WO2007040003A1 - 細胞内構造体の動態の観察方法および観察装置 - Google Patents

細胞内構造体の動態の観察方法および観察装置 Download PDF

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Wataru Watanabe
Sachihiro Matsunaga
Tomoko Shimada
Kiichi Fukui
Kazuyoshi Itoh
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Osaka University
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    • G01N21/6408—Fluorescence; Phosphorescence with measurement of decay time, time resolved fluorescence

Definitions

  • the present invention relates to a method of observing the dynamics of an arbitrary intracellular structure in a cell, in particular, a living cell, and an observation apparatus therefor.
  • fluorescent proteins have the property of converting the fluorescence emission wavelength by ultraviolet light irradiation.
  • This protein has a tripeptide structure (first form) consisting of histidine, tyrosine, and glycine represented by Formula I, and emits bright green fluorescence (excitation maximum 508 nm, fluorescence maximum 548 nm), but is irradiated with ultraviolet light.
  • the fluorescence conversion protein of the first form is excited by light having a wavelength of excitation maximum of 508 nm and emits fluorescence, but it has also been confirmed that the form is not converted by light in this wavelength region.
  • mitochondria are ellipsoids with a diameter of 0.5 / zm and a length of 1 ⁇ m, usually hundreds to thousands in one cell, and 15,000 in onion epidermis cells. These are included, and have functions such as energy production by repeating fusion and division.
  • Chromatin is a complex of DNA and protein existing in eukaryotic cells.
  • the Eukaryotic chromosomes have an aggregated structure during mitosis, but are decondensed in interphase cell nuclei and exist as chromatin fibers with a diameter of about 30 nm.
  • This 30nm chromatin fiber is a protein-histone wound with DNA! / On nucleosome force S-linker.
  • the lOnm chromatin fiber linked via the DNA part forms a helical structure.
  • the conventional method can photoactivate cells or cell nuclei with a size of 10 to 50 m, but intracellular structures with a size from 500 nm, such as 1 ⁇ m of mitochondria or The 2 m local chromatin region could not be photoactivated locally.
  • ultraviolet light having a short wavelength may damage a biological sample having high energy, and further, it does not reach the deep part of the sample, making it difficult to observe the sample in three dimensions. There was a problem.
  • Non-patent Document 3 R. Dixit et al. Have reported that active oxygen is generated by ultraviolet light irradiation when observing cells with a fluorescence microscope, and the cells are damaged (Non-patent Document 3). Y. Chen et al. Also used a one-photon excitation of fluorescence-converting proteins introduced into cells by ultraviolet light irradiation. It was confirmed that cells irradiated with ultraviolet light did not divide! / Non-patent document 4). Therefore, there is a need for a technique for photoactivating and converting a fluorescence conversion protein that does not damage living cells.
  • the blue light used for Dendora's photoactivity is less cytotoxic than the ultraviolet light that photoactivates other fluorescence converting proteins, but the blue light irradiation does not damage living cells. It is not clear whether fluorescence-converting proteins can be photoactivated and converted.
  • Two-photon excitation is a phenomenon in which a substance is excited and activated by absorbing two photons. Originally, a substance absorbs one photon by high-energy ultraviolet light irradiation and transitions to an excited state, but it irradiates light in a wavelength region having half the energy of ultraviolet light so as to have a high photon density. Then, the material absorbs two photons at the same time, and transitions to the same excited state as in the case of one-photon excitation.
  • Non-Patent Document 5 clearly states whether or not it is possible to locally photoactivate a specific intracellular structure in the cell.
  • Non-Patent Document 1 R. Ando, H. Hama, M. Yamamoto- Hino, H. Mizuno, and A. Miyawaki, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 12651-12656 (2002)
  • Non-Patent Document 2 S. Arimura, J. Yamamoto, G.P. Aida, M. Nakazono, and N. Tsutsumi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101, 7805-7808 (2004)
  • Non-Patent Document 3 R. Dixit and R. Cyr, "Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non—in nvasive fluorescence microscopy," Plant J. 36, 280-290 ( 2003)
  • Non-Patent Document 4 Y. Chen, PJ Macdonald, JP Skinner, GH Patterson, and JD Muller, "Probing nucleoxytoplasmic transport by two-photon activation of PA- GFP, Microscopy Research and Technique 69, 220-226 (2006)
  • Non-Patent Document 5 H. Tsutsui, S. Karasawa, H. bhimizu, N. Nukina, and A. Miyawaki, ⁇ Semi- rational engineering of a coral fluorescent protein into an efficient highlighter, "EMBO REPORTS 6, 233—238 (2005)
  • An object of the present invention is to fluorescently mark a plurality of intracellular structures in a living cell and to separate any part of the plurality of intracellular structures separately. It is to provide an observation method and an observation apparatus capable of tracking the spatio-temporal dynamics of a specific intracellular structure over a long period of time with high and three-dimensional spatial resolution by performing fluorescence marking. .
  • the fluorescence emission wavelength is converted by an external stimulus such as irradiation of ultraviolet light or blue light such as Kaeda dendra or irradiation of ultrashort light pulses in the visible region or infrared region.
  • an external stimulus such as irradiation of ultraviolet light or blue light such as Kaeda dendra or irradiation of ultrashort light pulses in the visible region or infrared region.
  • Fluorescence-converting proteins that can be converted into multiple intracellular structures, and then using a two-photon excitation type confocal laser microscope, the wavelength is longer than ultraviolet light or blue light, and the low-energy visible region or infrared region.
  • the form of the fluorescence conversion protein introduced into any intracellular structure is converted by collecting and irradiating the laser beam with a pulse width of femtoseconds.
  • the intracellular structure is composed of various organelles such as nucleus, mitochondria, chloroplast, peroxinome, Golgi, protein-DNA complex represented by chromatin, and protein complex.
  • the size of these intracellular structures is in the range of 500 ⁇ m force to 5 ⁇ m.
  • a method of expressing the fluorescence conversion protein in a specific intracellular structure using a gene recombination technique such as transformation, other methods such as E. coli, yeast, and insect cells In order to introduce the fluorescence conversion protein into the intracellular structure, a method of expressing the fluorescence conversion protein in a specific intracellular structure using a gene recombination technique such as transformation, other methods such as E. coli, yeast, and insect cells. And a method for introducing a fluorescence conversion protein prepared by a living organism using a protein introduction reagent or microinjection.
  • a plurality of intracellular structures into which fluorescence conversion proteins have been introduced in this way are visualized by a fluorescence microscope, and a part of the intracellular structures are selected, and only those partial intracellular structures are individually selected.
  • a fluorescence microscope By focusing and irradiating ultrashort light pulses in the visible region or infrared region, local fluorescence conversion of some of the intracellular structures is performed. Observe the dynamics of some intracellular structures that emit fluorescent light of different wavelengths by irradiation with ultrashort light pulses using a fluorescence microscope.
  • the present invention provides:
  • a method for fluorescence marking of intracellular structures comprising the step of converting only the first form of fluorescence conversion protein introduced into a plurality of arbitrary intracellular structures into the second form of fluorescence conversion protein;
  • the fluorescence conversion protein has the following formula:
  • the present invention also provides:
  • a method for observing the dynamics of an intracellular structure comprising the step of:
  • the fluorescence conversion protein has the following formula:
  • One or more arbitrary intracellular structures among the plurality of intracellular structures are focused and irradiated with an ultrashort light pulse in the visible region or the infrared region, and photoactivated by multiphoton absorption to be activated.
  • the focused irradiation means for converting only the first form of the fluorescence conversion protein introduced into the one or more arbitrary intracellular structures into the second form of the fluorescence conversion protein, the first form of fluorescence First excitation light irradiation means for irradiating the cells with excitation light having a first wavelength for exciting the conversion protein to emit fluorescence having a first fluorescence maximum wavelength;
  • Second excitation light irradiating means for irradiating the cell with excitation light having a second wavelength for exciting the fluorescence conversion protein of the second form to emit fluorescence having a second fluorescence maximum wavelength
  • First fluorescence detection means for detecting fluorescence having a first fluorescence maximum wavelength
  • a second fluorescence detection means for detecting fluorescence having a second fluorescence maximum wavelength; and a cell having fluorescence imaging means for analyzing the positional information of the detected fluorescence in the cell and creating a fluorescence image
  • the power of marking and observing a large number of unspecified intracellular structures in a cell According to the present invention, it becomes possible to individually mark only some of the intracellular structures.
  • FIG. 1 is a schematic diagram illustrating one-photon excitation by ultraviolet light irradiation.
  • FIG. 2 is a schematic diagram illustrating two-photon excitation by infrared light irradiation.
  • FIG. 3 is a schematic view of a two-photon excitation type confocal fluorescence microscope according to the present invention.
  • FIG. 4 is a schematic view of a part of a two-photon excitation type confocal fluorescence microscope according to the present invention.
  • FIG. 5 is a fluorescence image showing a single mitochondria fluorescently marked by the method of the present invention.
  • FIG. 6 is a fluorescence image showing the dynamics of a single mitochondria observed by the method of the present invention.
  • FIG. 7 is a fluorescence image showing the dynamics of a single chromatin region observed by the method of the present invention. Explanation of symbols
  • the excitation wavelength for causing multiphoton absorption depends on the one-photon absorption wavelength region of the fluorescence conversion protein to be used.
  • its one-photon absorption wavelength is 300 ⁇ ! Because it is in the ultraviolet region of ⁇ 600nm, in principle, 600 ⁇ !
  • Two-photon absorption can be caused by light irradiation in the wavelength region of ⁇ 1200nm, 900 ⁇ !
  • Three-photon absorption can be caused by light irradiation in the wavelength region of ⁇ 1800nm.
  • the lower limit is twice the shortest wavelength causing one-photon absorption, for example, 600 nm in the case of force.
  • the upper limit depends on the longest wavelength that causes one-photon absorption and the number of photons that cause an absorption phenomenon.
  • the confocal laser microscope has a very high resolution in the focal direction of about 0.1 ⁇ m.
  • the sample can be observed in three dimensions.
  • any intracellular structure in the cell in particular, a single intracellular structure is fluorescently marked, and its dynamics are observed in a spatio-temporal manner with high resolution for a long time. can do.
  • a first plurality of fluorescent substances having a first fluorescence maximum wavelength are emitted by irradiating an arbitrary plurality of intracellular structures in a cell with an ultrashort light pulse in a visible region or an infrared region. Fluorescence marking is performed with the fluorescence conversion protein of the first form by introducing a fluorescence conversion protein that converts the form having a second fluorescence maximum wavelength into a second form that emits fluorescence.
  • Arbitrary multiple intracellular structures are, for example, a specific type of subcellular organelle such as the nucleus, mitochondria, chloroplast, peroxisome, Golgi, etc., a protein-DNA complex represented by chromatin. It may be an intracellular structure such as a body or a protein complex, or it may be a variety of intracellular structures.
  • cells containing a plurality of intracellular structures fluorescently marked with the fluorescence conversion protein of the first form are held in a cell holding means such as an observation stage of a fluorescence microscope, and a cell such as an Ar + laser is Using the excitation light irradiation means, fluorescence having the first fluorescence maximum is emitted in the plurality of intracellular structures.
  • the fluorescence emission is observed with a fluorescence microscope, and the position of any part of the intracellular structures among the plurality of intracellular structures is specified.
  • an ultrashort light pulse in the visible region or the infrared region is individually focused and irradiated only on an arbitrary part of the plurality of intracellular structures
  • the fluorescence microscope used to convert the first form of fluorescence conversion protein introduced into some of these intracellular structures into the second form of fluorescence conversion protein is a two-photon excitation type fluorescence microscope. It is most preferable to use a two-photon excitation type confocal fluorescence microscope.
  • the visible region is 380 ⁇ ! ⁇
  • the wavelength region of 760nm refers to the wavelength region of 760nm or more.
  • the ultrashort light nors means a pulse having a time width on the order of femtoseconds (10 to 15 seconds), for example, a half width of the pulse of about 10 femtoseconds to several hundreds femtoseconds.
  • a focused irradiation means capable of oscillating such a pulse for example, a Ti 3+ : sapphire laser can be mentioned. If this laser is used, femtosecond pulses in the wavelength region of 600 nm to 1050 nm can be irradiated.
  • the wavelength of the laser can be appropriately converted using an optical parametric oscillator.
  • the second excitation light irradiation means such as a He-Ne laser is used to emit fluorescence having the second fluorescence maximum in the arbitrary partial intracellular structure.
  • a plurality of intracellular structures are fluorescently marked, and any part of them, in particular, only a single intracellular structure is separately fluorescently marked, so that a plurality of intracellular structures and their Any part of the intracellular structure can be visualized in a distinguishable manner. For example, if a plurality of mitochondria express a first form of a fluorescence conversion protein, and a single mitochondrial fluorescence conversion protein is converted into a second form of a fluorescence conversion protein, then multiple mitochondrial mitochondrions can A single mitochondria can be identified.
  • the fluorescence emitted from the intracellular structure containing the fluorescence conversion protein of the first form is detected by the first fluorescence detection means, and the strength of the intracellular structure containing the fluorescence conversion protein of the second form is emitted. Fluorescence is detected by the second fluorescence detection means.
  • fluorescence imaging means such as a computer
  • the emission wavelength, intensity, and three-dimensional position information of the fluorescence thus detected are analyzed, and a three-dimensional fluorescence image is synthesized and displayed. be able to.
  • a three-dimensional fluorescence image can be displayed two-dimensionally for a specific section of a cell.
  • the microscope used for converting the form of the fluorescence conversion protein introduced into the intracellular structure is most preferably a two-photon excitation type confocal fluorescence microscope.
  • a normal one-photon excitation type fluorescence microscope may be used.
  • two types of microscopes can be used properly for fluorescence marking of the intracellular structure and for observation of the intracellular structure, but the observation part is used in common for laser oscillation. By combining these optical systems, a microscope capable of both fluorescent marking and fluorescence observation can be produced.
  • Kaede was introduced into mitochondria in Tabacco BY-2 cells as a fluorescence converting protein capable of converting the fluorescence emission wavelength, and the behavior of single mitochondria was observed in living cells.
  • the method and apparatus of the present invention will be described.
  • the two-photon excitation type confocal fluorescence laser microscope 3 used in the present invention includes a confocal laser single microscope 30, a fluorescent substance excitation optical system 31 and a multiphoton excitation optical system 32.
  • a commercially available confocal laser microscope 30 can be used, such as a sample observation stage 301, an objective lens 302, a galvanometer mirror 303, a dichroic mirror 304, a lens 305, a pinhole 306, a dichroic mirror 307,
  • the band pass filter 308 and the photomultiplier tube 309 are configured.
  • the sample observation stage 301 can move in the plane direction (X-Y direction), and the objective lens 302 can move in the focal direction (Z direction).
  • the oscillation wavelength is 4 An 88 nm Ar + laser oscillator 311 and a He—Ne laser oscillator 312 with an oscillation wavelength of 543 nm were used.
  • the laser light also oscillated by these laser light source forces is incident on the objective lens 302 via the dichroic mirrors 313, 314 and 304 and further via the galvanometer mirror 303.
  • an ultrashort optical pulse oscillator 321 of Ti 3+ : Sapphire laser was used as the ultrashort optical pulse laser light source of the optical system 32 for multiphoton excitation.
  • the pulse laser oscillated from the ultrashort optical pulse oscillator 321 is also incident on the objective lens 302 via a specific optical system not shown in FIG. Figure 4 shows the specific optical system described above.
  • the pulse laser light oscillated from the ultrashort optical pulse oscillator 321 is expanded in pulse width by passing through a large number of optical components, so that the peak intensity is reduced at the condensing point and two-photon excitation is generated. Can not be. Therefore, pulse compression is performed by the dispersion compensation method. In this example, pulse compression was performed using the prism chirp optical system shown in FIG.
  • the pulse laser oscillated from the ultrashort optical Nors oscillator 321 first passes through an optical isolator 322 such as a Faraday isolator for blocking the return light.
  • the laser beam that has passed through the mirror 323 passes through the prism pair of the prisms 324a and 324b, is reflected by the mirror 325, and passes through the prism pair again, thereby negatively capping the pulse and expanding the pulse. To do.
  • This pulse-extended laser beam passes through mirror 323, lenses 326 and 327, neutral density one filter (ND filter) 328, and mirror 32 9, and then the Ar + laser oscillator 311 and He—Ne laser oscillator 312 are also oscillated.
  • the sample is pulse-compressed via the same optical system and irradiated onto the sample.
  • the fluorescence whose sample force is also emitted passes through the objective lens 302, the galvanometer mirror 303, the dichroic mirror 304, the condensing lens 305, the pinhole 306, the dichroic mirror 307, and the bandpass filters 308a and 308b. Finally, it is detected by the photomultiplier tubes 309a and 309b.
  • the light from the excitation light source is condensed into the sample by the objective lens.
  • the objective lens 302 is moved in the focal direction to scan the depth direction of the sample, and the sample observation stage 3 By scanning the plane of the sample by moving 01 and rotating the galvanometer mirror 303, and synthesizing the obtained data force, the shape and distribution of intracellular structures inside the sample are imaged three-dimensionally.
  • Ar + laser 311 (oscillation wavelength 488nm) and He-Ne laser 312 (oscillation wavelength 543nm) were irradiated to the mitochondria where the force of emitting green fluorescence was localized, and objective lens 302 was irradiated in the direction of the optical axis.
  • a depth of 0.5 ⁇ m a depth of 6 ⁇ m is scanned to obtain 13 confocal fluorescence images. Of these, 9 images are superimposed to create a three-dimensional composite fluorescence image.
  • Tobacco BY-2 cells in which mired were localized in mitochondria were placed on the observation stage of a microscope, and a three-dimensional synthetic fluorescence image was obtained in the same manner as described above. After that, a femtosecond laser with an energy of 0.08 njZ pulse was irradiated for 1 second (number of pulses: 7.6 X 10 7 ) to a rectangular region of ⁇ 2 centered on a single target mitochondria. A three-dimensional synthetic fluorescence image was obtained.
  • Example 2 Ultrashort light irradiation conditions for observation of dynamics of a single living mitochondria
  • a femtosecond laser pulse from a femtosecond Ti 3+ : sapphire laser oscillator 321 (center wavelength 750 nm, repetition rate 76 MHz, pulse width at the focal point of about 140 femtoseconds)
  • a 1 ⁇ m 2 rectangular area centered at the center was irradiated for 1-2 seconds.
  • the irradiation energy is in the range of 0.08-0.12njZ pulses.
  • the maple was able to undergo fluorescence conversion within a specific single living mitochondria, and it was possible to observe the dynamics.
  • Dendora is introduced as a fluorescence converting protein capable of converting the fluorescence emission wavelength into the nucleus of the human cultured cell HeLa and the dynamics of the chromatin in the chromatin region in living cells will be described.
  • Ar + laser 311 (oscillation wavelength 488 nm) and He-Ne laser 312 (oscillation wavelength 543 nm) were irradiated onto the chromatin region in the cell nucleus where the dendola emitting green fluorescence was localized. Scanning was performed at a depth of 0.5 m in the optical axis direction to scan a depth of 10 m, 20 confocal fluorescence images were acquired, and the images were superimposed to obtain a three-dimensional synthetic fluorescence image. At this time, as shown in FIG. 7A, the whole cell nucleus is emitting green light (gray part in the figure).
  • a femtosecond Ti 3+ : sapphire laser oscillator 321 (center wavelength 750 nm, repetition frequency 76 MHz, pulse width at the focal point of about 140 femtoseconds) in a circular chromatin region with a diameter of about 2 m as a target. Irradiate femtosecond laser pulse for 1 second. The irradiation position is indicated by the intersection of vertical and horizontal lines.

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Abstract

　生きた細胞内で、特定の細胞内構造体のうちの任意の細胞内構造体のみをマーキングし、高い三次元空間分解能でその時空間的な動態を長時間に渡って追尾することができる観察方法およびその観察装置を提供する。 　紫外光や可視領域または赤外領域の超短光パルス照射などの外部刺激により蛍光発光波長を変換することができる蛍光変換タンパク質を特定種類の細胞内構造体に導入し、そのうちの１または複数の任意の細胞内構造体のみに可視領域または赤外領域の超短光パルスを集光照射して多光子吸収を発生させて蛍光変換タンパク質の蛍光発光波長を変換し、異なった波長の蛍光を発光する任意の細胞内構造体の動態を蛍光顕微鏡で観察する。

Description

明 細 書
細胞内構造体の動態の観察方法および観察装置
技術分野
[0001] 本発明は、細胞内、特に、生きた細胞内で、任意の細胞内構造体を蛍光マーキン グし、その動態を観察する方法およびそのための観察装置に関する。
背景技術
[0002] 細胞生物学の研究分野では、生きた状態で細胞を観察するために蛍光標識による 可視化が行われている。生きた細胞を蛍光標識するために、蛍光タンパク質が用い られている。
従来、例えば、ォワンクラゲゃサンゴに由来する蛍光タンパク質により生体分子を 標識して可視化する技術が広く用いられているが、生体分子の定常状態を示す二次 元的な蛍光イメージしカゝ得られなカゝつた。
[0003] 近年、紫外光照射によって蛍光発光波長を変換する特性を有する蛍光タンパク質
(蛍光変換タンパク質）がヒュサンゴカゝら発見された。このタンパク質は、式 Iで示され るヒスチジン、チロシンおよびグリシン力 なるトリペプチド構造 (第 1の形態）を有し、 明るい緑色の蛍光 (励起極大 508nm、蛍光極大 548nm)を発光するが、紫外光照 射により光活性化されると、発色団を形成するヒスチジン残基のアルファ炭素原子と ァミノ基の窒素原子との間の共有結合が β脱離反応により切断されて式 IIで示される 構造 (第 2の形態）に変換され、赤色の蛍光 (励起極大 572nm、蛍光極大 582nm) を発光するようになる。紫外光照射で緑色力 赤色に変わるため、この蛍光変換タン パク質は Kaede (力ェデ）と命名された。
さらに、第 1の形態の蛍光変換タンパク質は、励起極大 508nmの波長の光で励起 され蛍光を発光するが、この波長領域の光では形態を変換しないことも確認されてい る。
[0004] [化 1]
Figure imgf000003_0001
[0005] 安藤らは、蛍光変換タンパク質力ェデを神経細胞に導入して緑色に発光させ、さら に単一の神経細胞のみを紫外光照射することによってカェデの形態を変換し、赤色 に発光させた。これにより、個々の神経細胞の輪郭を個別にトレースすることに成功 し、脳神経系組織内で長 、突起を伸ばして複雑に絡みあう神経細胞の空間的な関 係を明らかにした (非特許文献 1)。
[0006] 細胞内には、核、ミトコンドリア、葉緑体、ペルォキシノーム、ゴルジ体などの多種の 細胞内小器官、クロマチンに代表されるタンパク質と DNAの複合体、タンパク質の複 合体などの細胞内構造体が存在する。
例えば、ミトコンドリアは、直径 0. 5 /z m、長さ 1 μ mの長円体で、通常、 1つの細胞 内に数百個から数千個、タマネギ表皮細胞の場合には 1万 5千個以上も含まれてお り、融合および分裂を繰り返し、エネルギー産生等の機能を有している。
[0007] 有村らは、タマネギ表皮細胞内のミトコンドリアに力ェデを導入して緑色に発光させ 、紫外光照射することによって一部のミトコンドリアを赤色に発光させた。これにより、 緑色のミトコンドリアと赤色のミトコンドリアとが融合および分裂を繰り返し、 2時間以内 に約 1万 5千個のミトコンドリアが全て均一な黄色に変化することを確認し、ミトコンドリ ァが内容物を交換しあっていることを明らかにした (非特許文献 2)。
[0008] 1個の細胞内には数 10〜数 100種類の細胞内小器官が存在し、同一の細胞内小 器官であっても、核周辺や細胞膜外縁部などの細胞内の部位によって、機能が分化 し異なる役割を果たしていることが知られている。生きた細胞内での個々の細胞内小 器官の動態を時空間的に観察することは、細胞内小器官の機能分ィ匕ゃ細胞内情報 伝達のメカニズムを解明し、細胞の機能をより明確にすることができ、生きた細胞を用 いた医薬品の開発や評価にも有用である。
[0009] また、クロマチンは、真核細胞内に存在する DNAとタンパク質との複合体を意味す る。真核生物の染色体は、有糸分裂期には凝集した構造をとつているが、間期の細 胞核内では脱凝縮した状態となり、直径約 30nmのクロマチン繊維として存在する。 この 30nmクロマチン繊維は、タンパク質ヒストンに DNAが巻きつ!/ヽたヌクレオソーム 力 Sリンカ一 DNA部分を介して連結された lOnmクロマチン繊維がらせん構造を形成 したものである。
遺伝子の転写活性が活発な領域ではクロマチンの凝縮度が低ぐ DNAがほどけた 状態にあることが知られている。クロマチンの凝集度が低くなれば、クロマチンの動き が速くなるので、クロマチンの動態を観察することができれば、細胞内で、遺伝子発 現の状況を把握することができる。
[0010] 従来、蛍光変換タンパク質力ェデを導入した細胞を蛍光顕微鏡により観察し、カェ デの吸収波長領域（300nm〜600nm)にある 350nm〜420nmの紫外光または青 色光の照射によって力ェデの蛍光発光波長を変換していたが、紫外領域のレーザー 光を試料内部に集光すると、光強度に比例した一光子吸収が起こるため、焦点領域 以外でも光活性化させてしまい（図 1)、局所的な光活性ィ匕が不可能である。
すなわち、従来の方法では、 10 mから 50 mの大きさの細胞または細胞核全体 を光活性ィ匕することはできるが、 500nmから の大きさの細胞内構造体、例えば 、 1 μ mのミトコンドリアや 2 mの局所的クロマチン領域を局所的に光活性ィ匕すること ができなかった。
したがって、従来の方法では、細胞全体や不特定多数の細胞内構造体の総合的 な動態を観察することはできるが、生きた細胞内での任意の細胞内構造体の時空間 的な挙動を把握することができないため、細胞内小器官の機能分ィ匕ゃ細胞内情報 伝達のメカニズムの解明、遺伝子発現の状況の把握は困難であった。
[0011] また、波長が短い紫外光は、エネルギーが高ぐ生体試料に損傷を与える可能性 があり、さらに、試料の深部にまで到達しないため、試料の三次元的な観察が困難で ある等の問題があった。
R. Dixitらは、蛍光顕微鏡により細胞を観察する際の紫外光照射により、活性酸素 が生じて、細胞が損傷することを報告している（非特許文献 3)。また、 Y. Chenらは、 紫外光照射によって、細胞内に導入した蛍光変換タンパク質を一光子励起した場合 、紫外光照射された細胞は細胞分裂を行わな!/ヽこと確認した (非特許文献 4)。 したがって、生きた細胞に損傷を与えることなぐ蛍光変換タンパク質を光活性ィ匕し 、変換する技術が要求されている。
[0012] より近年、トゲトサカ属 (Dendronephthya)のソフトコーラルから、青色光（例えば、 48 8nm)の照射により、緑色の蛍光（励起極大 488nm、蛍光極大 505nm)を発光する 形態から赤色の蛍光 (励起極大 556nm、蛍光極大 575nm)を発光する形態に変換 する蛍光変換タンパク質が発見され、 Dendra (デンドラ）と命名された。
デンドラの光活性ィ匕に用いる青色光は、他の蛍光変換タンパク質を光活性化させ る紫外光よりも低い細胞毒性であるが、青色光照射により、生きた細胞に損傷を与え ることなく、蛍光変換タンパク質を光活性ィ匕し、変換できるか否かは明らかではない。
[0013] 筒井らは、細胞内に力ェデを導入し、細胞全体に含まれる力ェデを二光子励起し たことを報告して 、る (非特許文献 5)。
二光子励起とは、物質が二つの光子を吸収することにより励起し、活性化される現 象である。本来、高いエネルギーの紫外光照射により、物質は一つの光子を吸収し て励起状態に遷移するが、紫外光のエネルギーの半分のエネルギーを有する波長 領域の光を高い光子密度になるようにして照射すれば、物質は同時に二つの光子を 吸収して、一光子励起の場合と同じ励起状態に遷移する。
同時に二光子を吸収する確率は、入射光強度の 2乗に比例するため、照射した光 のエネルギーが集中する領域のみで二光子励起が誘起される。したがって、紫外光 照射による一光子励起と異なり、焦点領域以外の空間では光活性ィヒを起こさない。 すなわち、二光子励起の技術を適用すれば、集光点近傍では時間的および空間 的に高い光子密度になるので、集光点近傍のみで多光子吸収を発生させ、局所的 に光活性ィ匕することができる（図 2)。
また、波長が長い光、特に、赤外光は、エネルギーが低いため生体試料に損傷を 与えることなぐ散乱が少ないため試料の深部領域を照射することが可能である。 し力しながら、非特許文献 5には、細胞内の特定の細胞内構造体を局所的に光活 性ィ匕することができる力否かにっ 、ては明示されて ヽな 、。
[0014] したがって、依然として、生体試料に損傷を与えることなぐ任意の細胞内構造体の 時空間的な挙動を三次元的に把握しながら観察することができる方法は存在しない
[0015] 非特許文献 1 : R. Ando, H. Hama, M. Yamamoto- Hino, H. Mizuno, and A. Miyawaki , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 12651-12656 (2002)
非特許文献 2 : S. Arimura, J. Yamamoto, G.P. Aida, M. Nakazono, and N. Tsutsumi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101, 7805-7808 (2004)
非特許文献 3： R. Dixit and R. Cyr, "Cell damage and reactive oxygen species produ ction induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non— i nvasive fluorescence microscopy," Plant J. 36, 280-290 (2003)
非特許文献 4 : Y. Chen, P.J. Macdonald, J.P. Skinner, G.H. Patterson, and J.D. Mull er, "Probing nucleoxytoplasmic transport by two-photon activation of PA- GFP, Mi croscopy Research and Technique 69, 220-226 (2006)
非特許文献 5 : H. Tsutsui, S. Karasawa, H. bhimizu, N. Nukina, and A. Miyawaki,〃S emi- rational engineering of a coral fluorescent protein into an efficient highlighter," EMBO REPORTS 6, 233—238 (2005)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0016] 本発明の目的は、生きた細胞内で、複数の細胞内構造体を蛍光マーキングし、か つ、それら複数の細胞内構造体のうちの任意の一部の細胞内構造体を別個蛍光マ 一キングすることによって、高 、三次元空間分解能で特定の細胞内構造体の時空間 的な動態を長時間に渡って追尾することができる観察方法およびその観察装置を提 供することにある。
課題を解決するための手段
[0017] 本発明者らは、上記の目的の達成のため鋭意研究を進めた結果、力ェデに代表さ れる紫外光照射や可視領域または赤外領域の超短光パルス照射などの外部刺激に より蛍光発光波長を変換することができる蛍光変換タンパク質を細胞内構造体に導 入し、可視領域または赤外領域の超短光パルス照射で引き起こされる多光子吸収を 利用してこの蛍光変換タンパク質の蛍光発光波長を変換することによって、生きた細 胞内で、任意の細胞内構造体をマーキングし、可視化することに成功した。
[0018] 本発明によれば、まず、カェデゃデンドラのような紫外光または青色光の照射や可 視領域または赤外領域の超短光パルス照射などの外部刺激により蛍光発光波長を 変換することができる蛍光変換タンパク質を複数の細胞内構造体に導入し、ついで、 二光子励起型の共焦点レーザー顕微鏡を用いて、紫外光や青色光よりも波長が長く 低エネルギーの可視領域または赤外領域のレーザー光をフェムト秒のノ ルス幅で集 光照射することによって、任意の細胞内構造体に導入された蛍光変換タンパク質の 形態を変換する。
力べして、任意の細胞内構造体の時空間的な動態を長時間に渡って追尾すること ができる。
[0019] 本発明において、細胞内構造体は、核、ミトコンドリア、葉緑体、ペルォキシノーム、 ゴルジ体などの多種の細胞内小器官、クロマチンに代表されるタンパク質と DNAの 複合体、タンパク質の複合体などを含み、これらの細胞内構造体のサイズは、 500η m力ら 5 μ mの範囲にある。
蛍光変換タンパク質を細胞内構造体に導入するために、形質転換などの遺伝子組 換え技術を用いて特定の細胞内構造体内で蛍光変換タンパク質を発現させる方法、 大腸菌、酵母、昆虫細胞内などの他の生物で作成した蛍光変換タンパク質をタンパ ク質導入試薬やマイクロインジェクションで導入する方法などが挙げられる。
[0020] このようにして蛍光変換タンパク質を導入した複数の細胞内構造体を蛍光顕微鏡 により可視化し、任意の一部の細胞内構造体を選択し、それら一部の細胞内構造体 のみに個別に可視領域または赤外領域の超短光パルスを集光照射することによって 、それら一部の細胞内構造体の局所的な蛍光変換を行う。超短光パルスの照射によ り、異なった波長の蛍光を発光するようになった一部の細胞内構造体の動態を蛍光 顕微鏡で観察する。
[0021] より具体的には、本発明は、
(1)第 1の蛍光極大波長を有する蛍光を発光する第 1の形態から可視領域または 赤外領域の超短光パルスの集光照射により多光子吸収を起こして第 2の蛍光極大波 長を有する蛍光を発光する第 2の形態に変換する蛍光変換タンパク質を、第 1の形 態で、細胞内の複数の細胞内構造体に導入する工程；および
前記複数の細胞内構造体のうちの 1または複数の任意の細胞内構造体に、可視領 域または赤外領域の超短光パルスを集光照射することによって、細胞内で、前記 1ま たは複数の任意の細胞内構造体に導入された第 1の形態の蛍光変換タンパク質の みを第 2の形態の蛍光変換タンパク質に変換する工程を含む細胞内構造体の蛍光 マーキング方法；
(2)前記蛍光変換タンパク質が、次式：
[化 2]
Figure imgf000008_0001
で示されるトリペプチドィ匕合物であることを特徴とする（1)に記載の細胞内構造体の 蛍光マーキング方法；
(3)前記可視領域または赤外領域の超短光パルス力 600〜1050nmの波長領 域にあるフェムト秒パルスであることを特徴とする（1)に記載の細胞内構造体の蛍光 マーキング方法；
(4)前記 1または複数の任意の細胞内構造体がミトコンドリアであることを特徴とする (1)に記載の細胞内構造体の蛍光マーキング方法;および
(5)前記 1または複数の任意の細胞内構造体カ^ロマチンであることを特徴とする（ 1)に記載の細胞内構造体の蛍光マーキング方法を提供する。
また、本発明は、
(6)第 1の蛍光極大波長を有する蛍光を発光する第 1の形態から可視領域または 赤外領域の超短光パルスの集光照射により多光子吸収を起こして第 2の蛍光極大波 長を有する蛍光を発光する第 2の形態に変換する蛍光変換タンパク質が第 1の形態 で導入された第 1群の 1または複数の細胞内構造体と、前記蛍光変換タンパク質が 第 2の形態で導入された第 2群の 1または複数の細胞内構造体とを有する細胞に、第 1の形態の蛍光変換タンパク質を励起して第 1の蛍光極大波長を有する蛍光を発光 させるための第 1の波長を有する励起光を前記細胞に照射して、第 1の蛍光極大波 長を有する蛍光を検出すること、および、前記細胞に、第 2の形態の蛍光変換タンパ ク質を励起して第 2の蛍光極大波長を有する蛍光を発光させるための第 2の波長を 有する励起光を照射して、第 2の蛍光極大波長を有する蛍光を検出することを、同時 にまたは任意の順序で個別に実行する工程;および
前記検出された蛍光の細胞内の位置情報から、前記第 1群の 1または複数の細胞 内構造体および前記第 2群の 1または複数の細胞内構造体のうちいずれか 1または 双方の蛍光像を作成する工程を含む細胞内構造体の動態観察方法；
(7)前記蛍光変換タンパク質が、次式：
[化 3]
Figure imgf000009_0001
で示されるトリペプチドィ匕合物であることを特徴とする（6)に記載の細胞内構造体の 動態観察方法；
(8)前記可視領域または赤外領域の超短光パルス力 600〜1050nmの波長領 域にあるフェムト秒パルスであることを特徴とする（6)に記載の細胞内構造体の動態 観察方法;および
(9)前記第 2群の 1または複数の細胞内構造体がミトコンドリアであることを特徴とす る（6)に記載の細胞内構造体の動態観察方法；
(10)前記第 2群の 1または複数の細胞内構造体がクロマチンであることを特徴とす る（6)に記載の細胞内構造体の動態観察方法を提供する。
さらに、本発明は、
(11)第 1の蛍光極大波長を有する蛍光を発光する第 1の形態から可視領域または 赤外領域の超短光パルスの集光照射により多光子吸収を起こして第 2の蛍光極大波 長を有する蛍光を発光する第 2の形態に変換する蛍光変換タンパク質が第 1の形態 で導入された複数の細胞内構造体を有する細胞を保持する保持手段；
可視領域または赤外領域の超短光パルスを前記複数の細胞内構造体のうちの 1ま たは複数の任意の細胞内構造体に集光照射し、多光子吸収によって光活性化して 、細胞内で、前記 1または複数の任意の細胞内構造体に導入された第 1の形態の蛍 光変換タンパク質のみを第 2の形態の蛍光変換タンパク質に変換する集光照射手段 第 1の形態の蛍光変換タンパク質を励起して第 1の蛍光極大波長を有する蛍光を 発光させるための第 1の波長を有する励起光を前記細胞に照射する第 1の励起光照 射手段；
第 2の形態の蛍光変換タンパク質を励起して第 2の蛍光極大波長を有する蛍光を 発光させるための第 2の波長を有する励起光を前記細胞に照射する第 2の励起光照 射手段；
第 1の蛍光極大波長を有する蛍光を検出する第 1の蛍光検出手段；
第 2の蛍光極大波長を有する蛍光を検出する第 2の蛍光検出手段;および 前記検出された蛍光の細胞内の位置情報を解析して、蛍光像を作成する蛍光ィメ 一ジング手段を有する細胞内構造体の動態観察装置を提供する。
発明の効果
従来の方法では、細胞内の不特定多数の細胞内構造体をマーキングして観察して いた力 本発明により任意の一部の細胞内構造体のみを個別にマーキングすること が可能となった。
力べして、ミトコンドリアに代表される細胞内小器官の細胞内機能分ィ匕を初めて時空 間的に解析することができ、細胞内の新規シグナル伝達経路の発見や細胞内小器 官のクロストークの解明が可能となった。また、細胞内小器官の機能分ィ匕という新た な視点で疾患発症の細胞内メカニズムを明らかにし、医薬品の開発および評価に貢 献することができる。
さらに、クロマチンに代表されるタンパク質と DNAの複合体の凝縮度を観察するこ とが可能となり、遺伝子発現の実態を明らかにすることができる。 図面の簡単な説明
[0025] [図 1]紫外光照射による一光子励起を説明する概略図。
[図 2]赤外光照射による二光子励起を説明する概略図。
[図 3]本発明による二光子励起型の共焦点蛍光顕微鏡の概略図。
[図 4]本発明による二光子励起型の共焦点蛍光顕微鏡の一部の概略図。
[図 5]本発明の方法により蛍光マーキングされた単一ミトコンドリアを示す蛍光像。
[図 6]本発明の方法により観察された単一のミトコンドリアの動態を示す蛍光像。
[図 7]本発明の方法により観察された単一のクロマチン領域の動態を示す蛍光像。 符号の説明
[0026] 1 光子励起システム、
10···紫外光線、
11···対物レンズ、
12…試料、
13···光活性化領域、
2···二光子励起システム、
20···赤外光線、
21···対物レンズ、
22…試料、
23···光活性化領域、
3· ··二光子励起型の共焦点蛍光レーザー顕微鏡、
30· ··共焦点レーザー顕微鏡、
301···試料観察ステージ、
302···対物レンズ、
303·· 'ガルバノメーターミラー、
304· · 'ダイクロイツクミラー、
305···集光レンズ、
306···ピンホーノレ、
307· · 'ダイクロイツクミラー、 308· ··バンドパスフィルター、
309· ··光電子倍増管、
31·· •蛍光物質励起用光学系、
311· ••Ar+レーザー発振器、
312· • 'He— Neレーザー発振器、
313· • 'ダイクロイツクミラー、
314· • 'ダイクロイツクミラー、
32·· •多光子励起用光学系、
321· ··超短光パルス発振器、
322· ··光アイソレーター、
323· "ミラー、
324· "プリズム、
325· "ミラー、
326· "レンズ、
327· "レンズ、
328· ••NDフイノレター、
329· "ミラー。
発明を実施するための最良の形態
[0027] 本発明において、多光子吸収を起こすための励起波長は、用いる蛍光変換タンパ ク質の一光子吸収波長領域に依存する。例えば、蛍光変換タンパク質としてカェデ を用いる場合、その一光子吸収波長は 300ηπ！〜 600nmの紫外領域にあるため、原 理的に、 600ηπ！〜 1200nmの波長領域の光照射によって二光子吸収を起こすこと ができ、 900ηπ！〜 1800nmの波長領域の光照射によれば三光子吸収を起こすこと ができる。
すなわち、その下限は、一光子吸収を起こす最短波長の 2倍、例えば、力ェデの場 合には、 600nmとなる。一方、その上限は、一光子吸収を起こす最長波長および吸 収現象を起こすための光子数に依存する。
[0028] さらに、共焦点レーザー顕微鏡は、焦点方向の分解能が 0.1 μ m程度と非常に高 ぐ 3次元的に試料を観察することができる。
力べして、本発明の方法によれば、細胞内の任意の細胞内構造体、特に、単一の 細胞内構造体を蛍光マーキングし、その動態を長時間、高い分解能で時空間的に 観察することができる。
[0029] 本発明において、細胞内で、任意の複数の細胞内構造体に、可視領域または赤外 領域の超短光パルス照射によって、第 1の蛍光極大波長を有する蛍光を発光する第 1の形態から第 2の蛍光極大波長を有する蛍光を発光する第 2の形態に変換する蛍 光変換タンパク質を導入することによって、第 1の形態の蛍光変換タンパク質で蛍光 マーキングする。
任意の複数の細胞内構造体は、例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体、ペルォキシソ ーム、ゴルジ体などの特定の一種類の細胞内小器官、クロマチンに代表されるタンパ ク質と DNAの複合体、タンパク質の複合体などの細胞内構造体であってもよぐまた は、多種の細胞内構造体であってもよい。
このように第 1の形態の蛍光変換タンパク質で蛍光マーキングした複数の細胞内構 造体を含む細胞を、蛍光顕微鏡の観察ステージのごとき細胞保持手段に保持し、 Ar +レーザーのごとき、第 1の励起光照射手段を用いて、前記複数の細胞内構造体に おいて第 1の蛍光極大を有する蛍光を発光させる。この蛍光発光を蛍光顕微鏡によ り観察し、これらの複数の細胞内構造体のうち、任意の一部の細胞内構造体の位置 を特定する。
[0030] 本発明にお 、て、可視領域または赤外領域の超短光パルスを複数の細胞内構造 体のうちの任意の一部の細胞内構造体にのみ個別に集光照射して、これら一部の細 胞内構造体に導入した第 1の形態の蛍光変換タンパク質を第 2の形態の蛍光変換タ ンパク質に変換するために用いる蛍光顕微鏡は、二光子励起型の蛍光顕微鏡であ ることが好ましぐ二光子励起型の共焦点蛍光顕微鏡であることが最も好ましい。
[0031] 本発明において、可視領域とは 380ηπ！〜 760nmの波長領域、赤外領域とは 760 nm以上の波長領域をいう。また、超短光ノルスとは、フェムト秒（10_15秒)オーダー の時間幅、例えば、パルスの半値幅が約 10フェムト秒〜数百フェムト秒の時間幅を 有するパルスを意味する。 このようなパルスを発振することができる集光照射手段として、例えば、 Ti3+ :サファ ィァレーザーが挙げられる。このレーザーを用いれば、 600nm〜1050nmの波長領 域のフェムト秒パルスを照射することができる。また、光パラメトリック発振器を用いて、 レーザーの波長を適宜変換することができる。
さらに、 目的とする波長領域に応じて、その他のレーザーを適宜選択して用いること ができる。
[0032] 上記の方法および手段により、細胞内で、任意の特定の細胞内構造体に導入され た蛍光変換タンパク質のみが多光子吸収により光活性化され、その形態を変換する
[0033] その後、 He— Neレーザーのごとき、第 2の励起光照射手段を用いて、前記任意の 一部の細胞内構造体において第 2の蛍光極大を有する蛍光を発光させる。
力べして、複数の細胞内構造体を蛍光マーキングし、かつ、そのうちの任意の一部 、特に、単一の細胞内構造体のみを別途蛍光マーキングして、複数の細胞内構造体 とそのうちの任意の一部の細胞内構造体とを識別可能に視覚化することができる。 例えば、複数のミトコンドリアで第 1の形態の蛍光変換タンパク質を発現させ、そのう ちの単一のミトコンドリアの蛍光変換タンパク質を第 2の形態の蛍光変換タンパク質に 変換すれば、細胞内で複数のミトコンドリアのうち単一のミトコンドリアを識別すること ができる。
[0034] 第 1の形態の蛍光変換タンパク質を含む細胞内構造体から発光される蛍光を第 1 の蛍光検出手段によって検出し、第 2の形態の蛍光変換タンパク質を含む細胞内構 造体力 発光される蛍光を第 2の蛍光検出手段によって検出する。
これらの工程は、同時に実行することもできるし、いずれかの順序で別々に実行す ることちでさる。
[0035] コンピュータのごとき蛍光イメージング手段を用いて、このようにして検出された蛍光 の発光波長、強度、三次元的な位置情報を解析して、三次元的な蛍光像を合成して 表示することができる。
また、蛍光の三次元的な位置情報から、蛍光マーキングした特定の細胞内構造体 の動態を観察し、例えば、その移動範囲、移動距離、移動速度などを明確にすること ができる。
三次元的な蛍光像は、細胞の特定の断面について、二次元的に表示することを可 能である。
[0036] 細胞内構造体に導入された蛍光変換タンパク質の形態を変換するために用いる顕 微鏡は、上記したように、二光子励起型の共焦点蛍光顕微鏡であることが最も好まし いが、一旦、蛍光マーキングが完了した細胞内構造体を観察するには、通常の一光 子励起型の蛍光顕微鏡を用いればよい。本発明において、細胞内構造体を蛍光マ 一キングするときと、細胞内構造体の観察するときとで、二種類の顕微鏡を使い分け ることができるが、観察部を共通とし、レーザー発振のための光学系を組み合わせる ことによって、蛍光マーキングおよび蛍光観察の双方を可能とする顕微鏡を作製する ことができる。
実施例
[0037] 実施例 1 :単一のミトコンドリアの動態観察
以下、蛍光発光波長を変換することができる蛍光変換タンパク質としてカェデをタ バコ BY— 2細胞内のミトコンドリアに導入し、生きた細胞内で単一のミトコンドリアの動 態を観察した実験例を用いて、本発明の方法および装置を説明する。
[0038] 通常の形質転換技術により、力ェデを発現するプラスミド DNAをタバコ BY— 2細胞 に導入することによって、力ェデをミトコンドリア内に局在させたタバコ BY— 2細胞を 得た。この細胞を、図 3および 4に示す二光子励起型の共焦点蛍光レーザー顕微鏡 の観察ステージに搭載する。
[0039] 本発明で用いる二光子励起型の共焦点蛍光レーザー顕微鏡 3は、共焦点レーザ 一顕微鏡 30、蛍光物質励起用光学系 31および多光子励起用光学系 32を含む。 共焦点レーザー顕微鏡 30は、市販のものを使用することができ、試料観察ステー ジ 301、対物レンズ 302、ガルバノメーターミラー 303、ダイクロイツクミラー 304、レン ズ 305、ピンホール 306、ダイクロイツクミラー 307、バンドパスフィルター 308および 光電子倍増管 309等カゝら構成される。試料観察ステージ 301は、平面方向 (X— Y方 向）に移動可能であり、対物レンズ 302は焦点方向（Z方向）に移動可能である。 本発明において、蛍光物質励起用光学系 31のレーザー光源として、発振波長が 4 88nmの Ar+レーザー発振器 311および発振波長が 543nmの He—Neレーザー発 振器 312を用いた。これらのレーザー光源力も発振されたレーザー光は、ダイクロイ ックミラー 313、 314および 304を経由し、さらに、ガルバノメーターミラー 303を経由 して対物レンズ 302に入射される。
[0040] 同様に、多光子励起用光学系 32の超短光パルスレーザー光源として、 Ti3+ :サフ アイアレーザ一の超短光パルス発振器 321を用いた。超短光パルス発振器 321から 発振されたパルスレーザーも、図 3には図示されない特定の光学系を経由して、対物 レンズ 302に入射される。上記の特定の光学系を図 4に示す。
超短光パルス発振器 321から発振されたパルスレーザー光は、多数の光学部品を 通過することによってパルス幅が拡張されるため、集光点ではピーク強度が低下して 、二光子励起を発生させることができなくなる。そこで、分散補償法により、パルス圧 縮を行う。この実施例において、図 4に示すプリズムチヤープ光学系を用いてパルス 圧縮を行った。
超短光ノルス発振器 321から発振されたパルスレーザーは、まず、戻り光を阻止す るためのファラデーアイソレーターのごとき光アイソレーター 322を通過する。通過し たレーザー光はミラー 323を経由して、プリズム 324a, 324bのプリズム対を通過し、ミ ラー 325で反射され、再度プリズム対を通過することによってパルスに負のチヤープ をかけ、パルスを拡張する。このパルス拡張されたレーザー光は、ミラー 323、レンズ 326,327、ニュートラルデンシティ一フィルター（NDフィルター） 328およびミラー 32 9を経由し、その後、 Ar+レーザー発振器 311および He— Neレーザー発振器 312 力も発振されたレーザーと同じ光学系を経由して、パルス圧縮され、試料に照射され る。
[0041] 一方、試料力も発光された蛍光は、対物レンズ 302、ガルバノメーターミラー 303、 ダイクロイツクミラー 304、集光レンズ 305、ピンホール 306、ダイクロイツクミラー 307 およびバンドパスフィルター 308a, 308bを通り、最終的に光電子倍増管 309a,309b によって検出される。
[0042] 励起光源からの光は、対物レンズにより試料内部に集光される力 対物レンズ 302 を焦点方向に移動させることによって試料の深さ方向を走査し、試料観察ステージ 3 01の移動およびガルバノメーターミラー 303の回転によって試料の平面内を走査し、 得られたデータ力 合成することによって、試料内部の細胞内構造体の形状、分布 を三次元的に画像ィ匕する。
[0043] 緑色の蛍光を発光する力ェデを局在させたミトコンドリアに Ar+レーザー 311 (発振 波長 488nm)および He— Neレーザー 312 (発振波長 543nm)を照射し、対物レン ズ 302を光軸方向に 0. 5 μ mステップで移動させることによって 6 μ mの深さを走査 し、 13枚の共焦点蛍光像を取得し、このうち 9枚の画像を重ね合わせて三次元の合 成蛍光像を得た。
この時点では、図 5Aの固定細胞に示すごとぐ全てのミトコンドリアは緑色（図中、 白色部分）に発光している。この状態で、標的とする単一のミトコンドリア (矢印で示す )の位置を特定する。フェムト秒 Ti3+：サファイアレーザー発振器 321 (中心波長 750 nm、繰り返し周波数 76MHz、集光点でのパルス幅約 140フェムト秒、 0. 05njZパ ルス）からフェムト秒レーザーパルスをこの単一ミトコンドリアを中心とする 1 μ m2の矩 形領域に 1. 1秒間照射する。測定の精度から、パルス幅には 10フェムト秒程度の誤 差があり、「約 140フェムト秒」とは、 135〜145フェムト秒の時間領域を意味する。 パルスレーザー照射後、再度、蛍光像を取得すると、図 5Bに示すごとぐ特定の単 一ミトコンドリアのみが赤色（図中、黒色部分）に発光していた。
これにより、本発明の方法によって、細胞内で単一の細胞内小器官をマーキングで きることが示された。
[0044] 次に、超短光パルス照射後、時間経過による蛍光像を取得し、単一ミトコンドリアの 動態観察を行った。
力ェデをミトコンドリア内に局在させたタバコ BY— 2細胞を顕微鏡の観察ステージ 上に設置し、上記同様にして三次元の合成蛍光像を得た。その後、標的とする単一 のミトコンドリアを中心とする Ι πι2の矩形領域にエネルギーが 0. 08njZパルスのフ ェムト秒レーザーを 1秒間（パルス数：7. 6 X 107)照射し、同様に 3次元の合成蛍光 像を得た。
その後、超短光照射 300分後まで 30分間隔で三次元の合成蛍光像を取得した（ 図 6)。 [0045] 図 6から分力るように、標的となる単一の生きたミトコンドリア（図中、黒色部分）は細 胞内で三次元的に広い範囲を移動し、その平均移動速度は、 0. 18 mZ分である と測定された。
[0046] 実施例 2 :単一の生きたミトコンドリアの動態観察のための超短光照射条件
タバコ BY— 2細胞内のミトコンドリアに導入した力ェデを蛍光変換するための光照 射条件を調べた。
実施例 1と同様に、フェムト秒 Ti3+ :サファイアレーザー発振器 321 (中心波長 750 nm、繰り返し周波数 76MHz、集光点でのパルス幅約 140フェムト秒）からフェムト秒 レーザーパルスを特定の単一ミトコンドリアを中心とする 1 μ m2の矩形領域に 1〜2秒 間照射した。このとき、照射エネルギーは 0. 08-0. 12njZパルスの範囲にある。 上記の照射エネルギー範囲にあるとき、特定の単一の生きたミトコンドリア内でカェ デは蛍光変換を起こし、動態観察することが可能であった。
し力しながら、この照射エネルギー範囲を下回ったとき、蛍光変換は起こらず、動態 観察が不可能であった。一方、この照射エネルギー範囲を超えたとき、ミトコンドリア に褪色または損傷が発生し、動態観察が不可能であった。
[0047] 実施例 3 :クロマチンの動態観察
以下、蛍光発光波長を変換することができる蛍光変換タンパク質としてデンドラをヒ ト培養細胞 HeLaの細胞核に導入し、生きた細胞内でクロマチン領域内のクロマチン の動態を観察した実験例を説明する。
[0048] 通常の形質転換技術により、蛍光変換タンパク質デンドラを発現するプラスミド DN Aをヒト培養細胞 HeLaの細胞核（直径約 10 m)に導入することによって、デンドラ を細胞核内に局在させた HeLa細胞を得た。この細胞を、図 3および 4に示す二光子 励起型の共焦点蛍光レーザー顕微鏡の観察ステージに搭載する。
[0049] 緑色の蛍光を発光するデンドラを局在させた細胞核内のクロマチン領域に Ar+レー ザ一 311 (発振波長 488nm)および He—Neレーザー 312 (発振波長 543nm)を照 射し、対物レンズ 302を光軸方向に 0. 5 mステップで移動させることによって 10 mの深さを走査し、 20枚の共焦点蛍光像を取得し、画像を重ね合わせて三次元の 合成蛍光像を得た。 この時点では、図 7Aに示すごとぐ細胞核全体が緑色（図中、灰色部分）に発光し ている。この状態で、標的とする直径約 2 mの円形のクロマチン領域に、フェムト秒 Ti3+ :サファイアレーザー発振器 321 (中心波長 750nm、繰り返し周波数 76MHz、 集光点でのパルス幅約 140フェムト秒）からフェムト秒レーザーパルスを 1秒間照射 する。照射位置を縦横の線の交点で示す。
パルスレーザー照射後、再度、蛍光像を取得すると、図 7Bに示すごとぐ特定の微 小領域のクロマチンのみが赤色（図中、白色部分）に発光していた。
これにより、本発明の方法によって、生きた細胞核内で限定された微小領域に局在 するクロマチンのみをマーキングできることが示された。
産業上の利用可能性
本発明の方法および装置を用いれば、生きた細胞内で単一の細胞内構造体の動 態を長時間、高い時空間分解能で観察を行うことができるので、細胞内の新規シグ ナル伝達経路の発見や細胞内小器官のクロストークの解明、遺伝子発現の状態の 観察が可能となり、さらに、細胞内小器官の機能分ィ匕という新たな視点で疾患発症の 細胞内メカニズムを明らかにし、医薬品の開発および評価に貢献することができる。

Claims

請求の範囲
[1] 第 1の蛍光極大波長を有する蛍光を発光する第 1の形態から可視領域または赤外 領域の超短光パルスの集光照射により多光子吸収を起こして第 2の蛍光極大波長を 有する蛍光を発光する第 2の形態に変換する蛍光変換タンパク質を、第 1の形態で、 細胞内の複数の細胞内構造体に導入する工程;および
前記複数の細胞内構造体のうちの 1または複数の任意の細胞内構造体に、可視領 域または赤外領域の超短光パルスを集光照射することによって、細胞内で、前記 1ま たは複数の任意の細胞内構造体に導入された第 1の形態の蛍光変換タンパク質の みを第 2の形態の蛍光変換タンパク質に変換する工程を含む細胞内構造体の蛍光 マーキング方法。
[2] 前記蛍光変換タンパク質が、次式：
[化 1]
Figure imgf000020_0001
で示されるトリペプチドィ匕合物であることを特徴とする請求項 1に記載の細胞内構造 体の蛍光マーキング方法。
[3] 前記可視領域または赤外領域の超短光パルス力 600〜1050nmの波長領域に あるフェムト秒パルスであることを特徴とする請求項 1に記載の細胞内構造体の蛍光 マーキング方法。
[4] 前記 1または複数の任意の細胞内構造体がミトコンドリアであることを特徴とする請 求項 1に記載の細胞内構造体の蛍光マーキング方法。
[5] 前記 1または複数の任意の細胞内構造体カ^ロマチンであることを特徴とする請求 項 1に記載の細胞内構造体の蛍光マーキング方法。
[6] 第 1の蛍光極大波長を有する蛍光を発光する第 1の形態から可視領域または赤外 領域の超短光パルスの集光照射により多光子吸収を起こして第 2の蛍光極大波長を 有する蛍光を発光する第 2の形態に変換する蛍光変換タンパク質が第 1の形態で導 入された第 1群の 1または複数の細胞内構造体と、前記蛍光変換タンパク質が第 2の 形態で導入された第 2群の 1または複数の細胞内構造体とを有する細胞に、第 1の形 態の蛍光変換タンパク質を励起して第 1の蛍光極大波長を有する蛍光を発光させる ための第 1の波長を有する励起光を照射して、第 1の蛍光極大波長を有する蛍光を 検出すること、および、前記細胞に、第 2の形態の蛍光変換タンパク質を励起して第 2の蛍光極大波長を有する蛍光を発光させるための第 2の波長を有する励起光を照 射して、第 2の蛍光極大波長を有する蛍光を検出することを、同時にまたは任意の順 序で個別に実行する工程；および
前記検出された蛍光の細胞内の位置情報から、前記第 1群の 1または複数の細胞 内構造体および前記第 2群の 1または複数の細胞内構造体のうちいずれか 1または 双方の蛍光像を作成する工程を含む細胞内構造体の動態観察方法。
[7] 前記蛍光変換タンパク質が、次式：
[化 2]
Figure imgf000021_0001
で示されるトリペプチドィ匕合物であることを特徴とする請求項 6に記載の細胞内構造 体の動態観察方法。
[8] 前記可視領域または赤外領域の超短光パルス力 600〜1050nmの波長領域に あるフェムト秒パルスであることを特徴とする請求項 6に記載の細胞内構造体の動態 観察方法。
[9] 前記第 2群の 1または複数の細胞内構造体がミトコンドリアであることを特徴とする請 求項 6に記載の細胞内構造体の動態観察方法。
[10] 前記第 2群の 1または複数の細胞内構造体力 Sクロマチンであることを特徴とする請 求項 6に記載の細胞内構造体の動態観察方法。 第 1の蛍光極大波長を有する蛍光を発光する第 1の形態から可視領域または赤外 領域の超短光パルスの集光照射により多光子吸収を起こして第 2の蛍光極大波長を 有する蛍光を発光する第 2の形態に変換する蛍光変換タンパク質が第 1の形態で導 入された複数の細胞内構造体を有する細胞を保持する保持手段；
可視領域または赤外領域の超短光パルスを前記複数の細胞内構造体のうちの 1ま たは複数の任意の細胞内構造体に集光照射し、多光子吸収によって光活性化して 、細胞内で、前記 1または複数の任意の細胞内構造体に導入された第 1の形態の蛍 光変換タンパク質のみを第 2の形態の蛍光変換タンパク質に変換する集光照射手段 第 1の形態の蛍光変換タンパク質を励起して第 1の蛍光極大波長を有する蛍光を 発光させるための第 1の波長を有する励起光を前記細胞に照射する第 1の励起光照 射手段；
第 2の形態の蛍光変換タンパク質を励起して第 2の蛍光極大波長を有する蛍光を 発光させるための第 2の波長を有する励起光を前記細胞に照射する第 2の励起光照 射手段；
第 1の蛍光極大波長を有する蛍光を検出する第 1の蛍光検出手段；
第 2の蛍光極大波長を有する蛍光を検出する第 2の蛍光検出手段;および 前記検出された蛍光の細胞内の位置情報を解析して、蛍光像を作成する蛍光ィメ 一ジング手段を有する細胞内構造体の動態観察装置。
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