KR100796985B1

KR100796985B1 - 금박막이 부분 증착된 다기능성 나노입자

Info

Publication number: KR100796985B1
Application number: KR1020060060678A
Authority: KR
Inventors: 유경화; 신전수; 함승주; 박희열; 임미화; 양재문
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2006-06-30
Filing date: 2006-06-30
Publication date: 2008-01-22
Also published as: KR20080002080A; WO2008002101A1; US8257743B2; US20100028453A1

Abstract

본 발명은 약물을 중심으로 고분자가 코팅되어 고분자 나노입자가 형성되고, 상기 고분자 나노입자 표면의 일부에는 금박막이 증착되며, 상기 금박막에는 상기 약물을 전달하고자 하는 세포 표면에 발현된 물질에 대한 항체가 접합된 다기능성 나노입자 및 약물을 중심으로 고분자를 코팅시켜 고분자 나노입자를 제조하고; 상기 고분자 나노입자 표면의 일부를 금박막으로 증착시키고; 상기 금박막에 상기 약물을 전달하고자 하는 세포 표면에 발현된 단백질에 대한 항체를 접합시키고; 고분자 나노입자 표면의 일부가 금박으로 증착되고 항체가 접합된 나노입자를 분리하는 단계로 구성된 다기능성 나노입자의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 다기능성 나노입자를 함유한 조성물 및 상기 조성물을 이용한 치료방법과 진단방법에 관한 것이다.

다기능성 나노입자, 금박막, 근적외선

Description

금박막이 부분 증착된 다기능성 나노입자{Multi-Functional Nanoparticles Partially-Deposited with Gold Film}

도 1a는 본 발명의 한 양태에 따른 다기능성 나노입자를 간략하게 나타낸 것이다.

도 1b는 본 발명의 다른 양태에 따른 다기능성 나노입자를 간략하게 나타낸 것이다.

도 2a는 본 발명에 따라 금박막이 부분 증착된 PS 나노입자의 FESEM 이미지를 나타낸 것이다.

도 2b는 본 발명에 따라 금박막이 부분 증착된 PLGA 나노입자의 TEM 이미지를 나타낸 것이다.

도 3은 금박막이 부분 증착된 실리카 나노입자(a), 본 발명에 따라 금박막이 부분 증착된 PS 나노입자(b) 및 금박막이 부분 증착된 PLGA 나노입자(c)의 금박막 두께에 따른 광 흡수 스펙트럼의 변화를 나타낸 것이다.

도 4a는 본 발명에 따라 금박막이 부분 증착된 PS 나노입자에 항체가 접합되었는지 유무를 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타낸 것이다.

도 4b는 본 발명에 따라 금박막이 부분 증착된 PLGA 나노입자가 CD4 항체와 접합되기 전 · 후에 광 흡수 스펙트럼을 나타내는 것이다.

도 5a는 본 발명에 따라 CD4 항체가 접합되고 금박막이 부분 증착된 PLGA 나노입자가 H9 세포에 특이적으로 결합한다는 것을 나타내는 형광 현미경 이미지이다(좌측 칼럼: H9 세포주, 우측 칼럼: Ramos 세포주).

도 5b는 본 발명에 따라 CD4 항체가 접합되고 금박막이 부분 증착된 PLGA 나노입자가 H9 세포에 특이적으로 결합한다는 것을 나타내는 FESEM 이미지이다.

도 5c는 본 발명에 따라 CD4 항체가 접합되고 금박막이 부분 증착된 PLGA 나노입자가 H9 세포에 특이적으로 결합한다는 것을 나타내는 EDX 이미지이다.

본 발명은 다기능성 나노입자에 관한 것으로, 보다 자세하게는 약물을 중심으로 고분자가 코팅되어 고분자 나노입자가 형성되고, 상기 고분자 나노입자 표면의 일부에 금박막이 증착되며, 상기 금박막에 상기 약물을 전달하고자 하는 세포 표면에 발현된 물질에 대한 항체가 접합된 다기능성 나노입자, 이의 제조방법, 상기 다기능성 나노입자를 함유한 조성물 및 이를 이용한 치료방법과 진단방법에 관한 것이다.

표적 지향성 치료제 전달방법은 투여방식 및 부위에 상관없이 목적한 기관 또는 조직에 선택적이고 정량적으로 치료제가 축적되도록 하는 치료제 전달방법 중의 하나이다. 이러한 전달방법은 표적 부위에서 치료제의 농도를 증가시켜 치료 효과를 극대화시키는 반면에, 비표적 조직 및 기관에서 치료제의 농도는 감소시켜 부작용을 최소화시킬 수 있다. 아울러, 치료 효과를 달성하는데 필요한 치료제의 양 뿐만 아니라 치료에 소요되는 비용도 상당히 줄일 수 있다.

이러한 표적 지향성 치료제 전달을 위한 한 방안으로서, 아데노바이러스, 레트로바이러스 같은 바이러스 내에 약물을 로딩하고, 바이러스 외피에 상기 약물을 전달하고자 하는 세포의 표면에 존재하는 물질에 대한 항체를 결합시킨 형태의 표적 지향성 약물 전달체가 개발되어 왔다. 그러나, 바이러스를 이용한 약물 전달방식은 약물의 종류가 단백질 또는 핵산에 국한되며, 특히 바이러스가 숙주의 면역반응을 유발시켜 치료 효과 보다는 부작용이 커지는 문제점이 있다.

다른 방안으로서, 마그네타이트와 같은 자기성 물질과 약물을 고분자로 캡슐화한 자기성 나노입자가 개발되어 왔다. 이러한 자기성 나노입자는 환자에게 주입된 후 외부에서 인위적으로 표적 부위에 자기장을 걸어주면 상기 나노입자가 표적 부위로 집중되어 나노입자 내에 로딩되어 있던 약물이 방출됨으로써 치료 효과를 발휘하는 것이다. 그러나, 이러한 나노입자의 경우에는 상기 고분자의 분해가 혈중 분해효소에 의해 이루어지므로 고분자의 분해를 제어하기 어려워 결과적으로는 약물의 방출 속도를 제어하는데 어려움이 있다.

또 다른 방안으로서, 자성 또는 금속의 나노입자 표면에 약물을 결합시킨 나노입자가 개발되어 왔다. 이러한 나노입자는 전술된 나노입자에 비하여 크기가 작기 때문에 조직 깊숙이 침투할 수 있다는 장점이 있지만, 약물이 외부로 노출되어 있기 때문에 표적 부위로 전달되는 과정에서 정상 세포에도 영향을 미칠 가능성이 높다.

한편, 최근에는 조직을 통한 광학 전송이 근적외선 (near infrared, NIR) 영역(즉, 800 내지 1200nm)에서 최적화된다는 것이 알려지면서, 금으로 코팅된 Au₂S 나노셸(nanoshell)(Averitt, R. D. et al. Phys. Rev. Lett. 1997, vol.78, p.4217), 실리카-금 나노셸 입자(Loo, C. et al. Tech. in Cancer Res. & Treatment, 2004, vol.3, p.33) 및 중공의 금 나노셸(Chen, J. et al. Nano Lett. 2005, vol.5, p.473)과 같은 근적외선 공명 나노셸이 생물의약 분야에서 광범위하게 연구되고 있다.

일반적으로 고상의 금속 나노입자의 표면 플라즈몬-공명 주파수는 가시 영역에 위치한다. 그러나, 금속의 나노셸은 금속 셸의 두께를 다양화함에 따라 가시영역으로부터 NIR 영역으로 공명 주파수를 조율하는 가요성을 발휘하였다. 이와 같은 금속의 나노셸은 NIR을 강하게 흡수하여 그 광에너지를 열로 전환함에 따라 열 치료 및 광열로 변조되는 약물 전달에 사용될 수 있다.

L.R. Hirsh 등은 실리카-금 나노셸이 국소적인 가열의 과잉으로 인한 정상 세포의 손상 없이 표적 세포만을 살상할 수 있는 양으로 치료 효과적인 열을 전달하는데 사용될 수 있다는 것을 증명하였다(Hirsh, L. R. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003, vol.100, p.13549). 또한, S.R.Sershen 등은 폴리-NIPAAm-co-AAm)/AU-Au₂S 나노셸 복합물이 NIR 조사에 반응하여 가역적인 상전이를 수행하고 NIR을 조사하자마자 상기 복합물 수화겔(hydrogel)로부터 약물 방출을 촉진한다는 것을 증명하였다(Sershen, S. R. et al. J. Biomed. Mater. Res. 2000, vol.51, p.293).

그러나, 상기 NIPAAm-co-AAm 수화겔은 유독 물질로 알려진 아크릴아미드(AAm)를 포함하고 있기 때문에 생체 적합성이 떨어진다는 문제점이 있다. 특히, 아크릴아미드는 남성생식기관, 신장 또는 신경세포에 해로운 영향을 일으키는 것으로 알려져 있으며, 산업안전보건법에서 발암물질로 추정되는 물질로 지정하고 있다.

이에, 본 발명자들은 생체에 보다 적합한 표적 지향성 약물 전달체를 제공하기 위하여, 약물을 중심으로 고분자를 코팅하고 여기에 금박막을 부분 증착하고 항체를 접합시켜 나노입자를 제조하였다. 그리고, 상기 나노입자는 항체에 의해 표적 부위로 집중될 뿐 아니라 표적 부위에 근적외선을 조사하면, 금박막에 의해 열이 발생하여 표적 부위에 있는 세포를 살상하고, 또한 열에 의해 고분자의 분해가 증진되어 약물의 방출이 촉진됨에 따라 약물의 효능이 배가된다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명은 한 관점으로서, 약물을 중심으로 하여 고분자가 코팅되어 고분자 나노입자가 형성되고, 상기 고분자 나노입자 표면의 일부에는 금박막이 증착되며, 상기 금박막에는 상기 약물을 전달하고자 하는 세포 표면에 발현된 물질에 대한 항체가 접합된 다기능성 나노입자를 제공한다.

다른 관점으로서, (1) 약물을 중심으로 하여 고분자를 코팅시켜 고분자 나노입자를 제조하는 단계; (2) 상기 고분자 나노입자 표면의 일부를 금박막으로 증착 시키는 단계; (3) 상기 금박막에 상기 약물을 전달하고자 하는 세포 표면에 발현된 단백질에 대한 항체를 접합시키는 단계; 및 (4) 고분자 나노입자 표면의 일부가 금박막으로 증착되고 항체가 접합된 나노입자를 분리하는 단계로 구성된 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또 다른 관점으로서, 약물을 중심으로 하여 고분자가 코팅되어 고분자 나노입자가 형성되고, 상기 고분자 나노입자 표면의 일부에는 금박막이 증착되며, 상기 금박막에는 상기 약물을 전달하고자 하는 세포 표면에 발현된 물질에 대한 항체가 접합된 다기능성 나노입자 및 약제학적으로 허용된 담체를 포함한 약물의 표적 부위 전달용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또 다른 관점으로서 (1) 본 발명에 따른 약물의 표적 부위 전달용 조성물을 검체에 주입하는 단계; (2) 표적 부위에 다기능성 나노입자를 집중시키는 단계 및 (3) 표적 부위에 근적외선을 조사시킴으로써 열을 발생시켜 표적 부위에 존재하는 세포를 살상하고, 상기 약물의 방출을 촉진하여 표적 부위에서 약물의 효능을 배가시키는 단계를 포함한 치료 방법을 제공한다.

본 발명은 또 다른 관점으로서 (1) 본 발명에 따른 약물의 표적 부위 전달용 조성물을 검체에 주입하는 단계; 및 (2) 검체로부터 다기능성 나노입자에 의해 발산되는 신호를 감지하여 표적 부위를 확인하는 단계; 및 (3) 표적 부위에 근적외선을 조사시킴으로써 열을 발생시켜 표적 부위에 존재하는 세포를 살상하고, 상기 약물의 방출을 촉진하여 표적 부위를 치료하는 단계를 포함한 질병의 진단 및 치료방법을 제공한다.

본 발명은 약물을 중심으로 하여 고분자가 코팅되어 고분자 나노입자가 형성되고, 상기 고분자 나노입자 표면의 일부에는 금박막이 증착되며, 상기 금박막에는 상기 약물을 전달하고자 하는 세포 표면에 발현된 물질에 대한 항체가 접합된 다기능성 나노입자에 관한 것이다(도 1a 참조). 본 발명에 따른 다기능성 나노입자를 보다 명료하게 설명하기 위하여 먼저 다음 용어들을 정의한다.

본 발명의 명세서에서 용어 "고분자 나노입자"는 약물을 중심으로 하여 고분자의 코팅층이 형성되어 이루어진 입자를 의미하는 것으로서, 편의상 "고분자의 종류 나노입자"의 형태로 표기할 수 있다. 예를 들면, 고분자의 종류가 폴리 락티드-코-글리콜라이드(PLGA)인 경우에는 PLGA 나노입자로 표기된다.

본 발명의 명세서에서 용어 "금박막-고분자 나노입자"는 상기 고분자 나노입자 표면의 일부에 금박막이 코팅되어 이루어진 입자를 의미하는 것으로서, 편의상"금박막-고분자의 종류 나노입자"의 형태로 표기할 수 있다. 예를 들면, 고분자의 종류가 폴리 락티드-코-글리콜라이드(PLGA)인 경우에는 금박막-PLGA 나노입자로 표기된다.

본 발명의 명세서에서 용어 "항체-금박막-고분자 나노입자"는 상기 금박막-고분자 나노입자의 표면에 항체가 접합되어 이루어진 입자를 의미하는 것으로서, 편의상 "항체의 종류-금막박-고분자의 종류 나노입자"의 형태로 표기할 수 있다. 예를 들면, 항체가 CD4 항체이고 고분자의 폴리 락티드-코-글리콜라이드(PLGA)인 경우에는 CD4 항체-금박막-PLGA 나노입자로 표기된다. 또한, "항체-금박막-고분자 나노입자"는 본 발명의 "다기능성 나노입자"와 상호 교환적으로 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 다기능성 나노입자의 가장 내부에 존재하는 약물은 그 종류 및 화학적 성질은 특별히 제한적이지 않으며, 치료하고자 하는 질병에 따라 다양하게 선택 가능하다. 여기서, 약물이 다기능성 나노입자의 중심에 위치한다는 것은 약물이 실질적으로 다기능성 나노입자의 정중앙에 위치한다는 것이 아니라 고분자 나노입자의 내부 임의의 위치에 위치하는 것으로 이해되어야 한다. 특히, 본 발명에 따른 다기능성 나노입자는 약물을 표적 부위에 집중시킬 수 있으므로 부작용으로 인해서 임상적 사용이 제한적인 항암제, 면역억제제, 소염진통제 등과 같은 약물을 전달하는데 이용하면 유용할 것이다.

예를 들면, 본 발명에서는 항암제로 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 클로람부실(chlorambucil), 부설판(busulfan), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 독소루비신(doxorubicin), 블레오마이신(bleomycin), 메클로레타민(mechlorethamine), 디악티노마이신(diactinomycin), 택솔(taxol), 빈크리스틴(vincristin) 또는 빈블라스틴(vinblastin)을 이용할 수 있으며; 면역억제제로 브로모우라실(BUdR), 플루오로우라신(FUdR), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 코르티손(cortisone), 프레도니솔론(predonisolone), 6-메르캅토퓨린(6-mercaptopurin), 액티노마이신 D(actinomycin D) 또는 덱사메타손(dexamethasone)을 이용할 수 있으며, 소염진통제로 나프록센(naproxen), 디클로 페낙(diclofenac), 피록시캄(piroxicam), 이부프로펜(ibuprofen), 아자프로파존(azapropazon), 페노프로펜(fenoprofen), 플루비프로펜(flurbiprofen), 피라졸락(pirazolac), 브롬페낙(bromfenac) 또는 암피록시캄(ampiroxicam)을 이용할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

약물을 둘러싸는(즉, 코팅하는) 고분자로는 당업계에 공지된 생분해성 고분자(biodegradable polymer)가 이용될 수 있다. 예를 들면 폴리스티렌(PS), 폴리에틸렌이민, 폴리포스파겐, 폴리락타이드, 폴리락티드-코-글리콜라이드(PLGA), 폴리카프로락톤, 폴리안하이드라이드, 폴리말릭산 및 이의 유도체, 폴리알킬시아노아크릴레이트, 폴리하이드로옥시부틸레이트, 폴리카르보네이트 및 폴리오르소에스테르, 폴리에틸렌글리콜, 폴리-L-라이신, 폴리글리콜라이드, 폴리메틸메타아크릴레이트 및 폴리비닐피롤리돈으로 구성되는 군 및 이의 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택된 것이 이용될 수 있다. 상기 고분자들은 낮은 독성 뿐만 아니라 탁월한 생체 적합성을 보여주는 것으로 알려져 있다(A. J. Domb, et al. Handbook of biodegradable polymers, Harwood academic publishers, USA, 1997). 본 발명에서는 미국 FDA에 의해 승인된 PLGA를 이용하는 것이 바람직하다.

고분자 표면에 증착된 금박막은 근적외선 광에너지를 열에너지로 전환하여 예를 들면 표적 부위에 있는 세포(예, 암세포)를 살생하고, 상기 고분자의 분해를 촉진하여 고분자 내부에 위치한 약물의 방출을 가속화시키는 역할을 한다. 특히, 본 발명에 따른 다능성 나노입자는 금박막이 고분자 나노입자 표면의 일부에만 증착되어 있는 것을 특징으로 하는데, 금박막이 증착되지 않은 부분은 약물이 방출되 는 출구와 같은 역할을 하게 된다. 이러한 역할을 달성하기 위하여 금박막은 고분자 나노입자의 전체 표면 중 10 내지 90%, 바람직하게는 20 내지 80%, 보다 바람직하게는 30 내지 70%에 증착한다. 또한, 금박막은 금 뿐만 아니라 백금 또는 이 둘의 합금으로 이루어질 수 있다.

본 발명에서 금박막의 두께는 사용된 고분자에 따라 달라질 수 있다. 고분자로 폴리스티렌이 이용된 경우에는 금박막의 두께가 14nm 이상인 것이 바람직하다. 그래야만 금박막의 다기능성 나노입자의 흡수 피크가 조직 적합성이 탁월한 근적외선으로 조율될 수 있기 때문이다(실시예 3의 A 참조). 한편, 고분자로 폴리 락티드-코-글리콜라이드가 사용된 경우에는 금박막의 두께에 상관없이 흡수 피크가 근적외선 영역에 위치하였다(실시예 3의 B 참조).

본 발명에 따른 다기능성 나노입자를 표적 부위로 집중시키는데 기여하는 항체는 상기 약물을 전달하고자 하는 세포 표면에 발현된 물질에 대한 항체일 수 있다. 특히, 종양 세포는 정상 세포가 거의 또는 전혀 생산하지 않는 특정 물질(즉, 종양 마커)을 발현하는데, 그러한 종양 마커와 특이적으로 결합할 수 있는 물질(예, 항체, 항체 변형물질 혹은 펩타이드)을 본 발명에 따른 다기능성 나노입자에 도입하여 종양의 치료에 유용하게 이용할 수 있다. 당업계에는 다양한 종양 마커 뿐만 아니라 이들과 특이적으로 결합할 수 있는 물질이 공지되어 있다. 종양 마커의 예로는 암성 태아성 항원(carcinoembryonic antigen - 대장암 표지 항원), HER2/neu 항원(HER2/neu antigen - 유방암 표지 항원), 전립선 특이 항원 (prostate-specific membrane antigen - 전립선암 표지 항원) 등이 있다. 본 발명 에서 항체는 모노 클로날 또는 폴리 클로날일 수 있지만, 정확한 표적 지향성을 위하여 모노 클로날인 것이 바람직하다.

한편, 본 발명에 따른 다기능성 나노입자는 약물을 중심으로 하여 고분자가 코팅되어 고분자 나노입자가 형성되고, 상기 고분자 나노입자 표면의 일부에는 제 1 금박막이 증착되며, 상기 제 1 금박막 표면에는 자성물질의 박막이 증착되고, 상기 자성물질 박막 표면에는 제 2 금박막이 증착되며, 상기 제 2 금박막 표면에는 상기 약물을 전달하고자 하는 세포 표면에 발현된 물질에 대한 항체가 접합된 형태일 수도 있다(도 1b 참조). 다기능성 나노입자를 자성물질을 포함하고 있어 질병을 진단하는데 이용될 수 있다.

상기 다기능성 나노입자를 구성하는 약물, 고분자, 금박막은 모두 전술된 바와 유사하여 관련 설명은 생략하기로 한다. 여기서, 자성물질로는 당업계에 공지된 임의의 자성물질이 이용될 수 있으며, 예를 들면 Co, Mn, Fe, Ni, Gd 등이 이용될 수 있다. 자성물질로 박막을 형성하는 방법은 후술되는 금으로 박막을 형성하는 방법 중에서 금 대신에 자성물질을 사용하여 동일한 절차에 따라 진행될 수 있다.

본 발명에 따른 다기능성 나노입자는 (1) 약물을 중심으로 하여 고분자를 코팅시켜 고분자 나노입자를 제조하는 단계; (2) 상기 고분자 나노입자 표면의 일부를 금박막으로 증착시키는 단계; (3) 상기 금박막에 상기 약물을 전달하고자 하는 세포 표면에 발현된 단백질에 대한 항체를 접합시키는 단계; 및 (4) 고분자 나노입자 표면의 일부가 금박막으로 증착되고 항체가 접합된 나노입자를 분리하는 단계로 구성된 제조방법을 통하여 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 제조방법의 단계 (1)은 약물을 중심으로 하여 고분자를 코팅시켜 고분자 나노입자를 제조하는 단계이다. 약물이 중심에 위치한 고분자 나노입자를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 본 발명에서는 공지된 바에 의하여 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 제조방법의 단계 (2)는 상기 고분자 나노입자 표면의 일부를 금박막으로 증착시키는 단계이다. 먼저 고분자 나노입자를 예를 들면, 물과 같은 용매에 용해하여 현탁액을 제조한 후 상기 현탁액을 유리 또는 실리콘 기판 상에 뿌려주어 고분자 나노입자를 균일하게 분포시킨다. 기판 상에 고분자 나노입자를 균일하게 분포시키기 위하여, 유리 또는 실리콘 기판은 피라나(pirana) 변형시켜 친수성을 띄게 하는 것이 바람직하다. 유리 또는 실리콘 기판은 본래 소수성을 띄고 있어 물에 용해되어 친수성을 보이는 고분자 나노입자를 뿌려주면 방울로 뭉치면서 결과적으로 고분자 나노입자가 균일하게 분포되지 않기 때문이다.

또한, 기판 상에 고분자 나노입자를 균일하게 분포시키고 이후에 고분자 나노입자에 균일하게 금박막을 증착시키기 위하여, 단계 (2)는 기판을 스핀 코터(spin coater) 상에 위치시킨 상태로 실시하는 것이 바람직하다. 스핀 코터는 스핀을 발생시키는데, 이 스핀이 기판 상에 배열된 고분자 나노입자를 지정된 위치에 고정시키고 이후에 금박막이 균일하게 증착되도록 기여하기 때문이다.

기판 상에 고분자 나노입자를 균일하게 분포시킨 후에는 상기 고분자 나노입자 표면에 금박막을 증착시키는데, 이 때 열증발증착기(thermal evaporator)를 이용하는 것이 바람직하다. 열증발증착기는 진공 상태에서 고상의 금에 열을 가하여 금의 증기를 발생시키고, 상기 증기는 기판 상에 배열된 고분자 나노입자와 접촉하게 되면 고상이 되어 고분자 나노입자에 금박막을 증착시킬 수 있다. 여기서, 금박막은 고분자 나노입자의 전체 표면 중 10 내지 90%에 증착되도록 한다.

이렇게 하여 금박막이 증착된 나노입자는 물리적인 힘을 가하여 예를 들면, 초음파를 이용하여 기판으로부터 분리할 수 있다.

본 발명에 따른 제조방법의 단계 (3)은 금박막에 상기 약물을 전달하고자 하는 세포 표면에 발현된 단백질에 대한 항체를 접합시키는 단계이다. 항체는 티올기를 포함한 아미노산을 함유하고 있기 때문에 금박막과 항체간의 접합은 금 또는 백금과 항체에 있는 티올기 간의 공유결합에 의해 용이하게 달성될 수 있다.

본 발명에 따른 제조방법의 단계 (4)는 고분자 나노입자 표면의 일부가 금박으로 증착되고 항체가 접합된 나노입자를 분리하는 단계이다. 항체-금박막-고분자 나노입자는 항체 또는 금박막-고분자 나노입자에 비하여 무겁기 때문에 원심분리 등을 통하여 용이하게 분리할 수 있다. 다른 분리 방법으로 여과법, 세럼 교체 방법을 이용할 수도 있다.

다른 관점으로 본 발명은 본 발명에 따른 다기능성 나노입자와 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약물의 표적 부위 전달용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 조성물은 의약 분야에서 통상적으로 이용되는 경로를 통해 투여될 수 있으며, 비경구 투여가 바람직하고 예를 들어 정맥내, 복강내, 근육내, 피하 또는 국부 경로를 통하여 투여할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물에 사용되는 담체는 의약 분야에서 통상 사용되는 담체 및 비히클을 포함한다. 본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 약제학적으로 허용되는 담체로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 이온 교환, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질, 완충 물질, 물, 염 또는 전해질, 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모지 등이 포함된다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

한 양태로서, 본 발명에 따른 조성물은 비경구 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있다. 바람직하게는 한스 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 완충 용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입 현탁액은 소디움 카르복시메틸셀룰로즈, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다.

본 발명의 바람직한 조성물은 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액으로서 멸균 주사용 제제의 형태일 수 있다. 이러한 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 본 분야에 공지된 기술에 따라 제형될 수 있다. 멸균 주사용 제제는 또한 무독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사 용액 또는 현탁액일 수 있다. 사용될 수 있는 비히클 및 용매로는 만니톨, 물, 링거 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 비휘발성 오일이 통상적으로 용매 또는 현탁화 매질로서 사용된다. 이러한 목적을 위해 합성 모노 또는 디글리세라이드를 포함하여 자극성이 적은 비휘발성 오일을 사용할 수 있다.

다른 관점으로서, 본 발명은 (1) 본 발명에 따른 다기능성 나노입자와 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한 약물의 표적 부위 전달용 조성물을 검체에 주입하는 단계; (2) 표적 부위에 다기능성 나노입자가 집중되도록 하는 단계 및 (3) 표적 부위에 근적외선을 조사시킴으로써 열을 발생시켜 표적 부위에 존재하는 세포를 살상하고, 상기 약물의 방출을 촉진하여 표적 부위를 치료하는 단계를 포함한 치료 방법에 관한 것이다.

상기 치료방법의 단계 (1)에서는 본 발명에 따른 다기능성 나노입자와 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한 약물의 표적 부위 전달용 조성물을 검체에 주입한다. 이 때에는 예를 들면 혈액 또는 소변 검사와 같은 예비 검사를 통하여 검체의 질병 및 약물을 전달해야 할 부위(표적 부위)에 대한 정보가 이용 가능하고, 이러한 정보를 기반으로 제조된 상기 다기능성 나노입자는 약물을 전달하고자 하는 세포에 존재하는 물질에 대한 항체가 구비되어 있다.

상기 치료방법의 단계 (2)에서는 앞서 주지된 바와 같이 단계 (1)을 통하여 주입된 다기능성 나노입자가 약물을 전달하고자 하는 세포에 존재하는 물질에 대한 항체를 보유하고 있기 때문에 혈관을 타고 이동하다가 시간이 경과함에 따라 약물을 전달하고자 하는 세포(즉, 표적 부위)에 집중되게 된다.

상기 치료방법의 단계 (3)에서 표적 부위에 근적외선(800 내지 1200nm)을 조사하면 다기능성 나노입자의 금박막이 근적외선을 흡수한 후 열을 발생시킨다. 이 열은 표적 부위와 이에 근접한 세포들을 살상할 수 있고, 또한 고분자의 분해를 촉진하여 고분자 내에 있던 약물의 방출을 촉진한다. 결국, 열 자체에 의한 세포 살상과 열에 의한 약물 방출 촉진에 의하여 표적 부위에서 목적한 치료 효과를 배가시키는 것이 가능하다.

한편, 본 발명에 따른 다기능성 나노입자가 약물을 중심으로 하여 고분자가 코팅되어 고분자 나노입자가 형성되고, 상기 고분자 나노입자 표면의 일부에는 제 1 금박막이 증착되며, 상기 제 1 금박막 표면에는 자성물질의 박막이 증착되고, 상기 자성물질 박막 표면에는 제 2 금박막이 증착되며, 상기 제 2 금박막 표면에는 상기 약물을 전달하고자 하는 세포 표면에 발현된 물질에 대한 항체가 접합된 형태인 경우에 다음과 같이 질병의 진단 및 치료에 이용될 수 있다.

즉, (1) 전술된 양태의 다기능성 나노입자와 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한 약물의 표적 부위 전달용 조성물을 검체에 주입하는 단계; 및 (2) 검체로부터 상기 다기능성 나노입자에 의해 발산되는 신호를 감지하여 표적 부위를 확인하는 단계; 및 (3) 표적 부위에 근적외선을 조사시킴으로써 열을 발생시켜 표적 부위 에 존재하는 세포를 살상하고, 상기 약물의 방출을 촉진하여 표적 부위를 치료하는 단계를 포함한 질병의 진단 및 치료방법을 제공한다.

상기 진단 및 치료방법의 단계 (1)에서는 전술된 양태의 다기능성 나노입자와 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한 약물의 표적 부위 전달용 조성물을 검체에 주입한다. 이 때에도 예를 들면 혈액 또는 소변 검사와 같은 예비 검사를 통하여 검체의 질병 및 약물을 전달해야 할 부위(표적 부위)에 대한 정보를 입수한 상태이고, 이러한 정보를 기반으로 상기 다기능성 나노입자는 약물을 전달하고자 하는 세포에 존재하는 물질에 대한 항체를 구비하고 있지만, 표적 부위를 더욱 정확하게 확인하고 진단하는 것이 가능하다는 장점이 있다.

여기서, 단계 (1)을 거쳐 단계 (2)에서 종료된다면 질병의 진단만이 이루어진 것이며, 단계 (1) 및 (2)를 거쳐 단계 (3)까지 진행된다면 질병의 진단과 치료가 모두 이루어질 수 있다.

상기 진단방법에 있어서 다기능성 나노입자에 의해 발산되는 신호는 자기장을 이용하는 각종 장비들에 의해서 감지될 수 있는데 그러한 장치에는 자기공명영상 진단장치(MRI)가 포함될 것이다. 자기공명영상 진단장치는 강력한 자기장 속에 생체를 넣고 특정 주파수의 전파를 조사하여 생체조직에 있는 수소 등의 원자핵이 에너지를 흡수하여 에너지가 높은 상태로 만든 후 상기 전파를 중단하여 상기 수소 등의 원자핵 에너지가 방출되게 하고 이 에너지를 신호로 변환하여 컴퓨터로 처리하여 영상화한 장치이다. 자기 또는 전파는 골에 방해를 받지 않기 때문에 단단한 골 주위 또는 뇌나 골수의 종양에 대하여 종단, 횡단, 임의의 각도에서 선명한 입 체적인 단층상을 얻을 수 있다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1>

고분자 나노입자의 제조

A. PS 나노입자

PS 나노입자의 경우에는 100nm의 직경을 가지는 PS 비드(bead)를 Aldrich Chemicals Co.로부터 구입하여 이용하였다.

B. PLGA 나노입자

PLGA 나노입자의 경우에는 다음과 같이 제조하였다. 100㎎의 PLGA 50:50(분자량 5,000, Wako Chemicals Co.)을 10㎖의 클로로포름(Duksan Pure Chemicals Co.)에 용해하였고, 이 용액을 안정화제로서 폴리비닐 알코올(분자량 15,000~20,000)을 함유한 20㎖의 수상에 첨가하였다. 이 혼합물을 유기 및 연속상의 상호간 포화 후에 초음파기로 350W에서 10분 동안 유화시켰다. 이어서, 용매를 증발시키고 교반된(stirred) 여과 셀에서 세럼 교체(serum replacement)하고 10,000rpm에서 30분 동안의 원심분리를 3차례 반복하여 PLGA 나노입자를 수득하였다. 이렇게 얻은 PLGA 나노입자는 입도 분석기(direct light scattering analysis)로 분석한 결과, 평균 직경이 약 100nm인 것으로 확인되었다.

<실시예 2>

고분자 나노입자에 금박막 증착

실시예 1에서 얻은 PS 나노입자와 PLGA 나노입자를 각각 물에 용해하여 고분자 나노입자의 현탁액을 제조하였다. 스핀 코터에 피라나(pirana) 처리된 실리콘 기판을 위치시킨 후 이의 표면에 상기 현탁액을 뿌려서 고분자 나노입자가 균일하게 분포되도록 하였다. 그 다음 열증발증착기를 이용하여 고분자 나노입자 표면 일부에 금박막이 증착되도록 하였다. 이어서, 초음파(40kHz)를 5 내지 10분 정도 처리한 후 금이 증착된 고분자 나노입자를 기판에서 분리하였다.

이렇게 하여 수득한 금박막이 증착된 PS 나노입자를 FESEM(Field Emission Scanning Electron Microscopy)로 관찰한 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이 PS 나노입자 표면 일부에 금박막이 증착된 것을 확인할 수 있었다. 마찬가지로 앞서 얻은 PLGA 나노입자를 TEM으로 관찰한 결과, 도 2b에 나타낸 바와 같이 PLGA 나노입자 표면 일부에 금박막이 증착된 것을 알 수 있었다.

<실시예 3>

본 발명에 따른 금박막-나노입자의 흡수 스펙트럼 분석

실시예 2를 통하여 얻은 금박막-PS 나노입자 및 금박막-PLGA 나노입자에 대한 흡수 스펙트럼을 UV-Vis/NIR 분광계를 이용하여 분석하였다.

먼저, 실리카 나노입자 상에 부분적으로 금박막을 증착시키고 이를 대상으로 흡수 스펙트럼을 분석하였다. 도 3의 (a)에 나타낸 바와 같이 비대칭적인 기하학에도 불구하고, 실리카 금박막이 부분적으로 증착된 나노입자는 실리카 금박막이 전체 증착된 나노입자와 유사한 성향을 보여주었다. 특히, 금박막 두께를 변화시킴에 따라 흡수 피크가 이동하여 NIR 영역내로 조율될 수 있었다.

A. 금박막-PS 나노입자

도 3의 (b)에 나타낸 바와 같이 금박막-PS 나노입자는 상기 실리카 금박막이 부분적으로 증착된 나노입자와 같이 금박막의 두께에 따라 흡수 피크가 달라졌다. 금박막의 두께가 14nm 이상일 경우에는 피크의 위치가 짧은 파장으로 이동하는데 반하여 14nm 미만일 경우에는 긴 파장으로 이동하였다.

B. 금박막-PLGA 나노입자

다양한 금박막 두께를 가진 금박막-PLGA 나노입자에 대한 흡수 스펙트럼을 분석하고, 결과를 도 3의 (c)에 나타내었다. 흡수 피크는 NIR 영역에 위치하였지만, 이들의 피크 위치는 금박막의 두께를 변화시킴에 따라 크게 달라지지 않았다. 이러한 결과는 PLGA 나노입자가 약 22 내지 37의 높은 유전상수를 가지고 있기 때문일 것으로 추정되었다. 그러나, 도 3의 (c)는 NIR 광이 금박막-PLGA 나노입자에 의해 흡수되어 열 에너지로 전환될 수 있다는 것을 보여주는 것이다. PLGA 분해 속도는 온도에 따라 달라지고(Dunne, M. et al. Biomaterials, 2000, vol.21 P.1659), 금박막에서의 광열 전환은 PLGA의 분해 속도를 가속하여 결과적으로 약물 방출의 속도를 증가시킬 수 있다.

<실시예 4>

본 발명에 따른 항체가 접합된 금박막-PLGA 나노입자의 제조

금박막-PLGA 나노입자에 림프종 세포주인 H9를 표적할 수 있는 CD4 항체를 접합하였다. 구체적으로, 소듐 포스페이트 완충용액(pH 7.4)에 금박막-PLGA 나노입자와 항체를 첨가한 후 초음파를 사용하여 입자를 분산시키고, 입자를 안정화시키는데 기여하는 1% PEG(폴리에틸렌글리콜) 용액을 첨가한 후 4℃에서 하루 동안 정치시켰다. 이렇게 하여 금과 CD4 항체 티올 간의 공유 결합을 통하여 금박막에 CD4 항체를 접합시켰다. 이러한 접합 반응의 산물을 10,000rpm에서 3분간의 원심분리를 3차례 반복하여 항체가 접합되지 않은 금박막-PLGA 나노입자를 제거하였다.

이렇게 하여, 금박막에 항체가 결합되었는지 확인하기 위하여 앞서 수득한 항체-금박막-PLGA 나노입자를 소듐 포스페이트 완충용액(pH 7.4)으로 세정하고 SDS 샘플 완충용액으로 끓여주었다. 이렇게 얻은 산물을 10% SDS-PAGE로 분리하고 쿠마시 블루 용액으로 염색하여 밴드의 위치를 확인하였다. 분석 결과를 도 4a에 나타내었는데, 이로부터 금박막에 항체가 접합되었음을 확인할 수 있었다. 더 나아가, 항체가 접합된 다기능 나노입자에 대하여 흡수 스펙트럼을 분석한 결과, 항체가 접합되기 전의 흡수 스펙트럼과 거의 유사함을 알 수 있었다(도 4b 참조).

<실시예 5>

본 발명에 따른 항체가 접합된 다기능 나노입자의 표적지향성

실시예 4로부터 얻은 항체가 접합된 다기능 나노입자가 목적한 표적지향성을 보이는지 확인하기 위하여, CD4 분자를 발현하는 H9 세포(American Type Culture Collection)와 상기 항체가 접합된 다기능 나노입자를 30분 동안 정치시키고, FITC로 접합된 염소 항-마우스 Ig(BD Pharmingen)로 염색한 후 형광 현미경 AXIOVERT200(Carl Zeiss)으로 관찰하였다. 여기서 대조군으로서 CD4 분자를 발현하는 H9 세포 대신에 사람의 B세포주의 Ramos 세포를 이용하여 전술된 바와 동일한 절차를 진행하였다. 상기 현미경으로 관찰한 결과를 도 5a에 나타내었는데, 본 발명에 따른 다기능 나노입자는 CD4 분자를 발현하는 H9 세포에는 특이적으로 결합하는데 반하여(도 5a의 좌측 칼럼) CD4 분자를 발현하지 않는 Ramos 세포에는 결합하 지 않는 것을 확인할 수 있다(도 5a의 우측 칼럼).

더 나아가, FESEM으로 관찰한 결과, 도 5b에 나타낸 바와 같이 본 발명에 따른 다기능성 나노입자가 H9 세포에 특이적으로 결합하는 것을 확인할 수 있었다. EDX(Dispersive X-Ray) 분석을 통하여 도 5b에 나타낸 H9 세포에 결합된 대상이 본 발명의 다기능성 나노입자라는 것을 재차 확인할 수 있었다(도 5c 참조).

본 발명에 따른 다기능 나노입자는 항체에 의해 표적 부위로 집중될 수 있으며, 상기 표적 부위에 근적외선을 조사함으로써 금박막에 의해 열이 발생되어 표적 부위에 있는 세포들을 살상할 수 있고, 동시에 열은 고분자의 분해를 촉진해서 약물의 방출을 가속화시킴으로써 약물의 효능을 배가시킬 수 있다.

Claims

약물을 중심으로 하여 고분자가 코팅되어 고분자 나노입자가 형성되고, 상기 고분자 나노입자 표면의 일부에는 금박막이 증착되며, 상기 금박막에는 상기 약물을 전달하고자 하는 세포 표면에 발현된 물질에 대한 항체가 접합된 다기능성 나노입자.
제 1항에 있어서,

고분자는 폴리스티렌, 폴리에틸렌이민, 폴리포스파겐, 폴리락타이드, 폴리락티드-코-글리콜라이드, 폴리카프로락톤, 폴리안하이드라이드, 폴리말릭산 및 이의 유도체, 폴리알킬시아노아크릴레이트, 폴리하이드로옥시부틸레이트, 폴리카르보네이트 및 폴리오르소에스테르, 폴리에틸렌글리콜, 폴리-L-라이신, 폴리글리콜라이드, 폴리메틸메타아크릴레이트 및 폴리비닐피롤리돈으로 구성되는 군 및 이의 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 다기능성 나노입자.
제 1항에 있어서,

금박막은 고분자 나노입자의 전체 표면 중 10 내지 90%에 증착된 것을 특징으로 하는 다기능성 나노입자.
제 1항에 있어서,

금박막은 금 또는 백금 또는 이 둘의 합금으로 이루어진 것을 특징으로 하는 다기능성 나노입자.
제 1항에 있어서,

약물을 중심으로 하여 고분자가 코팅되어 고분자 나노입자가 형성되고, 상기 고분자 나노입자 표면의 일부에는 제 1 금박막이 증착되며, 상기 제 1 금박막 표면에는 자성물질의 박막이 증착되고, 상기 자성물질 박막 표면에는 제 2 금박막이 증착되며, 상기 제 2 금박막 표면에는 상기 약물을 전달하고자 하는 세포 표면에 발현된 물질에 대한 항체가 접합된 다기능성 나노입자.
제 5항에 있어서,

고분자는 폴리스티렌, 폴리에틸렌이민, 폴리포스파겐, 폴리락타이드, 폴리락티드-코-글리콜라이드, 폴리카프로락톤, 폴리안하이드라이드, 폴리말릭산 및 이의 유도체, 폴리알킬시아노아크릴레이트, 폴리하이드로옥시부틸레이트, 폴리카르보네이트 및 폴리오르소에스테르, 폴리에틸렌글리콜, 폴리-L-라이신, 폴리글리콜라이드, 폴리메틸메타아크릴레이트 및 폴리비닐피롤리돈으로 구성되는 군 및 이의 공중합체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 다기능성 나노입자.
제 5항에 있어서,

제 1 금박막은 고분자 나노입자의 전체 표면 중 10 내지 90%에 증착된 것을 특징으로 하는 다기능성 나노입자.
제 5항에 있어서,

제 1 금박막 및 제 2 금박막은 금 또는 백금 또는 이 둘의 합금으로 이루어진 것을 특징으로 하는 다기능성 나노입자.
제 5항에 있어서,

자성물질은 Co, Mn, Fe, Ni, Gd로 이루어진 그룹으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 다기능성 나노입자.
(1) 약물을 중심으로 하여 고분자를 코팅시켜 고분자 나노입자를 제조하는 단계; (2) 상기 고분자 나노입자 표면의 일부를 금박막으로 증착시키는 단계; (3) 상기 금박막에 상기 약물을 전달하고자 하는 세포 표면에 발현된 물질에 대한 항체를 접합시키는 단계; 및 (4) 고분자 나노입자 표면의 일부가 금박막으로 증착되고 항체가 접합된 나노입자를 분리하는 단계로 구성된 다기능성 나노입자의 제조방법.
제 10항에 있어서,

고분자는 폴리스티렌, 폴리에틸렌이민, 폴리포스파겐, 폴리락타이드, 폴리락티드-코-글리콜라이드, 폴리카프로락톤, 폴리안하이드라이드, 폴리말릭산 및 이의 유도체, 폴리알킬시아노아크릴레이트, 폴리하이드로옥시부틸레이트, 폴리카르보네이트 및 폴리오르소에스테르, 폴리에틸렌글리콜, 폴리-L-라이신, 폴리글리콜라이드, 폴리메틸메타아크릴레이트 및 폴리비닐피롤리돈으로 구성되는 군 및 이의 공중합체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 다기능성 나노입자의 제조방법.
제 10항에 있어서,

단계 (2)에서 금박막은 고분자 나노입자의 전체 표면 중 10 내지 90%에 증착시키는 것을 특징으로 하는 다기능성 나노입자의 제조방법.
제 10항에 있어서,

단계 (2)는 유리 또는 실리콘 기판 상에 고분자 나노입자를 균일하게 분포하고, 열증발증착기를 이용하여 상기 고분자 나노입자에 금박막을 증착시키는 것을 특징으로 하는 다기능성 나노입자의 제조방법.
제 13항에 있어서,

유리 또는 실리콘 기판은 피라나(pirana) 변형되어 친수성을 띄는 것을 특징을 하는 다기능성 나노입자의 제조방법.
제 10항에 있어서,

단계 (3)에서 금박막과 항체의 접합은 금 또는 백금과 항체에 있는 티올기 간의 공유결합에 의한 것을 특징으로 하는 다기능성 나노입자의 제조방법.
약물을 중심으로 하여 고분자가 코팅되어 고분자 나노입자가 형성되고, 상기 고분자 나노입자 표면의 일부에는 금박막이 증착되며, 상기 금박막에는 상기 약물을 전달하고자 하는 세포 표면에 발현된 물질에 대한 항체가 접합된 다기능성 나노입자 및 약제학적으로 허용된 담체를 포함한 약물의 표적 부위 전달용 조성물.
제 16항에 있어서,

상기 다기능성 나노입자는 약물을 중심으로 하여 고분자가 코팅되어 고분자 나노입자가 형성되고, 상기 고분자 나노입자 표면의 일부에는 제 1 금박막이 증착되며, 상기 제 1 금박막 표면에는 자성물질의 박막이 증착되고, 상기 자성물질 박막 표면에는 제 2 금박막이 증착되며, 상기 제 2 금박막 표면에는 상기 약물을 전달하고자 하는 세포 표면에 발현된 물질에 대한 항체가 접합된 것임을 특징으로 하는 약물의 표적 부위 전달용 조성물.
(1) 제 16항 또는 제 17항에 따른 약물의 표적 부위 전달용 조성물을 사람을 제외한 검체에 주입하는 단계; 및 (2) 표적 부위에 다기능성 나노입자를 집중시키는 단계 및 (3) 표적 부위에 근적외선을 조사시킴으로써 열을 발생시켜 표적 부위에 존재하는 세포를 살상하고, 상기 약물의 방출을 촉진하여 표적 부위에서 약물의 효능을 배가시키는 단계를 포함한 치료방법.
(1) 제 17항에 따른 약물의 표적 부위 전달용 조성물을 사람을 제외한 검체에 주입하는 단계; 및 (2) 검체로부터 상기 다기능성 나노입자에 의해 발산되는 신호를 감지하여 표적 부위를 확인하는 단계; 및 (3) 표적 부위에 근적외선을 조사시킴으로써 열을 발생시켜 표적 부위에 존재하는 세포를 살상하고, 상기 약물의 방출을 촉진하여 표적 부위를 치료하는 단계 선택적으로 살상하는 단계를 포함한 질병의 진단 및 치료방법.