KR20110067021A - 분자 대상체를 검출 및 판별하기 위한 장치 및 방법 - Google Patents

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KR20110067021A
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헝-춘 첸
밍-치아 리
창-셩 츄
유-탕 리
청-판 치오우
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인더스트리얼 테크놀로지 리서치 인스티튜트
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Abstract

본 발명은 광을 방출할 수 있는 대상체를 검출하는 장치를 제공한다. 해당 장치는 광의 강도를 결정할 수 있는 적어도 2개의 광학 센서를 포함하는 광 검출기; 및 상기 광학 센서에 의해 발생된 출력 신호를 처리하여, 해당 처리 결과를 공지된 유형에 대응하는 공지된 결과와 비교해서 상기 대상체가 상기 공지된 유형에 속하는지의 여부를 판정하는 컴퓨터를 포함한다.

Description

대상체를 검출 및 판별하기 위한 장치{APPARATUS FOR DETECTION AND DISCRIMINATION OBJECT}
관련 출원
본 출원은 미국 가특허출원 제61/159,310호(출원일: 2009년 3월 11일)에 대한 우선권의 이득을 주장하며, 그 전체 내용은 참조로 본 명세서에 포함된다.
기술분야
본 발명은 대상체를 검출 및/또는 판별하기 위한 검출 장치 및 이 장치를 이용하는 방법에 관한 것이다. 또 본 발명은 낮은 강도의 광을 방출시키는 대상체를 검출 및/또는 판별할 수 있는 검출장치에 관한 것이다.
인간 게놈 프로젝트(HGP: Human Genome Project)는 서열결정 처리작업량(sequencing throughput)의 방대한 증가에 박차를 가하여 서열결정 비용의 대응하는 강하를 가져왔다. 13년간 게놈당 거의 30억$(US)의 비용이 소요된 것에 대해서, 서열결정 비용이 상당히 저감되었고 - 실제로 두 개체의 게놈이 최근 완성되었다(McGuire et al., Science 317:1687 (2007)). 개인의 게놈은 환자와 건강관리 제공자의 양쪽 모두를 위한 의료 처치의 파라다임 변화를 나타낸다. 질병에 대한 유전적 위험 인자를 관리함으로써, 건강관리 제공자는 예방 의학을 더욱 용이하게 실시할 수 있고 맞춤화된 치료를 제공할 수 있다. 완성된 게놈의 커다란 뱅크에 의해, 약물 설계 및 투여가 더욱 효율적으로 될 수 있어, 약리유전학의 초기 분야를 추진해 나갈 수 있다.
많은 종래의 DNA 서열결정 기술은 대상체로부터 방출된 광을 검출함으로써 대상체를 검출 및/또는 판별하는 수단으로서 광전자기술을 이용한다. 이들 기술에 이용되는 검출장치들은 값비싼 경우가 있고 그 효율도 그다지 높지 않다.
종래의 방법은 통상 검출 중인 대상체(들)로부터 방출된 광이 최고 강도를 지니는 소정 파장 대역 내에서의 측정에 의거한다. 이어서, 측정된 강도는 대상체의 농도 혹은 양을 계산하는 데 이용된다. 최근, 단일 대상체로부터 방출된 광을 검출하는 것이 인기를 끌고 있다. 예를 들어, 사람들은, 예컨대, 분자를 판별하기 위하여 단일의 염료 분자로부터 방출된 형광광을 검출할 필요가 있을 수 있다. 이러한 형광광의 강도는 매우 낮을 수 있으므로, 종래의 검출 장치 및 방법은 이러한 약한 광을 검출하기에 적합하지 않다. 또한, 유세포 분석(flow cytometry) 및 유세포 분석-유사 미세 유체 랩-온-어-칩(lab-on-a-chip) 장치 등과 같은 분석 절차의 감도는 광 검출기의 감도에 의해 제한될 수 있다. 이러한 절차의 감도를 증가시키는 것은 비교적 낮은 수준에서 존재하는 물질을 검출하는 것을 가능하게 할 수 있고, 이것은 그럼에도 불구하고 예를 들어 진단 혹은 연구 응용에서 관심을 가질 수 있다.
게다가, 많은 종래의 장치에서, 소정의 파장 대역 내에 있는 방출된 광의 일부를 통과시키고 해당 방출된 광의 다른 부분을 차단하는 것을 가능하게 하는 컬러 필터를 이용하는 경우가 있다. 따라서, 이들 장치는 복잡화되고 더 많은 공간을 필요로 한다. 그 밖에, 방출된 광의 일부분이 상기 컬러 필터에 의해 차단되므로, 광 검출기에 도달하는 광자의 수가 저감된다. 이것에 의해 종래의 장치 및 방법은 예를 들어 약한 방출을 지니는 대상체를 검출 및/또는 판별하는 데 훨씬 덜 적합하게 된다.
따라서, 대상체, 특히 단일 염료 분자 등과 같은 낮은 강도의 광을 방출하는 대상체를 검출 및/또는 판별하는 장치 및 방법에 대한 요구가 있다.
본 발명에 따르면, 광을 방출할 수 있는 대상체를 검출하는 장치가 제공된다. 해당 장치는 광의 강도를 결정할 수 있는 적층되어 있는 제1광학 센서와 제2광학 센서를 적어도 포함하는 광검출기; 및 상기 광학 센서들에 의해 발생된 출력 신호들을 처리하여, 해당 처리 결과를 공지된 유형에 대응하는 공지된 결과와 비교해서 상기 대상체가 상기 공지된 유형에 속하는지의 여부를 판정하는 컴퓨터를 포함한다.
본 발명의 추가의 목적 및 이점들은, 그 일부가 이하의 상세한 설명에 부분적으로 기재될 것이고, 또한 일부는 해당 설명으로부터 명백할 것이거나, 또는 본 발명의 실행에 의해 습득되어질 수 있다. 본 발명의 목적과 이점들은 첨부된 특허청구범위에서 특별히 지적된 요소들 및 그의 조합에 의해 실현되고 달성될 것이다.
상기 일반적인 설명 및 이하의 상세한 설명은 모두 예시적인 것이며 단지 설명을 위한 것으로 청구된 바와 같이 본 발명을 제한하는 것은 아님을 이해할 필요가 있다.
본 발명의 일부를 구성하며 본 발명에 내포되는 첨부된 도면은 본 발명의 하나(혹은 수개)의 실시형태를 예시하고, 이하의 상세한 설명과 함께 본 발명의 원리를 설명하는 역할을 한다.
도 1은 실리콘의 흡광계수를 나타낸 그래프;
도 2는 본 발명에 따른 검출장치를 도시한 도면;
도 3은 본 발명에 따른 광검출기를 도시한 도면;
도 4는 본 발명에 따른 광검출기를 도시한 도면;
도 5는 본 발명에 따른 검출장치에 이용되는 격자(grating)를 도시한 도면;
도 6은 두 양자점(quantum dot)의 발광 스펙트럼을 나타낸 도면;
도 7은 본 발명에 따른 두 포토다이오드의 감응도(responsivity)를 나타낸 그래프;
도 8은 하나의 도면 내에 두 포토다이오드의 감응도 곡선과 두 양자점의 스펙트럼을 도시한 도면;
도 9는 본 발명의 일 실시형태에 따른 검출방법을 예시한 순서도;
도 10은 본 발명의 다른 실시형태에 따른 검출방법을 예시한 순서도;
도 11은 본 발명의 또 다른 실시형태에 따른 검출방법을 예시한 순서도;
도 12는 본 발명의 다른 실시형태에 따른 검출방법을 예시한 순서도;
도 13은 본 발명의 또 다른 실시형태에 따른 검출방법을 예시한 순서도;
도 14는 본 발명의 다른 실시형태에 따른 검출방법을 예시한 순서도;
도 15는 본 발명의 또 다른 실시형태에 따른 검출방법을 예시한 순서도;
도 16은 본 발명에 따른 검출장치의 일례를 도시한 도면;
도 17은 본 발명에 따른 광검출기의 일례로서의 멀티-접합 포토다이오드를 도시한 도면;
도 18은 도 11의 멀티-접합 포토다이오드에서 하나의 포토다이오드의 감응도 곡선을 나타낸 도면;
도 19는 도 11의 멀티-접합 포토다이오드에서 다른 포토다이오드의 감응도 곡선을 나타낸 도면;
도 20은 본 발명의 일 실시예에서 시험된 3개의 대상체의 흡광 스펙트럼을 나타낸 그래프;
도 21은 본 발명의 일 실시예에서 시험된 3개의 대상체의 방출 스펙트럼을 나타낸 그래프.
본 발명에 따른 실시형태들은 대상체를 검출 및/또는 판별하는 검출장치를 포함한다. 해당 검출장치는 대상체로부터 방출된 약한 광을 검출하는 능력을 지닐 수 있다.
이하, 본 발명에 따른 실시형태들에 대해서 도면을 참조하여 상세히 설명한다. 가능할 때는 언제든지, 도면을 통해서 동일한 참조 부호는 동일 혹은 유사한 부분을 지칭하는 데 이용될 것이다.
1. 본 발명의 장치
본 발명에 따른 검출장치는 광을 방출할 수 있는 대상체를 검출 및/또는 판정하는 데 이용될 수 있다. 상기 대상체는 형광성 염료 분자, 인광성 염료 분자, 양자점, 또는 생물발광 혹은 화학발광 시스템의 발광 산물(예컨대, 일중항 산소(singlet oxygen) 혹은 여기된 코엘렌테라미드(coelenteramide) 등과 같은 여기된-상태 반응 산물) 등의 발광원일 수 있다. 본 발명의 장치는 적어도 하나의 레이저 등과 같은 적어도 하나의 여기성(excitatory) 광원을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 여기성 광원은 예를 들어 생물발광 혹은 화학발광을 통해 발생될 수 있는 흡광과는 독립적으로 발광하는 대상체를 검출할 필요는 없다. 상기 대상체는 또한 광 방출 능력이 없는 표적 분자일 수 있지만, 광을 발광 가능한 표지 대상체(labeling object)(예컨대, 형광성 염료 분자, 인광성 염료 분자 또는 양자점)에 부착되어 있을 수 있다. 소정의 표지 대상체는 특정 표적 분자에 부착될 수 있는 능력을 지니고 있어도 된다. 따라서, 상기 표적 분자는 상기 표지 대상체를 통해서 식별될 수 있다. 하나 이상의 표지 대상체가 하나의 표적 분자에 부착되어 있을 수 있다. 상기 장치는 또한 다수의 대상체를 모니터링하는 데 이용될 수도 있다.
본 발명에 따른 검출장치는 대상체로부터 방출된 광을 검출하는 광검출기를 포함할 수 있다. 상기 광검출기는 입사하는 광을 적어도 부분적으로 흡수하여 해당 광에 응답하여 출력신호들을 발생하는 능력을 지닌다. 상기 광검출기는 해당 광검출기의 동작을 제어하기 위한 제어회로를 포함할 수 있다. 상기 제어회로는 신호증폭기의 회로, A/D 변환기, 적산기, 비교기, 논리회로, 독출회로(readout circuit), 메모리, 마이크로프로세서, 클록 및/또는 어드레스를 포함할 수 있다.
상기 검출장치는 상기 광검출기로부터의 출력신호들을 처리하여 판정 결과를 발생하는 컴퓨터를 포함할 수 있다. 상기 검출장치는 핀홀을 지닌 블라인드 시트를 추가로 포함할 수 있다. 상기 검출장치는 또한 대상체가 부착되는 링커 부위를 포함할 수 있다. 해당 링커 부위는 핀홀 부근이지만 외부에 형성되어 있을 수 있거나 핀홀 내에 형성되어 있을 수 있다. 상기 장치는 여기 광원을 추가로 포함할 수 있다. 상기 대상체는 여기광원으로부터 방출된 광을 흡수하고 나서 검출장치에 의해 검출될 다른 광을 방출할 수 있다. 상기 대상체로부터 방출된 광은 상기 여기광원으로부터 방출된 광과는 다른 파장을 지닐 수 있다.
1.1 광학 센서
본 발명에 따른 광검출기는 복수개의 광학 센서를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 광학 센서는, 예를 들어, 포토다이오드, 애벌란시 포토다이오드(avalanche photo diode: APD), 포토트랜지스터, 포토게이트, 양자우물 적외 광검출기(quantum-well infrared photodetector: QWIP), TFA(thin-film on ASIC), 금속-반도체-금속(MSM) 광검출기 또는 이들의 조합일 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 광학 센서는 포토다이오드일 수 있다.
포토다이오드는 광을 전류 혹은 전압으로 변환시키는 고상 소자(solid-state device)이다. 포토다이오드는 통상 실리콘 등과 같은 반도체 재료로 제조된다. 포토다이오드의 기본 구조는 p-형 반도체와 n-형 반도체를 접합시킴으로서 형성된 p-n 접합부를 포함한다. 포토다이오드는 단지 하나의 p-n 접합부만을 지녀 단지 하나의 출력신호를 제공할 수 있고 따라서 하나의 광학 센서로 간주될 수 있고; 멀티-접합 포토다이오드는 하나 이상의 p-n 접합부를 지녀 하나 이상의 출력신호를 제공할 수 있으며, 여기서, 각 p-n 접합부는 하나의 광학 센서로서 간주될 수 있다.
대안적으로, 포토다이오드는 p-i-n 포토다이오드일 수 있다. 해당 p-i-n 포토다이오드는 n-형 층과 p-형 층 사이에 삽입된 진성층, 혹은 저농도로 도핑된 n-형 층, 혹은 저농도로 도핑된 p-형 층을 지니는 특정 유형의 p-n 접합부 포토다이오드이다. p-i-n 포토다이오드에서, 거의 전체 진성층인 공핍 영역의 두께는 양자 효율 및 주파수 응답을 최적화하도록 맞춤되어 있을 수 있다(S. M. Sze, Physics of Semiconductor Devices, pp. 674-675, Wiley, 2007).
p-형 반도체와 n-형 반도체는 각각 반도체 기판 내에 p-형 불순물과 n-형 불순물을 도핑함으로써 형성될 수 있다. 예를 들어, 실리콘 중에, 인 혹은 아르센이 n-형 불순물로서 작용할 수 있고, 붕소 및 인듐이 p-형 불순물로서 작용할 수 있다. 일반적으로, 확산 및 이온 주입의 두 방법이 반도체 기판 내에 불순물을 도입하는 데 이용될 수 있다. n-형 반도체 기판 내에 p-형 불순물을 확산 혹은 주입시킴으로써, n-형 반도체 기판의 일부가 p-형 반도체로 변환될 수 있다. 따라서, p-n 접합부가 형성될 수 있다. 대안적으로, p-형 반도체 기판 내에 n-형 불순물을 확산 혹은 주입시킴으로써, p-형 반도체 기판의 일부가 n-형 반도체로 변환될 수 있고, 따라서 p-n 접합부가 형성될 수 있다. 확산 및 이온 주입 이외에, 에피택셜 성장도 n-형 반도체 혹은 p-형 반도체를 제작하는 데 이용될 수 있으며, 이것은 얇은 단결정층이 단일 결정 기판의 표면 상에 성장되는 공법이다(D. A. Neamen, Semiconductor Physics & Devices, pp. 17-18, McGrawHill, 1997). 광이 포토다이오드 상에 입사될 경우, 전자-정공쌍이 포토다이오드 내에 생성될 수 있다. 전자-정공쌍이 포토다이오드의 공핍 영역 내에 생성되면, 해당 공핍 영역 내의 내부 전위(built-in potential)가 전자와 정공을 분리시켜 광전류 혹은 전압을 발생할 수 있다.
상이한 포토다이오드는 입사광을 흡수하는 상이한 능력을 지닐 수 있다. 해당 능력은 포토다이오드를 구성하는 재료의 흡광계수에 의해 기술될 수 있다. 도 1은 상이한 파장에서 실리콘의 흡광계수를 나타낸다. 입사광의 광자속(photon flux)(Φ)은 광이 포토다이오드 내로 침투하는 깊이에 따라 기하급수적으로 감소한다. 포토다이오드 내부의 깊이(x)에서의 광자속은 다음 식과 같이 표현될 수 있다:
Figure pat00001
식 중, λ는 입사광의 파장이고, Φ0는 포토다이오드의 표면에서의 광자속이다. 따라서, 공핍 영역에 흡수된 광자속은 다음 식에 의해 부여될 수 있다:
Figure pat00002
식 중, xu 및 xl은 각각 공핍 영역의 상부 경계선의 깊이 및 하부 경계선의 깊이이다.
공핍 영역 내에 흡수된 광자속은 포토다이오드의 출력신호로서 광전류로 변환될 수 있다. 광전류는 이하의 식으로 표현될 수 있다:
Figure pat00003
식 중, A는 광학창(optical window)의 면적이고, R(λ)는 입사광의 단위 출력(unit power)에 의해 생성된 전류량으로서 정의되는 포토다이오드의 감응도이다.
1.2 신호 처리용의 컴퓨터
본 발명에 따르면, 출력신호들에 대한 수학적 혹은 논리 연산을 수행함으로써 광검출기에 의해 생성된 출력신호들을 처리하여 대상체의 존재유무 및 유형을 판정하는 컴퓨터가 제공된다. 광학 센서로부터의 출력신호들을 처리하는 데 이용되는 컴퓨터는, 예를 들어, 개인용 컴퓨터, 마이크로프로세서-기반 혹은 프로그램가능한 가전제품, 논리회로 등일 수 있다.
상기 컴퓨터는 일시적 혹은 영구적으로 데이터를 저장하는 하나 이상의 기억 장치 및 알고리즘을 나타내는 소프트웨어 코드를 포함하는 컴퓨터 프로그램을 포함할 수 있다. 상기 컴퓨터는 상기 알고리즘에 기초한 처리를 수행할 수 있다. 상기 기억장치는 판독전용 메모리(ROM), 랜덤 액세스 메모리(RAM), 또는 다른 액세스 옵션을 지니는 메모리일 수 있다. 상기 기억장치는 컴퓨터-판독가능한 매체, 예를 들어, (a) 하드 디스크, 플로피 디스크 및 기타 자기 디스크, 테이프, 카세트 테이프 등과 같은 자성 매체; (b) 광디스크(CD-ROM, DVD(digital versatile disk)) 등과 같은 광학 매체; (c) DRAM, SRAM, EPROM, EEPROM, 메모리 스틱 등과 같은 반도체 매체에 의해, 혹은 종이와 같은 기타 임의의 매체에 의해 물리적으로 수행될 수 있다.
상기 컴퓨터는 광검출기로부터의 출력신호들을 수신하는 하나 이상의 인터페이스를 포함할 수 있다. 상기 컴퓨터는 이들 신호를 처리하는 하나 이상의 프로세서를 포함할 수 있다.
또한, 상기 컴퓨터는 사용자로부터의 명령을 수신하는 하나 이상의 입력장치를 포함할 수 있고, 또 처리 결과를 출력하는 하나 이상의 출력장치를 포함할 수 있다. 입력장치는 예를 들어 마우스, 키보드 혹은 복수개의 버튼을 지닌 제어판일 수 있다. 출력장치는 예를 들어 디스플레이 혹은 프린터일 수 있다.
1.3 예시적인 검출장치들
도 2를 참조하면, 본 발명에 따른 검출장치(1)가 예시되어 있다. 해당 검출장치(1)는 광검출기(11)와 컴퓨터(12)를 포함할 수 있다.
광검출기(11)는 제1광학 센서(111) 및 제2광학 센서(112)를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 광검출기(11)는 2개 이상의 광학 센서를 포함할 수 있다. 예를 들어, 몇몇 실시형태에서, 광검출기(11)는 3개의 광학 센서 혹은 4개의 광학 센서를 포함할 수 있다. 제1광학 센서(111)와 제2광학 센서(112)는 적층되어 있을 수 있다. 적층된 형태에 있어서, 대상체로부터 방출된 광은 제1광학 센서(111)를 통과하고 이어서 제2광학 센서(112)를 통과한다. 몇몇 실시형태에서, 광학 센서는 수직방향으로 혹은 실질적으로 수직방향으로 적층되어 있을 수 있다. 다른 실시형태에서, 광학 센서는 수직 방향에 대해서 소정의 각도(10°, 30°, 45°, 60° 등)에서 하나의 방향으로 비스듬하게 적층되어 있을 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 광검출기(11)는 복수개의 p-n 접합부가 내부에 형성되어 있는 멀티-접합 포토다이오드일 수 있다. 멀티-접합 포토다이오드에서, 각 p-n 접합부는 하나의 개별 광학 센서의 기본 구조를 형성할 수 있다. 각 제1광학 센서(111) 및 제2광학 센서(112)는, 예를 들어, 도 3에 도시된 바와 같이, 각각 멀티-접합 포토다이오드 내의 하나의 p-n 접합부를 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 광검출기(11) 내의 상이한 광학 센서는 실리콘, 게르마늄, GaAs, AlGaAs, InGaAs, InGaAsN, InGaP, CdTe 혹은 CdS 등과 같은 동일 반도체 재료로 제작되어 있을 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 광검출기(11) 내의 상이한 광학 센서는 상이한 반도체 재료로 제작되어 있을 수 있다. 예를 들어, 도 4는 2개의 수직방향으로 적층된 광학 센서(PD-1), (PD-2)로 형성된 광검출기를 도시하고 있다. 광학 센서(PD-1)는 재료-1과 재료-2로 제작된 반면, (PD-2)는 재료-2와 재료-3으로 제작된다. 재료-1, 재료-2 및 재료-3은 전술한 반도체 재료의 조합일 수도 있다. 또한, 이들 광학 센서의 두께는 또 상이할 수도 있다.
도 2에 도시된 바와 같이, 대상체로부터 방출된 광, 예컨대, 광검출기(11)에 입사하는 양자점(QD)은 제1광학 센서(111)에 의해 부분적으로 흡수되어, 제1신호(J1)를 생성할 수 있다. 흡수되지 않은 광은 제1광학 센서(111)를 통과하고, 이어서 부분적으로 제2광학 센서(112)에 의해 흡수되어, 제2신호(J2)를 생성할 수 있다. 이들 신호는 컴퓨터(12)에 전송되어 처리될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 대상체로부터 방출된 광은 광학 필터, 프리즘 혹은 렌즈 등과 같은 기타 광학 소자를 통과하는 일없이 광검출기(11) 상에 입사될 수 있다(즉, 광검출기 상에 직접 입사될 수 있다). 몇몇 실시형태에서, 상기 장치는 대상체로부터 방출된 광을 수집하기 위한 집광용 광학 구조체를 추가로 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 광검출기(11)는 수평방향으로 배열된 2개 이상의 광학 센서(도시 생략)를 포함할 수 있다. 이들 실시형태에서, 검출장치(1)는 대상체와 광검출기(11) 사이에 배치된 광학 구조체를 추가로 포함할 수 있다. 대상체로부터 방출된 광은 상기 광학 구조체에 의해 하나 이상의 광학 센서로 유도되어 해당 하나 이상의 광학 센서에 의해 부분적으로 흡수될 수 있다. 상기 광학 구조체를 통과한 후의 광의 방향은 상이한 파장을 지니는 광에 대해서 상이할 수 있다. 따라서, 수평 배열을 지니는 광검출기 내의 상이한 광학 센서는 상이한 파장을 지니는 광을 검출할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 상기 광학 구조체는 프리즘을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 광학 구조체는 렌즈를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 광학 구조체는 프리즘과 렌즈를 포함할 수 있다. 프리즘은 예를 들어 삼각형 프리즘, 압베 프리즘(Abbe prism), 펠린-브로카(Pellin-Broca prism), 아미치 프리즘(Amici prism) 또는 이들의 조합일 수 있다. 렌즈는 예를 들어 수렴 렌즈, 발산 렌즈 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 광학 구조체는 예를 들어 유리, 플라스틱, 혹은 대상 파장에 대해서 투명한 기타 재료로 제작될 수 있다. 상기 광학 구조체의 투명성은 광의 대부분이 해당 광학 구조체의 통과하는 것을 허용하도록 충분히 높을 수 있다.
대안적으로, 몇몇 실시형태에서, 상기 광학 구조체는 격자를 포함할 수 있다. 해당 격자는 예를 들어 이진 격자, 블레이즈 격자(blaze grating), 사인 격자, 멀티-레벨 격자, 부피 격자 또는 이들의 조합일 수 있다. 도 5는 본 발명의 일 실시형태에 따른 검출장치의 일례를 도시하고 있다. 이 검출장치에서, 광검출기는 상이한 위치에 수평방향으로 배열된 복수개의 광학 센서를 포함한다. 격자는 상이한 광학 센서에 의해 흡수되도록 대상체로부터의 상이한 파장의 광을 광검출기의 상이한 위치로 유도하는 데 이용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 검출장치들의 어레이를 포함하는 검출 시스템이 제공된다. 본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 광검출기들의 어레이 및 해당 광검출기들의 어레이로부터의 출력신호들을 처리하여 해당 처리 결과에 의거해서 검출 및/또는 판별을 수행하는 컴퓨터를 포함하는 검출 시스템이 제공될 수 있다. 이러한 검출 시스템은 한번에 복수개의 대상체를 검출 및/또는 판별할 수 있고, 따라서 예를 들어 핵산의 대규모의 병렬 서열결정에 적합할 수 있다.
컴퓨터(12)는 처리유닛(121)과 출력유닛(122)을 포함할 수 있다. 해당 처리유닛(121)은 광검출기(11)로부터의 출력신호들을 처리하여 대상체의 존재유무 및 유형을 판정한다. 출력유닛(122)은 판정 결과를 출력한다. 몇몇 실시형태에서, 컴퓨터(12)는 또한 컴퓨터 프로그램을 저장하는 저장장치(도시 생략)를 포함할 수 있다. 해당 컴퓨터 프로그램은 컴퓨터에 신호를 처리하라는 명령을 내리기 위한 소프트웨어 코드를 포함할 수 있다.
광검출기(11)와 컴퓨터(12)는 단일의 반도체칩 내에 집적되어 있을 수 있다. 광검출기(11)와 컴퓨터(12)는 분리된 반도체 칩들 상에 형성되어 있을 수도 있다.
2. 검출방법
상이한 대상체로부터 방출된 광은 상이한 스펙트럼을 지닐 수 있다. 예를 들어, 도 6은 두 대상체로서 2개의 양자점("QD")(QD-1, QD-2)의 발광 스펙트럼을 도시하고 있다. 이 예에서, 이들 두 발광 스펙트럼의 피크는 상이한 파장에 있다. 다른 예에서는, 상이한 대상체의 발광 스펙트럼은 상이한 형상을 지닐 수도 있다.
제1광학 센서(111)와 제2광학 센서(112)는 상이한 응답 특성을 지닐 수 있다. 도 7은, 일례로서, 제1광학 센서(111)와 제2광학 센서(112)의 감응도 곡선을 도시하고 있다. 제1광학 센서(111)와 제2광학 센서(112)의 감응도는 상이한 형상을 지니고/지니거나 상이한 파장에 있는 피크일 수 있다는 점에서 서로 상이할 수 있다.
보다 명확한 도시를 위하여, 도 8은 하나의 도면에 두 QD의 발광 스펙트럼과 두 광학 센서의 감응도 곡선을 나타내고 있다. 이 예에서, (QD-1)로부터 방출된 광은 두 광학 센서에서 유사한 강도의 신호를 발생할 수 있다. 한편, (QD-2)로부터 방출된 광은 제1광학 센서(111)에의 신호보다 강한 제2광학 센서(112)에서의 신호를 발생할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 도 2에 도시된 바와 같이, 대상체로부터 방출된 광은 광검출기(11) 상에 입사되어 제1광학 센서(111) 및 제2광학 센서(112)에 의해 부분적으로 흡수되고, 이어서 각각 신호(J1), (J2)를 발생할 수 있다. 컴퓨터(12)는 신호(J1), (J2)를 처리하여 대상체를 판별한다.
도 9는 본 발명의 일 실시형태에 따른 대상체의 판별 방법의 순서도를 나타내고 있다. 스텝 201에서, 대상체로부터 방출된 광이 광검출기(11) 상에 입사된다. 스텝 202에서, 2개의 출력신호(J1), (J2)가 각각 제1광학 센서 및 제2광학 센서에 의해 발생되고, 이들 신호(J1), (J2)가 컴퓨터(12)로 전송된다. 스텝 203에서, 컴퓨터(12)는 신호(J1), (J2)를 처리한다. 스텝 204에서, 컴퓨터(12)는 처리 결과를 공지된 유형의 대상체에 대응하는 공지된 결과와 비교한다. 스텝 205에서, 컴퓨터(12)는 상기 대상체가 상기 공지된 유형에 속하는지의 여부를 판정한다.
일 실시형태에서, 신호(J1), (J2)를 처리하는 단계는 (J1) 및 (J2)의 비를 계산하는 단계를 포함할 수 있다. 계산된 비가 공지된 유형의 대상체에 대응하는 소정의 범위 내에 있다면, 검출 중인 대상체가 공지된 유형에 속하는 것으로 판정될 수 있다. 예를 들어, 공지된 유형의 양자점(QD-1)은 0.7 < J2/J1 < 1.2의 대응하는 범위를 지닐 수 있다. 검출 중인 대상체에 대한 계산된 비가 0.9이면, 대상체가 QD-1형 대상체인 것으로 판정될 수 있다.
도 10은 본 발명의 다른 실시형태에 따른 대상체를 판별하는 방법의 순서도를 나타내고 있다. 이 실시형태에서, 대상체는 예컨대 3개의 공지된 유형, 즉, 유형 1, 유형 2 및 유형 3의 대상체 중 하나에 속하는 것으로 판정될 수 있다. 이 실시형태의 처음 두 스텝(즉, 단계)은 전술한 실시형태의 것과 동일할 수 있다. 스텝 303에서, 컴퓨터(12)는 이들 두 신호(J1), (J2) 간의 관계를 판정한다. 스텝 304에서, 컴퓨터(12)는 상기 관계를 공지된 유형의 대상체에 대응하는 공지된 결과와 비교한다. 스텝 305에서, 컴퓨터(12)는 비교결과에 의거해서 상기 대상체가 어느 유형에 속하는지를 판정한다.
이 실시형태에서, 예를 들어, J1 > J2이면, 대상체는 유형 1의 대상체인 것으로 판정될 수 있다. J1
Figure pat00004
J2이면, 대상체는 유형 2의 대상체인 것으로 판정될 수 있다. J1 < J2이면, 대상체는 유형 3의 대상체인 것으로 판정될 수 있다.
도 11은 본 발명의 또 다른 실시형태에 따른 대상체를 판별하는 방법의 순서도를 나타내고 있다. 이 실시형태에서, 대상체는 복수개의 공지된 유형, 즉, 유형 1 내지 유형 n의 대상체 중 하나에 속하는 것으로 판정될 수 있다. 이 실시형태의 처음 두 스텝은 전술한 실시형태의 것과 동일할 수 있다. 스텝 403에서, 컴퓨터는 (J1) 및 (J2)의 비를 계산한다. 스텝 404에서, 컴퓨터(12)는 계산된 비를 공지된 유형의 대상체에 대응하는 공지된 비와 비교한다. 스텝 405에서, 컴퓨터(12)는 비교결과에 의거해서 상기 대상체가 어느 유형에 속하는지를 판정한다.
이 실시형태에서, 예를 들어, 공지된 유형의 모든 공지된 비 중에서, 유형 i(1 ≤ i ≤ n)의 공지된 비가 계산된 비와 가장 가까운 경우, 대상체는 유형 i의 대상체인 것으로 판정될 수 있다.
도 12는 본 발명의 다른 실시형태에 따른 대상체를 판별하는 방법의 순서도를 나타내고 있다. 이 실시형태에서, 대상체는 복수개의 공지된 유형, 즉, 유형 1 내지 유형 n의 대상체 중 하나에 속하는 것으로 판정될 수 있다. 이 실시형태의 처음 세 스텝은 전술한 실시형태의 것과 동일할 수 있다. 스텝 504에서, 컴퓨터(12)는 계산된 비를 공지된 유형의 대상체에 대응하는 공지된 비 범위와 비교한다. 스텝 505에서, 컴퓨터(12)는 비교 결과에 의거해서 대상체가 어느 유형에 속하는지를 판정한다.
이 실시형태에서, 예를 들어, 계산된 비가 유형 i(1 ≤ i ≤ n)에 대응하는 비 범위 내에 있다면, 대상체는 유형 i의 대상체인 것으로 판정될 수 있다. 계산된 비가 이 범위 내의 어느 것 내에도 들어가지 않는다면, 신뢰 수준이 낮아 검출 중인 대상체의 유형이 판정될 수 없다고 보고될 수 있다. 예를 들어, 유형 1의 대상체가 0.7 < J2/J1 < 1.2의 대응하는 비 범위를 지니고 유형 2의 대상체가 J2/J2 > 2의 대응하는 비 범위를 지니는 것으로 가정할 경우, 검출 중인 대상체에 대한 계산된 비가 1이면, 해당 대상체는 유형 1의 대상체인 것으로 판정될 수 있다. 한편, 검출 중인 대상체에 대한 계산된 비가 1.5이면, 신뢰 수준이 낮아 해당 검출중인 대상체의 유형이 판정될 수 없다고 보고될 수 있다.
일 실시형태에서, (J1) 및 (J2)의 비는 J2/J1일 수 있다. 일 실시형태에서, (J1) 및 (J2)의 비는 J1/J2일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, (J1) 및 (J2)의 비는 J2/(c×J1) 혹은 J1/(c×J2)일 수 있고, 여기서 "c"는 계수이다.
몇몇 실시형태에서, 신호들이 컴퓨터(12)에 전송된 후, 해당 컴퓨터(12)는 대상체가 샘플 내에 존재하는지의 여부를 판정하는 스텝을 추가로 수행할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 해당 판정은 역치값을 지닌 신호의 일부 혹은 전부의 합계를 비교함으로써 수행될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 예를 들어, 상기 합계가 역치 이상이면, 대상체가 존재한다고 판정될 수 있다. 한편, 상기 합계가 역치보다 작다면, 대상체가 존재하지 않는다고 판정될 수 있다. 다른 실시형태에서, 상기 합계가 역치값보다 작다면, 대상체가 존재한다고 판정될 수 있다. 또, 합계가 역치값 이상이면, 대상체가 존재하지 않는다고 판정될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 판정은 대상체의 존재유무를 판정하기 위하여 신호를 직접 역치와 비교함으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, 임의의 신호 혹은 소정 개수의 신호가 역치 이상이면, 대상체가 존재한다고 판정될 수 있다. 한편, 모든 신호가 역치보다 작다면, 대상체가 존재하지 않는다고 판정될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 광검출기(11)는 3개 이상의 광학 센서를 포함할 수 있고, 이들 광학 센서는 각각 대상체로부터 방출되어 광검출기(11) 상에 입사되는 광에 대해서 출력신호를 생성한다. 몇몇 실시형태에서, 발생된 출력신호들 중 2개가 컴퓨터(12)에 의해 처리되어 대상체를 판별할 수 있다. 다른 실시형태에서는, 발생된 출력신호들 중 그 이상 혹은 모두가 컴퓨터(12)에 의해 처리되어 대상체를 판별할 수 있다.
도 13은 본 발명의 또 다른 실시형태에 따른 대상체를 판별하는 방법의 순서도를 나타내고 있다. 이 실시형태에서, 광검출기(11)는 3개의 광학 센서(PD1), (PD2), (PD3)를 포함한다. 샘플 내의 대상체는 예를 들어 4가지 유형, 즉, 염료 1, 염료 2, 염료 3 및 염료 4 중 하나에 속하는 것으로 검출되고 판정될 수 있다. 이들 3개의 광학 센서에 의해 발생된 출력신호는 각각 (IPD1), (IPD2) 및 (IPD3)으로 표현되고, 컴퓨터(12)로 전송되어 처리된다. 이 방법은 이하에 설명된다.
우선, 샘플은 여기광원을 이용해서 여기될 수 있다. 이어서, 광학 센서(PD1), (PD2), (PD3)는 출력신호(IPD1), (IPD2), (IPD3)를 생성한다. 컴퓨터(12)는, 이들 출력신호를 수신하면, 이들 신호의 합계를 계산할 수 있다. 해당 합계가 역치값(Vth)보다 작다면, 컴퓨터(12)는 어떠한 형광도 발생하지 않았다는 보고를 발생할 수 있다. 그렇지 않다면, 컴퓨터는 다음 스텝으로 진행할 수 있다.
형광이 발생하였고, 대상체가 존재한다고 판정되면, 컴퓨터(12)는 우선 원래의 판별 스텝을 수행할 수 있다. 이 스텝에서, 컴퓨터(12)는 (IPD3)와 모든 신호의 합계 간의 제1비를 계산하여 이 비를 제1세트의 역치값, 예컨대, (Vth1), (Vth2), (Vth3) 및 (Vth4)와 비교해서, 그 계산된 제1비가 0과 (Vth1) 사이, (Vth1)과 (Vth2) 사이, (Vth2)와 (Vth3) 사이 혹은 (Vth3)와 (Vth4) 사이의 임의의 범위 내에 들어가는지의 여부를 판정할 수 있다. 그러나, 계산된 제1비가 상기 범위의 어느 것에도 들어가지 않는다면, 컴퓨터(12)는 잘못된 방출이 일어났다는 보고를 발생할 수 있다.
그 후, 확인 스텝이 수행된다. 이 확인 스텝에서는, (IPD2)와 (IPD3) 사이의 제2비가 계산되고, 해당 제2비를 제2세트의 역치값, 예컨대, (Vth1 '), (Vth2 '), (Vth3 ') 및 (Vth4 ')와 비교해서, 그 계산된 제2비가 0과 (Vth1 ') 사이, (Vth1')와 (Vth2 ') 사이, (Vth2 ')와 (Vth3') 사이 혹은 (Vth3 ')와 (Vth4 ') 사이의 임의의 범위 내에 들어가는지의 여부를 판정한다.
예를 들어, 원래의 판별 스텝에서, 계산된 제1비가 (Vth1)과 (Vth2) 사이의 범위 내에 들어가면, 대상체가 염료 2 유형에 속할 가능성이 있다고 판정할 수 있다. 컴퓨터(12)는 이어서 확인 스텝으로 진행하여 계산된 제2비가 (Vth1')와 (Vth2 ') 사이의 범위 내에 들어가는지의 여부를 판정할 수 있다. 그 결과, 해당 범위 내에 들어간다면, 대상체가 염료 2 유형에 속한다고 판정할 수 있다. 그렇지 않다면, 컴퓨터(12)는 잘못된 방출이 일어났다는 보고를 발생할 수 있다.
단, 전술한 원래의 판별 스텝과 확인 스텝 중 어느 하나가 개별적으로 수행되어 대상체의 판별을 수행해도 된다. 그러나 하나의 판별 절차 내에서 두 스텝을 모두 수행하는 것은 정확도를 향상시킬 수 있다.
도 14는 본 발명의 추가의 실시형태에 따른 대상체를 판별하는 방법의 순서도를 표시한다. 이 실시형태에서, 광검출기(11)는 복수개의 광학 센서(PD1), (PD2), . . . (PDn)를 포함하되, 여기서, n은 1보다 크고 6 이하일 수 있다. 또한, n은 3일 수도 있다. 본 실시형태의 장치 및 방법은 예를 들어 q개의 상이한 대상체, 예를 들어, D1, D2, . . . Dq라 표기된 q개의 상이한 염료를 검출하여 판별하는 데 이용될 수 있다.
본 실시형태에서 이용된 여기광원은 k개의 상이한 여기광 밴드(L1, L2, . . . Lk)를 지닐 수 있고, 여기서 k는 1 이상 3 미만일 수 있다. 여기광원은 이어서 일련의 지시에 따라 온/오프 전환될 수 있고, 그 결과 일련의 m개의 상이한 여기조건(Cj)(여기서, 1 ≤ j ≤ m)이 얻어질 수 있다. 각 여기 조건은 상이한 여기광 대역의 조합일 수 있다. 동일한 여기 조건 하에, 상이한 염료용의 소정의 광학 센서에 의해 발생된 출력신호는 상이할 수 있다.
소정의 염료(Ds)(여기서 1 ≤ s ≤ q)에 대한 j번째 여기조건(Cj) 하에 i번째 광학 센서(PDi)(여기서 1 ≤ i ≤ n)에서 발생된 출력신호는 Ds{J{PDi:Cj}}로 표기될 수 있다. PDi와 Cj의 상이한 조합으로 인해 상이한 Ds{J{PDi:Cj}}가 얻어질 수 있다. 따라서, 미지의 염료를 검출하여 판별하는 장치를 이용하기 전에, 염료(Ds)용의 표준 환경에서 PDi와 Cj의 상이한 조합을 이용해서 교정 판독을 수행함으로써, 출력신호의 행렬을 얻을 수 있다. 이 행렬은 염료에 고유할 수 있고, 이하에 표시된 바와 같이 염료(Ds)용의 표준 판독 행렬 M{dye Ds}이라 불릴 수 있다:
Figure pat00005
이 교정 판독은 각 염료에 대해서 반복되어 q개의 표준 판독 행렬 M{염료 D1}, M{염료 D2}, . . . M{염료 Dq}를 작성할 수 있다.
배경의 영향을 최소화하기 위하여, 배경 판독은 또한 염료가 존재하지 않을 경우 광학 센서로부터의 출력신호를 기록함으로써 얻어질 수도 있고, 그 결과 배경 판독 행렬 M{배경}이 얻어질 수 있다:
Figure pat00006
미지의 샘플이 검출장치에 적용될 경우, 상이한 여기 조건에서 광학 센서에 의해 발생된 출력신호가 측정되어 샘플 판독 행렬 M{샘플}이 얻어진다:
Figure pat00007
이 샘플 판독 행렬은 이어서 샘플이 어떠한 유형의 염료를 포함하는지를 판정하기 위하여 표준 판독 행렬과 비교될 수 있다. 그 결과 상에 배경의 영향을 최소화하기 위하여, 배경 판독 행렬은 비교 전에 표준 판독 행렬과 샘플 판독 행렬의 양쪽으로부터 차감될 수 있다.
상기 비교는 각 염료(Ds)의 유형에 대해서 랭크(Rs)를 계산함으로써 수행될 수 있다. (Rs)를 계산할 경우, 가중 인자와 통계학적 방법이 적용될 수 있다. 예를 들어, 최소자승법 혹은 최소 가능도법(most likelihood method)이 최상의 정합을 찾는데 이용될 수 있다. 가중 인자는 분석의 정확도를 증가시키기 위하여 각 광학 센서에 대해서 혹은 여기 광 모드에 대해서 적용될 수 있다.
(Rs)가 계산된 후, 컴퓨터(12)는 랭크(Rs)에 따라서 가장 가능한 염료, 제2의 가능한 염료 등을 보고할 수 있다.
합성법에 의한 서열결정에서, DNA 서열은 증식 쇄에 새롭게 추가된 뉴클레오타이드를 확인함으로써 결정된다. 뉴클레오타이드 부가 공정은 뉴클레오타이드에 부착된 형광단(fluorophore)으로부터 방출된 형광광에 의해 검출된다. 뉴클레오타이드 편입 반응은 수개의 단계로 나뉠 수 있다: 즉, 폴리메라제와 주형에 의해 형성된 활성 부위 속으로의 뉴클레오타이드의 도킹단계, 인산염 결합의 파괴단계 및 당에 새로운 결합을 형성단계. 몇몇 뉴클레오타이드는 활성 부위 내외로 직접 확산되어 실제의 편입을 일어나지 않는다. 실시간 편입 반응을 모니터링하기 위하여, 검출장치는 유입되는 형광단, 형광단의 유지시간 및 유형을 검출하는 것이 가능할 필요가 있을 수 있다. 유지 시간을 측정하는 이유는 확산하는 뉴클레오타이드가 이들 편입된 뉴클레오타이드보다 짧은 기간 동안 머물 수 있기 때문이다. 유지 시간 역치를 설정함으로써, 실시간 편입 이벤트가 검출될 수 있다. 이벤트 검출에 이용될 수 있는 본 발명의 추가의 실시형태에 따른 방법의 순서도는 도 15에 도시되어 있다. 이 방법은 기본적으로 전술한 방법과 유사하지만, 이벤트가 요구될 수 있는지의 여부를 판정하는 하나 이상의 스텝이 부가될 수 있다. 따라서, 이 방법의 상세한 설명은 생략한다. 도 16은 이 실시형태에 이용될 수 있는 하나의 예시적인 검출장치의 블록도를 나타낸다.
몇몇 실시형태에서, 광검출기(11)는 수평방향으로 배열된 2개 이상의 광학 센서를 포함할 수 있다. 수평방향으로 배열된 광학 센서에 의해 발생된 신호는, 대상체의 존재를 판정하고/하거나 대상체의 유형을 판별하는 전술한 방법들 중 하나와 마찬가지 방식으로 컴퓨터(12)에 입력되어 처리될 수 있다.
3. 응용
본 발명에 따른 검출장치 및 검출시스템, 그리고 이를 이용하는 검출방법은 예를 들어 핵산 검출, DNA 서열결정, 바이오마커 확인 혹은 유세포 분석에 적용될 수 있다. 이들 검출장치는 단일 분자 대상체 판별을 가능하게 하는 낮은 강도의 광 신호를 검출하여 처리할 수 있다.
본 발명의 방법의 몇몇 실시형태에서, 표지가 분석 대상물(들)(즉, 피검출 물질(들)), 프로브, 예컨대, 프라이머, 항체, 또는 분석 대상물(들)과 상호작용하는 기타 시약, 또는 기타 시약(들), 예컨대, 뉴클레오타이드들(뉴클레오타이드 유사체들을 포함)에 부착된다. 임의의 표지가 분석 대상물 혹은 프로브에 이용될 수 있고, 이것은 분석 대상물의 양 혹은 존재 유무와 신호의 상관에 유용할 수 있다.
예를 들어, 소분자, 형광 단백질(fluorescent protein) 및 양자점을 비롯한 광범위한 각종 형광 분자가 본 발명에 이용될 수 있다. 유용한 형광 분자(형광단)로는, 이들로 제한되는 것은 아니고, 1,5 IAEDANS; 1,8-ANS; 4-메틸움벨리페론(Methylumbelliferone); 5-카복시-2,7-다이클로로플루오레세인; 5-카복시플루오레세인(5-FAM); 5-카복시나프토플루오레세인; 5-카복시테트라메틸로다민(5-TAMRA); 5-FAM(5-카복시플루오레세인); 5-HAT(하이드록시트립타민); 5-하이드록시 트립타민(HAT); 5-ROX(카복시-X-로다민); 5-TAMRA(5-카복시테트라메틸로다민); 6-카복시로다민 6G; 6-CR 6G; 6-JOE; 7-아미노-4-메틸쿠마린; 7-아미노악티노마이신 D(7-AAD); 7-하이드록시-4-메틸쿠마린; 9-아미노-6-클로로-2-메톡시아크리딘; ABQ; 산성 푸크신(Acid Fuchsin); ACMA(9-아미노-6-클로로-2-메톡시아크리딘); 아크리딘 오렌지; 아크리딘 레드; 아크리딘 옐로; 아크리플라빈; 아크리플라빈 포일겐(Acriflavin Feulgen) SITSA; AFPs-자가형광 단백질(AutoFluorescent protein)-(QuantumBiotechnologies); 텍사스 레드; 텍사스 레드-X 컨쥬게이트; 티아다이카보사이아닌(DiSC3); 티아진 레드 R; 티아졸 오렌지; 티오플라빈 5; 티오플라빈 S; 티오플라빈 TCN; 티오라이트(Thiolyte); 티오졸 오렌지; 티노폴 CBS(Calcofluor White); TMR; TO-PRO-1; TO-PRO-3; TO-PRO-5; TOTO-1; TOTO-3; 트라이컬러(PE-Cy5); TRITC(TetramethylRodaminelsoThioCyanate); 트루 블루; 트루레드; 울트라라이트(Ultralite); 우라닌 B; 유비텍스SFC; WW 781; X-로다민; XRITC; 자일렌 오렌지; Y66F; Y66H; Y66W; YO-PRO-1; YO-PRO-3; YOYO-1; YOYO-3, Sybr 그린, 티아졸 오렌지 등과 같은 인터킬레이팅 염료; 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 350, 알렉사 플루오르 405, 430, 488, 500, 514, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 635, 647, 660, 680, 700 및 750 등과 같은, 광범위 스펙트럼을 커버하고 통상의 여기원의 기본적인 출력 파장과 정합하는 알렉사 플루오르 염료 시리즈 계열(Molecular Probes/lnvitrogen사 제품); Cy3, Cy3B, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7 등과 같은 광범위 스펙트럼을 또한 커버하는 Cy Dye 형광단 시리즈(GE Healthcare) 등의 계열; 오이스터(Oyster)-500, -550, -556, 645, 650, 656 등과 같은 오이스터 염료 형광단(Denovo Biolabels); 예를 들어, DY-415, -495, -505, -547, -548, -549, -550, -554, -555, -556, -560, -590, -610, -615, -630, -631, -632, -633, -634, -635, -636, -647, -648, -649, - 650, -651, -652, -675, -676, -677, -680, -681, -682, -700, -701, -730, -731, -732, -734, -750, -751, -752, -776, -780, -781, -782, -831, -480XL, -481XL, -485XL, -510XL, -520XL, -521XL 등과 같은 418㎚(DY-415) 내지 844㎚(DY-831)의 범위에 이르는 최대 흡수를 지니는 DY-표지즈 시리즈(Dyomics)의 계열; ATTO 390, 425, 465, 488, 495, 520, 532, 550, 565, 590, 594, 610, 611X, 620, 633, 635, 637, 647, 647N, 655, 680, 700, 725, 740 등과 같은 형광 표지의 ATTO 시리즈(ATTO-TEC GmbH)의 계열; CAL 플루오르 골드 540, CAL 플루오르 오렌지 560, 쿠아사(Quasar) 570, CAL 플루오르 레드 590, CAL 플루오르 레드 610, CAL 플루오르 레드 635, 쿠아사 670 등과 같은 염료의 CAL 플루오르 시리즈 혹은 쿠아사 시리즈(Biosearch Technologies)의 계열; EviTags 시리즈(Evident Technologies) 등과 같은 양자점, 또는 Qdot 525, Qdot565, Qdot585, Qdot605, Qdot655, Qdot705, Qdot 800 등과 같은 Qdot 시리즈(Invitrogen)의 양자점; 플루오레세인; 로다민; 및/또는 사이코에리트린(phycoerythrin); 또는 이들의 조합물 등을 들 수 있다. 이에 대해서는, 예를 들어, 미국 특허 공개 제2008/0081769호 공보를 참조할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 분석 대상물, 시약 혹은 반응 생성물 등과 같은 물질의 존재 하에 광을 발생하는 적어도 하나의 생물발광 혹은 화학발광 시스템이 제공된다. 예를 들어, 생물발광 혹은 화학발광 시스템은 합성 반응(이하에 더욱 상세히 논의됨)에 의해 서열결정에 생성된 파이로인산염을 검출하거나; 광-발생 반응의 촉매 반응에 의해 철 혹은 구리 등과 같은 금속의 존재를 검출하거나; 혹은 분석 대상물에 의해 둘러싸인 시약의 양을 측정하는 데 이용될 수 있고, 여기서, 시약은 생물 혹은 화학발광 시스템의 적어도 하나의 성분을 포함한다.
당업계에 공지된 생물발광 시스템의 예로는 적어도 하나의 루시페라제, 예컨대, 포티너스 피랄리스(Photinus pyralis) 루시페라제를 비롯한 개똥벌레 루시페라제를 구비하는 시스템을 포함한다. 생물발광 시스템은, 예를 들어, 합성 반응에 의한 서열결정의 성분과 함께, 루세페라제, ATP 설퍼릴라제, 루시페린 및 아데노신 5' 포스포설페이트를 제공함으로써, 파이로인산염을 검출하는 데 이용될 수 있다(여기서, dATP는 루시페라제에 의한 dATP의 소비로 인한 비특이광을 피하기 위하여 dATPαS 등과 같은 유사체로 치환될 수 있다). 파이로인산염이 뉴클레오타이드 편입 이벤트에 의해 발생될 경우, ATP 설퍼릴라제는 아데노신 5' 포스포설페이트 의존 방식으로 ATP를 생산한다. ATP는 루시페라제에 의해 옥시루피세린 + 광으로 루시페린의 변환을 추진한다. 기타 생물발광 시스템은, 코엘렌테라진을 여기된 코엘렌테라미드로 산화시켜 광을 방출하는 에쿼린(aequorin) 등과 같은 광단백질(photoprotein)에 기초한 시스템을 포함한다.
화학발광 시스템의 예로는 금속 촉매 혹은 보조 산화제의 존재 하에 발광 반응을 경험할 수 있는 루미놀 + 과산화수소; 다단계 반응에서 여기 및 광 발광을 경험하여 이산화탄소를 생성하는 다이페닐 옥살레이트 + 과산화수소와 적절한 염료(적절한 염료의 예로는 9,10-다이페닐안트라센, 9,10-비스(페닐에티닐)안트라센 및 1-클로로-9,10-비스(페닐에티닐)안트라센 등과 같은 페닐화 안트라센 유도체, 및 로다민 6G 및 로다민 B 등과 같은 로다민을 들 수 있음); 과산화수소 + 차아염소산 나트륨 등과 같은 일중항 산소-생산 시스템; 및 루미놀 혹은 기타 상업적으로 입수가능한 기질 상에 작용하는 서양고추냉이 퍼옥시다제 등과 같은 효소를 포함하는 시스템을 들 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 본 발명의 방법은 시약 혹은 분석 대상물과 표면 혹은 표지 사이 등과 같은 공유결합 부착물을 형성하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 단일 분자 서열결정 절차에 있어서, 핵산 분자 혹은 폴리메라제와 같은 효소는 유리 슬라이드 등과 같은 표면에 부착될 수 있다. 이러한 부착은 다수의 서열결정 사이클에 대해서 데이터의 획득을 가능하게 할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 표면 혹은 표지에 시약 등과 같은 공유 부착을 형성하는 많은 방법이 당업계에 공지되어 있다. 비공유 부착 방법도 또한 이용될 수 있다. 부착물 형성을 용이하게 하기 위하여 많은 상이한 화학 변성제가 이용될 수 있다. 화학 변성제의 예로는 N-하이드록시숙신이미드(NHS)기, 아민류, 알데하이드류, 에폭사이드류, 카복실기, 하이드록실기, 하이드라자이드류, 소수성 기, 멤브레인, 말레이미드류, 바이오틴, 스트렙타비딘, 티올기, 니켈 킬레이트류, 광반응성 기, 붕소기, 티오에스터기, 시스테인류, 다이설파이드기, 알킬 및 아실 할라이드기, 글루타티온류, 말토스류, 아자이드류, 인산염류 및 포스핀류 등을 들 수 있다. 이러한 화학적으로 변성된 표면을 지니는 유리 슬라이드 등의 표면은 다수의 변성을 위하여 상업적으로 입수가능하다. 이들은 표준 방법(Microarray Biochip Technologies, Mark Schena, Editor, March 2000, Biotechniques Books)을 이용해서 나중을 위하여 용이하게 준비될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 부착물은 적절한 변성제의 조합(예컨대, 친전자성 변성제와 친핵성 변성제)을 이용해서 두 물질 사이에 형성되고, 여기서 각 물질은 적어도 하나의 변성제를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 부착물은 상기 물질들 중 하나에 존재하는 화학 변성제 및 다른 물질의 천연 유래 물질, 예컨대, 아민 혹은 설피드릴을 이용해서 두 물질 사이에 형성된다. 몇몇 실시형태에서, 아민류와 반응성인 변성제가 이용된다. 이 반응의 이점은 신속하게 진행될 수 있다는 점과 독성 부산물의 생성을 피할 수 있다는 점이다. 이러한 변성제의 예로는 NHS-에스터류, 알데하이드류, 에폭사이드류, 아실 할라이드류 및 티오-에스터류 등을 들 수 있다. 대부분의 단백질, 펩타이드류, 글라이코펩타이드류 등이 유리 아민기를 지니며, 이들은 이러한 변성제와 반응하여 이들 변성제와 공유결합적으로 결합될 수 있다. 내부 혹은 말단 아민기를 지니는 핵산 프로브도 합성될 수 있고, 상업적으로 입수가능하다(예컨대, IDT 혹은 Operon사로부터). 이와 같이 해서, 생체 분자는 유사한 화학을 이용해서 표지, 표면 혹은 기타 시약에 (예를 들어, 공유 혹은 비공유 결합적으로) 결합될 수 있다.
다수의 기타 다작용성 가교제가 한 종류의 변성제의 화학 반응성을 다른 것으로 변환시키는 데 이용될 수 있다. 이들 기는 2작용성, 3작용성, 4작용성 등일 수 있다. 이들은 또한 호모작용성 혹은 헤테로작용성일 수 있다. 2작용성 가교기의 일례는 X-Y-Z이며, 여기서 X 및 Z는 2개의 반응성 기이고, Y는 접속용 링커이다. 또한, X와 Z가 동일한 기, 예컨대 NHS-에스터이면, 얻어지는 가교제 NHS-Y-NHS는 호모-2-작용성 가교제이고, 각각 아민을 포함하는 두 물질을 접속할 수 있었다. X가 NHS-에스터이고 Z가 말레이미드기이면, 얻어지는 가교제 NHS-Y- 말레이미드는 헤테로-2-작용성 가교기이며 티오기를 포함하는 물질과 아민을 포함하는 물질을 결합시킬 수 있었다. 다수의 상이한 작용기를 지니는 가교제는 광범위하게 입수가능하다. 이러한 작용기의 예로는 NHS-에스터, 티오-에스터류, 알킬 할라이드류, 아실 할라이드류(예컨대, 아이오도아세트아마이드), 티올류, 아민류, 시스테인류, 히스티딘류, 다이설파이드류, 말레이미드류, 시스-다이올류, 붕산, 하이드록삼산, 아자이드류, 하이드라진류, 포스핀류, 광반응성 기(예컨대, 안트라퀴논, 벤조페논), 아릴아마이드(예컨대, 아크리다이트), 친화성 기(예컨대, 바이오틴, 스트렙타비딘, 말토스, 말토스 결합 단백질, 글루타티온, 글루타티온-S-트랜스페라제), 알데하이드류, 케톤류, 카복실산류, 인산염류, 소수성 기(예컨대, 페닐, 콜레스테롤) 등을 들 수 있다.
기타 변성제 대용품(광가교 및 열가교 등)은 당업자에게 공지되어 있다. 상업적으로 입수가능한 기술로는, 예를 들어, Mosiac Technologies(Waltham, MA), EXIQON™(Vedbaek, Denmark), Schleicher and Schuell(Keene, N. H.), Surmodics™(St. Paul, MN), XENOPORE™(Hawthorne, N.J.), Pamgene(Netherlands), Eppendorf(Germany), Prolinx(Bothell, WA), Spectral Genomics(Houston, TX) 및 COMBIMATRIX™(Bothell, WA)으로부터의 것들을 들 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 유리 이외의 표면이 제공된다. 예를 들어, 금, 규소, 구리, 티탄 및 알루미늄 등의 금속 표면, 산화규소, 산화티탄 및 산화철 등의 금속 산화물, 폴리스타이렌, 폴리우레탄 등의 플라스틱, 제올라이트 및 기타 물질 등도 이용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 이들 재료의 층은 예를 들어 광전송을 허용하기 위하여 예컨대 약 100㎚ 미만으로 얇게 되어 있을 수 있다.
3.1 핵산 검출
본 발명에 따른 검출장치는 분자 검출, 예컨대, 핵산 서열결정의 방법 혹은 프로세스용의 시스템의 일부로서 사용될 수 있다. 이 장치, 그리고 이것을 이용하는 방법 혹은 프로세스는 예를 들어 분석 및 진단 용도에 유용하다. 이들 용도는 개인, 공중, 상업 혹은 산업용일 수 있다.
본 발명에 따른 검출장치는 광범위한 각종 서열결정 형식과 함께 이용될 수 있고, 이것은 단일분자를 서열결정하는 데 적합할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 검출장치는 기존의 바이오칩장치에 비해서 단순화된 설계, 조립 및 생산을 지닌다. 예를 들어, 서열결정될 핵산은, 해당 시스템의 어레이 상의 랜덤한 링커 부위에 부착될 수 있으므로, 소정 개소에 핵산을 합성하거나 침착시키기 위하여 시간 소모적이거나 값비싼 로봇을 이용하는 것을 피할 수 있다.
본 발명에 따른 검출장치는, 예를 들어, 전체 게놈 서열결정, 전사 프로파일링, 비교 전사 프로파일링 혹은 유전자 식별을 위한 핵산 하이브리다이제이션(hybridization) 혹은 서열결정을 비롯한 생체 분자 검출 시스템의 일부로서 혹은 그 방법 및 프로세스에 이용될 수 있다. 생체 분자 검출은 또한 예컨대 단백질/단백질, 항체/항원, 수용체/리간드 및 핵산/단백질 등의 결합 상호작용의 검출 및/또는 측정을 포함할 수 있다. 이들 응용은 분석 혹은 진단 프로세스 및 방법에 유용하다.
본 발명에 의해 제공된 장치 상에서의 검출에 적합한 핵산은, 몇몇 실시형태에서, 결합 분자의 일부일 수 있고, 이것은 결합 상호작용을 분석하기에 적합한 분자, 예컨대, 단백질, 기타 핵산, 탄수화물 부분 혹은 소분자를 본 발명에 의해 제공된 장치 상의 링커 부위에 부착될 수 있다. 결합 분자는, 몇몇 실시형태에서, 결합 상호작용을 위하여 분석되고 있는 분자에 결합되는 포획 분자를 추가로 포함할 수 있다. 결합 분자 내의 핵산은 예를 들어 직접 서열결정 혹은 하이브리다이제이션에 의해 결합 분자의 상기 포획 분자에 대한 확인 태그로서 역할한다.
본 발명에 의해 제공된 방법은 본 발명에 의해 제공된 검출 시스템의 어드레스 어레이에 검출될 분자를 부착시키는 단계를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 어드레스 어레이는 복수개의 핀홀을 지니는 블라인드 시트를 포함할 수 있고, 링커 부위는 핀홀 내 혹은 핀홀 둘레에 형성될 수 있다. 이와 같이 해서, 본 발명에 따른 검출 시스템은 수백만개의 핵산 세그먼트를 동시에 판독할 수 있다. 각 세그먼트가 예를 들어 1000개의 염기 길이이면, 단일 장치가 예를 들어 전체 게놈 서열결정 및 재서열결정을 가능하게 하는 수십만개의 비트의 서열 정보를 얻을 수 있었다.
3.1.1 검출될 분자
본 발명에 의해 제공된 방법에 의한 검출에 적합한 핵산은, 예를 들어, DNA, RNA 혹은 PNA(펩타이드 핵산)를 비롯한 임의의 핵산을 포함할 수 있고, 또한 임의의 서열-천연 유래 혹은 인공 서열을 비롯한 공지 및 미지의 것의 양쪽 모두를 포함할 수 있다. 핵산은 천연적으로 유래될 수 있거나, 재조합적으로 생산될 수 있거나, 혹은 화학적으로 합성될 수 있다. 핵산은 천연 유래 뉴클레오타이드, 천연에 존재하지 않는 뉴클레오타이드 유사체 또는 변성 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 검출될 핵산의 길이는 실제의 응용에 따라 다양할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 핵산은 적어도 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000, 10000, 20000개 혹은 그 이상의 염기를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 핵산은 10 내지 20, 10 내지 50, 10 내지 100, 50 내지 100, 50 내지 500, 50 내지 1000, 50 내지 5000, 500 내지 2000, 500 내지 5000 또는 1000 내지 5000개의 염기일 수 있다.
핵산은 검출용의 단쇄일 수 있다. 단쇄 핵산 주형은, 예를 들어, 가열 또는 알칼리 혹은 기타 화학약품 처리를 비롯한 당업계에 공지된 수단에 의해 이중쇄 분재로부터 유래될 수 있다. 단쇄 핵산 주형은 또한 예를 들어 화학적 혹은 시험관내 합성에 의해 생산될 수도 있다.
몇몇 실시형태에서, 검출될 핵산은 그의 5' 혹은 3' 말단에서 링커 부위에 부착될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 핵산은 해당 핵산의 5' 말단, 3' 말단, 또는 5' 말단과 3' 말단의 양쪽 모두에 결합된 하나 이상의 말단 링크 프라이머를 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 말단 링크 프라이머는 핵산의 3' 말단에 부착될 수 있다. 각 링크 프라이머는 검출될 핵산을 상기 장치 상의 링커 부위에 부착하고 또한 하나 이상의 검출 프라이머, 예를 들어 서열결정 프라이머에 대한 상보적인 서열을 제공하는 데 이용될 수 있다.
3.1.1.1 말단 링크 프라이머
말단 링크 프라이머는 100개 미만의 뉴클레오타이드로 통상 구성된 짧은 핵산 분자이다. 몇몇 실시형태에서, 말단 링크 프라이머는 길이가 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 50, 75, 90개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 소정의 실시형태에서, 말단 링크 프라이머는 길이가 8 내지 25, 10 내지 20, 10 내지 30 또는 10 내지 50개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 말단 링크 프라이머는 미분기되어 있을 수 있지만, 다른 실시형태에서는 이들은 분기되어 있을 수 있다.
말단 링크 프라이머는 검출될 핵산을 어드레스 어레이 상의 링커 부위에 부착시키는 데 이용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 말단 링크 프라이머는, 핵산을 어레이 표면에 직접, 예를 들어, 공유 결합(예컨대, 에스터 혹은 티올 결합) 혹은 비공유 결합, 예컨대, 항원/항체 또는 바이오틴/아비딘 결합에 의해 연결할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 말단 링크 프라이머는 핵산을 어레이 표면에 간접적으로, 예를 들어, 중간체 분자, 예컨대, 폴리메라제를 결합시킴으로써 연결할 수 있다. 따라서, 말단 링크 프라이머는 변성된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있거나, 또는 다르게는, 당업계에 공지된 수단, 예를 들어, 다이설파이드, 티오에스터, 아마이드, 포스포다이에스터 혹은 에스터 결합에 의해; 또는 예컨대, 항체/항원 혹은 바이오틴/아비딘 결합에 의해 링커 부위에 부착을 용이하게 하기 위하여 변성되어 있을 수 있고, 예컨대, 말단 링크 프라이머는 항원 부분을 포함하는 뉴클레오타이드 혹은 바이오틴화된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 변성된 뉴클레오타이드는 말단 링크 프라이머의 3'말단 상에 있을 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 말단 링크 프라이머의 5' 말단은 변성된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
말단 링크 프라이머는 또한 핵산을 검출하는 데 이용되는 하나 이상의 프라이머, 예컨대, 서열결정 프라이머에 대한 상보체로서 역할할 수도 있다. 몇몇 실시형태에서, 프라이머는 하이브리다이제이션에 의해 핵산을 검출하는 데 이용될 수 있고, 예컨대, 프라이머는 검출가능한 레벨, 예컨대, 형광 레벨을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 말단 링크 프라이머의 5' 말단은 서열결정 프라이머에 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 서열결정 프라이머에 상보적인 말단 링크 프라이머 서열은, 서열결정 프라이머의 3' 말단이 서열결정될 핵산 내의 첫번째 뉴클레오타이드에 바로 인접하도록 배향되어 있을 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 말단 링크 프라이머는 리가제(ligase), 예를 들어, DNA 리가제에 의해 검출될 핵산의 말단에 부가될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 검출될 말단 링크 프라이머와 핵산은 모두 결찰(ligation) 전에 단쇄일 수 있다. 다른 실시형태에서, 이들 양쪽 모두는 이중쇄일 수도 있다. 또 다른 실시형태에서, 한쪽은 단쇄이고 다른 쪽은 이중쇄일 수 있다. 결찰은 당업계에 충분히 공지되어 있다. 예를 들어, 폴로니 서열결정법(polony sequencing method)에서, Shendure 등(Science, 309:1728-1732 (2005))은 NEB(New England Biolabs') 퀵 리게이션 키트를 이용해서 T30 말단 링크 프라이머(32 bp)를 샘플 DNA 세그먼트에 결찰시켰다. 그때, 결찰 반응용액은 1X 퀵 리게이션 버퍼 중에 0.26 pMole의 DNA, 0.8 pMole의 T30 말단 링크 프라이머, 4.0㎕의 T4 DNA 리가제를 포함하고 있었다. 혼합 후, 반응 용액은 실온에서 약 10분간 배양되었고, 이어서, 얼음 위에 배치되었다. 결찰 반응은 10분간 65℃에서 샘플을 가열함으로써 정지되었다.
다른 실시형태에서, 말단 링크 프라이머는 검출될 핵산 상에 합성될 수 있다. 예를 들어, 말단 링크 프라이머는 예컨대 말단 트랜스페라제에 의해 부가된 호모폴리머일 수도 있다. 예를 들어, Harris 등(Science 320:106-109 (2008))은 폴리 A 테일을 DNA 주형에 첨가하였고, 이것은 살아있는 게놈의 단일 분자 서열결정에서 폴리 T 서열결정 프라이머에 대한 상보체(complement)로서 역할하였다.
3.1.1.2 서열결정 프라이머
서열결정 프라이머는 검출될 핵산의 세그먼트에 상보적인 단쇄 올리고뉴클레오타이드 혹은 그의 연관된 말단 링크 프라이머이다. 몇몇 실시형태에서, 서열결정 프라이머는 길이가 적어도 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 혹은 그 이상의 뉴클레오타이드일 수 있다. 특정 실시형태에서, 서열결정 프라이머는 길이가 8 내지 25, 10 내지 20, 10 내지 30 또는 10 내지 50개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 서열결정 프라이머는 천연 유래 뉴클레오타이드, 천연에 존재하지 않는 뉴클레오타이드 유사체 혹은 변성된 뉴클레오타이드를 비롯한, 임의의 유형의 뉴클레오타이드로 구성될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 서열결정 프라이머의 5'-말단은 서열결정 프라이머가 하나 이상의 말단 링크 분자를 포함하여 서열결정될 핵산과 하이브리다이제이션된 후 어드레스 어레이 상의 링커 부위에 대한 결합을 용이하게 하기 위하여 변성되어 있을 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 서열결정 프라이머는 변성된 뉴클레오타이드, 예컨대, 잠금 핵산(locked nucleic acid)(LNA; 변성된 리보뉴클레오타이드, 이것은 폴리핵산 내의 증강된 염기 적층 상호작용을 제공함)을 포함할 수 있다. LNA의 이용성의 예시로서, Levin 등(Nucleic Acid Research 34(20): 142 (2006))은 LNA-함유 프라이머가 대응하는 비잠금(unlocked) 프라이머에 비해서 보다 강력한 결합을 나타내고 향상된 특이성을 지닌 것을 제시하였다. 상기 프라이머 내의 상이한 위치에서 3 LNA 뉴클레오타이드(in caps)를 함유하는 MCP1 프라이머(5'-cttaaattttcttgaat-3')의 3개의 변이체, 즉, MCP1-LNA-3'(5'-cttaaattttCtTgaAt-3'); MCP1-LNA-5'(5'-CtTaAattttcttgaat-3'); 및 MCP1-LNA-짝수(5'-ctTaaatTttctTgaat-3')가 형성되었다. 모든 LNA-치환된 프라이머는 증강된 Tm을 지니는 한편, MCP1-LNA-5' 프라이머는 특히 증강된 서열결정 정확성을 보였다(Phred Q30 counts). 따라서, 특정 실시형태에서, 서열결정 프라이머는 그의 5' 영역, 즉, 서열결정 프라이머의 5' 절반, 1/3 혹은 1/4 내에 적어도 하나의 잠금 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
서열결정 프라이머 및 단쇄 샘플 핵산(즉, 적어도 하나의 말단 링크 프라이머를 포함하는 검출될 핵산)은 본 발명에 따른 검출장치에 적용되기 전에 하이브리다이제이션될 수 있다. 서열결정 프라이머 및 샘플 핵산은 5X SSC(또는 5X SSPE), 0.1% Tween 20(또는 0.1% SDS) 및 0.1% BSA 완충액 등과 같은 염-함유 용액 중에 샘플 핵산을 초과 몰량의 서열결정 프라이머와 혼합함으로써 하이브리다이제이션될 수 있다. 얻어진 혼합물은 적어도 5분간 65℃로 가열되고 서서히 실온까지 냉각되어, 프라이머/주형 어닐링을 가능하게 할 수 있다. 잔류 프라이머는 예컨대 분자체(molecular sieve)를 비롯한 적절한 수단에 의해 제거될 수 있다.
말단 링크와 서열결정 프라이머의 양쪽 모두를 포함하는 프라이머는 서열의 육안검사 혹은 컴퓨터-지원 프라이머 설계를 비롯한 적절한 수단에 의해 설계될 수 있다. 프라이머 설계에 있어서 원조하는 다수의 소프트웨어 패키지, 예컨대, DNAStar™(DNAStar, Inc., Madison, WI), OLIGO 4.0(National Biosciences, Inc.), 벡터 NTI®(Invitrogen), 프라이머 프레미어(Premier) 5(Premierbiosoft) 및 프라이머3(Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA)가 입수가능하다. 프라이머는 예를 들어 서열결정될 분자, 특이성, 길이, 소망의 용융온도, 2차 구조, 프라이머 다이머, DC 콘텐트, 완충 용액의 이온성 강도 및 pH, 그리고 사용된 효소(즉, 폴리메라제 혹은 리가제)를 고려해서 설계될 수 있다. 이에 대해서는, 예컨대, 문헌[Joseph Sambrook and David Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3rd edition (2001)]을 참조할 수 있다.
3.1.1.3 어레이 표면에 대한 결합
하나 이상의 말단 링크 프라이머를 비롯한 서열결정될 핵산 및 서열결정 프라이머가 어닐링된 후, 이 복합체는 적절한 완충액 중에서 준비되어, 어드레스 어레이의 표면에 적용되어, 결합을 허용할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 샘플 핵산(검출될 핵산 및 하나 이상의 말단 링크 프라이머)은 링커 부위에 부착될 수 있고, 서열결정 혹은 검출용 프라이머가 이어서 적용될 수 있다. 다른 실시형태에서, 해당 복합체는 장치에 적용되기 전에 하이브리다이제이션될 수 있다. 단지 하나의 단일 핵산이 결합되어 있는 링커 부위는 유효 어드레스로서 공지되어 있다. 소정의 실시형태에서, 상기 복합체는 어드레스 어레이 상의 랜덤한 링커 부위에 고정된 샘플 핵산 및 검출 시스템에 적용될 수 있다. 다른 실시형태에서, 샘플 핵산은, 예컨대, 로봇 혹은 액체 취급 시스템 등을 비롯한 적절한 수단에 의해 어드레스 어레이 상의 소정의 링커 부위에 적용될 수 있다.
고형 지지체에 핵산을 부착하는 적절한 수단은 당업계에 충분히 공지되어 있다. 몇몇 실시형태에서, 동일한 핵산이 공유 결합, 예컨대, 다이설파이드, 티오에스터, 아마이드, 포스포다이에스터 혹은 에스터 결합에 의해; 혹은 비공유 결합, 예를 들어, 항체/항원 또는 바이오틴/아비딘 결합에 의해 링커 부위에 직접 고정될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 샘플 핵산은 개입 분자에 의해 링커 부위에 부착될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 개입 분자는 폴리메라제, 예컨대, DNA 폴리메라제일 수 있다.
핵산의 직접적인 공유 부착의 예시적인 예로서, Adeesi 등(Nucleic Acid Research, 28:87 (2000))은 SH 작용기를 포함하도록 프라이머의 5' 말단을 변성시켰다. Adeesi 등의 방법에 따르면, 핵산은 50μM 인산염 완충 식염수("PBS")(NaPi: 0.1M NaH2PO4 pH 6.5, 0.1M NaCl) 중에 준비될 수 있다. 약 1-5㎕의 프라이머 용액이 이어서 실란화 유리 슬라이드의 표면에 인가되어, 약 5시간 동안 실온에서 습도 제어 박스 내에서 배양되어 당해 칩 표면에 프라이머를 결합할 수 있다. 결합 반응이 완결된 후, PBS 용액은 실온에서 5분간 각각 2회 진동 세척되어 미결합된 DNA를 제거한다. 세정 후, 10mM β-머캅토에탄올이 PBS 용액에 첨가되어, 실온 하에 어드레스 어레이 표면을 헹구어 미결합된 DNA의 티올기를 불활성화시키는 데 이용된다. 다음에, 어레이 표면은, 예컨대, 5X SSC 0.1% Tween으로 1회 그리고 5X SSC 완충용액으로 1회 세척되었다. 따라서, 몇몇 실시형태에서, Adeesi 등에 의해 사용된 방법은, 예컨대, 서열결정 프라이머 혹은 샘플 핵산의 5' 말단을 통해서 링커 부위에 샘플 핵산 복합체를 부착시키기 위하여 본 발명에 의해 제공된 방법에서 이용될 수 있다.
대안적인 실시형태에서, 샘플 핵산은, 예컨대, 바이오틴화된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있고, 링커 부위 표면 상의 아비딘에 결합한다. 다른 실시형태에서, 샘플 핵산은 링커 부위 상의 항체(혹은 그의 단편)에 의해 결합되는 항원 부분, 예컨대, BrdU 혹은 다이곡시게닌을 포함할 수 있다. "항체"란 용어는, 예를 들어, 하나 이상의 CDR 도메인; 또는 가변성 중 단편(variable heavy fragment) 혹은 가변성 경 단편을 비롯한 면역글로불린 분자의 단편을 포함하는 것으로 이해할 필요가 있다. 항체는 천연 유래, 재조합 혹은 합성일 수 있다. 항체는 또한 예컨대 폴리클로날 혹은 모노클로날 변이체를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 항체는 적어도 106, 107, 108, 109M, 혹은 그 이상의 연관 상수로 그들의 항원(들)을 결합할 수 있다. 항체의 구조, 기능 및 생산은 당업계에 충분히 공지되어 있다. 예를 들어, 이것은 문헌[Gary Howard and Matthew Kasser, Making and Using Antibodies : A Practical Handbook CRC Press; 1st edition (2006)]을 참조할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 샘플 핵산은 폴리메라제, 예컨대, DNA 폴리메라제에 의해 링커 부위에 부착되어 있을 수 있다. 당업자라면, 효소 기능을 유지하기 위하여, 효소의 1차, 2차 및 3차 구조 등과 같은 이용가능한 정보를 고려할 필요가 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, Taq 및 Phi29 폴리메라제의 구조는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌[Kim et al., Nature, 376:612-616 (1995)] 및 [Kamtekar et al., Mol . Cell, 16:609-618 (2004)]을 각각 참조할 수 있다. 활성을 유지하면서 표면에 폴리메라제를 고착시키는 수단은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 공보 제2008/0199932호(공개일: 2008년 8월 21일 및 문헌[Korlach et al. PNAS 105:1176-1181 (2008)]에 공지되어 있다.
몇몇 실시형태에서, 링커 부위의 알데하이드-변성 표면은 알데하이드-함유 실란 시약으로 처리된다. 알데하이드는 단백질 상의 1차 아민과 용이하게 반응하여 Schiff의 염기 결합을 형성한다. 다수의 단백질이 NH2-말단에서 일반적으로 더욱 활성인 α-아민에 부가해서 그들의 표면 상에 리신을 드러내기 때문에, 이들은 각종 배향으로 슬라이드에 부착되어, 해당 단백질의 다른 측면이 용액 중의 기타 단백질 혹은 소분자와 상호작용을 허용할 수 있게 된다. 다른 실시형태에서, 포토NHS(탄소 사슬 링커를 지니는 아지도나이트로벤젠 분자에 결합된 N-하이드록시숙시이미도 카복실레이트 분자)는 UV 광활성화에 의해 장치 상의 아민-변성 표면에 부착될 수 있다. 이들 실시형태에서, UV광은 질소를 제거함으로써 아지도나이트로벤젠 부분을 여기시켜, 고도로 반응성인 나이트렌을 생성한다. 나이트렌은 장치의 표면 상에 있는 NH2와 용이하게 반응하여 하이드라진 결합을 형성한다. 링커의 타단부는 NHS 카복실레이트이고, 이것은 폴리메라제의 표면 상에 있는 리신과 반응하여 아마이드 공유 결합을 생성한다. 다른 실시형태에서, NHS 카복실레이트 부분은 완충된 조건 하에 장치의 표면 상에 있는 1차 아민과 반응될 수 있다. UV광은 아지도나이트로벤젠 부분을 활성화시켜 전자 결핍기로서 고도로 반응성인 나이트렌을 형성하여 폴리메라제 상의 리신 잔기의 1차 아민과 용이하게 반응시키는 데 이용될 수 있다.
3.1.2 서열결정 방식
본 발명에 의해 제공되는 검출 장치 및 방법은 당업계에 공지된 수단에 의해 핵산을 검출하고 서열결정하는 데 이용될 수 있고, 이것에 대해서는 예컨대 미국 특허 제6,946,249호 공보 및 문헌[Shendure et al., Nat . Rev . Genet. 5:335-44 (2004)]을 참조할 수 있다. 서열결정 방식은 당업계에 공지된 단일 분자 서열결정 방법으로부터 채택될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 서열결정 방법은 DNA 폴리메라제 또는 DNA 리가제의 특이성에 의존할 수 있고, 예컨대, 염기 확장 서열결정(단일 염기 단계적 확장), 합성에 의한 다수-염기 서열결정(예컨대, 말단-표지된 뉴클레오타이드를 이용한 서열결정을 포함) 및 결찰에 기반한 워블 서열결정을 포함할 수 있다. 상기 방법은 전형적으로 적어도 하나의 말단 링크 프라이머를 포함할 수 있는 샘플 핵산을 제공하는 단계를 포함한다. 상기 핵산은, 예컨대, 링커 부위에서 기질에 (직접적으로 혹은 간접적으로) 부착될 수 있다. 상기 핵산은 예컨대 화학적 혹은 열적 변성에 의해 단쇄를 부여할 수 있거나 단쇄 형태로 제공될 수 있다. 서열결정은 이어서 서열결정 프라이머에서 시작될 수 있다(리가제-기반 서열결정은 통상 앵커 프라이머라 지칭되고, 이것은 서열결정 프라이머와 유사한 목적을 제공한다).
단일 분자 서열결정 방식을 위하여, 본 발명은 단일 분자의 재서열결정을 행할 수 있는 이점을 제공할 수 있다. 예를 들어, 서열결정 판독의 완료 후, 서열결정 프라이머 및 확장된 뉴클레오타이드는 샘플 핵산으로부터 박리될 수 있고, 장치는 세척되어, 서열결정은 반복된다. 각종 실시형태에서, 재서열결정은 동일 혹은 상이한 방법으로 수행될 수 있다. 동일 분자를 재서열결정함으로써, 서열결정 오차가 서열결정 판독치의 개수의 거듭제곱으로 될 것으로 예상된다. 예를 들어, 염기 당 단일 판독에 대한 에러율이 10-3이면, 두 번 판독 후, 이것은 (10-3)2, 즉, 10-6으로 된다. 이것은, 서열결정을 위해 이용되는 변성된 뉴클레오타이드가 예컨대 위조 결손을 초래하는 그들의 표지 혹은 블로킹 기를 손실할 수 있기 때문에 단일 분자 서열결정에 대해서 특히 유리하다.
일반적으로, 단일 분자 서열결정 시, 서열결정될 적어도 하나의 핵산 분자는 기질에 부착되어, 프라이머와 함께 수축된다. 해당 프라이머는, 예컨대, 적어도 하나의 효소-촉매작용 중합 혹은 결찰 반응을 수행함으로써 변성된다. 적어도 하나의 반응은 핵산을 구성하는 적어도 하나의 염기의 동일성에 대해서 상관이 있는 광의 발광을 초래한다. 광의 발광을 "초래하는"이란, 적어도 하나의 반응이 핵산을 구성하는 적어도 하나의 염기의 동일성에 대해서 상관이 있는 광 방출이 발생하는 적어도 하나의 조건을 유발하는 것을 의미하는 것으로 이해되며, 이 발생은 여기성 광, 화학 혹은 생물 발광 시스템 등과의 상호작용을 통해서 일어날 수 있다. 상기 적어도 하나의 조건은, 예를 들어, 적어도 하나의 반응의 생성물 속으로의 형광단의 편입, 또는 파이로인산염의 방출일 수 있다. 이와 같이 해서, 광은 외부 여기와 함께 혹은 외부 여기 없이 일어날 수 있다. 예를 들어, 단일 분자 서열결정은 공유결합된 검출가능한 표지, 예컨대, 형광 표지 및 어떠한 부차적인 확장도 방지하는 블로킹 기를 포함하는 가역성 종결부위 염기 유사체에 의해서 수행될 수 있고, 여기서 유사체는 프라이머에 부가된 후에 여기되어 검출되고, 상기 표지 및 블로킹 기는 다른 회의 확장을 허용하기 위하여 부가 후에 제거된다. 대안적으로, 확장 스텝의 생성물, 예컨대, 파이로인산염은 파이로인산염-의존 방식으로 광을 방출하는 화학 혹은 생물 발광 검출 시스템을 제공함으로써 외부 여기 없이 검출될 수 있다. 이들 및 기타 방식은 이하에 더욱 상세히 논의된다.
방출된 광은 핵산을 구성하는 적어도 하나의 염기의 동일성과 상관이 있다. 몇몇 실시형태에서, 해당 상관은 일시적일 수 있고; 예컨대, 광의 방출 시간은, 상이한 염기 유사체가 상이한 시간에 중합 반응에 이용하기 위하여 제공될 경우 등과 같이, 적어도 하나의 염기의 동일성을 나타낸다. 몇몇 실시형태에서, 상관은 공간적일 수 있고; 예컨대, 방출된 광의 스펙트럼은, 상이한 형광단을 포함하는 상이한 염기 유사체가 중합 반응에 이용하기 위하여 제공될 경우 등과 같이, 적어도 하나의 염기의 동일성을 나타낸다.
몇몇 실시형태에서, 단일 분자 핵산 서열결정은 다수의 서열결정 사이클을 포함한다. 서열결정 사이클은, 첫번째 염기가 확인된 후에 핵산을 구성하는 적어도 두번째 염기를 확인하기 위하여 반복되는 적어도 하나의 염기의 동일성과 상관이 있는 광의 방출을 초래하는 이벤트를 의미하는 것으로 이해된다. 이와 같이 해서, 단일 분자 서열결정을 포함하는 본 발명에 따른 방법에서, 단일 분자 핵산 서열결정은 핵산을 구성하는 적어도 부여된 수의 염기의 동일성과 일괄적으로 상관이 있는 적어도 주어진 수의 광의 방출을 초래하는 적어도 주어진 수의 서열결정 사이클을 포함할 수 있고, 상기 방법은 핵산을 구성하는 적어도 주어진 수의 염기를 확인하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 주어진 수는, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 200 혹은 500일 수 있다.
서열결정 방법은 핵산을 구성하는 하나 이상의 염기의 동일성을 판정하는 단계를 포함할 수 있다. 단일 분자 핵산 서열결정을 수행하는 것이 적어도 제1광학 센서와 제2광학 센서를 포함하는 적어도 하나의 광검출기에 의해서 검출되는 광의 방출을 가져오고, 적어도 두 광학 센서로부터의 출력신호가 처리되는 본 발명에 따른 방법의 몇몇 실시형태에서, 핵산을 구성하는 적어도 하나의 염기의 동일성은 적어도 하나의 처리 결과를 적어도 하나의 공지된 유형에 대응하는 적어도 하나의 공지된 결과와 비교함으로써 판정될 수 있다.
예를 들어, 상기 처리 결과는 반응이 일어나는 시간을 나타내며, 즉, 방출된 광이 핵산을 구성하는 적어도 하나의 염기의 동일성과 시간적으로 상관이 있는 경우, 해당 시간은 핵산을 구성하는 적어도 하나의 염기를 확인하는 데 이용될 수 있다.
다른 예에서, 상기 처리 결과는 어떠한 형광단이 반응 생성물 내로 편입되었는지의 판정일 수 있고, 방출된 광이 핵산을 구성하는 적어도 하나의 염기의 동일성과 공간적으로 상관이 있는 경우, 상기 판정은 핵산을 구성하는 적어도 하나의 염기를 확인하는 데 이용될 수 있다.
3.1.2.1 염기 확장 서열결정: 단계적 확장
몇몇 실시형태에서, 본 발명에 의해 제공되는 검출장치는 염기 확장 서열결정 동안 발생된 광을 검출하는 데 이용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 염기 확장 서열결정은 서열결정될 단쇄 핵산을 포함하는 부분 이중쇄 샘플 핵산, 서열결정될 핵산의 3' 말단과 연관된 말단 링크 프라이머 및 이에 어닐링된 서열결정 프라이머를 링커 부위에 부착시킴으로써 개시된다. 몇몇 실시형태에서, 폴리메라제 및 변성된 뉴클레오타이드는 적절한 완충액 중에서 광 검출 장치에 적용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 샘플 핵산 복합체는 링커 부위에서 폴리메라제에 의해 링커 부위에 부착될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 뉴클레오타이드는 공유결합된 검출가능한 표지, 예컨대, 형광 표지, 및 어떠한 부차적인 확장도 방지하는 블로킹 기를 포함할 수 있다. 따라서, 서열결정은 서열결정 프라이머의 3' 말단에 단일 뉴클레오타이드의 부가 후 중지된다.
염기 확장 서열결정 반응의 일 실시형태의 제1스텝에서, 형광성 블로킹 기를 지니는 뉴클레오타이드는 서열결정 프라이머의 3' 말단에 DNA 폴리메라제에 의해 부가될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 형광 표지는 블로킹 기로서 작용할 수 있다. 다른 실시형태에서, 이들은 별개의 부분일 수 있다. 단일 뉴클레오타이드는 서열결정 프라이머의 3' 말단에 편입될 수 있고, 대응하는 광검출기에 의해 그의 표지에 의해 확인된다. 형광 표지와 블로킹 기는 이어서 예컨대 화학 혹은 효소 분해에 의해 제거되어 염기 확장의 추가의 사이클을 허용한다. 소정의 실시형태에서, 상기 표지 및 블로킹 기는 동시에 혹은 순차적으로 그리고 임의의 수순으로 제거될 수 있다. 추가된 염기의 순서를 컴파일링함으로써, 샘플 핵산의 서열은 한번에 하나의 염기를 3'에서 5' 방향으로 추론될 수 있다.
일반적으로, 단계식 확장 동안 부가된 뉴클레오타이드를 인식하는 방법에는 두 가지가 있다. 첫번째 방법에서, 4개의 뉴클레오타이드가 동일한 검출가능한 표지를 모두 지닐 수 있지만, 미리 결정된 수순으로 한번에 하나가 추가된다. 확장된 뉴클레오타이드의 동일성은 해당 뉴클레오타이드가 확장 반응에서 부가되는 순서에 의해 결정될 수 있다. 확장 동안 일체화된 염기를 인식하기 위한 두번째 방법에서, 4개의 상이한 뉴클레오타이드가 동시에 부가될 수 있고, 각각은 별도의 검출가능한 표지와 결합되어 있다. 다른 실시형태에서, 표지의 여기 혹은 방출 스펙트럼 및/또는 강도는 상이할 수 있다. 확장 시 부가된 뉴클레오타이드의 동일성은 검출된 표지의 강도 및/또는 파장(즉, 여기 혹은 방출 스펙트럼)에 의해 판정될 수 있다.
3.1.2.2 합성에 의한 서열결정: 다단계 확장
몇몇 실시형태에서, 합성에 의한 서열결정은 다수의 연속된 확장으로, 예컨대, 블로킹 기의 사용없이 진행할 수 있다. 이들 실시형태에서, 중합 반응은 뉴클레오사이드 삼인산 가수분해 후 인산염의 방출, 즉, β 및 γ 인산 복합체의 방출을 검출함으로써 모니터링될 수 있다. 이 복합체는 직접, 예를 들어, 복합체 상의 형광 부분에 의해, 또는, 예를 들어, 전술한 바와 같은 화학 혹은 생물 발광 검출 시스템에 파이로인산염을 결합시킴으로써 검출될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 샘플 핵산은 말단-인산염-표지화 뉴클레오타이드를 이용해서 주로 연속해서 서열결정될 수 있다. 말단-인산염-표지화 뉴클레오타이드의 예시적인 실시형태들 및 그들의 이용 방법은, 예컨대, 미국 특허 제7,361,466호 및 미국 특허 공보 제2007/0141598호(공개일: 2007년 6월 21일)에 기술되어 있다. 간략하게는, 뉴클레오타이드는 본 발명에 의해 제공된 시스템에 인가될 수 있고, 중합 동안 가수분해된 경우, 표지된 파이로인산염이 대응하는 광검출기에 의해 검출될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 모두 4개의 뉴클레오타이드는 별도의 표지를 포함할 수 있고, 동시에 부가될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 뉴클레오타이드는 식별불가능한, 예컨대, 동일한 표지를 포함할 수 있고, 미리 결정된 수순으로 순차적으로 부가될 수 있다. 식별불가능한 표지를 지니는 뉴클레오타이드의 순차적이고도 순환적인 부가는 또한 예컨대 호모폴리머 서열 내에 다수의 연속적인 중합 단계를 허용한다.
3.1.2.3 리가제 -기반 서열결정
다른 실시형태에서, 샘플 핵산은 리가제-기반 서열결정에 의해 본 발명에 의해 제공된 장치 상에서 서열결정될 수 있다. 리가제-기반 서열결정 방법은, 예를 들어, 미국 특허 제5,750,341호 공보, PCT 출원 공개 제WO 06/073504호 공보 및 문헌[Shendure et al., Science, 309:1728-1732 (2005)]에 개시되어 있다. 예를 들어, Shendure 등의 방법에서, 미지의 단쇄 DNA 샘플이 2개의 말단 링크 프라이머에 의해 플랭크될 수 있고, 고상 지지체 상에 고정화되어 있을 수 있다. 미지의 서열 내의 특정 위치(예컨대, 특정 말단 링크 프라이머에 인접한 n번째 염기)는 소위 앵커 프라이머(서열결정 프라이머와 유사함)를 말단 링크 프라이머들 중 하나에 어닐링시키고 나서 4개의 변성 나노머의 풀을 이 혼합물에 인가함으로써 정보가 얻어질 수 있다. 4개의 나노머는 모두 별개의 형광 표지를 지니고, 조회 위치를 제외한 모든 위치에서 변성되며, 여기서 각 나노머는 별개의 염기, 즉, A, C, G 혹은 T에 의해 정보를 얻는다. 샘플이 세척되고 형광 주사되어, 조회 염기가 확인된다. 앵커 프라이머 및 결찰된 나노머는 이어서 샘플 핵산으로부터 박리되고, 장치는 세척되어, 상기 과정은 반복되어 상이한 위치를 조회한다. 유리하게는, 이 방법은 점진적이지 않으며, 즉, 염기는 순서대로 조회될 필요는 없다. 이와 같이 해서, 오차는 누적되지 않는다. 대안적으로, 이 방법은 5' 혹은 3' 방향으로부터 뉴클레오타이드를 조회할 수 있고, 즉, 정통적인 5' → 3' DNA 합성을 필요로 하지 않는다. 샘플 핵산의 약 13개의 염기의 총합은 전형적으로 이 방법에 의해 서열결정될 수 있다.
3.1.2.4 제3세대 서열결정
몇몇 실시형태에서, 샘플 핵산은 제3세대 서열결정을 이용해서 본 발명에 의해 제공된 장치 상에서 서열결정될 수 있다. 이 제3세대 서열결정에서, 다수의 작은(~50㎚) 구멍을 지닌 알루미늄 코팅을 가진 슬라이드가 제로 모드 도파관으로서 이용된다(예컨대, Levene et al., Science 299, 682- 686 (2003) 참조). 알루미늄 표면은 폴리인산염 화학, 예컨대, 폴리비닐인산염 화학에 의해 DNA 폴리메라제의 부착으로부터 보호된다(예컨대, Korlach et al., Proc Natl Acad Sci USA 105, 1176-1181 (2008) 참조). 이 결과, 알루미늄 코팅의 구멍 속에 노출된 실리카에 DNA 폴리메라제 분자가 우선적으로 부착된다. 이 셋업은 소실성 파 현상이 형광 배경을 저감시키는 데 이용될 수 있게 하고, 형광 표지된 dNTP의 보다 높은 농도의 이용을 허용한다. 형광단은 dNTP의 말단 인산염에 부착되므로, 형광은 dNTP의 편입 시 방출되지만, 형광단은 새롭게 편입된 뉴클레오타이드에 부착된 채로 남아 있지 않으며, 이것은 복합체가 다른 회의 편입을 위해 바로 준비되어 있는 것을 의미한다. 이 방법에 의해, 알루미늄 코팅의 구멍들 속에 존재하는 개별의 프라이머-주형 복합체 내로의 dNTP의 편입이 검출될 수 있다. 이것은 예컨대, 문헌[Eid ef al., Science 323, 133-138 (2009)]을 참조할 수 있다. 본 발명에 따른 검출 시스템의 이용은 고감도를 제공할 수 있고, 또한 편입된 dNTP의 더욱 효율적인 검출을 허용하여, 결과적으로 해석가능한 서열데이터의 비교적 낮은 오차율 및/또는 보다 긴 판독을 가능하게 한다.
3.1.3 추가의 응용
본 발명에 따른 검출 시스템은 수백만개의 핵산 세그먼트를 동시에 검출할 수 있다. 각 세그먼트가 예를 들어 1000개 염기 길이이면, 단일의 장치가 한번에 수십만개 이상의 염기 서열을 얻을 수 있었다. 이하에 본 명세서에서 제공된 장치 및 방법의 추가의 응용을 논의한다.
3.1.3.1 전체 게놈 서열결정
본 발명에 따른 검출 시스템은, 예컨대, 바이러스, 박테리아, 진균, 진핵생물 혹은 척추동물, 예를 들어, 포유동물, 예컨대, 인간의 전체 혹은 부분적인 게놈 서열결정을 수행하는 데 이용될 수 있다.
게놈 DNA는 서열결정을 위하여 적어도 20, 50, 100, 200, 300, 500, 800, 1200, 1500개의 뉴클레오타이드의 단편으로 잘라낼 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 이와 같이 잘라낸 게놈 DNA는 20 내지 50, 20 내지 100, 20 내지 500, 20 내지 1000, 500 내지 1200 또는 500 내지 1500개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 서열결정될 핵산은, 연관된 말단 링크 프라이머와 함께, 단쇄로 만들어져서 서열결정 프라이머에 어닐링되고, 전술한 바와 같은 서열결정을 위하여 본 발명에 의해 제공된 시스템에 적용될 수 있다.
3.1.3.2 유전자 발현 프로파일링
다른 실시형태에서, 본 발명에 따른 검출 시스템은 유전자 발현 프로파일링을 위하여 cDNA를 서열결정하는 데 이용될 수 있다. 예를 들어, mRNA 수준은 특정 서열이 장치 상에서 검출되는 상대 주파수를 측정함으로써 정량화될 수 있다. 수백만 cDNA 분자가 본 발명에 의해 제공된 장치 상에 병렬로 서열결정될 수 있다. 하나의 세포가 평균 350,000개의 mRNA 분자를 포함한다면, 세포당 한번의 복제 시에라도 존재하는 전사는 일백만번의 서열결정 반응에서 대략 3회인 것으로 예상된다. 따라서, 본 발명에 의해 제공되는 장치는 단일 복제수 감도를 지닌 단일 분자 서열결정에 적합하다.
cDNA 합성은 당업계에 충분히 공지되어 있고, 전형적으로 mRNA의 임의선택적 농축과 함께 총 RNA 추출을 포함한다. cDNA는, 예를 들어, 제1쇄 합성을 위하여 역전사; 잔류 RNA를 제거하기 위한 RNA분해효소 처리; DNA 폴리메라제에 의한 제1쇄 및 제2쇄 합성의 랜덤 헥사머 프라이밍을 포함하는 단계에 의해 mRNA로부터 생산된다. 얻어지는 cDNA는 본 발명에 의해 제공된 장치 상에서의 서열결정에 적합하다. DNA와 RNA의 양쪽 모두를 단리하고 제조하는 방법은 당업계에 충분히 공지되어 있다. 이에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Joseph Sambrook and David Russell, Molecular Cloning : A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3rd edition (2001)]을 참조할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, cDNA는 어댑터 폴리핵산과 결찰될 수 있고, 해당 어댑터는 특수화된 제한효소로 처리되고, 마지막으로 해당 처리된 핵산은 본 발명에 의해 제공된 장치의 링커 부위에서 고정된 상보적 올리고뉴클레오타이드에 결합한다. 특정 실시형태에서, 어댑터 분자는 말단 링크 프라이머일 수 있다.
본 발명에 따른 몇몇 실시형태에서, mRNA의 폴리-A 테일은 적절한 말단 링크 프라이머로서 역할할 수 있고, 이것은 폴리 T 서열결정 프라이머에 상보적이다.
3.1.3.3 결합 상호작용의 검출 및/또는 측정
다른 실시형태에서, 검출장치는, 예컨대, DNA/DNA, RNA/RNA 또는 DNA/RNA 염기 짝짓기, 핵산/단백질 상호작용, 항원/항체, 수용체/리간드 결합 및 효소/기질 결합을 비롯한 각종 결합 상호작용을 검출하는 데 이용될 수 있다. 일반적으로, 샘플 분자는 확인용 핵산 태그(ID)를 포함하는 결합 분자에 고정될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 결합 분자는 샘플 분자를 결합하는 포획 분자를 추가로 포함할 수 있다. 상기 결합 분자는 또한 비공유 결합, 예컨대, 항체/항원 혹은 바이오틴/아비딘 결합에 의해; 또는 링커 부위; 예컨대, 다이설파이드, 티오에스터, 아마이드, 포스포다이에스터 또는 에스터 결합 등과 같은 공유 화학 결합을 용이하게 하기 위한 부분에 결합하기 위한 수단을 포함할 수도 있다. 몇몇 실시형태에서, 결합 분자는 ID 태그에 의해 어레이에 고정되어 있을 수 있다.
샘플 분자는 본 발명에 따른 시스템에 적용될 수 있고, 예컨대, 링커 분자 상에 위치된 포획 분자와 결합함으로써, 랜덤한 링커 부위에 그의 링커 분자에 의해 부착될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 샘플 분자와 링커 분자는 혼합되어 결합되고 나서 본 발명에 의해 제공된 장치에 적용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 링커 분자는 우선 상기 장치에 적용되어 링커 부위에 부착되고 나서, 샘플 분자가 적용될 수 있다. 다음에, ID는 연관된 샘플 분자를 확인하기 위하여 본 발명에 따른 방법에 의해 (예컨대, 하이브리다이제이션 혹은 서열결정에 의해) 검출될 수 있다. 복수개의 샘플 분자종은 동일 어레이에 부착될 수 있고 그들의 표지에 의해 식별될 수 있는 한편 그들의 결합 상호작용은 포획 분자의 고유한 ID를 이용해서 그에 결합되는 것을 특징으로 할 수 있다. 이와 같이 해서, 몇몇 실시형태에서, 표지된 샘플 분자를 검출하는 방법은 핵산 태그(ID)를 포함하는 링커 분자에 의해 본 발명에 따른 시스템의 링커 부위에 샘플 분자를 결합하는 단계, 상기 ID의 핵산 서열결정을 수행하는 단계 및 표지된 샘플 분자를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 핵산 서열결정은 염기 확장 서열결정일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 핵산 서열결정은 리가제-기반 서열결정 혹은 말단-인산염-표지된 뉴클레오타이드 서열결정으로부터 선택될 수 있다.
뉴클레오타이드 "비트"를 사용함으로써, 4n개까지의 별개의 포획 분자가 부착되어 본 발명에 다른 검출 시스템 상에서 확인될 수 있으며, 여기서 n은 서열결정된 ID의 길이를 나타내는 자연수이다. 예를 들어, 5개의 뉴클레오타이드는 1000개의 고유한 ID에 걸쳐서 제공될 수 있었던 반면, 12개의 뉴클레오타이드는 1600만개의 조합에 걸쳐서 제공된다. 예를 들어, 링커 분자는 본 발명에 따른 시스템에 부착될 수 있고, 그들의 위치는 그들의 대응하는 ID 태그를 검출함으로써 판정될 수 있다. 링커 분자는 이어서 하나 이상의 표지된 샘플 분자와의 결합 상호작용을 조사하는 프로브로서 역할할 수 있다. 즉, 그에 부착된 하나 이상의 링커 분자를 지니는 시스템은 프로브 어레이로서 역할할 수 있다.
소정의 실시형태에서, 표지된 샘플 분자는 형광 표지되어 있을 수 있다. 표지된 샘플 분자는, 링커 분자의 포획 분자에 결합된 경우, 링커 분자가 부착되는 링커 부위에 대응하는 광검출기에 의해 검출될 수 있다. 따라서, 몇몇 실시형태에서, 본 발명에 따른 방법은 본 발명에 따른 시스템에 표지된 샘플 분자를 적용하는 단계 및 해당 표지된 샘플 분자를 검출하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 시스템은 그의 링커 부위에 부착된 핵산 태그(ID)를 포함하는 링커 분자를 지닐 수 있다. 다수의 표지된 샘플 분자는, 동시에 프로브 어레이에 적용될 수 있고, 또한, 그들의 표지에 의해, 예컨대, 그들의 형광 표지의 강도 및/또는 파장에 의해 식별될 수 있다. 샘플 분자와 표지된 조회 분자 간의 결합 상호작용에 대한 해리 상수는 표지된 조회 분자의 주어진 농도에서 반응속도(예컨대, 도킹/언도킹 속도) 및 통계(예컨대, 임의의 주어진 시간에 결합 혹은 미결합 상태에 있는 샘플분자의 부분)의 양쪽 모두에 의거해서 추론될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 링커 분자의 ID는 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 90, 100, 150, 200 또는 그 이상의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, ID는 5 내지 10, 20, 40, 80 혹은 160; 10 내지 20 혹은 50; 또는 20 내지 35개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. ID는 고유한 핵산 서열, 즉, 검출될 핵산을 포함한다. 특정 실시형태에서, 고유한 핵산 서열은 적어도 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 24, 30 혹은 그 이상의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 고유한 핵산 서열은 4 내지 10, 12, 15 혹은 20; 또는 10 내지 20개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. ID는 적어도 하나의 말단 링크 프라이머를 포함할 수 있고, 즉, ID는 서열결정 프라이머에 상보적인 서열을 포함할 수 있으며, 이것은, 몇몇 실시형태에서, 예컨대 바이오틴화된 뉴클레오타이드를 포함함으로써 링커 부위에 대한 부착으로 변성될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, ID의 말단 링크 프라이머 부분은 고유한 핵산 서열에 대한 3'일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 이것은 고유한 핵산 서열에 대한 5'일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 말단 링크 프라이머는 고유한 핵산 서열의 3' 및 5' 말단의 양쪽에 존재할 수 있다.
소정의 실시형태에서, 샘플 분자 및 포획 분자는 탄수화물, 지질, 단백질, 펩타이드, 항원, 핵산, 호르몬, 작은 유기 분자(예컨대, 약제), 혹은 비타민 부분; 또는 이들의 조합으로부터 선택된 부분을 포함할 수 있다. 이들 부분은 천연 유래(예컨대, 생화학적으로 정제) 혹은 합성(예컨대, 화학적으로 합성 혹은 재조합적으로 생산)일 수 있다. 또한, 이들 기판은 비천연 성분(예컨대, 비천연 아미노산, 블로킹기 혹은 보호기 등)을 전혀, 일부 혹은 모두 함유할 수 있다. 특정 실시형태에서, 샘플 분자 혹은 포획 분자는 단백질, 예컨대, 성장 인자, 펩타이드 항원, 항체 혹은 수용체일 수 있다.
링커 분자 혹은 링커 부위에 핵산을 컨쥬게이트하기 위한 각종 수단은, 예컨대, 미국 특허 공개 제2004/0038331호 공보에 기재되어 있는 바와 같이, 당업계에 공지되어 있다. 해당 '331호 공보는 고상 지지체 상에 단백질 올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 형성하는 방법을 개시하고 있다. 미국 특허 제4,748,111호 공보는 핵산의 3' 말단에 단백질을 컨쥬게이트하는 일례를 제공한다. 여기서, 말단 트랜스페라제가 우선 분자의 3' 부분에 리보스 잔기를 부가하는 데 이용된다. 이어서, 과요오드산 산화반응은 핵산 상에 3' 알데하이드기를 생성하며, 그 후 단백질의 아마이드기와 공유 결합을 형성한다. 단백질이 ID의 3' 말단에 컨쥬게이트되면, 링커 부위에 대한 부착은 ID의 5' 말단을 개재해서 이루어진다.
몇몇 실시형태에서, 포획 분자, 예컨대, 단백질은 ID의 5' 말단에 연결될 수 있다. 이들 실시형태에서, 서열결정 프라이머의 5' 말단 혹은 ID의 3' 말단은 링커 부위에 포획 분자를 고정시키는 데 이용될 수 있다. 미국 특허 제6,013,434호 공보는, 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드-폴리아마이드 컨쥬게이트를 개시하고 있고, 여기서, 그 접속은 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단을 개재해서 이루어진다. 미국 특허 제6,197,513호 공보는 PNA와 DNA가 핵산의 5' 말단을 개재해서 카복실산 부분을 지닌 분자, 예컨대, 단백질에 컨쥬게이트되는 것을 개시하고 있다. PNA 및 DNA 분자는 아릴아민 혹은 아미노옥시아세틸 부분을 함유한다. 미국 특허 제6,153,737호 공보는 각종 분자를 컨쥬게이트하는 데 적합한 적어도 하나의 2' 작용화된 뉴클레오사이드를 함유하는 올리고뉴클레오타이드를 개시하고 있다.
3.1.3.4 추가의 검출방법
(a) FRET
몇몇 실시형태에서, 분자는 형광공명 에너지전이라고도 불리는 FRET(Forster resonance energy transfer)에 의해 본 발명에 의해 제공된 검출장치 상에서 검출될 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, FRET는 여기된 공여체 분자가 수용체 분자에 에너지를 비방사적으로 전달할 경우(이때 에너지를 전형적으로 광으로서 방출함) 일어난다. FRET는 예컨대 검출 중에 있는 분자에 대해서 유효 여기 파장과 발광 파장 사이에 커다란 스펙트럼 분리를 제공함으로써 배경광의 저감을 도울 수 있다. FRET는 그의 효율이 공여체와 수용체 분자 사이의 거리의 6승으로 감쇠되므로 가까운 분자 상호작용을 검출하는 데 이용될 경우가 있다. 이에 대해서는, 예를 들어, FRET에 의해 핵산 하이브리다이제이션을 검출한 Zhang et al.(Nature Materials 4:826-31 (2005))을 참조할 수 있다. 여기서, 바이오틴화된 핵산 표적은 아비딘-피복된 양자점 공여체에 컨쥬게이트되었고, 이어서, 이것은 Cy5-컨쥬게이트된 DNA 프로브를 여기시켰다. 몇몇 실시형태에서, 표지된 포획 분자와 표지된 샘플 분자는 FRET에 의해 검출용의 공여체/수용체(또는 그 반대)쌍을 형성할 수 있다.
본 발명에 의해 제공되는 핵산 서열결정의 몇몇 실시형태에서, 형광 표지된 뉴클레오타이드는 폴리메라제 혹은 리가제에 부착된 공여체 발색단에 대해서 수용체 발색단으로서 작용할 수 있다. 따라서, 이들 실시형태에서, 폴리메라제 혹은 리가제 상에 위치된 공여체 발색단은 샘플 핵산 상에 중합되고 있는 혹은 샘플 핵산에 결찰되고 있는 뉴클레오타이드 상의 수용체 발색단을 여기시킬 수 있다. 폴리메라제에 인접하지 않은 뉴클레오타이드는 FRET 효율의 신속한 저하로 인해 여기될 수 없다. 몇몇 실시형태에서, 공여체 분자는, 예컨대, 다른 형광단, 예컨대, 양자점일 수 있다. 양자점, 예컨대, 반도체 양자점은 당업계에 공지되어 있고, 예컨대, 국제 특허 공개 제WO 03/003015호 공보에 기재되어 있다. 예컨대 생체분자에 양자점을 결합하는 수단은 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대, 문헌[Mednitz et al., Nature Materials 4:235-46 (2005)], 미국 특허 공개 제2006/0068506호(공개일: 2006년 3월 30일) 공보 및 미국 특허 공개 제2008/0087843호(공개일: 2008년 4월 17일) 공보에 기재되어 있다. 몇몇 실시형태에서, 양자점은 DNA 폴리메라제 분자에 컨쥬게이트되어 있을 수 있다. 링커 부위에 효소를 컨쥬게이트하기 위하여 이미 위에서 논의된 바와 같이, 당업자라면, 예컨대, DNA 폴리메라제 혹은 리가제에 형광단을 컨쥬게이트할 경우, 효소의 1차, 2차 및 3차 구조 상에 형광단을 컨쥬게이트하는 어떠한 효과를 완화시킴으로써 효소 기능을 유지하기 위하여 조심할 필요가 있다는 것을 틀림없이 이해할 것이다.
(b) 멀티 광자 여기
몇몇 실시형태에서, 발색단은 2개 이상의 광자에 의해 여기될 수 있다. 예를 들어, 몇몇 실시형태에서, FRET 내의 공여체 혹은 수용체 발색단의 여기는 2개 이상의 광자를 통해서 일어날 수 있다. 2개의 광자 및 멀티-광자 여기는 미국 특허 제6,344,653호 및 제5,034,613호 공보에 더욱 기재되어 있다.
(c) 시간차 검출
몇몇 실시형태에서, 본 발명에 의해 제공되는 장치의 여기광원 및 광검출기는 특징적인 위상차를 지니도록 변조될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개 제2008/0037008호(공개일: 2008년 2월 14일) 공보에 개시된 바와 같이, 당해 기술분야에 공지된 방법을 이용해서, 본 발명에 의해 제공되는 장치 상에서 검출될 분자로부터 방출된 광은 여기광원으로부터의 간섭 없이 대응하는 광검출기에 의해 측정될 수 있다.
(d) 유세포 분석법
몇몇 실시형태에서, 본 발명에 의해 제공되는 장치의 여기광원 및 광검출기는 유세포 분석 데이터를 획득하는 데 이용될 수 있다. 유세포 분석은 일반적으로 액상 현탁액에 대상체의 모집단의 광학적 분석을 포함한다. 상기 현탁액은 검출기를 통과하여 흐를 수 있으므로, 상기 모집단 내의 많은 대상체로부터 광의 순차적인 검출을 가능하게 한다. 대상체는, 작은 크기의 세포, 마이크로비즈 혹은 기타 입자, 예컨대, 적어도 하나의 치수(입자의 형상에 따라 적합한 길이, 폭, 높이, 직경 등)에서 0.1㎛, 0.2㎛, 0.5㎛, 1㎛, 2㎛ 혹은 5㎛ 이하의 입자 및/또는 적어도 하나의 치수 혹은 모두 치수에서 5㎜, 2㎜, 1㎜, 500㎛, 200㎛, 100㎛, 50㎛, 20㎛ 혹은 10㎛ 이하의 입자로부터 선택될 수 있다. 대상체는 하나 이상의 여기광원과 검출기 사이를 일렬 종대로 통과할 수 있고, 형광 및/또는 광 산란 데이터가 획득될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 대상체는 적어도 1종, 적어도 2종, 적어도 3종 혹은 적어도 4종의 형광단을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서는, 대상체의 적어도 서브모집단에 의해 발생된 광이 검출된다.
형광단은 예를 들어 혹은 세포 구조(예컨대, DNA에 특이적인 DAPI, 또는 형질막(plasma membrane)을 염색하는 에반스 블루(Evans Blue))의 부류에 대해 특이적인 결합 활성을 지닌 형광단; 뉴클레오타이드 유사체에 컨쥬게이트된 형광된, 예컨대, 사이아닌-염료 컨주게이트된 dUTP; 및 항체, 아비딘 혹은 핵산 프로브 등과 같은 특정 결합 파트너에 컨쥬게이트된 합성 형광단을 비롯하여, 전술한 형광단에 부가해서, 형광 단백질(GFP, BFP, CFP, YFP, RFP 등) 등과 같은 세포에 의해 내인성으로 발현되는 형광단으로부터 선택될 수 있다. 입자에 존재 및/또는 해당 입자에 결합하는 형광단의 양, 따라서 형광단의 방출량은, 적절한 파장의 광에 의해 여기될 경우, 발생되어, 해당 입자 내 혹은 입자 상에 DNA, 형질막, 혹은 특정 핵산, 단백질, 기타 생체분자, 또는 대사산물 등과 같은 생체분자의 존재유무 및/또는 양과 상관이 있을 수 있다.
유세포 분석법은 히스토그램 등과 같은 형광 강도의 주파수 분포를 생성하는 입자의 모집단을 분석하는 단계를 포함할 수 있다. 하나 이상의 형광단이 이용되고/되거나 광 산란 데이터가 또한 획득되고, 또한 데이터 획득이 시간-분해될 경우, 주파수 분포는 다차원적일 수 있다. 본 발명에 의해 제공되는 장치의 여기광원 및 광검출기의 사용은, 예를 들어, 높은 감도 및/또는 높은 신호 대 잡음비를 지니는 데이터 획득을 허용함으로써, 고품질의 데이터를 얻을 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 유세포 분석을 수행하는 단계를 포함하는 본 발명의 방법은 형광 활성화된 선별 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 실시형태에서, 입자는 유세포 분석에 의해 실시간에 분석되고, 사용자-정의된 파라미터에 따라 선별된다. 예를 들어, 주어진 범위 내에서 이러한 형광을 나타내는 입자 혹은 주어진 형광단으로부터 검출가능한 형광을 나타내는 입자는 기준에 부응하지 않는 입자와는 별도로 선별될 수 있다. 이들 입자는 추가의 분석을 위해 수집될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 이와 같이 해서 선별된 입자는 살아있는 세포이다. 본 발명에 따른 검출장치의 감도는, 검출불가능한 활성을 지닌 세포 및 높은 활성을 지닌 세포와는 별도로, 효소 활성 혹은 프로모터 활성 등과 같은 낮은 수준의 활성을 지니는 세포의 선별을 허용할 수 있다. 이와 같이 해서, 본 발명의 방법 및 장치는 주어진 낮은 프로모터 혹은 효소 활성을 지니는 기존에 쉽게 얻을 수 없는 농축된 세포 모집단에 대한 접근을 허용할 수 있다.
(e) 기타 형광 검출장치 및 방법
몇몇 실시형태에서, 본 발명의 방법은 생물학적 세포(이것은 살아있는 세포 혹은 고정된 세포일 수 있음)를 구성하는 적어도 하나의 대상체에 의해 방출된 광의 검출에 관한 것이다. 몇몇 실시형태에서, 적어도 하나의 대상체는 적어도 하나의 양자점을 포함하는 적어도 하나의 대상체, 적어도 하나의 형광 단백질을 포함하는 적어도 하나의 대상체 및 적어도 하나의 작은 형광성 화학 성분(fluorescent small chemical moiety)을 포함하는 적어도 하나의 대상체로부터 채택된다. 몇몇 실시형태에서, 적어도 하나의 대상체는 형광 표지되어 있고 적어도 하나의 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드, 올리고펩타이드, 폴리펩타이드, 올리고당, 다당류 또는 지질을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 적어도 하나의 대상체는, 양자점, 형광 단백질 및 작은 형광성의 화학적 성분으로부터 선택될 수 있는, 고정된 동시에 제한된 수의 형광단, 예컨대, 최대 20, 10, 5 혹은 2개의 형광단을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 적어도 하나의 대상체는 양자점, 형광 단백질 및 작은 형광성 화학 성분으로부터 선택된 단일 형광단만을 포함한다. 작은 형광성 화학 성분의 많은 예가 위에 논의되어 있다. 몇몇 실시형태에서, 작은 형광성 화학 성분은 300 내지 800㎚ 사이의 발광 피크 및/또는 적어도 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8 혹은 0.9의 양자수율(흡수된 피크 흡수 파장의 광자당 방출된 광자의 분획)을 지닐 수 있다.
3.2 생체분자 분석 서비스
본 발명은 또한 본 발명의 실시형태에 따른 검출장치를 이용해서 생체 분자 분석 서비스를 제공하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 분석될 생체 분자를 포함하는 샘플을 서비스 요청자로부터 서비스 공급자에 제공하는 단계 및 서비스 요청자가 서비스 공급자로부터 분석 결과를 입수하는 단계를 포함할 수 있되, 여기서 상기 결과는 본 발명에 의해 제공된 장치를 이용해서 생성될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 보상적 사항, 예컨대, 서비스에 대한 비용 혹은 계약 서비스 협정에 대해서 수행될 수 있다. 또한, 상기 샘플은 서비스 요청자와 서비스 공급자 사이에 직접 혹은 판매자를 개입시켜 출하될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 서비스 제공자 혹은 판매자는 지리적으로 미합중국 이외의 영토, 예컨대, 다른 나라에 위치되어 있을 수 있다.
4. 실시예
실시예 I
이 실시예에서, 도 1에 도시된 바와 같은 장치는 3가지 유형의 대상체를 검출하여 판별하는 데 이용된다. 이 실시예에서 이용되는 광검출기는 도 17에 도시된 바와 같은 P-N-P-N-P 구조를 지니는 멀티-접합 포토다이오드이다. p-형 층(601)과 n-형 층(602)은 제1광학 센서를 구성한다. p-형 층(603)과 n-형 층(604)은 제2광학 센서를 구성한다. 모두 3층의 p-형 층은 접지되어 있다. n-형 층(602), (604)은 각각 신호(J1), (J2)를 출력하기 위한 전극에 접속되어 있다.
407㎚의 중심 파장을 지니는 6.5mW 레이저 다이오드가 검출 중에 있는 대상체를 여기시키기 위한 여기원으로서 이용된다. 대상체로부터 방출된 광은 광검출기에 입사되고, 제1광학 센서와 제2광학 센서에 의해 순차적으로 부분적으로 흡수된다. 도 18 및 도 19는 제1광학 센서 및 제2광학 센서의 감응도 곡선을 나타낸다.
멀티-접합 포토다이오드는 환경으로부터 광의 영향을 최소화하기 위하여 블랙 박스 내부에 둘러싸여 있다. 상기 포토다이오드 위쪽에 있는 상기 박스의 표면 상에 작은 구멍이 개구되어 있다. 검출 중인 대상체는 상기 작은 구멍을 통해서 검출 영역으로 삽입되고, 여기서 대상체는 여기원으로부터 방출된 여기광에 노출된다. 장파장 투과 간섭(long-pass filter) 박막 광학 필터는 검출 존과 포토다이오드 사이에 놓여 산란된 여기광을 부분적으로 차단할 수 있다.
3개의 대상체가 검출장치를 시험하는 데 이용된다. 대상체 1은 5.0×10-5M 농도로 탈이온화된 H2O 중에 용해된 피라닌을 포함하는 제1염료 용액이고, 대상체 2는 5.0×10-5M의 농도로 탈이온화된 H2O 중에 용해된 로다민 6G(R6G)를 포함하는 제2염료 용액이며, 대상체 3은 6.25×10-4M의 농도로 톨루엔 중에 용해된 CdxZn1 - xSe의 조성물과 함께 양자점을 포함하는 양자점 용액이다. 도 20 및 도 21은 각각 3개의 대상체의 흡수 스펙트럼과 방출 스펙트럼을 나타내고 있다.
이 실시예에서, 염료나 양자점이 없는 물을 포함하는 기준 샘플도 시험된다. 상기 대상체들 및 기준 샘플은 각 시각에 하나씩 시험된다. 제1광학 센서로부터의 출력신호(J1)와 제2광학 센서로부터의 출력신호(J2)는 매 5.12㎳마다 기록된다. 각 대상체로부터의 10개의 연속된 판독치 및 기준 샘플로부터의 것들의 기록치가 이하의 표 1에 표시되어 있다.
광검출기로부터의 출력신호
대상체 대상체 없음 대상체 1 대상체 2 대상체 3
신호 J1 J2 J1 J2 J1 J2 J1 J2
1 0.0012 0.017 0.4861 1.036 0.1423 0.787 0.051 0.3807
2 0.0022 0.017 0.4866 1.036 0.1428 0.787 0.0515 0.3807
3 0.0017 0.017 0.4851 1.036 0.1433 0.7865 0.051 0.3802
4 0.0017 0.017 0.4846 1.036 0.1418 0.7865 0.0505 0.3798
5 0.0007 0.0165 0.4866 1.036 0.1433 0.7865 0.0505 0.3807
6 0.0012 0.0165 0.4861 1.036 0.1423 0.787 0.0505 0.3807
7 0.0022 0.016 0.4851 1.036 0.1423 0.787 0.0501 0.3798
8 0.0022 0.016 0.4856 1.036 0.1428 0.787 0.0505 0.3812
9 0.0027 0.0165 0.4856 1.036 0.1438 0.7875 0.0501 0.3802
10 0.0022 0.0165 0.4851 1.036 0.1423 0.787 0.051 0.3798
평균 0.0020 0.017 0.486 1.036 0.143 0.787 0.051 0.380
STD 0.0006 0.0004 0.0007 0.0000 0.0006 0.0003 0.0004 0.0005
이 실시예에서, 값 0.2가 대상체가 존재하는지의 여부를 판정하기 위한 역치값으로서 선택된다. 출력신호(J1), (J2) 중 어느 한쪽이 0.2보다 높다면, 대상체가 존재한다고 판정된다.
대상체의 존재가 판정된 후, 비 R = J2/(2×J1)이 계산된다. 0.5 < R < 1.5이면, 검출 중인 대상체가 대상체 1인 것으로 판정된다. 2.0 < R < 3.0이면, 검출 중인 대상체가 대상체 2인 것으로 판정된다. 3.5 < R < 4.5이면, 검출 중인 대상체가 대상체 3인 것으로 판정된다. 이하의 표 2는 검출 결과의 몇몇 예를 나타내고 있다.
검출결과의 예

시험 조건		 연산 및 결과
존재유무 판별
기준 대상체 1 대상체 2 대상체 3
판독 J1 J2 유형 J1 혹은 J2>0.2이면 R=
J2/(2×J1)		 0.5<R<1.5 2.0<R<3.0 3.5<R<4.5
1 0.0017 0.0155 대상체 없음 거짓 - - - -
2 0.0032 0.0155 대상체 없음 거짓 - - - -
3 0.4856 1.036 대상체 1 참 1.067 참 거짓 거짓
4 0.4841 1.036 대상체 1 참 1.070 참 거짓 거짓
5 0.4851 1.036 대상체 1 참 1.068 참 거짓 거짓
6 0.1423 0.787 대상체 2 참 2.765 거짓 참 거짓
7 0.1423 0.7855 대상체 2 참 2.760 거짓 참 거짓
8 0.0501 0.3749 대상체 3 참 3.742 거짓 거짓 참
9 0.0476 0.3734 대상체 3 참 3.922 거짓 거짓 참
10 0.0501 0.3739 대상체 3 참 3.732 거짓 거짓 참
실시예 II
최근의 연구는, 사이토카인 활성에 있어서의 결함이 간으로부터 HCV의 유효한 청소를 제한하는 HCV/HIV 공-감염된 사람에서 일어날 수 있다는 것을 나타내고 있다(J. Med. Viroi. 78:202-207, 2006). HCV 단일-감염된 사람과 HCV/HIV 공-감염된 사람의 HCV 및 HIV 바이러스 RNA는 분자 비콘 접근법(molecular beacon approach) 및 실시예 1의 검출기를 이용해서 정량화될 수 있다.
RNA 추출
총 RNA는 고순도 RNA 조직 키트(Roche Diagnostics: Meylan, France) 및 RNA가 없는 물(RNase-free water) 100㎕ 중의 용출을 이용해서 HCV 단일-감염된 사람과 HCV/HIV 공-감염된 사람의 간 생검으로부터 추출될 수 있다.
cDNA 합성
간 생검의 추출된 총 RNA는, HCV에 대해서는 RC21 프라이머(5'-CTC CCG GGG CAC TCG CAA GC-3' (서열번호 1))를, 그리고 HIV에 대해서는 gagR 프라이머(S'-TTTGGTCCTTGTCTTA TGTCCAGAATG-3'(서열번호 2))를 각각 이용해서 써모스크립트 역전사효소 키트(Thermoscript Reverse Transcriptase kit)로 역전사시킨다. 샘플 중의 임의의 HCV 및/또는 HIV RNA의 존재는 역전사를 일으켜 상보적 단쇄 cDNA를 생성할 것이다. 이어서, RNA는 샘플로부터 제거된다.
분자 비콘 프로브
상이한 색의 분자 비콘은 HCV 혹은 HIV의 검출을 위해 합성된다. HCV: (5'-FAM-GCTAGCATTTGGGCGTGCCCCCGCIAGAGCTAGC-DABCYL-3'(서열번호 3)). HIV: (5'-HEX-GCTAGCATTTGGGCGTGCCCCCGCIAGAGCTAGC-DABCYL-3'(서열번호 4)). 용액 중의 cDNA 산물의 검출은 분자 비콘(MBs) 브로브를 이용해서 수행되며, 이것은 95℃에서 10분간의 변성 단계에 이어 55℃에서 4시간 어닐링됨으로써 그들의 상보적인 서열과 하이브리다이제이션되었다.
표적의 검출
하이브리다이제이션된 cDNA 샘플은 전극매립된 미세유체 반응기(electrodeembedded microfluidic reactor)(Wang, TH et al., 2005)로 옮겨지고, 해당 반응기에는 단일-분자 추적을 위한 레이저-집속 검출 영역이 제공되어 있다. 샘플 용액은 마이크로채널의 입구에서 도입된 후 유체역학적 펌핑을 통해서 구동된다. 분자들이 상기 전극 영역에 유입되면, 그들의 수송은 전극-제어된 동전기력에 의해 지배되어, 이들을 중앙 전극의 중심에 위치된 최소 에너지의 영역 쪽으로 향하게 한다. 공초점식 형광 분광기의 집속된 레이저빔은 상기 에너지 최소 영역의 하류 단부에 위치결정되어, 개별의 분자로부터 방출된 형광 폭발(fluorescent burst)이 실시예 I의 검출기에서 검출된다. 샘플 중의 HCV 및 HIV의 존재유무는 실시예 I의 방법을 이용해서 비콘 프로브 상에 표지된 염료로부터 검출·판별된다. 샘플 중의 HCV 및 HIV 바이러스 RNA의 양은 상기 검출장치에 의해 보고된 검출 회수에 따라 정량화된다.
***
본 명세서에 인용된 모든 특허, 출원 혹은 기타 참고문헌에 대해서, 인용된 명제에 대해서뿐만 아니라 모든 목적을 위해서 그의 전문이 참조로 포함되는 것임을 이해할 필요가 있다. 참조에 의해 포함된 문헌과 본 출원 간에 어떠한 모순이 있다면, 본 출원이 우선할 것이다.
본 명세서는 해당 명세서 내에 인용된 참고문헌의 교시에 비추어 더욱 완전히 이해된다. 본 명세서 내의 실시형태는 본 발명의 실시예의 예시를 제공하며 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 파악해서는 안된다. 당업자라면, 기타 많은 실시형태가 본 발명에 의해 망라됨을 용이하게 인식할 것이다. 본 개시 내용에 인용된 모든 공보 및 특허는 그들의 전문이 참조로 내포된다. 참조에 의해 내포된 자료가 어느 정도 본 명세서와 모순되거나 일치하지 않는다면, 본 명세서가 이러한 자료를 대신할 것이다. 본 명세서에서의 임의의 문헌의 인용은 이러한 문헌이 본 발명에 대한 종래 기술임을 허용하는 것은 아니다.
달리 표시된 경우를 제외하고, 특허청구범위를 비롯하여 본 명세서에서 이용된 성분들의 양, 반응 조건 등을 표시하는 모든 숫자는 모든 실례에 있어서 "약"이라는 용어에 의해 변경될 수 있는 것으로 이해할 필요가 있다. 따라서, 이에 반하여 달리 표기된 경우를 제외하고, 수치 파라미터는 대략의 값이며, 본 발명에 의해 추구될 소망의 특성에 따라 변화될 수 있다. 최소한, 특허청구범위의 범주와 등가의 이론의 출원을 제한하기 위한 시도로서가 아니라, 각 수치 파라미터는 유효숫자의 수 및 통상의 반올림 접근법을 감안하여 추론될 필요가 있다.
달리 표시된 경우를 제외하고, 일련의 요소에 선행하는 "적어도"라는 용어는 해당 일련의 요소 중의 모든 요소를 지칭하는 것으로 이해될 필요가 있다. 당업자라면 본 명세서에 기재된 발명의 특정 실시형태에 대한 많은 등가물이 단지 관례적인 실험에 지나지 않는 것을 이용해서 규명될 수 있거나 규명되는 것을 인지할 것이다. 이러한 등가물은 이하의 특허청구범위에 의해 포함되는 것으로 의도된다.

Claims (18)

  1. 광을 방출할 수 있는 대상체를 검출하는 장치로서,
    (a) 광의 강도를 결정할 수 있는 적층되어 있는 제1광학 센서와 제2광학 센서를 적어도 포함하는 광검출기; 및
    (b) 상기 광학 센서들에 의해 발생된 출력 신호들을 처리하여, 해당 처리의 결과를 공지된 유형에 대응하는 공지된 결과와 비교해서 상기 대상체가 상기 공지된 유형에 속하는지의 여부를 판정하는 컴퓨터를 포함하는, 대상체의 검출장치.
  2. 제1항에 있어서,
    (c) 상기 대상체로부터 방출된 광을 수집하여 광학 센서들로 유도하는 광학 구조체를 추가로 포함하는, 대상체의 검출장치.
  3. 제2항에 있어서, 상기 광학 구조체는 렌즈를 포함하는 것인 대상체의 검출장치.
  4. 제1항에 있어서, 상기 광학 센서들은 포토다이오드인 것인 대상체의 검출장치.
  5. 제1항에 있어서, 상기 적어도 두 광학 센서는 하나의 장치 내에 있는 적어도 2개의 적층하고 있는 p-n 접합부에 의해 형성되는 것인 대상체의 검출장치.
  6. 제1항에 있어서, 상기 광검출기는 신호증폭기의 회로, A/D 변환기, 적산기, 비교기, 논리회로, 독출회로(readout circuit), 메모리, 마이크로프로세서, 클록, 및/또는 어드레스를 포함하는 것인 대상체의 검출장치.
  7. 제1항에 있어서, 상기 신호들을 처리하는 것은
    상기 신호들의 합계를 계산하는 단계; 및
    상기 합계를 역치값과 비교하여, 대상체의 존재 유무를 판정하는 단계를 포함하되,
    상기 합계가 상기 역치값 이상인 경우, 대상체가 존재한다고 판정하고,
    상기 합계가 상기 역치값보다 작은 경우, 대상체가 존재하지 않는다고 판정하는 것인 대상체의 검출장치.
  8. 제1항에 있어서, 상기 신호들을 처리하는 것은
    상기 신호들의 합계를 계산하는 단계; 및
    상기 합계를 역치값과 비교하여, 대상체의 존재 유무를 판정하는 단계를 포함하되,
    상기 합계가 상기 역치값보다 작은 경우, 대상체가 존재한다고 판정하고,
    상기 합계가 상기 역치값 이상인 경우, 대상체가 존재하지 않는다고 판정하는 것인 대상체의 검출장치.
  9. 제1항에 있어서, 상기 신호들을 처리하는 것은 해당 신호들의 비를 계산하는 단계를 포함하고,
    상기 처리의 결과를 공지된 결과와 비교하는 것은 상기 계산된 비를 공지된 유형에 대응하는 공지된 비와 비교하는 단계를 포함하되,
    상기 계산된 비와 상기 공지된 비 간의 차이가 미리 규정된 범위 내에 있을 경우, 상기 대상체가 상기 공지된 유형에 속한다고 판정하는 것인 대상체의 검출장치.
  10. 제1항에 있어서, 상기 컴퓨터는 또한 상기 처리의 결과를 복수개의 공지된 유형에 대응하는 복수개의 공지된 결과와 비교하여 상기 대상체가 어떠한 유형에 속하는지를 판정하는 것인 대상체의 검출장치.
  11. 제9항에 있어서, 상기 컴퓨터는 또한 상기 계산된 비를 복수개의 공지된 유형에 대응하는 복수개의 공지된 비와 비교하여 상기 대상체가 어떠한 유형에 속하는지를 판정하는 것인 대상체의 검출장치.
  12. 제11항에 있어서, 복수개의 공지된 비 중 상기 계산된 비에 대해서 가장 작은 차이를 지니는 공지된 비를 지니는 공지된 유형이, 대상체가 속하는 유형인 것으로 판정되는 것인 대상체의 검출장치.
  13. 제1항에 있어서, 상기 대상체는 적어도 하나의 양자점(quantum dot), 적어도 하나의 형광 단백질(fluorescent protein) 또는 적어도 하나의 작은 형광성 화학 성분(fluorescent small chemical moiety)을 포함하는 것인 대상체의 검출장치.
  14. 제1항에 있어서, 상기 대상체는 형광 표지되어 있고, 또한 적어도 하나의 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드, 올리고펩타이드, 폴리펩타이드, 올리고당, 다당류 또는 지질을 포함하는 것인 대상체의 검출장치.
  15. 제1항에 있어서, 상기 대상체는 광 방출 능력이 없는 표적 대상체와 광 방출 능력을 지니는 표지 대상체(labeling object)를 포함하는 것인 대상체의 검출장치.
  16. 제1항에 있어서, 상기 대상체는 광 방출 능력이 없는 표적 대상체와 광 방출 능력을 지닌 표지 대상체들의 그룹을 포함하는 것인 대상체의 검출장치.
  17. 제1항에 있어서, 상기 광검출기는 복수개의 대상체를 검출하는 적어도 하나의 광검출기 중 하나이고, 상기 복수개의 대상체는 액체 현탁액으로 구성되고, 해당 현탁액은 적어도 하나의 광검출기를 통과하여 흐르는 것인 대상체의 검출장치.
  18. 복수개의 대상체를 검출하는 시스템으로서,
    제1항에 기재된 대상체 검출장치들의 어레이를 포함하는, 복수개의 대상체의 검출 시스템.
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