ES2559004T3 - Aparato para detección y diferenciación del tipo de un objeto molecular - Google Patents

Aparato para detección y diferenciación del tipo de un objeto molecular Download PDF

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Abstract

Un aparato para detectar un objeto capaz de emitir luz que comprende: (a) un detector de luz (11) que comprende al menos un primer sensor óptico y un segundo sensor óptico capaces de determinar la intensidad de la luz, en el que el primer sensor óptico (111) y el segundo sensor óptico (112) están apilados y la luz emitida desde un objeto pasa a través del primer sensor óptico y a continuación pasa a través del segundo sensor óptico, y en el que el primer sensor óptico y el segundo sensor óptico determinan intensidades de señales ópticas que son diferentes y estas señales ópticas diferentes se relacionan con diferentes longitudes de onda de la luz detectada; y (b) un ordenador (12; 121) que procesa las señales de salida generadas por los sensores ópticos y que compara un resultado del procesamiento con un resultado conocido que corresponde a un tipo de objeto conocido para determinar si el objeto pertenece al tipo de objeto conocido, en el que el procesamiento de las señales comprende: calcular una suma de las señales; y comparar la suma con un valor de umbral para determinar la presencia de un objeto, en el que: cuando la suma es igual o mayor que el valor del umbral, se determina que un objeto está presente: y cuando la suma es menor que el valor del umbral, se determina que un objeto está ausente, y en el que el procesamiento de las señales comprende adicionalmente: cuando se determina que un objeto está presente; calcular una proporción de las señales; en el que la comparación de los resultados con el resultado conocido comprende la comparación de la proporción calculada con una proporción conocida que corresponde a un tipo conocido; y cuando la diferencia entre la proporción calculada y la proporción conocida está dentro de un cierto intervalo, se determina que el objeto pertenece al tipo conocido.

Description

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pueden ser las mismas que las que aparecen en la realización indicada anteriormente. En la etapa 403, el ordenador calcula la proporción de J1 y J2. En la etapa 404, el ordenador 12 compara la proporción calculada con proporciones conocidas que corresponden a tipos de objetos conocidos. En la etapa 405, el ordenador 12 determina el tipo al que pertenece el objeto basándose en el resultado de la comparación.
En este ejemplo, si, entre todas las proporciones conocidas de los tipos conocidos, la proporción conocida del Tipo i (1 < i ≤ n) es la más cercana a la proporción calculada, entonces se puede determinar que el objeto es un objeto de Tipo i.
La FIG. 12 muestra un diagrama de flujo de un método para diferenciar un objeto de acuerdo con un ejemplo adicional de la presente divulgación. En este ejemplo, se puede determinar que un objeto pertenece a uno de una pluralidad de tipos de objetos conocidos, es decir, del Tipo 1 al Tipo n. Las primeras tres etapas de este ejemplo pueden ser las mismas que las que aparecen en la realización indicada anteriormente. En la etapa 504, el ordenador 12 compara la proporción calculada con intervalos de proporción conocidos que corresponden a tipos de objetos conocidos. En la etapa 505, el ordenador 12 determina el tipo al que pertenece el objeto basándose en el resultado de la comparación.
En este ejemplo, por ejemplo, si la proporción calculada entra en el intervalo de proporción que corresponde al Tipo i (1 < i ≤ n), entonces se puede determinar que el objeto es un objeto de Tipo i. Si la proporción calculada no entra dentro de ninguno de los intervalos, se puede indicar que el nivel de confianza es bajo y que no se puede determinar el tipo del objeto que se está detectando. Por ejemplo, suponiendo que el objeto de Tipo 1 tiene un intervalo de proporción correspondiente de 0,7 < J2/J1 < 1,2 y el objeto de Tipo 2 obtiene un intervalo de proporción correspondiente de J2/J1 > 2, si la proporción calculada para un objeto que se está detectando es 1, entonces se puede determinar que el objeto es un objeto de Tipo 1. Por otro lado, si la proporción calculada para un objeto que se está detectando es 1,5, entonces se puede informar que el nivel de confianza es bajo y que no se puede determinar el tipo del objeto.
En un ejemplo, la proporción de J1 y J2 puede ser J2/J1. En una realización, la proporción de J1 y J2 puede ser J1/J2. En algunos ejemplos, la proporción de J1 y J2 puede ser J2/(c x J1) o J1/(c x J2), en las que "c" un coeficiente.
Después de enviar las señales al ordenador 12, el ordenador 12 realiza una etapa de determinación de si un objeto está presente en una muestra. La determinación se realizó mediante comparación de la suma de todas o algunas de las señales con un valor de umbral. Si la suma es igual o mayor que el umbral, se puede determinar que un objeto está presente. Por otro lado, si la suma es menor que el umbral, se puede determinar que un objeto está ausente. En otras realizaciones, si la suma es menor que el valor del umbral, se puede determinar que un objeto está presente.
En algunas realizaciones, el detector de luz 11 puede comprender tres o más sensores ópticos, cada uno de los cuales genera una señal de salida sobre la luz emitida desde un objeto incidente en el detector de luz 11. En algunas realizaciones, dos de las señales de salida generadas se pueden procesar con el ordenador 12 para diferenciar el objeto. En otras realizaciones, más o todas las señales de salida generadas se pueden procesar con el ordenador 12 para diferenciar el objeto.
La FIG. 13 muestra un diagrama de flujo de un método para diferenciar un objeto de acuerdo con todavía otra realización de la presente invención. En esta realización, el detector de luz 11 comprende tres sensores ópticos, PD1, PD2, y PD3. Un objeto en una muestra se puede detectar y determinar que pertenece a, por ejemplo, uno de los cuatro tipos, tales como colorante 1, colorante 2, colorante 3, y colorante 4. Las señales de salida generadas por estos tres sensores ópticos se representan con lPD1, IPD2, e lPD3, respectivamente, y se envían al ordenador 12 para su procesamiento. El método se describe a continuación.
En primer lugar, la muestra se puede excitar usando una fuente de luz de excitación. A continuación, los sensores ópticos PD1, PD2, y PD3 pueden generar las señales de salida lPD1, IPD2, e lPD3. Después de recibir las señales de salida, el ordenador 12 puede calcular una suma de estas señales. Si la suma es menor que un valor de umbral, Vth, el ordenador 12 puede generar un informe de que no se ha producido fluorescencia. De otro modo, el ordenador puede avanzar a la siguiente etapa.
Cuando se determina que no se ha producido florescencia y que existe un objeto, el ordenador 12 puede realizar primero una etapa de diferenciación original. En esta etapa, el ordenador 12 puede calcular una primera proporción entre lPD3 y la suma de todas las señales, y comparar esta proporción con un primer conjunto de valores de umbral, por ejemplo, Vth1, Vth2, Vth3, y Vth4, para determinar si la primera proporción calculada entra dentro de cualquier intervalo entre 0 y Vth1, entre Vth1 y Vth2, entre Vth2 y Vth3, o entre Vth3 y Vth4. Sin embargo, si la primera proporción calculada no entra dentro de ninguna de los intervalos mencionados anteriormente, el ordenador 12 puede generar un informe de que se ha producido una emisión de error.
Después de eso, se realiza una etapa de confirmación. En la etapa de confirmación, se calcula una segunda proporción entre lPD2 e lPD3, y se compara con un segundo conjunto de valores de umbral, por ejemplo, Vth1', Vth2', Vth3', y Vth4' para determinar si la segunda proporción calculada entra dentro de cualquier intervalo entre 0 y Vth1',
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entre Vth1' y Vth2', entre Vth2' y Vth3', o entre Vth3' y Vth4'.
Por ejemplo, si, en la etapa de diferenciación original, la primera proporción calculada entra dentro del intervalo entre Vth1 y Vth2, se puede determinar que el objeto posiblemente pertenece al colorante de tipo 2. A continuación, el ordenador 12 puede avanzar hasta la etapa de confirmación para determinar si la segunda proporción calculada entra dentro del intervalo entre Vth1' y Vth2'. Si es afirmativo, se puede determinar que el objeto pertenece al colorante de tipo 2. De otro modo, el ordenador 12 puede generar un informe de que se ha producido una emisión de error.
Se indica que se puede realizar una cualquiera de la etapa de diferenciación original y la etapa de confirmación que se han descrito anteriormente de forma individual para diferenciar un objeto. La realización de ambas etapas en un procedimiento de discriminación, sin embargo, puede aumentar la precisión.
La FIG. 14 muestra un diagrama de flujo de un método para diferenciar un objeto. En este ejemplo el detector de luz 11 comprende una pluralidad de sensores ópticos PD1, PD2, ... PDn, en la que n es mayor que 1 y puede ser menor
o igual que 6. Además, n puede ser igual a 3. El aparato se puede usar para detectar y diferenciar q objetos diferentes, por ejemplo, q colorantes diferentes, indicados como D1, D2, ... Dq.
La fuente de luz de excitación usada en la presente realización puede tener k bandas de luz de excitación diferentes, L1, L2, ... Lk, en la que k puede ser mayor o igual que 1 y menor o igual que 3. La fuente de luz de excitación se puede activar y desactivar siguiendo un conjunto de instrucciones, dando como resultado un conjunto de m condiciones de excitación diferentes Cj, en las que 1 ≤ j ≤ m. Cada condición de excitación puede ser una combinación de diferentes bandas de luz de excitación. En la misma condición de excitación, la señal de salida generada por un cierto sensor óptico para diferentes colorantes puede ser diferente.
La señal de salida generada en el sensor óptico de i-th, PDi, (en el que 1 ≤ i ≤ n) en la condición de excitación de jth, Cj, para un cierto colorante Ds (en el que 1 ≤ s ≤ q) se puede indicar como Ds{J{PDi:Cj}}. Diferentes combinaciones de PDi y Cj pueden dar como resultado un Ds{J{PDi:Cj}} diferente. Por lo tanto, antes de usar el aparato para detectar y diferenciar un colorante desconocido, mediante la realización de lectura de calibración usando diferentes combinaciones de PDi y Cj en entornos convencionales para un colorante Ds, se puede obtener una matriz de señales de salida. Esta matriz puede ser única para un colorante, y se puede denominar matriz de lectura patrón para un colorante Ds, M{colorante Ds}, como se muestra a continuación:
Ds{J{PD1:C1}},
Ds{J{PD2:C1}}, ... Ds{J{PDn:C1}}
Ds{J{PD1:C2}},
Ds{J{PD2:C2}}, ... Ds{J{PDn:C2}}
…
Ds{J{PD1:Cm}}, Ds{J{PD2:Cm}},
... Ds{J{PDn:Cm}}
Esta lectura de calibración se puede repetir para cada uno de los colorantes, creando q matrices de lectura patrón
M{colorante D1}, M{colorante D2}, ... M{colorante Dq}. Para minimizar el impacto del fondo, también se puede obtener una lectura de fondo mediante el registro de señales de salida desde los sensores ópticos cuando no existe colorante, que puede dar como resultado una matriz de lectura de fondo M{fondo}:
B{J{PD1:C1}}, B{J{PD2:C1}}, ... B{J{PDn:C1}} B{J{PD1:C2}}, B{J{PD2:C2}}, ... B{J{PDn:C2}} … B{J{PD1:Cm}}, B{J{PD2:Cm}}, ... B{J{PDn:Cm}}
Cuando se aplica una muestra desconocida al aparato de detección, se miden las señales de salida generadas por los sensores ópticos en diferentes condiciones de excitación y se obtiene una matriz de lectura de la muestra M{muestra}:
J{PD1:C1}, J{PD2:C1}, ... J{PDn:C1} J{PD1:C2}, J{PD2:C2}, ... J{PDn:C2} … J{PD1:Cm}, J{PD2:Cm}, ... J{PDn:Cm}
Esta matriz de lectura de la muestra a continuación se puede comparar con las matrices de lectura patrón para determinar qué tipo de colorante contiene la muestra. Para minimizar el impacto del fondo en el resultado, la matriz de lectura de fondo se puede restar tanto de las matrices de lectura patrón como de la matriz de lectura de la
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muestra antes de la comparación.
La comparación se puede realizar calculando un rango Rs para cada tipo de colorante Ds. Cuando se calcula Rs, se pueden aplicar factores de peso y métodos estadísticos. Por ejemplo, se puede usar un método de mínimos cuadrados o un método con la mayor probabilidad para encontrar el mejor emparejamiento. Algunos factores de peso se pueden aplicar a cada sensor óptico o modo de luz de excitación para aumentar la precisión del análisis.
Después de calcular Rs, el ordenador 12 puede indicar el colorante más probable, el segundo colorante probable, etc. de acuerdo con el rango Rs.
En la Secuenciación con el método de Síntesis, la secuencia de ADN se determina identificando el nucleótido recién añadido a la hebra en crecimiento. El proceso de adición de nucleótido se detecta con luz fluorescente emitida desde el fluoróforo unido al nucleótido. La reacción de incorporación de nucleótido se puede dividir en varias etapas: el acoplamiento del nucleótido en el sitio activo formado por polimerasa y molde, rotura del enlace de fosfato, y formación del nuevo enlace con el azúcar. Algunos nucleótidos simplemente se difunden en y fuera del sitio activo, con sin que se produzca una incorporación real. Para controlar la reacción de incorporación en tiempo real, puede ser necesario que el aparato de detección sea capaz de detectar la llegada de un fluoróforo, tiempo de retención, y tipo de fluoróforo. La razón por la cual se mide el tiempo de retención es que los nucleótidos que se difunden pueden permanecer durante un periodo de tiempo más corto que los nucleótidos incorporados. Mediante el ajuste de un umbral del tiempo de retención, se puede detectar un suceso de incorporación real. En la FIG. 15 se muestra un diagrama de flujo de un método de acuerdo con una realización adicional más de la presente invención, que se puede usar para detección de sucesos. Este método es básicamente similar al que se ha descrito anteriormente, con una etapa más añadida para determinar si se puede reivindicar un suceso. Por lo tanto, la descripción detallada de este método se omite. La FIG. 16 muestra un diagrama de bloques de un aparato de detección a modo de ejemplo que se puede usar en esta realización.
En algunos ejemplos, el detector de luz 11 puede comprender dos o más sensores ópticos colocados de forma horizontal. Las señales generadas por los sensores ópticos colocados de forma horizontal pueden entrar en el ordenador 12 y se pueden procesar de una manera similar a la de uno de los métodos que se han desvelado anteriormente para determinar la presencia de un objeto y/o para diferenciar el tipo de un objeto.
3. Aplicaciones
Los aparatos y sistemas de detección de acuerdo con la presente invención se pueden aplicar, por ejemplo, para detección de ácidos nucleicos, secuenciación de ADN, identificación de biomarcadores, o citometría de flujo. Los aparatos de detección pueden detectar y procesar señal de luz de baja intensidad, que hace posible la discriminación de objetos de una sola molécula.
En algunas realizaciones de los métodos de la presente invención, las etiquetas se unen al analito(s) (es decir, la sustancia(s) a detectar), la sonda(s), tales como cebadores, anticuerpos, u otros reactivos que interactúan con el analito(s), u otro reactivo(s), tales como nucleótidos (incluyendo análogos de nucleótido). Cualquier etiqueta se puede usar en el analito o sonda que puede ser útil en la correlación de la señal con la cantidad o presencia de analito.
Por ejemplo, en la presente invención se puede usar una gran diversidad de moléculas fluorescentes incluyendo moléculas pequeñas, proteínas fluorescentes y puntos cuánticos. Algunas moléculas fluorescentes útiles (fluoróforos) incluyen, pero no se limitan a: 1,5 IAEDANS; 1,8-ANS; 4-Metilumbeliferona; 5-carboxi-2,7diclorofluoresceína; 5-Carboxifluoresceína (5-FAM); 5-Carboxinaftofluoresceína; 5-Carboxitetrametilrodamina (5-TAMRA); 5-FAM (5-Carboxifluoresceína); 5-HAT (Hidroxi Triptamina); 5-Hidroxi Triptamina (HAT); 5-ROX (carboxi-Xrodamina); 5-TAMRA (5-Carboxitetrametilrodamina); 6-Carboxirrodamina 6G; 6-CR 6G; 6-JOE; 7-Amino-4metilcumarina; 7-Aminoactinomicina D (7-AAD); 7-Hidroxi-4-metilcumarina; 9-Amino-6-cloro-2-metoxiacridina; ABQ; Fucsina Ácida; ACMA (9-Amino-6-cloro-2-metoxiacridina); Naranja de Acridina; Rojo de Acridina; Amarillo de Acridina; Acriflavina; Acriflavina Feulgen SITSA; AFPs-Proteína AutoFluorescente-(Quantum Biotechnologies); Rojo Texas; Conjugado de Rojo Texas-X; Tiadicarbocianina (DiSC3); Rojo de Tiazina R; Naranja de Tiazol; Tioflavina 5; Tioflavina S; Tioflavina TCN; Thiolyte; Naranja de Tiozol; Tinopol CBS (Calcofluor Blanco); TMR; TO-PRO-1; TO-PRO-3; TO-PRO-5; TOTO-1; TOTO-3; Tricolor (PE-Cy5); TRITC (lsoTioCianato de TetrametilRodamina); True Blue; TruRed; Ultralite; Uranine B; Uvitex SFC; WW 781; X-Rodamina; XRITC; Naranja de Xileno; Y66F; Y66H; Y66W; YO-PRO-1; YO-PRO-3; YOYO-1; colorantes de interquelación tales como YOYO-3, Sybr Verde, naranja de Tiazol; miembros de la serie de colorantes Alexa Fluor (de Molecular Probes/lnvitrogen) que cubren un amplio espectro y que emparejan las principales longitudes de onda de salida de fuentes de excitación comunes tales como Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 405, 430, 488, 500, 514, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 635, 647, 660, 680, 700, y 750; miembros de la serie de fluoróforos de Colorante Cy (GE Healthcare), que también cubren un amplio espectro tales como Cy3, Cy3B, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7; miembros de los fluoróforos de colorante Oyster (Denovo Bioiabels) tales como Oyster -500, -550, -556, 645, 650, 656; miembros de la serie de Etiquetas de DY (Dyomics), por ejemplo, con máximos de absorción que varían de 418 nm (DY-415) a 844 nm (DY-831) tales como DY-415, 495, -505, -547, 548, -549, -550, -554, -555, -556, -560, -590, -610, -615, -630, -631,-632, -633, -634, -635, -636, -647, -648, -649, 650, -651, -652, -675, -676, -677, -680, -681, -682, -700, -701,-730, -731,-732, -734, -750, -751, -752, -776, -780,
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Como un ejemplo ilustrativo de unión covalente, directa de un ácido nucleico, Adeesi et al. (Nucleic Acid Research,
28: 87 (2000)) modificaron el extremo en la posición 5' de un cebador para que incluyera un grupo funcional SH. De acuerdo con el método de Adeesi et al., un ácido nucleico se puede preparar en solución salina taponada con fosfato 50 µM ("PBS") (NaPi: NaH2PO4 0,1 M a pH 6,5, NaCI 0,1 M). A continuación, aproximadamente 1 -5 µl de solución de cebador se pueden aplicar a una superficie de porta objetos de vidrio silanizado y se puede incubar en una caja de control de humedad a temperatura ambiente durante aproximadamente 5 horas para unir el cebador a la superficie del chip. Después de completar la reacción de unión, la solución de PBS se lava con vibración dos veces a temperatura ambiente durante 5 minutos cada lavado para retirar el ADN no unido. Después de limpias, se añade βmercaptoetanol 10 mM a una solución de PBS y se usa para aclarar la superficie de la matriz de dirección a temperatura ambiente, para desactivar el grupo tiol del ADN no unido. A continuación, la superficie de la matriz se lava, por ejemplo, una vez con 5X de Tween al 0,1 % de SSC y una vez con 5X de solución tampón de SSC. Por consiguiente, en algunas realizaciones, el método usado por Adeesi et al. se puede usar en los métodos proporcionados por la invención para fijar el complejo de muestra de ácido nucleico a un sitio conector, por ejemplo, a través del extremo en la posición 5' de un cebador de secuenciación o la muestra de ácido nucleico.
En una realización alternativa, la muestra de ácido nucleico puede comprender, por ejemplo, un nucleótido biotinilado, y se une a avidina en la superficie del sitio conector. En otra realización, la muestra de ácido nucleico puede comprender un resto antigénico, por ejemplo, BrdU o digoxigenina, que se une con un anticuerpo (o fragmento del mismo) en el sitio conector. Por "anticuerpo" se debe entender que este término incluye fragmentos de moléculas de inmunoglobina, que incluyen, por ejemplo, uno o más dominios de CDR; o fragmentos pesados variables o variables ligeros. Los anticuerpos pueden ser de origen natural, recombinante o sintético. Los anticuerpos también pueden incluir, por ejemplo, variantes policlonales y monoclonales. En algunas realizaciones, los anticuerpos se pueden unir a sus antígeno(s) con constantes de asociación de al menos 106, 107, 108, 109 M, o superiores. La estructura, función y producción de anticuerpos se conocen bien en la técnica. Véase, por ejemplo, Making and Using Antibodies: A Practical Handbook CRC Press; 1ª edición (2006), de Gary Howard y Matthew Kasser.
En otra realización más, la muestra de ácido nucleico se puede fijar al sitio conector mediante una polimerasa, por ejemplo, ADN polimerasa. El experto en la materia observará que, para retener la función enzimática, se debería tener en cuenta la información disponible, tal como las estructuras primaria, secundaria y terciaria de la enzima. Por ejemplo, las estructuras de las Taq y Phi29 polimerasas se conocen en la técnica, véase: Kim et al., Nature, 376: 612-616 (1995) y Kamtekar et al., Mot. Cell, 16: 609-618 (2004), respectivamente. En la técnica se conocen algunos medios para fijar una polimerasa a una superficie, a la vez que mantiene la actividad y se describen, por ejemplo, en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 2008/0199932, publicada el 21 de agosto de 2008 y en Korlach et al., PNAS 105: 1176-1181 (2008).
En algunas realizaciones, una superficie de un sitio conector modificada con aldehído se trata con reactivo de silano que contiene aldehído. Los aldehídos reaccionan rápidamente con aminas primarias en las proteínas para formar una unión de base de Schiff. Dado que muchas proteínas presentan lisinas en sus superficies además de la α-amina generalmente más reactiva en el extremo NH2-terminal, estas se pueden unir a la lámina en una diversidad de orientaciones, que permiten que diferentes lados de la proteína interactúen con otras proteínas o moléculas pequeñas en solución. En otra realización, un fotoNHS (una molécula de N-hidroxi succimido carboxilato unida a una molécula de azidonitrobenceno con un conector de cadena del carbono) se puede unir a una superficie modificada con amina en el dispositivo mediante fotoactivación de UV. En estas realizaciones, la luz UV excita el resto de azidonitrobenceno para producir nitreno altamente reactivo, por eliminación de nitrógeno. El nitreno reacciona rápidamente con NH2 en la superficie del dispositivo y forma un enlace de hidrazina. El otro extremo del conector es carboxilato de NHS, que reacciona con lisinas en la superficie de la polimerasa para producir un enlace covalente de amida. En otra realización, se puede hacer reaccionar un resto de carboxilato de NHS con amina primaria en la superficie del dispositivo en condiciones de tamponamiento. La luz UV se puede usar para activar un resto de azidonitrobenceno y para formar un nitreno altamente reactivo como un grupo deficiente en electrones y que reacciona fácilmente con la amina primaria de restos de lisina en la polimerasa.
3.1.2 Modalidades de secuenciación
Los aparatos de detección proporcionados por la presente invención se pueden usar para detectar y secuenciar ácidos nucleicos con medios conocidos en la técnica, tal como se revisa, por ejemplo, en el documento de Patente de Estados Unidos Nº 6.946.249 y en Shendure et al., Nat. Rev. Genet. 5: 335-44 (2004). Las modalidades de secuencia se pueden elegir entre métodos de secuenciación de moléculas individuales conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, los métodos de secuenciación pueden depender de la especificidad ya sea de una ADN polimerasa o de una ADN ligasa y pueden incluir, por ejemplo, secuenciación de extensión de bases (extensiones por etapas de bases individuales), secuenciación de múltiples bases mediante síntesis (incluyendo, por ejemplo, secuenciación con nucleótidos etiquetados de forma terminal), y secuenciación oscilante, que se basa en la ligación. Los métodos por lo general implican proporcionar una muestra de ácido nucleico, que puede incluir al menos un cebador de unión terminal. El ácido nucleico se puede fijar a un sustrato (ya sea directa o indirectamente), por ejemplo, en un sitio conector. El ácido nucleico se puede proporcionar en una forma monocatenaria o se puede convertir en monocatenario, por ejemplo, mediante desnaturalización química o térmica. A continuación, la secuenciación puede comenzar en un cebador de secuenciación (la secuenciación basada en ligasa normalmente
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3.1.2.1 Secuenciación de extensión de bases: extensión en etapas
En algunas realizaciones, un aparato de detección proporcionado por la invención se puede usar para detectar luz generada durante la secuenciación de extensión de bases. En algunas realizaciones, la secuenciación de extensión de bases comienza uniendo una muestra de ácido nucleico dúplex parcial que comprende un ácido nucleico monocatenario a secuenciar, un cebador de unión terminal asociado con el extremo en la posición 3' del ácido nucleico a secuenciar, y un cebador de secuenciación hibridado al mismo, a un sitio conector. En algunas realizaciones, se pueden aplicar polimerasa y nucleótidos modificados a continuación al aparato de detección de luz en un tampón adecuado. En algunas realizaciones, el complejo de muestra de ácido nucleico se puede fijar al sitio conector mediante una polimerasa en un sitio conector. En algunas realizaciones, los nucleótidos pueden incluir una etiqueta detectable unida de forma covalente, por ejemplo, una etiqueta fluorescente, y un grupo de bloqueo para prevenir cualquier extensión secundaria. Por consiguiente, la secuenciación se detiene después de la adición de un solo nucleótido al extremo en la posición 3' del cebador de secuenciación.
En una primera etapa de una realización de una reacción de secuenciación de extensión de bases, se puede añadir un nucleótido con un grupo de bloqueo fluorescente mediante una ADN polimerasa al extremo en la posición 3' del cebador de secuenciación. En algunas realizaciones, la etiqueta fluorescente puede actuar como el grupo de bloqueo. En otras realizaciones, pueden ser restos separados. Un solo nucleótido se puede incorporar en el extremo en la posición 3' del cebador de secuenciación y se identifica por su etiqueta con el detector de luz correspondiente. La etiqueta fluorescente y el grupo de bloqueo se retiran a continuación, por ejemplo, mediante lisis química o enzimática, para permitir ciclos adicionales de extensión de bases. En ciertas realizaciones, los grupos de etiqueta y de bloqueo se pueden eliminar de forma simultánea o de forma secuencial y en cualquier orden. Al recopilar el orden de las bases añadidas, la secuencia de la muestra de ácido nucleico se puede deducir en la dirección en la posición 3' a 5', de una base a una base.
Generalmente, existen dos maneras para reconocer el nucleótido añadido durante la extensión en etapas. En el primer caso, los cuatro nucleótidos pueden tener la misma etiqueta detectable, pero se añaden de uno en uno, en un orden determinado previamente. La identidad del nucleótido extendido se puede determinar mediante el orden en el que se añade el nucleótido en la reacción de extensión. El segundo modo para reconocer la base integrada durante la extensión, se pueden añadir cuatro nucleótidos diferentes al mismo tiempo y cada uno se acopla con una etiqueta distinta. En diferentes realizaciones, los espectros y/o la intensidad de excitación o de emisión puede diferir. La identidad del nucleótido añadido en la extensión se puede determinar mediante la intensidad y/o longitud de onda (es decir, espectros de excitación o emisión) de la etiqueta detectada.
3.1.2.2 la y la secuenciación mediante síntesis: extensión en múltiples etapas
En algunas realizaciones, la secuenciación mediante síntesis puede evolucionar con múltiples extensiones sin interrumpir, por ejemplo, sin el uso de grupos de bloqueo. En esta realización es, la reacción de polimerización se puede controlar detectando la liberación del pirofosfato después de la hidrólisis de nucleósido trifosfato, es decir, la liberación del complejo de fosfato β y γ. Este complejo se puede detectar directamente, por ejemplo, con un resto fluorescente en el complejo, o indirectamente, por ejemplo, por acoplamiento del pirofosfato a un sistema de detección quimio-o bioluminiscente, como se ha analizado anteriormente.
En algunas realizaciones, la muestra de ácido nucleico se puede secuenciar básicamente de forma continua mediante el uso de nucleótidos etiquetados con fosfato terminal. Algunas realizaciones a modo de ejemplo de nucleótidos etiquetados con fosfato terminal y métodos de su uso se describen, por ejemplo, en el documento de Patente de Estados Unidos Nº 7.361.466 y en la Publicación de Patente de Estados Unidos Nº 2007/0141598, publicada el 21 de junio de 2007. En resumen, los nucleótidos se pueden aplicar al sistema proporcionado por la invención y, cuando se hidroliza durante la polimerización, el pirofosfato etiquetado se puede detectar mediante un detector de luz correspondiente. En algunas realizaciones, los cuatro nucleótidos pueden comprender distintas etiquetas y se pueden añadir de forma simultánea. En algunas realizaciones, los nucleótidos pueden comprender etiqueta que no se pueden distinguir, por ejemplo, idénticas, y se pueden añadir secuencialmente en un orden determinado previamente. La adición cíclica, secuencia de nucleótidos con etiquetas que no se pueden distinguir todavía permite múltiples etapas de polimerización sin interrumpir, por ejemplo, en secuencias de homopolímeros.
3.1.2.3 Secuenciación basada en ligasa
En otras realizaciones, una muestra de ácido nucleico se puede secuenciar en el aparato proporcionado por la invención mediante secuenciación con ligasa. Algunos métodos de secuenciación basada en ligasa se desvelan, por ejemplo, en el documento de Patente de Estados Unidos Nº 5.750.341, la publicación de PCT WO 06/073504, y Shendure et al., Science, 309: 1728-1732 (2005). En el método de Shendure et al., por ejemplo, una muestra de ADN monocatenario desconocido se puede flanquear con dos cebadores de unión terminal y se puede inmovilizar en un soporte sólido. Una posición en particular en la secuencia desconocida (por ejemplo, la nésima base proximal a un cebador de unión terminal en particular) se puede interrogar mediante hibridación de un cebador de ancla denominado de este modo (que es análogo al un cebador de secuenciación) a uno de los cebadores de unión terminal y a continuación se puede aplicar una combinación de 4 nonámeros degenerados a la mezcla. Los cuatro nonámeros tienen distintas etiquetas fluorescentes y están degenerados en todas las posiciones excepto en la
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En algunas realizaciones, el ADNc se puede ligar con ácidos poli nucleicos adaptadores, los adaptadores se pueden procesar con enzimas de restricción especializadas, y por último, los ácidos nucleicos procesados se unen a oligonucleótidos complementarios fijados en sitios conectores de un aparato proporcionado por la invención. En realizaciones en particular, las moléculas adaptadoras pueden ser cebadores de unión terminal.
En algunas realizaciones de acuerdo con la presente invención, la cola de poli-A de un ARNm puede servir como un cebador de unión terminal adecuado, que es complementario a un cebador de secuenciación de poli T.
3.1.3.3 Detección y/o medida de interacciones de unión
En otras realizaciones, un aparato de detección se puede usar para detectar diversas interacciones de unión que incluyen, por ejemplo, emparejamientos de bases de ADN/ADN, ARN/ARN, o ADN/ARN, interacciones de ácido nucleico/proteína, antígeno/anticuerpo, unión de receptor/ligando, y unión de enzima/sustrato. En general, una molécula de muestra se puede fijar a una molécula de unión que comprende una etiqueta de ácido nucleico de identificación (ID). En algunas realizaciones, la molécula de unión puede comprender adicionalmente una molécula de captura que se une a la molécula de muestra. La molécula de unión también debe comprender un medio para unirse a un sitio conector; por ejemplo, un resto para facilitar la unión química covalente, tal como uniones de disulfuro, tioéster, amida, fosfodiéster, o éster; o mediante unión no covalente, por ejemplo, unión de anticuerpo/antígeno o de biotina/avidina. En algunas realizaciones, una molécula de unión se puede fijar a la matriz mediante la etiqueta de ID.
Una molécula de muestra se puede aplicar a un sistema de acuerdo con la presente invención y se puede fijar a un sitio conector aleatorio mediante su molécula conectora, por ejemplo, mediante la unión de una molécula de captura localizada en la molécula de unión. En algunas realizaciones, la molécula de muestra de las moléculas conectoras se pueden mezclar, se puede permitir que se unan, y a continuación aplicar a un dispositivo proporcionado por la invención. En algunas realizaciones, la molécula conectora se puede aplicar primero al dispositivo, permitir que se fije a un sitio conector, y a continuación se puede aplicar la molécula de muestra. A continuación, la ID se puede detectar (por ejemplo, mediante hibridación o secuenciación) con los métodos de acuerdo con la invención para identificar la molécula de muestra asociada. Una pluralidad de especies de moléculas de muestra se pueden fijar a la misma matriz y se pueden distinguir por su etiqueta aunque sus interacciones de unión se pueden caracterizar usando las ID únicas de la molécula de captura a la que se une. Por lo tanto, en algunas realizaciones, un método para detectar una molécula de muestra etiquetada puede comprender las etapas de unión de una molécula de muestra a un sitio con lector de un sistema de acuerdo con la presente invención con una molécula conectora que comprende una etiqueta de ácido nucleico (ID), realización de secuenciación de ácidos nucleicos de la ID, y detección de la molécula de muestra etiquetada. En realizaciones en particular, la secuenciación de ácidos nucleicos puede ser secuenciación de extensión de bases. En algunas realizaciones, la secuenciación de los ácidos nucleicos se puede elegir entre secuenciación basada en ligasa, o secuenciación de nucleótidos etiquetados con fosfato terminal.
Con el uso de "bits" de nucleótidos, se pueden fijar hasta 4n moléculas de captura distintas y se pueden fijar en un sistema de detección de acuerdo con la presente invención, en las que n es un número natural que representa la longitud de la ID secuenciada. Por ejemplo, 5 nucleótidos podrían proporcionar aproximadamente mil ID únicas, mientras que 12 nucleótidos proporcionan aproximadamente 16 millones de combinaciones. Por ejemplo, algunas moléculas conectoras se pueden fijar a un sistema de acuerdo con la presente invención y sus ubicaciones se pueden determinar detectando su etiqueta de ID correspondiente. A continuación, las moléculas conectoras pueden servir como sondas para, por ejemplo, investigar interacciones de unión con una o más moléculas de muestra etiquetadas. Es decir, un sistema con uno o más moléculas conectoras fijadas al mismo puede servir como una matriz de ensayo.
En ciertas realizaciones, las moléculas de muestra etiquetadas se pueden etiquetar con fluorescencia. Cuando se unen a la molécula de captura de una molécula conectora, una molécula de muestra etiquetada se puede detectar con el detector de luz que corresponde al sitio conector en el que se fija la molécula conectora. Por consiguiente, la presente divulgación puede comprender adicionalmente las etapas de aplicación de una molécula de muestra etiquetada ha un sistema de acuerdo con la presente invención y detección de la molécula de muestra etiquetada. En realizaciones en particular, el sistema puede tener moléculas conectoras que comprenden una etiqueta de ácido nucleico (ID) fijada a sus sitios conectores. Múltiples moléculas de muestra etiquetadas se pueden aplicar a una matriz de sonda de forma simultánea y se pueden diferencial por sus etiquetas, por ejemplo, por la intensidad y/o longitud de onda de sus etiquetas fluorescentes. Las constantes de disociación para interacciones de unión entre moléculas de muestra y moléculas de búsqueda etiquetadas se pueden deducir basándose tanto en la cinética (por ejemplo, tasas de replicación/no replicación) como en la estadística (por ejemplo, las porciones de moléculas de muestra en el estado unido o no unido en un tiempo dado) a una concentración dada de una molécula de búsqueda etiquetada.
En algunas realizaciones, la ID de una molécula de unión puede tener una longitud de al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 90, 100, 150, 200, o más o más nucleótidos. En algunas realizaciones, la ID puede tener una longitud de 5 a 10, 20, 40, 80, o 160; o de 10 a 20 o 50; o de 20 a 35 nucleótidos. La ID contiene una secuencia de ácidos nucleicos única, es decir, un ácido nucleico a detectar. En realizaciones en particular, la secuencia de ácidos
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Tabla 1. Señales de salida desde el detector de luz
Objeto
Sin objeto Objeto 1 Objeto 2 Objeto 3
Señal
J1 J2 J1 J2 J1 J2 J1 J2
1
0,0012 0,017 0,4861 1,036 0,1423 0,787 0,051 0,3807
2
0,0022 0,017 0,4866 1,036 0,1428 0,787 0,0515 0,3807
3
0,0017 0,017 0,4851 1,036 0,1433 0,7865 0,051 0,3802
4
0,0017 0,017 0,4846 1,036 0,1418 0,7865 0,0505 0,3798
5
0,0007 0,0165 0,4866 1,036 0,1433 0,7865 0,0505 0,3807
6
0,0012 0,0165 0,4861 1,036 0,1423 0,787 0,0505 0,3807
7
0,0022 0,016 0,4851 1,036 0,1423 0,787 0,0501 0,3798
8
0,0022 0,016 0,4856 1,036 0,1428 0,787 0,0505 0,3812
9
0,0027 0,0165 0,4856 1,036 0,1438 0,7875 0,0501 0,3802
10
0,0022 0,0165 0,4851 1,036 0,1423 0,787 0,051 0,3798
Promedio
0,0020 0,017 0,486 1,036 0,143 0,787 0,051 0,380
STD
0,0006 0,0004 0,0007 0,0000 0,0006 0,0003 0,0004 0,0005
En este ejemplo, un valor de 0,2 se selecciona como el valor del umbral para determinar si un objeto está presente. Si una cualquiera de las señales de salida, J1 y J2, es mayor que 0,2, se determina que un objeto está presente.
5 Después de determinar la presencia de un objeto, se calcula una proporción R = J2/(2 x J1). Si 0,5 < R < 1,5, se determina que el objeto que se está detectando es el Objeto 1. Si 2,0 < R < 3,0, se determina que el objeto que se está detectando es el Objeto 2. Si 3,5 < R < 4,5, se determina que el objeto que se está detectando es el Objeto 3. La Tabla 2 muestra algunos ejemplos de resultados de detección.
Tabla 2. Ejemplos de resultados de detección
Condiciones del Ensayo
Operación y Resultado
Presencia
Diferenciación
Criterios
Objeto 1 Objeto 2 Objeto 3
Lectura
J1 J2 Tipo Si J1 o J2 > 0,2 R = J2/(2 x J1) 0,5 < R< 1,5 2,0 < R < 3,0 3,5 < R < 4,5
1
0,0017 0,0155 Sin objeto FALSO - - - -
2
0,0032 0,0155 Sin objeto FALSO - - - -
3
0,4856 1,036 Objeto 1 VERDADERO 1,067 VERDADERO FALSO FALSO
4
0,4841 1,036 Objeto 1 VERDADERO 1,070 VERDADERO FALSO FALSO
5
0,4851 1,036 Objeto 1 VERDADERO 1,068 VERDADERO FALSO FALSO
6
0,1423 0,787 Objeto 2 VERDADERO 2,765 FALSO VERDADERO FALSO
7
0,1423 0,7855 Objeto 2 VERDADERO 2,760 FALSO VERDADERO FALSO
8
0,0501 0,3749 Objeto 3 VERDADERO 3,742 FALSO FALSO VERDADERO
9
0,0476 0,3734 Objeto 3 VERDADERO 3,922 FALSO FALSO VERDADERO
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