함입시키고, 상기 폴리머들을 가교결합시킨다.
전기수력적(전기 유체역학적) 분사법에 의해 분사하여 가교결합성 폴리머 하이드로겔이 상기 금속 나노 클러스터를 둘러싸서 캡슐화된다.
전기수력적 분사 (Electrohydrodynamic jetting, EHD jetting)는 다른 모양 및 크기를 가지는 폴리머성 나노섬유 및 나노입자의 제작을 위한 용이한 기술로서 일반적으로 사용된다. 주로 조절 가능한 파라미터의 조작은 1) 폴리머 용액의 점도, 전기 전도성, 및 표면 장력, 2) 두 전극 사이 적용되는 전압 및 거리 및 3) 다수의 마이크로미터 내지 소수의 나노미터의 범위인 다양한 폴리머성 나노구조를 생성하는 것을 야기하는 흐름율을 포함한다. 그 중에서도, 전기수력적 공동분사법 (Electrohydrodynamic co-jetting, EHD co-jetting)은 멀리 폴리머 용액의 평형 라미나 흐름(equilibrated laminar flow)이 2개의 상을 가지는 테일러 콘 (Taylor cone)의 꼭지점으로부터 전하-전하 척력 (charge to charge repulsion)에 의해 얇은 제트스트림 형태 (jet stream)로 분사되도록 한다.
한편, 가교결합성 고분자(폴리머)는 친수성 폴리머라면 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있다.
본 발명의 폴리머는 가교결합 (Thermal crosslinking)이 가능한 공중합체 폴리머로서, 예를 들어, 폴리(아크릴아미드-코-아크릴레이트)[poly(acrylamide-co-acrylic acid, poly(AAm-co-AA)], 폴리(N-이소프로필 아크릴아미드-코-스테아릴 아크릴레이트)[Poly (N-isopropyl acrylamide-co-stearyl acrylate), Poly(NIPAm-co-SA)], 폴리(N-이소프로필 아크릴아미드-코-알릴아민)[poly(N-isopropylacrylamide-co-allylamine), poly(NIPAM-co-AA)], 및 아크릴 부분(acrylic moiety)을 가지는 poly(NIPAM-co-AA)로 등으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 일 구체예에서는 폴리(아크릴아미드-코- 아크릴레이트)[poly(AAm-co-AA)]를 사용하였다.
수용성 폴리머의 "가교결합(cross-linking)"은 물에 노출될 때 용해되는 것에 대한 저항성을 주는 것에 매우 중요하다. 폴리머 사슬의 내부 분자 가교결합은 이런 나노섬유가 수용성 조건과 같은 실질적으로 가용화 환경에서 원래의 구조를 유지시키는데 도움을 준다, 이것은 또한 나노섬유가 상당한 양의 물을 포함하는 소프트 히드로겔로서 작용하게 하는데 도움을 준다. 생분해성 폴리머로 구성된 히드로겔은 조직 복구 및 약물 전달 담체에 광범위하게 이용되고 있다.
하이드로겔의 가교결합은 물리적, 화학적 및 광개시적 가교결합을 포함하는 다양한 기작을 통해 달성될 수 있다. 물리적 또는 화학적으로 가교결합된 나노구조체는 안정되고 수용성 환경에서 이용될 수 있다. 특히, 다중 구획의 히드로겔 나노입자 및 나노섬유의 제작은 전기수력적 공동분사 동안 외부적으로 적용되는 전기장 하에서 다른 고분자 용액의 유동학적 양립성 및 동적 순서에 의존한다. 전기수력적 공동분사 동안 고분자 용액의 유체 역학적 특성의 유지는 균일한 다중 구획의 나노입자 및 나노섬유를 생산하기 위해 가장 임계적인 파라미터가 될 수 있다. 나노섬유 내에 화학적 가교결합은 고분자 용액에 첨가되는 가교결합제가 필요하고, 이는 전기수력적 공동분사의 공정 동안 유동학적 특성을 간섭할 수 있다. 그러나, 정전 및 소수성 상호작용을 기초로 한 물리적 가교결합은 가교결합제 없이 전기수력적 공동분사를 통해 유동학적 특성 상수를 만든다.
그러므로, 본 발명의 가교결합성 고분자(폴리머)들로 캡슐화된 금속 나노클러스터를 가열하거나 자외선을 처리하면, 상기 금속 나노클러스터를 둘러싸는 폴리머 사이에 가교결합이 형성되어 상기 금속 나노클러스터-폴리머 사이에 네트워크가 형성된다. 그리고, 이러한 가교결합을 통한 네트워크를 형성으로 인해 물에 용해되지 않는다.
이하는 본 발명의 일 실시예에 따른 (iii) 및 (iv) 단계의 공정 모식도이다
Figure pat00002

상기 그림은 본 발명의 일 실시예에 따른 폴리머 나노섬유 내 은나노입자 응집체를 캡슐화시키는 전형적인 전기 방사 장치를 보여준다. 친수성, 생체적합성 및 UV 가교결합성 폴리머 UV-poly(acrylamide-co-acrylic acid), UV-P(AAm-co-AA)의 수용액 중 은나노입자 응집체의 모노분산된 현탁액에서, UV-P(AAm-co-AA)는 플라스틱 시린지 펌프에 부착된 얼룩 없는 스틸 캐필러리가 장착된 플라스틱 시린지에 채워진다. 디지털 사진은 전기분사(electrospraying) 실험 동안 taylor cone, jet stream, 및 jet breakup의 형성을 보여준다.
상기 방법으로 제조된, 본 발명의 표면-증강 라만 산란 분석용 나노섬유 복합체 기판은 폴리머 하이드로겔 나노섬유 내부에, 라만 염료에 의한 금속나노입자들의 응집체가 균일하게 분포되어 있는 것을 특징으로 한다.
이 때, (i) 라만 염료 종류와 농도 조절, (ii) 금속나노입자 응집체들의 밀도 조절, (iii) 전기유체역학적 분사 조절을 통해, 다양한 밀도로 금속 나노입자들의 응집체를 고르게 분포시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 표면-증강 라만 산란 분석용 나노섬유 복합체 기판는 제조방법이 어렵지 않아서 제조비용도 경제적이다.
원하는 클러스터 사이즈의 금속 나노입자 응집체에 유도된 염료(라만 염료), 단백질 코팅에 의한 안정화 그리고 연속적으로 고분자(폴리머)를 이용한 캡슐화 공정을 거친다.
앞서 설명한 바와 같이, 고분자 폴리머는 바이오하이브리드, 비독성 그리고 하이드로겔 폴리머이고, 캡슐화는 전기수력적 분사기술을 이용한다. 이 고분자 폴리머는 수용성 환경에서 잘 부풀고 소프트 매트릭스 상태가 되어서 금속 나노클러스터를 잘 붙드는 역할을 한다. 전기수력적 분사(electrohydrodynamic jettig, 이하, EHD 분사)는 다양한 폴리머 내부에 많은 무기 나노입자를 캡슐화하는 데 잘 이용되고 있는 기술이다[Yoshida, M., K. H. Roh, et al. 2009, Advanced Materials 21(48): 4920]. EHD 분사 후, 고분자 폴리머는 열적으로 또는 광으로 경화되어 수용성 환경(aqueous media)에 놓인 나노프로브를 안정화시킨다. 내부에 라만 활성 중심을 가지는, 가교결합(crosslinked)된 폴리머는 바이오센싱 및 바이오이미징에 쓰이는 민감한 SERS 기질로 이용될 수 있다.
한편, 본 발명은 다른 관점에서, 이러한 표면-증강 라만 산란 분석용 나노섬유 복합체 기판을 이용하는 물질 분석방법에 관한 것이다.
분석대상으로서 물질은 제한은 없다. 예를 들어, 발암 물질 등의 위해성 물질로서, 디피콜린산(dipicolinic acid;DPA), 말라카이트 그린(malachite green; MG) 등을 유용하게 검출하여 분석할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 말라카이트 그린(malachite green; MG)을 분석물질로 하였다.
말라카이트그린(malachite green)은 초록색의 공업용 색소이자 세균방지제로, 양식업에서는 기생충, 곰팡이 및 박테리아 감염 방지제로 사용되어 왔지만, 1950년대부터 어류에 대한 독성이 상당히 강한 것으로 밝혀지면서 지난 1991년 미국에서 사용을 금지시켰고, 유럽과 중국도 2002년 식용어류에 대 한 말라카이트그린의 사용을 규제하고 있으며, 우리나라 역시 유독 화학물질로 분류하여 규제하고 있다.
특히, 본 발명의 표면-증강 라만 산란 분석용 나노섬유 복합체 기판 자체에는 금속 나노 클러스터 제조시 이용한 라만 염료가 존재하고 있기 때문에, 표면-증강 라만 산란에 의해 일정한 세기를 나타내는 이의 내부 표준 신호(Internal standard signal)를 기준으로 삼아, 분석 물질에 대한 라만 신호 세기를 비교 분석함으로써 효과적으로 검출할 수 있는 장점이 있다.
종래, 대부분 화학물질 미량분석용 화학센서로 개발된 표면-증강 라만 산란 기판 자체에는 라만 염료에 의해 유도된 표면-증강 라만 산란에 의한 내부 표준 신호(Internal standard signal)가 존재하지 않으므로, 내부 표준에 따른 재현성있는 미량 분석이 어려웠지만, 본 발명은 내부 표준 신호가 존재하므로 이러한 문제점을 해결할 수 있는 것이다.
본 발명의 일 실시예에서는, 미량으로 용액 상에 용해되어 있는 발암 물질인 말라카이트 그린(malachite green, MGITC)이, 팽윤된 하이드로겔인 유무기 나노섬유 복합체 기판 내부를 통해 확산되어 금속 나노입자 응집체 표면에 흡착하여 나타나는, 이의 농도에 따른 표면-증강 라만 산란 스펙트럼을 관찰함으로써 말라카이트 그린을 검출 및 분석하였다.
특히, 표면-증강 라만 산란 기판 자체에 존재하는 RBITC 라만 염료에 의해 유도된 표면-증강 라만 산란에 의한 일정한 내부 표준 신호(Internal standard signal) 세기와 비교하여, 말라카이트 그린의 농도 증가에 따른 라만 신호 세기의 변화를 관찰함으로써 정량 평가를 수행하였다.
Figure pat00003
상기 그림은 본 발명의 일 실시예에 따른, SERS 기술에 따른 MGITC의 흔적 분석에 대한 모식도를 나타낸다. 가교결합된 폴리머성 나노섬유가 하이드로겔 특성을 포함하고, 염색약 분자들이 매트릭스를 투과할 수 있게하며, 은 나노클러스터 상에서 흡수되게 한다. 들어오는 레이저 빔이 은나노입자 응집체 상에 흡수된 염색 분자와 상호작용하여, MGITC 용액 침지 전 및 후에 기질로부터 각각의 라만 신호를 생성하였다.
한편, 본 발명의 방법에 의해 특히 0.5-6 ppm의 MGITC 농도 범위와 SERS 신호가 1차 선형 관계를 가지고, 검출 가능한 분석물질의 한계 농도를 검출 한계 농도(Limit of detection, LOD)로 정의하는데, 현재까지 실시예에 따라 LOD는 약 0.5 ppm (part per million)까지 가능한 바, 미량으로 존재하는 광범위한 표적 물질의 검출에 유용하게 사용될 수 있다. 주요 미량 분석법으로 사용되고 있는 대표적인 종래 기술로 Liquid chromatography mass spectroscopy (LC-MS)가 대표적으로 사용되고 있는데, SERS에 기초한 MGITC 분석 물질의 LOD는 현재까지 약 1-2 ppb (part per billion)까지 보고되고 있어, LC-MS의 LOD와 상응하는 검출 한계가 가능하다.
본 발명에서 (i) 라만 염료 종류와 농도 조절, (ii) 금속나노입자 응집체들의 밀도 조절, (iii) 전기유체역학적 분사 조절을 통해 다양한 밀도로 금속 나노입자들의 응집체를 고르게 분포시켜 약 1 ppb 이하의 LC-MS의 LOD와 상응하는 검출 한계를 극복하는 것이 가능하다.
이와 같이, 본 발명은 가교결합성 폴리머 하이드로겔 나노섬유 내부에, 라만 염료에 의한 금속나노입자들의 응집체가 균일하게 분포되어 있는 것을 특징으로 하는, 표면-증강 라만 산란 분석용 나노섬유 복합체 기판을 이용하여 미량의 물질을 효과적으로 검출하고 비교분석할 수 있는 방법에 관한 것이다.
앞서 설명한 모든 특징들은 본 발명의 표면-증강 라만 산란 분석용 나노섬유 복합체 기판이 바이오센싱 및 바이오이미징 도구로 사용하는 데 유용한 특징이 될 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실험 재료
은 니트레이트(질산은), 소듐 보로하이드라이드, 소듐 시트레이트 삼염기 디하이드레이트, BSA(bovine serum albumin), 로다민 B 이소티오시아네이트 결합된 덱스트란 RITC-덱스트란(MW 70 kDa), 로다민 B 이소티오시아네이트 (RBITC 혼합된 아이소머), 2-하이드록시-2-메틸프로페논, 아세톤, 알부민-플루오레세인 이소티오시아네이트 결합된 (FITC-BSA), 에틸렌 글리콜 무수물, 크로토노닐 클로라이드(crotonoyl chloride), 말라카이트그린 이소티오시아네이트(Malachite green isothiocyanate) 및 소듐 하이드록사이드(=98%)를 Sigma Aldrich로부터 구입하였다. Poly(acrylamide-co-acrylicacid, sodium salts), P(AAm-co AA) (MW 200 kDa; 10% acrylic acids)를 Polysciences Inc 로부터 구입하고, 모든 시약들을 받아서 사용하였다.
실험방법
1. UV - Vis 및 라만 측정
모든 UV-Vis 흡광도 스펙트럼 측정은 실온에서 UV-1800 (Shimadzu, Japan)를 이용하여 300 ~ 800 nm 파장 범위에서 수행하였다.
최대 흡광도를 표지하여 AgNPs 및 AgNCs(은나노 입자 응집체)의 특성을 분석하였다. 샘플의 작은 표본을 명시된 시간 간격에서 빼내고, Reinshaw 2000 microscope integrated system 에서 633 nm 파장에서 여기된 He-Ne 레이저 빔 아래 라만 스펙트럼을 수득하였다. 633 nm의 파장을 가지는 He-Ne 레이저를 사용하여 10mW 레이저 파워로 라만 리포터 분자를 여기시켰다. 홀로그래픽 노치 필터를 이용하여 수집된 스펙트럼으로부터 Rayleigh lines을 제거하였다.
2. SEM , TEM 이미징
스캐닝 전자 현미경에 의해 폴리머 나노섬유의 형태를 특징짓기 위해, 얼룩없는 스틸 시트(5x5mm)의 작은 사각형 조각들을 전기방사 동안 알루미늄 호일 표면 상에 두었다.
그 후, 이러한 섬유들을 K575X Turbo Sputter Coater를 이용하여 Pt 스퍼터링(platinum sputtering)으로 코팅하고 가속 전압 0.5 ~ 30kV에서 작동되는 SEM VEGA (TESCAN, USA)를 이용하여 이미지화하였다. 이미지들을 5.0KX, 8KX 및 10KX의 상이한 배율에서 취하였다. 투과전자현미경(Transmission electron microscopy, TEM)을 사용하여, 입자 크기 및 크기 분포 분석을 위해 단일 은 나노입자(AgNPs) 및 은 나노 입자 응집체(AgNCs)를 특징화하였다. 제조된 은 시드로서, 현탁액을 0.2μm Dismic 13Jp(ADVANTEC, Japan) 일회용 PTFE 소수성 시린지 필터를 통해 여과시키고, TEM을 위한 샘플 준비 전에 5회 희석하였다. 적은 양의 에탄올을 빠른 증발을 위해 혼합시킬 수 있다.
유사하게, 준비한 은나노입자 응집체를 0.2μm filter로 여과시키고, D.I. water로 4회 희석하고 TEM grid (Ted Pella Inc. USA)상에 놓았다. 이러한 샘플들을 가속전압 80 ~ 200 kV에서 작용하는 JEM-2100F (FEG) 장 방출(Field emission) 스캐닝 투과 전자 현미경(JEOL, Germany)을 이용하여 이미지화하였다.
3. 공초점 레이저 스캐닝 현미경
100X 대물렌즈 (오일 침지된 렌즈)로 Leica TCS SP2 (Leica, Germany) 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 이용하여 폴리성 나노섬유를 직접적으로 커버 글래스로부터 이미지화하였다. 작은 표본의 현탁된 섬유를 커버 글라스 위에 두고, 부품 특성 및 결합 효율을 조사하였다.
실시예 1 : 은나노 입자 응집체(은 나노클러스터, AgNCs )의 제조
1-1. 은 시드 입자의 합성
은 시드 입자를, 논문 (J Colloid Interface Sci. 211, 122-129 (1999))에 기술되어 있는 방법대로 제조하였다. 스톡 용액의 0.5 M 은 니트레이트, 소듐 시트레이트 및 0.05 M 소듐 보로하이드라이드의 스톡 용액을 DI water에서 준비하였다. 두 용액을 각각 별도로 제조하였다. 용액 A는 50ml의 DI water 중 4mM 질산은을 함유하고 있는 반면, 용액 B는 50 ml의 DI water 중 0.6 mM 소듐 보로하이드라이드, 8 mM 소듐 시트레이트 및 2 mM 소듐 하이드록사이드를 함유하였다. 두 용액을 혼합 전 5분 동안 교반하여 농도를 균질화하였다. 용액 B에 용액 A를 첨가함으로써, 은 시드 입자를 제조하였다. 상기 반응을 어두운 조건 하 10시간 동안 수행하여 완료하였다.
은 시드 입자를 0.2μm 필터를 통해 여과시켜 임의의 은 나노로드 또는 큰 입자들을 제거하였다. 이러한 방법으로 제조된 은 시드는 크기가 6~13nm 직경의 범위에 있었다. 이러한 입자들을 8~10℃에서 어두운 조건 하 보관하였다.
1-2. 은나노 입자 응집체( AgNCs )의 합성
라만 수용체 및 응집제로서 RBITC로 은 나노클러스터(AgNCs)의 합성을 위해, 50 ml의 은 시드 입자를 유리 바이알에 넣고, 0.01 M RBITC, 0.5M AgNO3 및0.5M 소듐 시트레이트 용액과 혼합하여 최종 농도가 각각 7.5μM, 0.85mM 및 0.5mM이 되도록 하였다. 이 혼합물을 부드럽게 적어도 5분 동안 교반한 후, 전기적으로 가열된 오븐에서 95℃에 정해진 시간 동안 두었다.
규칙적인 시간 간격에서 샘플(300 μl each)의 작은 표본을 채취하여 클러스터 크기 및 최대 라만 강도를 최적화시키고, SERS 신호 측정을 위해 실험하였다.상기 샘플들을 1mM 소듐 시트레이트 수용액으로 5회 희석한 후, UV-Vis 흡광도 스펙트럼 측정으로 분석하였다. 최대 라만 강도가 수득되었을 때, 상기 반응을 정지시켰다. AgNCs를 함유하는 혼합물을 실온으로 빨리 냉각시키고 0.5% w/v BSA 수용액과 혼합하여 최종 농도 0.0018 5w/v가 되게 하여 AgNCs를 안정화시켰다. 현탁액을 0.2μm PTFE 소수성 시린지 필터로 여과하고 추가의 분석을 위해 상온에서 보관하였다
연속적 실험을 수행하여 클러스터 크기 및 개별적인 입자 크기 최적화하고 최대 라만 신호를 달성하였다.
실시예 2 : AgNCs 캡슐화( Encapsulation )에 따른 기판 제조
2-1. UV - 가교결합성 Poly ( acrylamide - co - acrylic acid )의 합성; UV -P( AAm -co-AA)
광가교결합성 폴리머를 P(AAm-co-AA) 및 Crotonoyl chloride의 반응으로부터 제조하였다.
아크릴산의 카르복시기는 잔기를 함유하는 이중결합으로 부분적으로 변경할 수 있다. 크로토닐 클로라이드를 카르복시기와 반응시키고 이중결합을 이 위치에 도입하였다.
전형적인 반응에서, 2.0x10-6M의 P(AAm-co-AA)가 실온에서 50 ml D.I.에 존재하였다. 크로토닐 클로라이드를 격렬히 교반된 폴리머 용액에 매우 천천히 첨가하여 온도 상승을 피하고, 최종 농도 0.0208M가 되게 하였다. 반응 5.0 시간 후, 상기 혼합물을 150 ml의 드라이 아세톤내로 부어 침전시켰다. 상기 침전물을 아세톤으로 3회 세척하고 어두운 조건 하 저장하였다.
2-2. 폴리머 나노 섬유 내 AgNCs 캡슐화( Encapsulation )
준비된 AgNCs를 반복적으로7000 rpm에서 8분동안 원심분리하고 1mM 소듐 시트레이트 용액으로 3회 세척하여 임의의 과량의 BSA 및 다른 반응물들을 제거하였다.
그 후, 적은 양의 시트레이트 이온을 함유하고 있는 DI water에 AgNCs를 재현탁하였다. UV-P(AAm-co-AA)의 15.0 w/v% 용액을DI water 중 제조하였다. RBITC-Dextran을 폴리머의 형광염색시약 0.5 w/v%으로 첨가하였다. 2-Hydroxy-2-methylpropiophenone(photoinitiator)을 0.0024 w/w% 의 폴리머의 농도에 따라 첨가하였다.
다양한 양의 AgNCs를 폴리머 용액에 현탁하였다. 잘 분산된 현탁액을 21게이지(NanoNC, Korea)의 금속 관(metal capillary)이 구비된 1ml syringe (Becton-Dickinson, New Jersey, US)에 로딩하였다. 투입 시린지 펌프(KdScientific)를 사용하여 시간당 0.2ml의 연속적인 유속을 유지하였다. 고전압 공급기(NNC HV 30)의 양극(anode)을 모세관(capillary)에 연결시키고, 음극(cathode)은 알루미늄 호일(Fisherbrand, US)로 이루어진 수집한 기질(substrate)에 접촉시켰다. 전극 간 분리는 10 ~ 15 cm의 범위에서 다양화하였다.
전압은 14 ~ 17 kV에서 다양하게 적용하였고, 유속은 0.20 ~ 0.30 ml/hr 범위에서 유지하였다. 전기방사(Electrospinning) 실험을 주위 조건(ambient conditions)에서 수행하였다. 고체 상태에서 공초점 레이저 스캐닝 현미경 사용을 위한 나노섬유를 위해, 작은 커버 글래스를 알루미늄 호일 상에 놓았다. 폴리머 쇄를 가교결합시키기 위해, 320-500 nm 파장 범위에서 60mW/cm2 전력으로, Omnicure-1500A (Lumen Dynamics Group Inc. Canada)을 이용하여 30초 동안 알루미늄 호일을 UV광에 노출시켰다.
실시예 3 : 은 나노 입자 크기 및 나노 클러스터 크기
AgNCs 형성 동안 UV-Vis 흡광도 스펙트럼을 수득하고, 이상적인 개개의 입자 크기 및 클러스터 크기를 확인하였다.
그 결과들을 도 2에 도시하였다.
도 2(A)는 은나노입자 응집체 형성 동안 상이한 시간 간격에서 수집된 흡광도 스펙트럼을 보여준다. 개별적인 입자 크기가 배양시간 증가에 따라 증가함으로써, 400 nm에서 크고 좁은 흡광도 피크를 가졌다. 400 nm에서 주요한 흡광도 피크는 60분 내 429 nm까지 긴 파장대로 옮겨갔다. 50분에서의 649 nm에서 관찰되는 추가의 피크는 클러스터 형성을 가리킨다. RBITC는 555 nm에서 특징적인 피크를 가졌다.
도 2 (A)는 배양 시작 때를 보여주는데, 충분한 은 이온이 감소함으로써 크기 증가가 보다 빠르게 일어나고, 커브는 시간이 40분이 지남에 따라 보다 편평하게 나타났다.
그리고, 투과 전자 현미경으로 싱글 은 나노입자 및 은 나노클러스터(AgNCs)의 직경 및 형태를 확인하였다.
결과를 도 2(C) 및 2(D)에 나타냈다.
도 2(C)는 TEM 이미지로 배양시간 60분 후 클러스터가 60 ~ 100 nm 범위 크기임을 보여주고, 도 2(D)는 단일 은 시드 입자가 6~13nm 범위 크기임을 보여준다. 배양시간의 증가에 따라 개개의 입자 크기도 증가하였고, 또한, 단일 입자들 사이의 합쳐짐이, UV-Vis 스펙트럼에서 고유하게 관찰되는 은나노입자 응집체의 형성을 가져왔다.
실시예 3 : AgNCs 의 라만 신호 측정
또한, AgNCs 제조 중 라만 신호를 측정하였다.
도 2(E)는 응집 반응시간의 경과에 따른 은나노입자 응집체의 증가하는 라만 신호를 보여준다. 최대 라만 신호를 배양 시간 60분 후에 수득하였다. 매우 긴 배양 시간은 신호 강도 상에서 역효과를 가졌는데, 이는 아마도 보다 큰 클러스터 형성에 의한 것으로 생각된다.
도 2(F)는 RBITC 스펙트럼 대 배양 시간에 따른 2가지 주요한 라만 피크의 강도 플랏을 보여준다. 상이한 시간 간격에서 수집된 모든 스펙트럼 중 피크의 위치에서 주목할 만한 차이는 나타나지 않았다.
RBITC 농도를 최적화시켜 클러스터가 60 ~ 100 nm 크기로 성장한 후 최대 라만 신호를 가지도록 하였다. RBITC 및 MGITC와 같은 이소티아시아네이트 염색약은 다른 염색약과 비교하여 강한 응집 성향을 가진다. 배양시간 60분에 따른 7.5 μM RBITC의 최적 염색약 농도가 최대 SERS 신호를 생성하는 것을 발견하였다.
은 나노입자의 콜로이드성 안정성은 은 나노입자 주변의 음전하의 시트레이트 이온의 캡핑에 의해 확인된다. 이는 라만 염색약에 의한 은 나노입자의 응집 메커니즘이, 음이온에 의한 나노입자들 사이에서 정전기적 반발이 라만 염색약이 금속 나노입자의 표면에서 흡수됨에 따라 감소한다는 원리에 의존하고 있다. 개별적 입자의 크기는 은의 추가적 축적(deposition)으로 인해 증가하고, 염색약 분자들은 높은 확률로, 합쳐지는 입자들의 결합부에서 캡쳐된다.
이러한 종류의 구조체는 상기 스팟에서 존재하는 높은 전자기장 때문에 높은 라만 신호와 관련이 있다. 작은 은 시드 나노입자들은, 개별적 나노입자 25 ~ 30 nm 및 평균 응집체(클러스터) 크기 76 nm의 최대 입자 크기가 될때까지 나노입자의 증가가 이루어지는 그래프에 선명히 나타나 있듯이 매우 낮은 라만 강도를 가지고 있었다. 80 ~ 90분의 긴 배양시간 후, 응집체(클러스터) 크기는 상당히 컸고, 빨리 침전되어 신호 강도의 감소를 가져왔다.
응집체(클러스터) 형성의 유용한 의미는 혼합물의 혼탁도(turbidity), UV-Vis 스펙트럼에서 추가된 피크의 출현, 최대 라만 신호를 증가시키는 것이다. 전기방사 동안 폴리머 나노섬유 내 AgNCs가 캡슐화되고, 폴리머는 UV광으로의 노출에 의해 가교결합한다.
이를 확인하기 위해, 수득한 섬유를 물에 노출시키고 팽윤 상태에서 CLSM 이미징에 의해 관찰하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 라만 신호가 매우 안정적이었고, 광 가교결합 전후에도 이들의 원래 특성 피크를 보유하고 있었다.
다른 가교결합, 예를 들어 높은 온도에서 염색약의 탈착에 의한 라만 신호의 현저한 감소를 야기하는 열적 가교결합에서 신호가 감소하는 것과 비교하여, UV가교결합 후 신호에서는 현저한 감소가 나타나지 않았다.
실시예 5 : 다양한 파라미터와 라만신호의 관계성
배양시간, 가교결합 종류, 온도 등에 대한 앞선 실험결과에 기초하여, 라만 신호는 다양한 파라미터, 예를 들어 폴리머 나노섬유 내 AgNCs 양 조절 또는 핫 스팟의 수를 조절함에 의해 쉽게 맞출 수 있는 파라미터의 수에 의해 조절될 수 있음을 예상할 수 있었다.
이에, 다양한 파라미터에 따른 SERS 신호 특성을 조사하였다.
나노 섬유 내에서 동시에 일어나는 다른 메커니즘은, 염색약 분자들이 갇힌 결합부위에서 단일 나노입자들과의 부분적 융합으로, 결합부위에서 염색약 분자들이 전자기장에 많이 위치하기 때문에 SERS 신호가 강화되는 잠재적인 핫스팟이 된다. 이러한 염색약 응집은 높은 신호 강화를 달성하는데 유용하다. 따라서, 온도, 배양 시간, 염색약 농도, 온도 및 첨가된 은 이온 양 등으로 실험을 활용하였다.
5-1 온도와의 관계
우선, SERS 신호는 높은 온도에서 역효과를 나타냄을 알 수 있었다.
비록 다른 염색약들이 고온에서 신호로서 상이한 안정성을 가지지만, R6G 및 CV와 같은 다른 염색약에 비해서, 이소티오시아네이트기를 함유하는 염색의 경우는 이소티오시아네이트기 및 금속 입자 사이의 금속-황 결합의 결합 형성으로 인해 안정화되어 있다. 낮은 신호는, SERS효과를 감소시키는 은 나노입자로부터 염색약의 탈착에서 기인하는 것으로 생각된다. 대부분의 유기 염색약은 175℃(열적 가교결합 온도)에서 안정한 화학구조를 가지고, 염색약 분해 가능성을 제거한다.
*그러나, 내부에 라만 활성 중심을 가지는 나노섬유의 광가교결합은 SERS 신호의 현저한 저하를 방지하는 온건한 조건 하에서 이루어졌다.
P(AAm-co-AA) 및 크로토닐 클로라이드의 성공적인 폴리머화가 H1NMR 스펙트럼으로부터 확인하였다.
순수 P(AAm-co-AA)는 6.640, 6.957,6.974, 6.977,6.996,7.013 및 7.030에서 크로토닐 클로라이드에 이중 결합의 특성 피크를 보이지 않았고, 이는 도 3에 도시한 바와 같이 변형된 폴리머에서도 나타났다.
5-2. AgNCs 양과의 관계
또한, 라만 신호 강도는 스피닝 시간, 염색약 농도, 클러스터 크기 및 개개의 은 입자 크기와 같은 변하지 않는 다른 파라미터를 유지하는 동안, 폴리머 나노섬유 내 AgNCs의 양에 의존하여 변하였다.
특히, 도 4에 나타난 바와 같이 라만 강도 및 AgNCs 양 사이의 관계는 선형의 그래프로 나타났다. 따라서, 다양한 AgNCs의 양의 도입에 의해 SERS 신호를 조절할 수 있음을 예측할 수 있다.
나노섬유 내 캡슐화된 AgNCs(은나노입자 응집체)의 양에 대하여 RBITC 스펙트럼에서 특이적 피크의 라만 강도의 플롯을 도 4 (C, D)에 도시하였다.
*RBITC 스펙트럼으로부터 기준 피크로서 1645.9 cm-1를 선택하고, 다른 AgNCs 농도에서의 신호들을 비교하였다. 폴리머 나노섬유 내 다른 양의 AgNCs를 도입함으로써 목적하는 라만 신호를 쉽게 조절할 수 있음을 역시 알 수 있었다.
5-3. 용매와의 관계
그리고, 나노섬유 내 캡슐화된 AgNCs의 라만 신호 안정성을 다른 용매에 이러한 섬유 매트를 침지함으로써 분석하였다.
다른 용매, 즉, DI water, 아세톤 및 에탄올에서의 라만 신호 강도의 변화를 도 5(A)에 나타냈다.
신호는 안정적이었고 이러한 용매로의 노출에 따른 현저한 저하는 보이지 않았다. UV 조사에 의한 폴리머 쉘의 가교결합 때문에, SERS 기질을 안정화시키는 은 나노클러스터의 분해가 방지되기 때문으로 생각된다.
5-4. 신호의 재현성
한편, SERS 기질의 가장 중요한 형태 중 하나는, 특히 정량 목적의 SERS 신호의 재현성(reproducibility)이다. 라만 스펙트럼을, 나노섬유 기질의 표면에서 랜덤으로 선택한 스팟 14개에서 수집하여 신호의 재현성을 확인하였다.
이러한 결과들을 도 5 (B)에 도시하였다.
주요 피크의 강도를 다른 스팟에 표시하였다. 상당히 재현가능한 신호가 평균값으로부터 작은 편차로 나타났다.
5-5. pH 및 염 농도와의 관계
또한, 다른 pH값에서의 신호 안정성을, 실온에서 1.0 M NaOH 및 0.5 M HCl을 이용하여 pH값을 변화시켜 1.5 ~ 11.0 범위에서 분석하였다.
그 결과, 도 5(C)에 도시한 바와 같이, 캡슐화된 라만 활성 은나노입자 응집체의 라만 신호 강도는 pH의 넓은 범위에 걸쳐 안정적이었다. 은나노입자 응집체를 커버하는, 가교결합된 폴리머 네트워크가 이러한 기질의 고유한 특성을 보호한다.
그리고, 상기 기질의 신호 강도를 염 농도에 걸쳐 조사하였다. 1.0 M NaCl 수용액을 클로라이드 이온의 소스로서 사용하였다.
*라만 스펙트럼 결과를 도 5 (D)에 도시하였다. AgNCs 캡슐화하고 있는 나노섬유 매트는 염 농도의 넓은 범위에 걸쳐 매우 안정적인 신호를 보여주었다.
실시예 6 : 나노 클러스터 및 나노섬유 매트의 특성 확인
AgNCs 캡슐화하고 있는 나노섬유 매트의 형태학적 특징 및 크기를 확인하는데 SEM 이미징을 사용하였다.
상기 결과를 도 6에 도시하였다.
6-1. 나노 섬유 크기
상기 나노섬유는 5분 동안 얼룩없는 스틸 기질 상에서 직접적으로 전기 방사로 제조되었고, 나노섬유의 직경은 220 ~ 260 nm의 범위에 있었다.
7.5 % w/v, 10.0 % w/v, 12.5 w/v % 및 15.0 w/v % 의 다른 폴리머 농도를 이용하여 섬유 크기 및 균일성을 좋게 만들었다.
더 낮은 폴리머 농도는 스트링 구조상에서 비드를 따라 나노섬유 및 나노입자의 혼합물을 보였고, 폴리머 농도의 증가에 따라, 섬유의 상대적 양이 증가하였다.
또한, 12.5 w/v % 이상의 폴리머 농도를 이용하는 실험에서 스트링 구조 상 입자 및 비드가 제거되었다. 높은 폴리머 농도를 사용, 전극상의 거리 감소 및 유속 증가에 의해 나노섬유의 평균 직경이 증가함을 알 수 있었다.
6-2. 제타 포텐셜
또한, 나노입자의 표면에서 염색약의 흡착이, 클러스터 형성을 유도하는 힘인 은 콜로이드의 제타 포텐셜에서 현저한 감소를 가져왔다(데이터 도시않음).
6-3. 가교 결합
또한, 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 이용하여 가교결합된 폴리머 나노섬유 매트를 건조 상태 및 팽윤 상태에서 확인하였다.
도 6(E)는 건조 상태에서 AgNCs를 캡슐화하고 있는 폴리머 나노섬유를 현미경하에서 직접적으로 이미지화한 것이다.
도 6(F)는 폴리머의 성공적인 가교결합 후 수용액 상에서 팽윤된 섬유의 이미지이다. 나노섬유를 광 가교결합하고, 1분 동안 초음파 처리 후 D.I. water에 재현탁 하였다. 상기 섬유들은 수중 침지 후 부풀어 부드러운 매트릭스로 되어 AgNCs를 홀딩하였다. 이러한 하이드로겔 특성은 많은 생물학적 장치에 매우 유용할 것이다.
6-4. 다양한 양의 AgNCs 도입
또한, 장 방사 스캐닝 전파 전자 현미경(Field emission scanning transmission electron microscopy)을 이용하여, 다양한 밀도로 나노섬유 내 RBITC 기반의 AgNCs의 성공적인 캡슐화를 확인하였다.
나노섬유 내 AgNCs 양 증가에 따른 라만 신호 증가는, 도 7에서 나타난 바와 같은 TEM 이미지에 의해 확인된 폴리머성 나노섬유에서 AgNCs의 증가된 밀도와 일치하였다. 즉, SERS 신호는 나노섬유 내 다양한 양의 AgNCs 도입에 의해 조절될 수 있음을 알 수 있다.
실시예 7 : 말라카이트 그린 이소티오시아네이트 흔적 검출
0.5ppm ~ 6.0ppm 범위의 다양한 농도를 가진 말라카이트 그린 이소티오시아네이트의 다른 용액을, 부피비 3:1의 물 및 에탄올 혼합물에서 준비하였다. 알루미늄 호일상에 놓여진 나노섬유 매트를 적당한 크기로 잘라서 MGITC 용액에 30분 동안 침지하였다. 상기 매트를 DI water로 3회 철저히 세척하고 라만 스펙트럽 분석에 사용하였다.
라만 스펙트럼을 He/Ne 레이저의 일루미네이션, 633 nm 하 5초의 노출시간동안 수집하였다. 모든 샘플들을 라만스코프의 동일 조건 하에서 분석하였다. 캡쳐된 스펙트럼을 수정하고 정량 분석에 사용하였다. 분석물 검출을 위한 사용 전, 기질의 다양한 스팟에서 균일한 SERS 신호가 확인되었다.
다양한 농도의 분석물의 용액에서 나노섬유 매트의 침지 후 수집된 SERS 스펙트럼을 나노섬유 매트의 오리지널 스펙트럼과 비교하였다. 각 샘플을 적어도 5 스캔 사이클 동안 시험하였고, 결과물 SERS 스펙트럼의 평균을 구하였다. 1621 cm-1 에서 라만 강도는, 내부 라만 염색, RBITC로부터 발생하는 1646cm- 1 에서의 피크 동안 분석물과 일치하였다. 내부 피크의 강도에 대한 내부 분석물 피크 강도의 비율을, 증가하는 농도의 분석물 용액에 대해 표시하였다.
에탄올-물 혼합물에서 수용성인 MGITC은 쉽게 나노섬유 내에 확산되고 높은 SERS 신호를 생성하는 나노클러스터의 표면에 흡착된다. 폴리머 나노섬유 내 확산된 후 MGITC로부터 생성되는 라만 신호를 측정하여 다양한 농도에 대해서 나타냈다. 수용액 상태에서 MGITC 의 0.5 ppm 농도까지 민감하게 검출되었다. RBITC 피크를 내부 표준으로 사용하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, MGITC 피크 강도는 농도에 따라 증가하였고, 이를 통해 농도와 라만 강도 사이에 선형 관계(linear relation)가 존재함을 확인하였다.
RBITC 특성 피크 하 영역이 분석을 통해 일정하게 유지되는 것은 용액 내 RBITC의 심한 확산없이 우수한 안정성을 보이는 것을 의미한다. RBITC 피크 하 일정한 영역은, 점차적으로 증가하는 MGITC 피크 하 영역과 비교될 수 있는 있고, 다른 조건 아래 MGITC 스펙트럼에서 상이한 피크의 강도들에 의해 야기되는 에러를 제거하기 위해 내부 표준으로서 사용되었다. 높은 재현성있는 정량적 결과를 얻기 위해, 정량분석 툴로서 오직 분석물 하나만 사용하는 대신, 일정한 내부 신호에 대해 증가하는 분석물 SERS 신호의 비율이 중요함을 알 수 있었다.

Claims (6)

  1. 가교결합성 폴리머 하이드로겔 나노섬유 내부에 라만 염료에 의한 금속나노입자들의 응집체(클러스터)가 균일하게 분포되어 있는 것을 특징으로 하는, 표면-증강 라만 산란 분석용 나노섬유 복합체 기판을 준비하고; 그리고
    상기 나노섬유 복합체 기판을 분석 물질이 포함된 용액에 침지시켜서 분석 물질을 검출하는;
    단계를 포함하는 표면-증강 라만 산란 분석방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 나노섬유 복합체 기판은, 상기 금속나노입자들의 응집체들을 둘러싸는 상기 폴리머 사이에 가교결합이 형성되어 상기 금속나노입자들의 응집체와 상기 폴리머 사이에 네트워크가 형성되어 있는 것을 특징으로 하는, 표면-증강 라만 산란 분석방법.
  3. 제1 항에 있어서,
    상기 방법은
    상기 기판 내 존재하는 라만 염료에 의해 유도된 표면-증강 라만 산란에 의한 일정한 내부 표준 신호(Internal standard signal) 세기를 기준으로 비교 분석할 수 있는 것을 특징으로 하는 표면-증강 라만 산란 분석방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 방법은
    분석물질이 0.01 ~ 6 ppm 농도로 존재하는 경우에 검출 가능한 것을 특징으로 하는 표면-증강 라만 산란 분석방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 분석물질은 발암 물질인 것을 특징으로 하는 표면-증강 라만 산란 분석방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 나노섬유 복합체 기판을 상기 분석 물질이 포함된 용액에 침지시키면, 상기 분석 물질이 상기 나노섬유 복합체 기판을 통해 확산되어 상기 금속 나노입자 응집체들 표면에 흡착함으로써 분석 물질을 검출하는 것을 특징으로 하는 표면-증강 라만 산란 분석방법.
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