JP2017504039A - 高精度での単一分子解析 - Google Patents

Abstract

本発明は、単一分子を解析するため、具体的には、単一核酸分子のシーケンスをするための、プロセスに関する。

Description

本発明は、単一分子を解析するための、具体的には単一核酸分子をシーケンスするための、プロセスに関する。

約３×１０^９塩基からなるヒトゲノムまたは他の生物のゲノムのシーケンスおよび個々の配列変異の決定および比較は、第一に早く、第二にルーチン的に用いることができて費用効果的な、シーケンス方法の提供を要する。Ｓａｎｇｅｒらによる酵素的チェーンターミネーション法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４（１９７７），５４６３）のような、身近なシーケンス方法を加速させるために、具体的には自動化によって（Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ（１９９４），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、多大な試みがなされている。

費用効率的なシーケンスに関する強い要求は、複数の配列を同時に産生するシーケンスプロセスを並行するハイスループットのシーケンス技術の開発を駆り立てている。これらのシーケンス技術の例は、超並列署名シーケンス（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（Ｌｙｎｘ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ポロニーシーケンス（ｐｏｌｏｎｙ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、４５４ピロシーケンス（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、イルミナシーケンス（Ｓｏｌｅｘａ Ｉｎｃ．）、ライゲーションによるシーケンス（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、イオントレントの半導体シーケンス（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはＤＮＡナノボールシーケンス（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）である。これらの技術は、核酸集団内のコンセンサス配列の迅速解析を可能にする。しかしながら、解析すべき核酸集団内の少数配列（例えば細胞ゲノムの少数）に存在する変異は、集団内に存在する他の配列の大多数に隠されるので検出されない。

その他の方法は、単一分子シーケンス（Ｄｏｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｍａｇｉｎｇ ５（１９９７），１３９ １５２）であり、その方法では、核酸のシーケンスは、微細構造チャネル内での、蛍光標識一本鎖ＤＮＡ分子の漸進的な酵素分解および連続放出される単量体分子の検出により行われる。このプロセスは、配列決定を行なうために標的核酸の単一分子のみで十分であるという利点がある。

ＰＣＴ／ＥＰ０１／０７４６２は、固定化形態で複数の蛍光標識基を有する核酸分子を支持体上に提供するステップ、および、ヌクレオチドビルディングブロックが切断されるときに生じる、前記核酸分子または／および前記切断されたヌクレオチドビルディングブロックの蛍光の時間依存的変化に基づき、複数の核酸分子の塩基配列を同時に決定するステップを含む、多重シーケンスプロセスを開示している。ＷＯ２００３／０５２１３７によれば、支持体内に光を照射して、固定化核酸分子の領域における支持体表面上での内反射によってエバネッセント励起域を発生させることにより、配列が決定される。
ＷＯ２００６／０１３１１０は、固定化形態で核酸分解および／または核酸合成酵素分子を提供するステップ、固定化酵素をフリーの核酸分子と接触させるステップ、および、核酸ビルディングブロックが、核酸分子に取り込まれるとき、および／または、核酸分子から切断されるときに生じる時間依存的な蛍光変化に基づき、複数の核酸分子の塩基配列を同時に決定するステップを含む、多重シーケンスプロセスを開示する。
ＷＯ２０１３／１３１８８８は、特に単一分子での、核酸分子のパラレルハイスループットシーケンスのためのプロセスを開示し、環状核酸テンプレート分子の使用を含む。

最近になって、ヘリスコープ単一分子シーケンス（Ｈｅｌｉｃｏｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）または単一分子リアルタイムシーケンス（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）などの、一本鎖ＤＮＡの配列を決定するための単一分子シーケンス技術が開発されている。

現在の商業用の単一分子ＤＮＡシーケンス技術の手法は、ＤＮＡ配列のいわゆるコンセンサス決定を含む。この方法により、いくつかの似たＤＮＡフラグメントの解析によって、および正確なＤＮＡ配列を推定するための複雑な統計アルゴリズムの使用によって、ＤＮＡフラグメントの配列の正確な決定（好ましくは９９．９％以上）を提供することが意図される。これらのアルゴリズムは、解析すべきサンプル内に単一配列のみが存在するという仮説に基づく。

それ故に、サンプル内の他のＤＮＡ分子とは配列が異なる少数の配列変異体がサンプル中に存在する場合は、そのような少数の配列変異体は考慮されないが、「ノイズ」または「エラー」としてアルゴリズムにより処理される。サンプルが、だいたい同じ濃度で異なるＤＮＡ配列変異体の混合物を含む場合は、アルゴリズムに基づく解析は、「コンセンサス」配列を結論付けることができず、結果は空虚（無効）である。しかしながら、複雑なアルゴリズムの使用は、現在の商業用の単一分子ＤＮＡシーケンス技術がおよそ８５〜９０％という低い一次精度しかないことを補うために必要である。

従前のシーケンスプロセスに関する精度の問題を克服するために、本発明は、個々の鎖変異およびＤＮＡ分子の集団におけるそれらの分布の解析を可能にするために十分な精度を達成する単一分子のシーケンスプロセスを提供する。

したがって、本発明は、単一分子を解析するための、具体的には複数の単一分子を解析するための、より具体的には単一核酸分子をシーケンスするための、プロセスおよびデバイスを提供し、以下の特徴を備える：
−支持体上に解析すべき単一分子を配置するための少なくとも１つのサンプルスポットを備える支持体、
−支持体上の少なくとも１つの単一分子の位置に少なくとも１つの照らされたボリュームエレメント（例えば共焦点ボリュームエレメント）を提供する、光源（具体的には多点レーザー）、および
−支持体上の個々の単一分子からの単一光子の検出を可能にする検出器（具体的には多ピクセル検出器）。

光源、支持体および検出器の間の光学経路によって、検出器上（すなわち像面）の検出ピクセルは、支持体上（すなわち対象面上）に光学的に投影される。それにより、像面における検出ピクセルサイズは、支持体上の検出ピクセルの光学投射のサイズと比べて、例えば１０〜２００倍、好ましくは４０〜１２０倍に拡大される。

さらに、以下の図は、本発明を説明することを意図する。

ＷＯ２００２／０９７４０６に記載の、回折光学素子により生産される共焦点照明ボリュームエレメントによる、レーザー点マトリックスを示す。 １０２４−ピクセルＳＰＡＤ検出器を示す。ＳＰＡＤ検出器は、例えば３５０〜９００ｎｍの広いスペクトル域にわたる高感度と、高い時間分解能（≦１ｎｓ）とを組み合わせる。 検出器のピクセル数は、好ましくは約１００〜約５００．０００である。検出器上のピクセル直径は、好ましくは約１〜２０μｍであり、検出器ピッチ長（すなわち検出器上の個々のピクセル間の距離）は、約２〜２００μｍである。 以下において、表２は、検出器上の好ましいピクセル直径およびピッチ長のサイズを示す。 支持体上の検出ピクセル（灰色）の光学投射の中央におけるサンプルスポット（黒）のアライメントを示す。 表３は、サンプルスポット直径（ＳＤ）、ピクセル投射直径（ＰＤ）およびシーケンス精度（Ａ）の関係を表す。さらに、サンプルスポット距離（ピクセル投射距離（投射ピッチ）と等しい）およびピクセル倍率（ピクセル投射直径に対するピクセル直径の比）を示す。シーケンス精度は以下のように計算され得る： Ａ＝ｅｘｐ−（ＳＤ／ＰＤ）^２ 検出器ピクセルマトリックスおよびサンプルスポットマトリックスのアライメントは、好ましくは、検出器により駆動されるフィードバックループにおけるナノメートル精度のｘ−ｙ圧電−調節により行われる（Ｐｈｙｓｉｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｅ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。
レーザーに基づく励起によりセットアップされる対物型の内反射（ＴＩＲ）を示す。コリメートレーザービームは、高ＮＡ対物のバックフォーカス面で焦点が合わされる。コリメートレーザービームは、照らされた領域のガラス表面により全反射される。表面の蛍光分子は、表面からの距離に伴って指数関数的に減衰するエバネッセント域において蛍光に励起される。コリメートレーザービームの焦点を合わせるレンズの後の回折光学素子の導入により、レーザービームの多様性を生じることができ、それはＴＩＲにより反射される。ＳＰＡＤマトリックスのピクセルおよびＴＩＲ表面上のそれらの投射とともに、多数の共焦点ボリュームエレメントが生じ得る。 Ａｂｂｒ．ＯＬ対物レンズ、ＢＦＰバックフォーカス面（ｐｌａｎ）、ＤＭダイクロイックミラー、ＤＯＥ回折光学素子、ＧＣ角度ビーム制御、ＥＭＦ放射フィルター、ＳＰＡＤシングルフォトンアバランシェダイオードマトリックス。 ＴＩＲ（Ｆ）セットアップが入射ビームおよび全反射ビームの角度（したがって、エバネッセンス域のサイズ）の調節を可能にすることを示す。数ゼプトリットルのボリュームが、具体的にはＤＯＥ分割レーザービームを用いて達成され得る。平面の利点は、表面上の自由な流れの適用およびもつれが解けたＤＮＡ鎖に対する酵素作用である。 一次精度（ｐ）を、ＤＮＡの両方の鎖を測定した場合の一塩基の正確な読み出しの確率とともに示す。

本発明によれば、支持体上のサンプルスポットは、単一検出ピクセルの光学投射（好ましくは支持体上の単一検出ピクセルの投射の中央）に並べられる。サンプルスポットの中央とピクセル投射の中央との間のアライメントは、好ましくは、例えば５ｎｍ以下、２ｎｍ以下または実に１ｎｍ以下の許容範囲で提供される。アライメントは、回折光学素子および／または調節素子により提供され得る。支持体上のサンプルスポットおよび支持体上のピクセルの光学投射の配置は、支持体上の個々のサンプルスポット間の距離が、好ましくは支持体上のピクセルの光学投射の間の距離と等しいように配置される。それにより、個々の検出器ピクセルからのシグナル間のクロストークが回避され、個々の単一分子は、高精度で、好ましくは単一測定で、および場合により１０回まで、例えば１、２、３、４または５回の繰り返し測定で、少なくとも９９．０％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．６％または少なくとも９９．９％の精度で解析することができる。

ＤＮＡシーケンスを行なうための本発明の手法は、好ましくは少なくとも９９．９％の一次精度での単一分子ＤＮＡシーケンスの手法である。当該方法は非常に正確なので、各単一ＤＮＡ分子の配列は正確に読まれ、ほぼ１００％の精度を達成するために個々のＤＮＡ分子それぞれのおそらく２、３回（例えば１、２または３回）を超える繰り返し測定の必要がない。「コンセンサス」配列の概念は、このＤＮＡシーケンスに適用されず、測定データを解明するための複雑なアルゴリズムは必要ない。

一次精度（すなわち単一塩基の成功した同定の確率）がｐ（０＜ｐ＜１）であるならば、Ｎ塩基対の長さのＤＮＡフラグメントをシーケンスする場合に、ε（０＜ε＜１）の精度でシーケンス結果を得るのに必要なシーケンスの平均回数は、以下である。
必要なシーケンス回数＝Ｌｏｇ（１−ε）／Ｌｏｇ（１−ｐ^Ｎ） （１）

以下の表１では、等式（１）を用いて、それぞれ１００塩基対および１０００塩基対の長さのＤＮＡフラグメントについて必要なシーケンス回数を計算する。

正確な読み出しを得るために必要な再シーケンスの回数の計算（等式１の微分）

ｐは、一次精度＝単一塩基の成功した同定の確率として定義する。ｐは、０〜１の閉区間内で定義される実数値である。

Ｎは、シーケンスすべきＤＮＡ分子の塩基数である。Ｎは正の整数である。

ｐ_ｓｅｑは、Ｎ塩基の全配列が正確に読まれる確率である。ｐ_ｓｅｑは、０〜１の閉区間で定義される実数値である。その結果：
ｐ_ｓｅｑ＝ｐ^Ｎ （２）

ｒは、当該方法が所定のＤＮＡ分子由来の（ｆｏｒｍ）ＤＮＡ配列を解析および読み出す回数として定義する。Ｒは正の整数である。Ｒは、「再シーケンス回数」とも呼ばれ得る。

それから、実施されたシーケンス回数ｒのうち、少なくとも１回の読み出しが正確である確率εは、以下により与えられる。

Ｐ（実施されたシーケンス回数ｒのうち、少なくとも１回の正確な読み出し）＝

εは、０〜１の閉区間内の実数値である。

等式（３）に等式（２）を挿入すると、以下が得られる。

ε＝１−（１−ｐ^Ｎ）^ｒ
これは、以下と等しい。

１−ε＝（１−ｐ^Ｎ）^ｒ （４）

さらに、等式（４）の両側に対数関数を適用すると、以下が得られる。

ε＝１−（１−ｐ^Ｎ）^ｒ
これは、以下と等しい。

１−ε＝（１−ｐ^Ｎ）^ｒ （４）

さらに、等式（４）の両側に対数関数を適用すると、以下が得られる。

本発明は、以下のステップを含む、単一分子を解析するためのプロセスに関する：
（ａ）支持体上の個々のサンプルスポットに配置された解析すべき少なくとも１つの単一分子を提供するステップ、ここで、前記スポットは、約１〜２０ｎｍの範囲の直径を有し、各個々のスポットの間の距離は、スポットの直径の少なくとも約２倍、好ましくは約３〜１０倍である、
（ｂ）個々のサンプルスポットにおいて光源を用いて単一分子を個々に照らすステップ、ここで前記光源は、サンプルスポットにおいて少なくとも１つの照らされたボリュームエレメントを提供する、
（ｃ）少なくとも１つの検出ピクセルを備える光検出器を用いて前記単一分子からの光を個々に検出するステップ、ここで、検出器上の前記検出ピクセルは、約０．５μｍ〜５０μｍの範囲の直径を有し、各検出ピクセル間の距離は、検出ピクセルの直径の少なくとも約２倍、好ましくは約３〜１０倍、具体的には少なくとも３倍または少なくとも５倍である、および
（ｄ）個々の検出ピクセルからの検出光を、個々のスポット上に配置された単一分子と関連する事象と関連付けるステップ、
ここで、支持体上の検出ピクセルの光学投射は、約１００ｎｍ〜５μｍの範囲の直径を有し、個々のサンプルスポットは、支持体上の単一検出ピクセルの投射（具体的には、支持体上の単一検出ピクセルの投射の中央）に並べられる。

本発明は、特に、以下のステップを含む、単一分子を解析するためのプロセスに関する：
（ａ）支持体上の個々のサンプルスポットにそれぞれ配置された複数の解析すべき単一分子を提供するステップ、ここで、前記スポットは、約１〜２０ｎｍの範囲の直径を有し、個々のスポットの間の距離は、スポットの直径の少なくとも約２倍、好ましくは約３〜１０倍である
（ｂ）個々のサンプルスポットにおいて光源を用いて単一分子を個々に照らすステップ、ここで前記光源は、サンプルスポットにおいて複数の個々の照らされたボリュームエレメントを提供する
（ｃ）前記単一分子から放射される光を、光検出器を用いて個々に検出するステップ、ここで、光検出器は、複数の検出ピクセルを備え、検出器上の前記検出ピクセルは、約０．５μｍ〜５０μｍの範囲の直径を有し、前記検出ピクセルの間の距離は、検出ピクセルの直径の少なくとも約２倍、好ましくは約３〜１０倍、具体的には少なくとも３倍または少なくとも５倍である、および
（ｄ）個々の検出ピクセルからの検出光を、個々のスポット上に配置された単一分子と関連する事象と関連付けるステップ
ここで、支持体上の検出ピクセルの光学投射は、約１００ｎｍ〜５μｍの範囲の直径を有し、個々のサンプルスポットは、支持体上の単一検出ピクセルの投射（具体的には、支持体上の単一検出ピクセルの投射の中央）に並べられる。

本発明のプロセスは、単一分子の解析に関し、具体的には、複数の単一分子の並行解析に関する。それは、相互作用（例えば単一分子間の結合）および／または反応（例えば単一分子の伸長または分解）を検出するのに適している。具体的には、本発明のプロセスは、単一核酸分子のシーケンスに関する。

本発明では、解析すべき単一分子をその上に配置するための少なくとも１つのサンプルスポット（具体的には複数の個々のサンプルスポット）を備える、支持体が提供される。スポットは、約１〜２０ｎｍ、例えば約２〜１５ｎｍまたは約４〜１２ｎｍの範囲の直径を有し得る。個々のスポット間のクロストークを避けるためには、支持体上の個々のサンプルスポットの中央の間の距離（すなわちサンプルスポット距離）は、スポット直径のサイズの、好ましくは少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約５倍より大きく、少なくとも約１０倍、例えば約３〜１０倍、または約２０〜５００倍、例えば約５０〜４００倍である。サンプルスポット距離は、好ましくは、約５０ｎｍ〜５０００ｎｍ、例えば約１５０〜３０００ｎｍである。

解析すべき単一分子は、支持体上の表面に結合され得る。他の実施態様では、解析すべき単一分子は、サンプルスポットにおいて支持体表面に結合はしないがフリーの形態で存在し、または、サンプルスポットに配置されたナノ粒子、例えば約０．５〜２０ｎｍ、好ましくは約１〜５ｎｍの直径を有する粒子に結合される。

支持体上の個々のサンプルスポットにおいて単一分子を照らすために、多点照明に適切な光源、例えばレーザー光源が用いられ得る。好ましくは、光源は、多点光源、例えば多点レーザー光源である。光源は、個々のサンプルスポットにおいて複数の個々の照らされたボリュームエレメントを提供することが可能である。ボリュームエレメントは、１０^−１０〜１０^−２４ｌ、例えば１０^−１２〜１０^−２４ｌのサイズを有する。ボリュームエレメントは、共焦点ボリュームエレメントまたは全内反射（ＴＩＲ）により得られるエバネッセント域により提供されるボリュームエレメントであってよい。好ましくは、ボリュームエレメントは、全内反射（ＴＩＲ）により得られるエバネッセント域により提供される。

本発明のプロセスは、支持体上に配置された単一分子から放射される光の検出を含む。好ましくは、検出される光は、光学的に検出可能な標識基から、具体的には蛍光標識基から放射される。放射光は、続いて光検出器を用いて検出され、支持体上の個々のスポットに配置された単一分子と関連する事象と関連付けられる。

放射光の検出は、励起状態の寿命の検出、および／または回転運動性の検出および／または横方向運動性の検出および／または特定波長の検出を伴い得る。さらに、ラマン（Ｒａｍａｎ）、ラマン／アンチストークス（Ａｎｔｉｓｔｏｋｅｓ）および／または表面増強ラマン（ＳＥＲ）に基づく検出方法を用いて単一分子を同定することが可能である。好ましくは、放射光の検出は、場合により特定波長の検出と組み合わせた寿命検出を含む。例えば、異なる成分は、それらの平均寿命がおよそ１ナノセカンド異なる場合、０．９９８の精度で区別することができることが示されている。

検出すべき事象は、例えば、解析すべき単一分子と標識基の会合および／または解離によって、または、放射光の時間依存的変化を引き起こす任意の他の事象、例えば時間依存的蛍光変化によって、引き起こされ得る。

ボリュームエレメント（例えば共焦点ボリュームエレメント）の照明は、ボリューム内に存在する標識基が光（例えば蛍光）を放射するように励起させ、それは検出器を用いて測定される。照らされたボリュームエレメントのパターンは、例えばＷＯ２００２／０９７４０６（その内容は参照により本明細書中に援用される）に記載の回折光学素子を介して生じるレーザードットのマトリックス、または量子井戸レーザーにより生じ得る。好ましくは、光源は、多点光源、例えば多点レーザー光源である。光源は、適切な光学素子を光の経路内で用いることにより、複数の個々の照らされたボリュームエレメントを個々のサンプル領域に適切に提供することが可能である。ボリュームエレメントは、１０^−１０〜１０^−２４ｌ、例えば１０^−１２〜１０^−２１ｌのサイズを有してよい。

好ましい実施態様では、光が支持体内へ照射され、それにより、エバネッセント励起域が、解析すべき分子の領域内の支持体表面における内反射により生じる。解析すべき分子の領域内の支持体表面の１または複数の位置での内反射は、それぞれのスポットに存在する標識基を励起させるエバネッセント励起域を生じさせる。特に好ましい実施態様では、検出は、全内反射（ＴＩＲ）、特に全内反射蛍光（ＴＩＲＦ）検出を含む。

回折光学素子（ＤＯＥ）を用いて支持体上に多点照明を提供し得る。また、ＤＯＥは、例えばＴＩＲ（Ｆ）セットアップにおいて励起光ビームに回折光学素子を導入することにより、内反射を伴う検出方法においても用いられ得る。

本発明によれば、単一分子から放射される光は、支持体上にサンプルスポットのマトリックスとともに並べられた複数の検出ピクセルを備える光検出器を用いて検出される。好ましくは、検出器は、多点シングルフォトンアバランシェ検出器（ＳＰＡＤ）である。それは、広いスペクトル域（例えば３５０〜９００ｎｍ）にわたる高感度と、高い時間分解能（例えば≦１ｎｓ）とを組み合わせ、励起蛍光状態の寿命が分子解析に使われる場合に有利である。

標識基（例えば蛍光標識基）の正確な同定のために、励起状態の寿命は、好ましくは、波長特異的な放射とともに決定される。寿命は、好ましくは、１〜６ｎｓの範囲である。寿命、分子あたりの特性計数率（波長依存性のレーザー強度により決定される）、励起係数（例えば約１０^５／Ｍ ｃｍ）、量子収率（例えば０．３〜０．９）、および／または波長依存性の検出器感度から選択されるパラメーターの組み合わせから、特定の波長依存性の放射フィルターを使用せずに標識基の同定を行なうことができる。

さらに、レイリー（Ｒａｌｅｉｇｈ）およびラマン散乱に起因する迷光、および、光子漂白（ｐｈｏｔｏｎ ｂｌｅａｃｈｉｎｇ）および三重項状態の形成を、消去または低減するために、解析すべき単一分子のパルス励起を行なうことが好ましい。好ましいパルス励起時間は、１ｎｓ未満、例えば約５０〜５００ｐｓである。

検出器上の個々の検出ピクセルの直径は、通常、約０．５μｍ〜５０μｍである。個々の検出ピクセルは距離（すなわちピクセルピッチ長）は離れていて、その長さは、少なくともピクセル直径であり、好ましくは、検出ピクセルの直径の少なくとも約２倍、より好ましくは少なくとも約３〜１０倍である。好ましくは、検出器上のピクセル間の距離は、約２〜２００μｍ、より好ましくは約４〜１５０μｍである。

上記に概説されるように、検出ピクセルの光学投射は、支持体上に形成される。支持体上の光学投射は、検出器上の検出ピクセルのサイズよりも、例えば約１０〜２００倍または約４０〜１２０倍小さい。それ故に、光学投射は、通常、約２０ｎｍ〜約１μｍ、好ましくは約１００〜６００ｎｍの直径を有する。支持体上の個々の検出ピクセル投射の中央の間の距離（すなわち投射ピッチ長）は、検出ピクセル投射の直径の、好ましくは少なくとも約２倍、好ましくは約３〜１０倍、具体的には少なくとも３倍または少なくとも５倍である。基本的に、支持体の個々のスポット間の距離は、検出器の各検出ピクセル間の距離と一致するはずである。投射ピッチ長は、好ましくはサンプルスポット距離と同等であり、例えば約５０〜５０００ｎｍ、好ましくは約１５０〜３０００ｎｍである。

好ましい実施態様では、本発明のプロセスは、単一核酸分子のシーケンスのために用いられる。本実施態様では、プロセスは、好ましくは以下のステップを含む：
−支持体の個々のサンプルスポットにおいて、（ｉ）単一核酸分子、（ｉｉ）核酸合成酵素分子および／または核酸分解酵素分子、および（ｉｉｉ）フリーの形態および／または核酸分子内の取り込まれた蛍光標識ヌクレオチドビルディングブロックを、提供するステップ、
−酵素反応を行なうステップ、ここで、ヌクレオチドビルディングブロックは、前記単一核酸分子内に取り込まれる、および／または、前記単一核酸分子から切断される、および
−ヌクレオチドビルディングブロックが、前記単一核酸分子に取り込まれるとき、および／または、前記単一核酸分子から切断されるときに生じる、時間依存的蛍光変化に基づき、核酸分子の塩基配列を個々に決定するステップ。

核酸分子へのヌクレオチドビルディングブロックの取り込みおよび核酸分子からのヌクレオチドビルディングブロックの切断は、両方とも、標識基の蛍光放射に時間依存的変化をもたらし得る。

分解によるシーケンスに関する実施態様では、核酸分解酵素分子は、標識基（具体的には蛍光標識基）が取り込まれたシーケンスすべき核酸分子と接触する。

伸長によるシーケンスに関する実施態様では、核酸合成酵素分子は、プライマーがアニールしたシーケンスすべき核酸分子および標識基（具体的には蛍光標識基）を有するフリーのヌクレオチドビルディングブロックと接触する。

一実施態様では、核酸合成酵素分子および／または核酸分解酵素分子は、例えば支持体上または支持体上に配置されたナノ粒子上に固定化され得る。別の実施態様では、シーケンスすべき核酸分子は、例えば支持体上または支持体上に配置されたナノ粒子上に固定化され得る。

一実施態様では、本出願は、個々の核酸分子をシーケンスするためのプロセスに関し、以下のステップを含む：
（ａ）固定化形態の少なくとも１つの核酸合成酵素分子、環状または線状の核酸テンプレート、前記テンプレートにアニールしたプライマーまたは前記核酸テンプレートにアニールすることが可能なプライマー、および蛍光標識ヌクレオチドビルディングブロックを、提供するステップ、
（ｂ）前記固定化核酸合成酵素分子により触媒されるプライマー伸長において、前記ヌクレオチドビルディングブロックを取り込んだ、核酸テンプレート分子の配列と相補の核酸分子を生産するステップ、
（ｃ）場合により、前記の生産された核酸分子を核酸分解酵素分子と接触させて、前記核酸分解酵素分子により触媒されるヌクレアーゼ消化において、個々のヌクレオチドビルディングブロックを前記の生産された核酸分子から切断するステップ、および
（ｄ）ヌクレオチドビルディングブロックが、プライマー伸長中に取り込まれるとき、および／または、ヌクレアーゼ消化中に切断されるときに生じる、時間依存的蛍光変化に基づき、前記核酸テンプレート分子の塩基配列を決定するステップ。

さらなる実施態様では、本出願は、個々の核酸をシーケンスするためのプロセスに関し、以下のステップを含む：
（ａ）核酸合成酵素、固定化形態の環状または線状の核酸テンプレート分子、前記テンプレートにアニールしたプライマーまたは前記核酸テンプレートにアニールすることが可能なプライマー、および蛍光標識ヌクレオチドビルディングブロックを、提供するステップ、
（ｂ）前記核酸合成酵素分子により触媒されるプライマー伸長において、前記ヌクレオチドビルディングブロックを取り込んだ、前記固定化核酸テンプレートの配列に相補の核酸分子を生産するステップ、
（ｃ）場合により、前記の生産された核酸分子を核酸分解酵素分子と接触させて、前記核酸分解酵素分子により触媒されるヌクレアーゼ消化において、個々のヌクレオチドビルディングブロックを前記の生産された核酸分子から切断するステップ、および
（ｄ）ヌクレオチドビルディングブロックが、プライマー伸長中に取り込まれるとき、および／または、ヌクレアーゼ消化中に切断されるときに生じる、時間依存的蛍光変化に基づき、前記核酸テンプレートの塩基配列を決定するステップ。

さらなる実施態様では、本出願は、以下のステップを含むプロセスに関する：
（ａ）固定化形態の少なくとも１つの核酸分解酵素分子、蛍光標識ヌクレオチドビルディングブロックを含む核酸分子を提供するステップ、
（ｂ）前記核酸分解酵素分子を前記核酸分子と接触させて、前記核酸分解酵素分子により触媒されるヌクレアーゼ消化において、個々のヌクレオチドビルディングブロックを前記核酸分子から切断するステップ、および
（ｃ）ヌクレアーゼ消化中にヌクレオチドビルディングブロックが切断されるときに生じる時間依存的蛍光変化に基づいて、前記核酸分子の塩基配列を決定するステップ。

さらなる実施態様では、本出願は、個々の核酸をシーケンスするためのプロセスに関し、以下のステップを含む：
（ａ）固定化形態の蛍光標識ヌクレオチドビルディングブロックを含む少なくとも１つの核酸分子、および、核酸分解酵素分子を提供するステップ、
（ｂ）核酸分子を核酸分解酵素分子と接触させて、前記核酸分解酵素分子により触媒されるヌクレアーゼ消化において、個々のヌクレオチドビルディングブロックを前記核酸分子から切断するステップ、および
（ｃ）ヌクレアーゼ消化中にヌクレオチドビルディングブロックが切断されるときに生じる時間依存的蛍光変化に基づき、前記核酸分子の塩基配列を決定するステップ。

本発明のプロセスは、支持体に基づく多重シーケンス方法であり、複数の個々の核酸分子がシーケンスされることを可能にする。これは、シーケンスすべき核酸分子および複数の核酸合成および／または分解反応の時間依存的蛍光変化を並行して決定するための核酸分解および／または核酸合成酵素を含む、反応スペースを提供することにより達成される。プロセスは、好ましくはパラレルハイスループットの単一分子解析の形態で行なわれる。

好ましい実施態様では、核酸合成酵素分子は固定化形態で提供される。また、核酸分解酵素分子も固定化形態で存在してもよく、またはフリーの形態で存在してもよい。さらに他の実施態様では、核酸合成酵素分子と核酸分解酵素分子のハイブリッドおよび／またはコンジュゲート、例えば、二機能性リンカー分子により結合された遺伝子融合および／またはコンジュゲートを用いてよい。

さらに好ましい実施態様では、複数の核酸分子を固定化形態で有する支持体が提供される。この実施態様では、核酸合成酵素分子および／または核酸分解酵素分子またはそれらのハイブリッドおよび／またはコンジュゲートは、フリーの形態で用いられ得る。

前記プロセスに用いられる支持体は、任意の平面または構造化された支持体であってよい。好ましくは、支持体は平面である。適切な支持体材料の例は、ガラス、石英、プラスチック、金属、シリコンなどの半金属、例えば二酸化ケイ素などの金属酸化物、または前記材料を含む複合材料である。支持体は、少なくともサンプルスポットの領域に、十分な光透過性、および、支持体を通した蛍光放射光の後方散乱または／および蛍光励起光による照射のため、または消失に基づく蛍光検出のための、適切な表面特性を有し得る。原理的に、支持体は、個々のヌクレオチドビルディングブロックが、液体反応混合物において前記支持体と接触した核酸に取り込まれ、および漸進的に切断されるのを可能にする反応スペースが形成され得る限り、任意のデザインを有してもよい。

本発明のプロセスは、支持体またはその一部にわたって形成される単一の反応スペース内で行なうことができ、そこに酵素または核酸分子が固定化される。あるいは、プロセスは、支持体にわたる別個の複数の反応スペースでも行われ得て、別個の反応スペースは、少なくともプロセスの特定のステップの間、互いに連通していない。複数の個別の反応スペースは、支持体上に、例えば、ナノ−および／またはマイクロウェルおよび／またはナノ−またはマイクロスポットにより形成され得る。

酵素または核酸分子は、共有または非共有の相互作用を介して固定化され得る。例えば、ビオチン／ストレプトアビジンまたはアビジン、ハプテン／抗−ハプテン抗体、糖／レクチンなどの特定の結合ペアのパートナー間の高親和性の相互作用は、ポリペプチドまたは核酸の固定化を仲介することができる。したがって、ビオチン化した酵素または核酸分子を、ストレプトアビジンで被覆した表面に結合させることが可能である。あるいは、酵素または核酸分子は、吸着を介して固定化してもよい。したがって、アルカンチオール基の取り込みにより修飾された酵素または核酸分子は、金属の支持体（例えば金で作られた支持体）に結合し得る。さらに他の代替は、シリカ表面上の反応性シラン基を介して酵素または核酸分子の結合を仲介することができる、共有結合の固定化である。

本発明によれば、少なくとも１つの単一分子が解析される。好ましくは、複数の単一分子が解析される。これらの分子は、支持体上のサンプルスポットに配置される。それらは、フリーの反応パートナーを含むサンプル液体と接触する。それにより、１つまたは複数の反応スペースが規定される。好ましくは少なくとも１００、特に好ましくは少なくとも１０００、特に好ましくは少なくとも１０ ０００、および、１０^６を超えるほどの分子が、単一支持体（例えば単一平面支持体）上で解析され得る。

解析すべき分子（例えば酵素または核酸分子）は、例えばビオチン化分子の希釈溶液を支持体と接触させることによって、支持体表面上の特定のスポットに適用され、その特定の領域のみがストレプトアビジンで被覆されている。核酸分解酵素分子が固定化される実施態様では、それらは核酸合成酵素分子とともに固定化され得て、すなわち、両方のタイプの酵素分子が支持体表面の同一スポットに結合する。

配列を決定すべき核酸分子は、例えば、ゲノムＤＮＡフラグメント、ｃＤＮＡ分子、プラスミドなどのＤＮＡ分子、またはｍＲＮＡ分子などのＲＮＡ分子から、選択され得る。核酸分子は、細胞または生物（例えば真核生物または原核生物の細胞または生物）から生産されるゲノムまたは発現ライブラリーに由来してよい。本発明のプロセスは、複数の異なる核酸テンプレート分子、例えば少なくとも１０、１００、１．０００または１０．０００、および、１００．０００、１０^６または１０^７まで、またはさらにより多くの異なる核酸分子の、パラレルシーケンスを可能にする。

好ましくは、シーケンスすべき核酸分子は、線状または環状形態の一本鎖核酸分子、例えば共有結合した環状形態である。環状核酸テンプレートを取得するために、サンプル調製中、線状核酸分子を環状化手順および場合により鎖分離手順に供し得る。環状化は、例えばＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼを用いた公知のプロトコルによるライゲーションにより達成され得る。一部の実施態様では、アダプターおよび／または識別分子、すなわち、公知配列の核酸分子を、核酸分子に結合させてよい。

核酸分子は、好ましくは２０〜１００ ０００ヌクレオチド、特に好ましくは２０〜５０ ０００、より好ましくは２０〜１０ ０００、２０〜５０００ヌクレオチド、特に好ましくは５０〜２０００または１００〜１０００ヌクレオチドの長さである。配列決定は、核酸伸長および／または核酸分解を含んでよい。シーケンスプロセスは、１または複数のシーケンスサイクルを含む。

核酸合成酵素分子は、核酸テンプレート分子にアニールしたプライマーを伸長させることが可能である。好ましくは、プライマー伸長は、伸びている核酸鎖の３’末端に個々のヌクレオチドビルディングブロックを漸進的に取り込むことにより行われ、環状核酸テンプレートの配列に相補の核酸分子が生産される。核酸合成酵素は、テンプレート特異的な核酸重合が可能なポリメラーゼから選択され、好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼ、例えば天然または修飾ポリメラーゼ（耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む）から選択される。

適切なＤＮＡポリメラーゼの具体例は、Ｔａｑポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ−欠損Ｔａｑポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、逆転写酵素、野生型Φ２９ポリメラーゼを含むΦ２９−関連ポリメラーゼ、およびそのようなポリメラーゼの誘導体、例えば、エキソヌクレアーゼ−欠損型、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＢ６９ポリメラーゼおよびその他を含む。

核酸分解酵素分子は、個々のヌクレオチドビルディングブロックを核酸分子から漸進的に切断することが可能である。好ましくはエキソヌクレアーゼ、より好ましくは３’→５’方向または５’→３’方向で分解する一本鎖エキソヌクレアーゼが用いられる。特に好ましく用いられるエキソヌクレアーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉエキソヌクレアーゼＩおよびＥ．ｃｏｌｉエキソヌクレアーゼＩＩＩなどの３’→５’エキソヌクレアーゼ、および、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉエキソヌクレアーゼＩＩおよびＥ．ｃｏｌｉエキソヌクレアーゼＶＩＩＩなどの５’→３’エキソヌクレアーゼである。さらに、様々なポリメラーゼ（例えばＫｌｅｎｏｗフラグメント、ＴａｑポリメラーゼまたはＴ４ポリメラーゼ）のエキソヌクレアーゼ活性を用いてよい。

核酸合成酵素分子は、線状または環状の核酸テンプレート分子、例えば一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子、および、核酸テンプレート分子にアニールしたプライマー分子またはそれにアニールすることが可能なプライマー分子と接触する。プライマー分子は、好ましくは、固定化核酸合成酵素分子により触媒される酵素反応により伸長することのできるフリーの３’末端を有する、一本鎖核酸または核酸アナログ分子である。プライマー分子の長さは、反応条件下でテンプレートに対して効果的なアニールが可能であるように選択される。通常、プライマー分子の長さは、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２または少なくとも１５ヌクレオチド、例えば、２０、２５、５０または１００ヌクレオチドまでであり、または実にそれよりも長い。一部の実施態様では、プライマーは、例えば、分解に対して安定性のあるヌクレオチドビルディングブロック間の結合および／またはヌクレオチドアナログビルディングブロックの取り込みにより、核酸分解酵素分子による消化に対して耐性がある。他の実施態様では、プライマーは、核酸分解酵素分子による消化に対して感受性である。

プライマーの配列は、反応条件下でテンプレート分子に効率的にアニールするように選択される。例えば、プライマーは、未知の核酸配列に統計的にアニールすることが可能な普遍的なディジェネレートプライマーであってよい。他の実施態様では、プライマーは、核酸テンプレート分子の公知配列部分にアニールすることが可能であってよい。この実施態様では、公知のアダプターおよび／または識別配列が、核酸テンプレート分子に取り込まれてよい。プライマーは非標識でよく、または蛍光標識基を含んでよい。

さらに、少なくとも１つの蛍光標識基を有するヌクレオチドビルディングブロックの存在が必要とされる。好ましくは、それぞれの異なるヌクレオチドビルディングブロック（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ／Ｕ）は、異なる蛍光標識基を含む。

蛍光標識基は、生体高分子（具体的には核酸）を標識化するのに用いられる公知の蛍光標識基（例えば、フルオレセイン、ローダミン、オキサジン、例えばＥｖｏｂｌｕｅまたはＧｎｏｔｈｉｓ Ｂｌｕｅ、フィコエリトリン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＩＲ色素またはそれらの誘導体など）から選択してよい、

ヌクレオチドビルディングブロックは、（ｉ）核酸合成酵素分子により触媒されるプライマー伸長中、ビルディングブロックが核酸分子に取り込まれるときに、ビルディングブロックに留まる蛍光標識基、および／または（ｉｉ）核酸合成酵素分子により触媒されるプライマー伸長中、ビルディングブロックが核酸分子に取り込まれるときに、ビルディングブロックから切断される蛍光標識基を、有し得る。ビルディングブロックに留まる蛍光標識基は、好ましくは、α−リン酸基、糖および／または核酸塩基の基に結合している。好ましくは、ビルディングブロックに留まる蛍光標識基は、例えば、１５まで、好ましくは１０〜１２個の炭素原子の鎖長（場合により、ヘテロ原子、例えばＮ、ＯまたはＳ原子を含む）を有し得るリンカーを介して、核酸塩基に結合している。ビルディングブロックが核酸分子に取り込まれるときに切断される蛍光標識基は、例えば六−、五−、四−または三リン酸ビルディングブロックの末端リン酸基、例えば、三リン酸ビルディングブロックのγ−リン酸基に、結合し得る。特定の実施態様では、（ｉ）取り込み後に留まる蛍光標識基、および（ｉｉ）取り込み中に切断される蛍光標識基の両方を含むビルディングブロックが選択される。この場合、例えばクエンチングおよび／またはエネルギー移動により互いに作用することが可能な蛍光基を選択し得る。

核酸分子が核酸分解酵素分子を用いたダイレクトシーケンスに供される場合、シーケンスすべき核酸分子は蛍光標識基を含む。一方で、核酸分子がプライマー伸長におけるテンプレートとして用いられる場合は、シーケンスすべき核酸分子は、蛍光標識基を含まなくてよい。

本発明のプロセスは、核酸合成酵素分子により触媒される、プライマー伸長においてヌクレオチドビルディングブロックが取り込まれた核酸分子を生産するステップ、および／または、核酸分解酵素分子により触媒される、生産された核酸分子から個々のヌクレオチドビルディングブロックを切断する第二のステップを含んでよい。蛍光標識のタイプにより、核酸配列決定は、プライマー伸長中および／または分解中に行なわれ得る。

プライマー伸長中の配列決定は、核酸分子に取り込まれるときにビルディングブロックから切断される蛍光標識基を有するヌクレオチドビルディングブロックの使用を含む。この場合、ヌクレオチドビルディングブロックからの蛍光標識基の切断に起因する時間依存的蛍光変化が決定され得る。核酸分解中の配列決定は、核酸分子に取り込まれるときにビルディングブロックに留まる蛍光標識基を有するヌクレオチドビルディングブロックの使用を含む。核酸分子からの個々のヌクレオチドビルディングブロックの漸進的な切断は、標識ヌクレオチドビルディングブロックが核酸分子から解離するときに、蛍光の時間依存的変化を生じさせる。特定の実施態様では、伸長および分解中に、すなわち、ビルディングブロックが核酸分子に取り込まれるときにビルディングブロックに留まる蛍光標識基およびビルディングブロックから切断される蛍光標識基の両方を有するヌクレオチドビルディングブロックを用いる場合に配列決定を行なうことも可能である。この実施態様では、両方の蛍光基は同一または異なってよい。

一部の実施態様では、本発明の方法は、核酸分子テンプレートの塩基配列を決定するために、核酸合成および核酸分解の１または複数のサイクルを含む。核酸合成は、核酸合成酵素分子により触媒される、核酸テンプレート分子にアニールしたプライマーの伸長を含み、核酸テンプレートの配列に相補の核酸分子が生産される。次のステップで、生産された核酸分子は、核酸分解酵素分子により分解される。

伸長した核酸分子にヌクレオチドビルディングブロックが取り込まれる場合、蛍光の時間依存的変化が生じ得て、上記に示したとおりに検出することができる。好ましくは、伸長した核酸分子へのヌクレオチドビルディングブロックの取り込みは、蛍光の検出可能な増大と関連し、好ましくは、蛍光の一過的な増大と関連する。例えば、ビルディングブロックがプライマーへ取り込まれるときに切断される分子の部分（例えばγ−リン酸基）に蛍光標識基を有するヌクレオチドビルディングブロックを用いてよい。

合成された核酸分子からヌクレオチドビルディングブロックが切断される場合、蛍光の時間依存的変化は、核酸鎖に組み込まれた蛍光標識基と、隣接基、例えば核酸の化学基、具体的には核酸塩基（Ｇなど）、または／および隣接蛍光標識基との相互作用により判定され得て、これらの相互作用は、クエンチングプロセスまたは／およびエネルギー移動プロセスにより、「分離した」形態の蛍光標識基と比べた蛍光（具体的には蛍光強度）の変化をもたらす。個々のヌクレオチドビルディングブロックの切断による除去は、蛍光全体、例えば固定化核酸鎖の蛍光強度を変化させ、この変化は個々のヌクレオチドビルディングブロックの切断による除去の関数であり、すなわち時間の関数である。

特定の実施態様では、生体分子複合体と標識ヌクレオチドの関連性は、放出光子の偏光を測定することにより検出される。励起状態の光子の偏光は、光を放射するヌクレオチド標識の回転運動により変化し、重合プロセスにおいて、結合した標識ヌクレオチドに対する自由運動を同定するのに用いることができる。

伸長および／または分解中の蛍光のこの時間依存的変化は、複数の核酸分子に関して並行して記録して、個々の核酸鎖の塩基配列と関連付けることができる。標識基を含むヌクレオチドビルディングブロックまたはクエンチングを引き起こす隣接ビルディングブロックが切断により除去された後に少なくとも部分的に蛍光強度が増大するように、核酸鎖に組み込まれるときはクエンチングされる蛍光標識基を用いることが優先される。

個々のヌクレオチドビルディングブロックの取り込みおよび／または除去の間、核酸鎖または／および取り込まれたヌクレオチドビルディングブロックまたは切断されたヌクレオチドビルディングブロックの蛍光強度の変化を測定することが、クエンチングプロセスまたはエネルギー移動プロセスのおかげで可能である。経時的な蛍光強度のこの変化は、試験した核酸鎖の塩基配列に依存し、したがって、配列と相関し得る。

核酸分子の完全配列は、全ての４つの異なる塩基、例えばＡ、Ｇ、ＣおよびＴ、または２または３個の異なる塩基の組み合わせが標識された、ヌクレオチドビルディングブロックの混合物を用いることにより決定され得る。また、適切な場合は、最初にシーケンスのスタート時は公知の蛍光パターンで、その後にのみ、試験すべき未知配列に対応する蛍光パターンが得られるように、試験すべき核酸鎖に「配列識別子」（すなわち公知配列の標識核酸）を、例えばリガーゼまたは／およびターミナルトランスフェラーゼを用いた酵素反応により結合させることも可能である。

検出は、蛍光標識基を励起させるために、好ましくはレーザーを用いて、または別の適切な光源により、支持体へ光を照射するステップを含む。これに関連して、１つまたは複数のレーザービーム、例えば約１〜２０ｍｍの横断面を有する拡大レーザービーム、または／および、多重レーザービームを用いることが可能である。検出は、好ましくは、レーザーによる多点蛍光励起、例えば、回析光学（ＷＯ２００２／０９７４０６参照）または量子井戸レーザーを介して生産されるレーザードットのドットマトリックスを含む。

複数の核酸鎖の蛍光放射は、例えば、ＣＣＤカメラなどの電子検出器マトリックス、ＣＭＯＳカメラなどのＣＭＯＳ検出器マトリックス、またはアバランシェフォトダイオードマトリックスを備える検出器マトリックスを用いて、並行して検出され得る。検出は、蛍光励起および検出が、試験される全ての核酸鎖について並行して行われるようにして行なわれ得る。これに対するあり得る代替は、それぞれの場合において数回のステップで核酸鎖の部分を試験することである。反応スペースまたは支持体本体を通って支持体表面から本質的に直角に放射される蛍光の検出を行なうことが優先される。

検出は、例えば、共焦点単一分子検出を用いて、例えば蛍光相関分光法により行なってよく、その方法は、非常に小さな（好ましくは共焦点の）ボリュームエレメント（例えば１０^−２１〜１０^−１０ｌ）を、レーザーの励起光または別の適切な光源に曝露するステップを含み、その光は、後者が蛍光を放射するようにこの測定ボリューム内に存在するレセプターを励起し、前記測定ボリュームから放射される蛍光が光検出器を用いて測定され、そして、適度に高希釈で前記測定ボリューム内の個々の分子を同定することが可能なように、経時的に測定される放射の変化が解析物の濃度と関連付けられる。検出に用いられる手順および器具の詳細は、欧州特許０ ６７９ ２５１の開示に見ることができる。単一分子の共焦点決定は、Ｒｉｇｌｅｒ ａｎｄ Ｍｅｔｓ（Ｓｏｃ．Ｐｈｏｔｏ−Ｏｐｔ．Ｉｎｓｔｒｕｍ．Ｅｎｇ．１９２１（１９９３），２３９ ｆｆ．）およびＭｅｔｓ ａｎｄ Ｒｉｇｌｅｒ（Ｊ．Ｆｌｕｏｒｅｓｃ．４（１９９４）２５９−２６４）にさらに記載されている。

これに代え又はこれに加えて、検出は、例えばＲｉｇｌｅｒらによる「Ｕｌｔｒａｆａｓｔ Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｓ」、Ｄ．Ｈ．Ａｕｓｔｏｎ，Ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ １９８４の「Ｐｉｃｏｓｅｃｏｎｄ Ｓｉｎｇｌｅ Ｐｈｏｔｏｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ」に記載の、「タイムゲーティング」と呼ばれる時間分解減衰測定の方法で行なってもよい。ここでは、蛍光分子は、測定ボリューム内で励起され、その後に、好ましくは≧１００ｐｓの時間間隔で検出間隔を開けて、光検出器上で励起される。このようにして、ラマン効果により生じるバックグラウンドシグナルを、単一分子が本質的に干渉されない様式で検出されるのを可能にするように十分に低く保つことが可能である。

また、本発明は、少なくとも１つの個々の単一分子を解析するための器具、例えば、少なくとも１つの核酸分子をシーケンスするための器具に関し、以下を含む：

（ａ）解析すべき単一分子を個々のスポット上に配置するための少なくとも１つのサンプルスポットを備える支持体、ここで、前記スポットは、約１ｎｍ〜２０ｎｍの範囲の直径を有し、個々のスポット間の距離は、スポットの直径の少なくとも約１０倍、好ましくは約２０〜５００倍である、
（ｂ）個々のスポットで単一分子を個々に照らすための、支持体上のサンプルスポットにおいて少なくとも１つの個々の照らされたボリュームエレメントを提供する光源
（ｃ）個々のスポットにおいて単一分子から放射される光を個々に検出するための、少なくとも１つの検出ピクセルを備える光検出器、ここで、前記検出ピクセルは、約０．５μｍ〜５０μｍの範囲の直径を有し、前記検出ピクセルの間の距離は、検出ピクセルの直径の少なくとも約２倍、好ましくは約３〜１０倍である、および
（ｄ）個々の検出ピクセルからの検出シグナルを、個々のスポット上に配置された単一分子と関連する事象と関連付けるための手段、
ここで、支持体上の検出ピクセルの光学投射は、約１００ｎｍ〜５μｍの範囲の直径を有し、個々のサンプルスポットは、支持体上の単一検出ピクセルの投射（具体的には、支持体上の単一検出ピクセルの投射の中央）に並べられる。

本発明はさらに、以下を含む、複数の個々の単一分子または複数の個々の核酸分子を並行して解析するための器具に関する：
（ａ）解析すべき単一分子を個々のスポット上に配置するための複数のサンプルスポットを備える支持体、ここで、前記スポットは、約１〜２０ｎｍの範囲の直径を有し、個々のスポットの間の距離は、スポットの直径の少なくとも約１０倍、好ましくは約２０〜５００倍である、
（ｂ）個々のスポットで単一分子を個々に照らすための、支持体上のスポットにおいて複数の個々の照らされたボリュームエレメントを提供する光源
（ｃ）個々のスポットにおいて単一分子から放射される光を個々に検出するための、複数の検出ピクセルを備える光検出器、ここで、検出器上の前記検出ピクセルは、約０．５μｍ〜５０μｍの範囲の直径を有し、前記検出ピクセルの間の距離は、検出ピクセルの直径の少なくとも約２倍、好ましくは約３〜１０倍である、および
（ｄ）個々の検出ピクセルからの検出光を、個々のスポット上に配置された単一分子と関連する事象と関連付けるための手段、
ここで、スポットは、支持体表面上の領域、例えば、金属、半金属またはシランの領域を含んでよい。

金属スポットは、金属（例えばＡｕ、Ａｇ、Ａｌ、Ｃｒ、Ｎｉおよびその他）の気相蒸着により調製してよく、エレクトロビームリソグラフィーまたは同等技術によって製造され得るグリッドマスクで覆われた支持体上で気化される。グリッドマスクの穴のサイズは、支持体表面上のスポットのサイズに対応し得る。好ましくは、グリッドマスクの穴の直径は、５ｎｍ以下である。あるいは、支持体上のスポットは、例えば２〜１０ｎｍのサイズを有するナノ粒子の部位特異的な沈着により、支持体上（具体的には平面を有する支持体上）に粒子をゼプトリットルの精度でピペッティングすることにより、調製され得る。粒子は、金属、例えばＡｕ、Ａｇ、Ａｌ、Ｃｒ、Ｎｉまたはその他、半金属またはシランから選択される表面を有し得る。あるいは、粒子は、蛍光特性を有し得る量子ドットから作ることができる。支持体および／または粒子上のスポット表面領域は、ビオチンおよび／またはストレプトアビジンまたは他の親和剤により、上述のように修飾され得る。

支持体上のサンプルスポットは、好ましくは、個々の検出ピクセルの投射の中央に並べられる。サンプルスポットおよび検出ピクセル投射の間のアライメントの調節は、検出器により駆動されるフィードバックループにおけるナノメートルの精度の圧電−調節素子により行われ得る。サンプルスポットの中央と検出ピクセル投射の中央との間の調節の許容範囲は、好ましくは約５ｎｍ以下、約２ｎｍ以下、または約１ｎｍ以下である。

本発明のプロセスおよび本発明の器具は、例えば、ゲノムおよびトランスクリプトームの解析または差分解析、例えば個々の種または種内の生物のゲノムまたはトランスクリプトームにおける違いに関する研究において、用いられ得る。特に好ましいのは、配列（例えば少なくとも１０、少なくとも１０^２、少なくとも１０^３または少なくとも１０^４の個々の配列）の集団内の個々のサブシーケンスの度数および／または分布の決定である。

好ましい実施態様では、本発明のプロセスおよび本発明の器具は、準種配列（Ｍ．Ｅｉｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｑｕａｓｉ Ｓｐｅｃｉｅｓ」，Ｊ．Ｐｈｙｓ． Ｃｈｅｍ．９２，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９８８，６８８１−６８９１；Ｍ．Ｅｉｇｅｎ＆Ｃ．Ｂｉｅｂｒｉｃｈｅｒ，「Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｅ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ Ｖｉｒｕｓ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ」，ｉｎ ＲＮＡ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．３： Ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ＲＮＡ Ｇｅｎｏｍｅｓ；ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９８８；Ｍ．Ｅｉｇｅｎ＆Ｒ．Ｗｉｎｋｌｅｒ−Ｏｓｗａｔｉｔｓｃｈ，「Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｇｅｏｍｅｔｒｙ ｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｓｐａｃｅ」，ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ：Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９９０，Ｍ．Ｅｉｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，「Ｔｈｅ Ｈｙｐｅｒｃｙｃｌｅ−Ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｏｆ ＲＮＡ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｃｙｃｌｅ ｏｆ ａｎ ＲＮＡ Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ」，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９９１，１１００５−１１０１８，Ｍ．Ｅｉｇｅｎ，「Ｖｉｒａｌ Ｑｕａｓｉｓｐｅｃｉｅｓ」，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ， Ｊｕｌｙ １９９３，４２−４９，Ｅ．Ｄｏｍｉｎｇｏ ｅｔ ａｌ．「Ｑｕａｓｉｓｐｅｃｉｅｓ ａｎｄ ＲＮＡ Ｖｉｒｕｓ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」，Ｌａｎｄｅｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｍａｄａｍｅ Ｃｕｒｉｅ Ｄａｔａｂａｓｅ，２０００およびそれらで引用される参考文献を参照）の解析に用いられ得る。

単一分子シーケンスを用いて、種内の生物の集団内または生物内の細胞の集団内の個々の配列の分布を決定し得る。例えば、細菌またはウイルスなどの生物の集団、または、精子などの細胞の集団は、それらのゲノムの特定配列中に同一の遺伝情報を含まない。その代わりに、独特の個々の配列（いわゆる準種または亜種に相当する）が存在し、所定の長さにわたって１個または数個、例えば２、３または４個のヌクレオチドが異なる。本発明はここで、単一分子シーケンスを用いて、具体的には個々の変異の繰り返しサイクルの単一分子シーケンスを用いて、個々の変異配列の正確な決定を可能にする。それにより、生物（例えばウイルスまたは細菌性生物）の集団または細胞（例えば精子）の集団内の個々のサブシーケンスの度数および分布が決定され得る。この情報を用いて、所定の生物集団または細胞集団内の亜種の分布が正確に決定され得る。これは、−細菌またはウイルスなどの病原性生物の場合−例えば薬剤耐性変異の存在または不存在を検出することにより、改善された診断および治療を可能にする。精子などの細胞の場合、例えば特定の遺伝子型の存在または不存在を検出することにより、改善された遺伝解析が行われ得る。

シーケンスの精度は、標的二本鎖ＤＮＡのいわゆる＋および−鎖の両方をシーケンスすることにより、さらにいっそう改善することができる。＋および−鎖の両方をシーケンスすることにより、１０^６の分析したヌクレオチドのうち誤ったヌクレオチド解読が１つである精度を達成することが可能である。ＤＮＡは、核塩基の２本の鎖からなる。一方の鎖の各核塩基型は、他方の鎖の塩基型と相補であり、各相補鎖は＋および−鎖と呼ばれる。以降、我々は、用語「塩基対合」を用いて、一方のＤＮＡ鎖が他方のＤＮＡ鎖の塩基型と、ＡおよびＴおよびＣおよびＴが同一の塩基番号において常に互いに反対に位置するように相補であることを記載する。さらに我々は、相補ＤＮＡ鎖を「＋鎖」および「−鎖」と呼ぶ。

本発明の実施態様によれば、単一ＤＮＡ分子の＋鎖および−鎖を解析することが可能である。この実施態様によれば、核酸標的は、単一の二本鎖核酸の２本の相補鎖から構成される。したがって、２本の相補鎖は、＋および−鎖と呼ばれる。したがって、一実施態様では、核酸標的は、＋および−鎖から構成される。

ここで一次精度（ｐ）は、単一の鎖（＋または−鎖）のみを用いて、その方法が、単一ＤＮＡ分子内の単一塩基の型（Ａ、Ｔ、ＣまたはＧのいずれか）を正確に同定および報告する確率として定義される。

単一ＤＮＡ分子の＋鎖および−鎖の両方ともが本発明の一実施態様により読まれる場合、方法の一次精度は、単一ＤＮＡ分子の単一の鎖のみが解析される状況に比べて高くなる。塩基対合の規則の先験的知識を用いて、各塩基型の決定における統計精度は、さらに以下に述べるように、高くなる。

二本鎖ＤＮＡ分子内の２つの相補塩基を測定する場合、塩基型が塩基対合の規則に従うことのみが論理的に正しい結果である。このようにして、塩基の誤測定を特定して破棄することができる。特定することができない唯一の事象は、誤った結果が塩基対合の規則に従うようにして、両方の相補塩基を当該方法が間違って決定する事象である。前の文が定義する事象の確率は（１−ｐ）^２である。それ故に、当該方法が、二本鎖ＤＮＡ（＋および−鎖の両方を含む核酸標的）の塩基を正確に決定する確率は１−（１−ｐ）^２であり、それは以下と等しい。
ｐ（二本鎖ＤＮＡを用いた方法により一塩基が正確に決定される）＝ｐ（２−ｐ） （６）

図６において、一次精度（ｐ）は、ＤＮＡの両方の鎖を測定した場合の一塩基の正確な読み出しの確率とともに表される。

Claims (30)

1. 単一分子を解析するためのプロセスであって、
   以下のステップ：
   （ａ）支持体上の個々のサンプルスポットに配置された解析すべき少なくとも１つの単一分子を提供するステップ、ここで、前記スポットは、約１〜２０ｎｍの範囲の直径を有し、各個々のスポットの間の距離は、前記スポットの直径の少なくとも約１０倍、好ましくは約２０〜５００倍である、
   （ｂ）個々のサンプルスポットにおいて光源を用いて単一分子を個々に照らすステップ、ここで、前記光源は、前記サンプルスポットにおいて少なくとも１つの照らされたボリュームエレメントを提供する、
   （ｃ）少なくとも１つの検出ピクセルを備える光検出器を用いて前記単一分子からの光を個々に検出するステップ、ここで、前記検出器上の前記検出ピクセルは、約０．５μｍ〜５０μｍの範囲の直径を有し、各検出ピクセル間の距離は、前記検出ピクセルの直径の少なくとも約２倍、好ましくは約３〜１０倍である、および
   （ｄ）個々の検出ピクセルからの検出光を、個々のスポット上に配置された単一分子と関連する事象と関連付けるステップ、
   を含み、
   ここで、前記支持体上の検出ピクセルの光学投射は、約１００ｎｍ〜５μｍの範囲の直径を有し、個々のサンプルスポットは、前記支持体上の単一検出ピクセルの投射（具体的には、前記支持体上の単一検出ピクセルの投射の中央）に並べられる、
   プロセス。
2. 単一分子を解析するためのプロセスであって、
   以下のステップ：
   （ａ）支持体上の個々のサンプルスポットにそれぞれ配置された複数の解析すべき単一分子を提供するステップ、ここで、前記スポットは、約１〜２０ｎｍの範囲の直径を有し、個々のスポットの間の距離は、前記スポットの直径の少なくとも約１０倍、好ましくは約２０〜５００倍である
   （ｂ）個々のスポットにおいて光源を用いて単一分子を個々に照らすステップ、ここで、前記光源は、前記サンプルスポットにおいて複数の個々の照らされたボリュームエレメントを提供する
   （ｃ）前記単一分子から放射される光を、光検出器を用いて個々に検出するステップ、ここで、前記光検出器は、複数の検出ピクセルを備え、前記検出器上の前記検出ピクセルは、約０．５μｍ〜５０μｍの範囲の直径を有し、各検出ピクセル間の距離は、前記検出ピクセルの直径の少なくとも約２倍、好ましくは約３〜１０倍である、
   および
   （ｄ）個々の検出ピクセルからの検出光を、個々のスポット上に配置された単一分子と関連する事象と関連付けるステップ
   を含み、
   ここで、前記支持体上の検出ピクセルの光学投射は、約１００ｎｍ〜５μｍの範囲の直径を有し、個々のサンプルスポットは、前記支持体上の単一検出ピクセルの投射（具体的には、前記支持体上の単一検出ピクセルの投射の中央）に並べられる、
   プロセス。
3. 請求項１または２のプロセスであって、
   個々のサンプルスポットの中央は、前記支持体上の単一検出ピクセルの投射の中央に、≦５ｎｍ、≦２ｎｍまたは≦１ｎｍの位置精度で並べられる、
   プロセス。
4. 請求項１から３のいずれか一項のプロセスであって、
   前記支持体上の個々のサンプルスポットの間の距離は、前記支持体上の検出ピクセルの光学投射の間の距離と同等である、
   プロセス。
5. 請求項１から４のいずれか一項のプロセスであって、
   前記検出光は、場合により検出可能な標識基から、具体的には蛍光標識基から、放射される、
   プロセス。
6. 請求項１から５のいずれか一項のプロセスであって、
   単一核酸分子をシーケンスするため、具体的には、複数の単一核酸分子を並行してシーケンスするための、
   プロセス。
7. 請求項１から６のいずれか一項のプロセスであって、
   以下のステップ：
   −前記支持体の個々のスポットにおいて、（ｉ）単一核酸分子、（ｉｉ）核酸合成酵素分子および／または核酸分解酵素分子、および（ｉｉｉ）フリーの形態および／または前記核酸分子に取り込まれた蛍光標識ヌクレオチドビルディングブロック、を提供するステップ、
   −酵素反応を行なうステップ、ここで、ヌクレオチドビルディングブロックは、前記単一核酸分子に取り込まれる、および／または、前記単一核酸分子から切断される、および
   −ヌクレオチドビルディングブロックが、前記単一核酸分子に取り込まれるとき、および／または、前記単一核酸分子から切断されるときに生じる、時間依存的蛍光変化に基づき、前記核酸分子の塩基配列を個々に決定するステップ、
   を含む、
   プロセス。
8. 請求項６または７のプロセスであって、
   前記単一核酸分子は環状であるか、または、前記単一核酸分子は線状である、
   プロセス。
9. 請求項７から８のいずれか一項のプロセスであって、
   前記核酸合成酵素分子および／または前記核酸分解酵素分子は、固定化形態である、
   プロセス。
10. 請求項７から８のいずれか一項のプロセスであって、
    前記核酸分子は、固定化形態である、
    プロセス。
11. 請求項１から１０のいずれか一項のプロセスであって、
    前記支持体は平面を有する、
    プロセス。
12. 請求項１から１１のいずれか一項のプロセスであって、
    前記支持体は、ガラス、プラスチック、金属、石英、半金属、金属酸化物または複数の前記材料を含む複合材料から選択される表面を有する、
    プロセス。
13. 請求項１から１２のいずれか一項のプロセスであって、
    サンプルスポットは、前記支持体上の被覆された表面領域、または、前記支持体上の表面上に蒸着された粒子を備える、
    プロセス。
14. 請求項１から１３のいずれか一項のプロセスであって、
    サンプルスポットおよび／またはその上に蒸着された粒子の表面は、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｒ、ＮｉまたはＡｌなどの金属、半金属またはシランである、
    プロセス。
15. 請求項１から１４のいずれか一項のプロセスであって、
    サンプルスポットおよび／またはその上に蒸着された粒子の表面は、捕捉試薬、例えばビオチン、ストレプトアビジンまたはその他の高親和性捕捉試薬により修飾される、
    プロセス。
16. 請求項１から１５のいずれか一項のプロセスであって、
    前記支持体上の検出ピクセルの投射は、前記検出器上の検出ピクセルよりも約１０〜２００倍小さい、
    プロセス。
17. 請求項１から１６のいずれか一項のプロセスであって、
    前記検出器は、多点シングルフォトンアバランシェ検出器（ＳＰＡＤ）である、
    プロセス。
18. 請求項１から１７のいずれか一項のプロセスであって、
    前記検出器は、１０^３〜１０^６の個々の検出ピクセルを備える、
    プロセス。
19. 請求項１から１８のいずれか一項のプロセスであって、
    検出ピクセルに対するサンプルスポットの位置は、調節素子（例えば、圧電調節素子）により並べられる、
    プロセス。
20. 請求項１から１９のいずれか一項のプロセスであって、
    前記光源は、多点レーザーである、
    プロセス。
21. 請求項１から２０のいずれか一項のプロセスであって、
    前記の複数の個々の照らされたボリュームエレメントは、回折光学素子により提供される、
    プロセス。
22. 請求項１から２１のいずれか一項のプロセスであって、
    解析すべき前記分子は、少なくとも部分的に光透過性の支持体を通して照らされ、
    ここで、前記支持体を通して放射される放射光が決定される、
    プロセス。
23. 請求項２２のプロセスであって、
    光は、前記支持体を通して放射され、エバネッセント励起域の形成は、照らされたサンプルスポットの領域内の支持体表面での内反射により、具体的には全内反射（ＴＩＲ）により生じる、
    プロセス。
24. 請求項１から２３のいずれか一項のプロセスであって、
    回折光学素子が、ＴＩＲセットアップにおいて励起光ビームに導入される、
    プロセス。
25. 請求項１から２４のいずれか一項のプロセスであって、
    前記検出は、場合により波長特異的な検出と組み合わせて、励起状態の寿命の検出を含む、
    プロセス。
26. 請求項１から２５のいずれか一項のプロセスの使用であって、
    配列の集団内のサブシーケンスの度数および／または分布を決定するための、
    使用。
27. 請求項２６の使用であって、
    前記集団は、少なくとも１０、少なくとも１０^２、少なくとも１０^３、または少なくとも１０^４の個々のメンバーを含む、
    集団。
28. 少なくとも１つの個々の単一分子を解析するため、例えば、少なくとも１つの核酸分子をシーケンスするための、デバイスであって：
    （ａ）解析すべき単一分子を個々のスポット上に配置するための少なくとも１つのサンプルスポットを備える支持体、ここで、前記スポットは、約１ｎｍ〜２０ｎｍの範囲の直径を有し、個々のスポットの間の距離は、前記スポットの直径の少なくとも約１０倍、好ましくは約２０〜５００倍である、
    （ｂ）個々のスポットで単一分子を個々に照らすための、前記支持体上のサンプルスポットにおいて少なくとも１つの個々の照らされたボリュームエレメントを提供する光源
    （ｃ）個々のスポットで単一分子から放射される光を個々に検出するための、少なくとも１つの検出ピクセルを備える光検出器、ここで、前記検出ピクセルは、約０．５μｍ〜５０μｍの範囲の直径を有し、前記検出ピクセルの間の距離は、前記検出ピクセルの直径の少なくとも約２倍、好ましくは約３〜１０倍である、および
    （ｄ）個々の検出ピクセルからの検出シグナルを、個々のスポット上に配置された単一分子と関連する事象と関連付けるための手段、
    を備え、
    ここで、前記支持体上の検出ピクセルの光学投射は、約１００ｎｍ〜５μｍの範囲の直径を有し、個々のサンプルスポットは、前記支持体上の単一検出ピクセルの投射（具体的には、前記支持体上の単一検出ピクセルの投射の中央）に並べられる、
    デバイス。
29. 単一分子を解析するためのデバイスであって：
    （ａ）解析すべき単一分子を個々のスポット上に配置するための複数のサンプルスポットを備える支持体、ここで、前記スポットは、約１〜２０ｎｍの範囲の直径を有し、個々のスポットの間の距離は、前記スポットの直径の少なくとも約１０倍、好ましくは約２０〜５００倍である、
    （ｂ）個々のスポットで単一分子を個々に照らすための、前記支持体上の前記スポットにおいて複数の個々の照らされたボリュームエレメントを提供する光源
    （ｃ）個々のスポットで単一分子から放射される光を個々に検出するための、複数の検出ピクセルを備える光検出器、ここで、前記光検出器上の前記検出ピクセルは、約０．５μｍ〜５０μｍの範囲の直径を有し、前記検出ピクセルの間の距離は、前記検出ピクセルの直径の少なくとも約２倍、好ましくは約３〜１０倍である、および
    （ｄ）個々の検出ピクセルからの検出光を、個々のスポット上に配置された単一分子と関連する事象と関連付けるための手段、
    を備え、
    ここで、前記支持体上の検出ピクセルの光学投射は、約１００ｎｍ〜５μｍの範囲の直径を有し、個々のサンプルスポットは、前記支持体上の単一検出ピクセルの投射（具体的には、前記支持体上の単一検出ピクセルの投射の中央）に並べられる、
    デバイス。
30. 請求項２８または２９のデバイスの使用であって、
    請求項１から２５のいずれか一項のプロセスのための、
    使用。