CN115901711B - 一种基于三光子荧光显微术表征叶绿体三维结构信息的方法 - Google Patents
一种基于三光子荧光显微术表征叶绿体三维结构信息的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115901711B CN115901711B CN202310013337.5A CN202310013337A CN115901711B CN 115901711 B CN115901711 B CN 115901711B CN 202310013337 A CN202310013337 A CN 202310013337A CN 115901711 B CN115901711 B CN 115901711B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- photon fluorescence
- chloroplast
- cell
- chloroplasts
- photon
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
本发明公开了一种基于三光子荧光显微术表征叶绿体三维结构信息的方法。本发明首先采用抽真空的方式，将细胞壁染料标记到叶片细胞的细胞壁上；然后将上述叶片固定在三光子荧光显微镜的载物台上，采用飞秒激光激发，分别对叶绿体和细胞壁进行三光子荧光成像，获取叶片中同一区域的叶绿体和细胞壁的三光子层析成像图；最后对获取的植物叶片三维层扫图进行三维重建分析，提取叶片中叶绿体的单个体积、表面积、个数、总体积占细胞体积之比，总表面积与细胞表面积之比以及时空分布动态等结构表型信息。本发明采用三光子荧光显微术，利用叶绿素的三光子荧光特性，实现了较高通量下表征叶片原位叶绿体三维结构分布特征，对解析植物的光合生理过程具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于应用光学的生物荧光成像技术领域，具体涉及一种利用三光子荧光显微术对叶绿体三维层析成像进行叶绿体三维结构表征的方法。
背景技术
三光子荧光显微术具有亚微米量级的空间分辨率，且成像深度大，层析效果好。一方面，由于三光子荧光显微术通常采用近红外光激发，在生物组织中具有更低的散射，激发光波长越长，抗生物组织的散射能力越强，穿透深度也越大。另一方面，三光子荧光为近似五阶非线性光学效应，荧光信号高度局限于聚焦光斑处，因此三光子荧光显微术在生物组织中具有极佳的信号背景比和高的空间分辨率。目前，三光子荧光显微术已经在活体动物脑成像、动物器官成像中实现了高空间分辨、极大深度的成像。
植物细胞中，叶绿体形态结构和空间分布直接决定了植物碳同化速率，并能随环境变化动态调整，从而改变光合和光保护策略。因此，叶绿体的结构表型是植物生理研究和育种中重要的特性。然而，现有的多种基于光谱技术的叶片叶绿素表征方法仅能计算叶绿素含量，无法对叶绿体结构和分布进行测量。另一方面，透射电镜和扫描电镜技术虽然能实现叶绿体三维结构的重建，但这些方法具有制样繁琐，成像深度局限等缺点。所以，开发一种具有高通量、可原位测量植物细胞叶绿体三维结构表型的方法对于后续植物光合生理研究和以叶绿体结构表型为目标的现代育种具有重要意义。
发明内容
针对目前技术的不足，本发明提供了一种基于三光子荧光显微术表征叶绿体三维结构信息的方法。本发明可以实现完整叶片的叶绿体三维成像，进而提取叶绿体的体积、密度以及空间分布等信息。
一种基于三光子荧光显微术表征叶绿体三维结构信息的方法，包括如下步骤：
(1)采用抽真空的方式，将细胞壁染料标记到叶片细胞的细胞壁上；
(2)将上述叶片固定在三光子荧光显微镜的载物台上，采用飞秒激光激发，分别对叶绿体和细胞壁进行三光子荧光成像，获取叶片中同一区域的叶绿体和细胞壁的三光子层析成像图；
(3)对获取的植物叶片三维层扫图进行三维重建分析，提取叶片中叶绿体的单个体积、表面积、个数、总体积占细胞体积之比，总表面积与细胞表面积之比以及时空分布动态等结构表型信息。
所述的叶绿体三光子荧光成像基于叶绿素的三光子吸收，采用1600nm飞秒激光激发三光子荧光，标记细胞壁的染料采用碘化丙啶染料，采用1600nm飞秒激光激发三光子荧光。
所述的抽真空的方式包含如下步骤：
(1)在密封盖上钻有小孔的离心管中，装入碘化丙啶染料的重水溶液；
(2)将叶片从植株上摘下，用剪刀将叶子剪成小片，装入上述离心管中，此时叶片半浮在液面上；
(3)将装有叶片的离心管放入真空釜中，在真空泵的抽气下形成真空，静置3分钟，此时重水溶液中的气泡开始渗出，并伴随叶片下沉；
(4)拔开真空阀，释放真空釜中的负压，摇晃离心管使液体中的气泡溢出；重复抽气-静置-恢复过程3-4次，直到叶片完全下沉且再次抽气时无更多气泡溢出。
所述的三光子荧光显微镜包含重频1MHz的飞秒脉冲激光器和扫描显微镜，其中，物镜采用60X的高倍物镜。
所述的提取叶片中叶绿体的体积、密度以及空间分布等信息的流程为：(1)导入三光子荧光层析成像图，(2)在细胞壁三光子荧光成像通道选择叶肉细胞胞体所在的感兴趣区域(ROI)，(3)提取ROI中细胞边界及囊括在内的叶绿体边界空间坐标点云，(4)对细胞/叶绿体对象的边界点云进行平滑处理，(5)三维重建，生成水密模型，即模型表面没有孔隙和漏洞，(6)提取细胞/叶绿体对象体积、表面积、空间位置，(7)三维可视化，(8)计算单个叶绿体体积、表面积、数量，求和后计算占整个细胞的比例，分析叶绿体时空分布动态等显微结构表型特征。
本发明具有的效益：
第一，相较于之前的方法，本发明采用三光子荧光显微术，利用叶绿素的三光子荧光特性，实现了较高通量下表征叶片原位叶绿体三维结构分布特征的方法，对解析植物的光合生理过程具有重要意义。
第二，得益于三光子荧光显微术的大深度成像特点，该方法可以实现完整叶片的三光子荧光成像，并进而实现完整叶片下叶肉细胞和叶绿体三维结构特征提取。
第三，该方法同时还可以实现植株在体上的叶绿体移动追踪，对解析叶绿体光响应对光合和光保护策略的关联具有重要意义。
附图说明
图1为本发明实现对叶片抽真空染色的装置示意图；
图2为本发明实现叶绿体和细胞壁三光子层析成像的三光子荧光显微镜示意图；
图3为本发明实现叶肉细胞、叶绿体体积和表面积计算方法流程示意图；
图4为本发明实现叶肉细胞、叶绿体三光子双通道成像提取特征过程示例图；
图5为本发明实现叶肉细胞、叶绿体三光子双通道成像效果示例图；
图6为细胞和叶绿体三维重构可视化结果。
其中：
1真空泵、2真空管、3真空釜、4离心管、5真空阀、6低重频(1MHz)高脉冲激光器、7一号反射镜、8二号反射镜、9三号反射镜、10扫描振镜、11扫描透镜、12套筒透镜、13长通二向色镜(700nm)、14物镜、15载物台、16长通二向色镜(635nm)、17带通滤光片(605-625nm)、18带通滤光片(650-700nm)、19光电倍增管、20光电倍增管、21计算机。
具体实施方式
以下结合附图对本发明具体实施方法作进一步清晰完整地阐述，显然，所描述的实施例仅是一部分实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的其他实施例都属于本发明保护的范围。
本实施例主要包括如下步骤：
(1)如图1所示，将玉米叶片从植株上剪下，装入盖子上钻有小孔的离心管4中，向离心管中装入碘化丙啶染料的重水溶液，此时叶片悬浮在液面。在真空泵1的抽气下，带有真空阀5的真空釜3中的气体通过真空管2被抽出，重水溶液中的气泡也随即渗出，叶片开始下沉。重复操作3-4次，直到玉米叶片完全下沉。
(2)如图2所示，三光子显微镜系统采用低重频(1MHz)高脉冲激光器6，扫描显微镜优化了镜组的红外透过率和反射率。激发光经过一号反色镜7进入显微镜，在显微镜中经二号反射镜8和三号反射镜9到达扫描振镜10进行角度扫描，之后经过扫描透镜11和套筒透镜12进行扩束，经过700nm的长通二向色13后在60倍率的水镜14(UPLSAPO60XW)下方聚焦，激发样品的荧光信号。在荧光探测通道中，采用635nm的长通二向色镜16分光，透射通道的光电倍增管20前面装有650-700nm的带通滤光18，收集叶绿体的三光子荧光信号。反射通道中光电倍增管19的前面装有605-625nm的带通滤光片17，用于收集碘化丙啶染料的三光子荧光信号。将标记了碘化丙啶染料的玉米叶片固定在显微镜的载物台15上，先选用1600nm飞秒波长的激发光对叶片进行叶绿体的三光子荧光层析成像，之后继续用1600nm飞秒波长的激发光对叶片中的碘化丙啶染料进行三光子荧光层析成像，获取完整叶片下的三光子荧光双通道层析成像。
(3)在计算机21上对获取的植物叶片三维层层析成像图进行三维重建分析，图3展示了提取叶绿体三维结构信息方法的具体流程图。导入三光子层析成像图，如图4所示，选取叶肉细胞所在区域，通过细胞壁的三光子荧光层析成像勾勒出中间单颗叶肉细胞胞体所在的感兴趣区域(ROI)，提取细胞边界空间坐标点云，切换到叶绿体成像通道中，提取叶绿体边界空间坐标点云。图5展示了单颗叶肉细胞胞体ROI下的叶肉细胞、叶绿体三光子双通道成像效果图。之后，利用平滑算法对细胞和叶绿体对象边界点云进行平滑处理，最终生成三角网格，对细胞和叶绿体分别重建水密的模型，经计算该叶肉细胞的体积为49328μm3，叶肉细胞内的叶绿体一共83个，平均体积243μm3，平均表面积206μm2，总体积为20230μm3，总表面积17108μm2，叶绿体总体积与细胞体积之比0.41，叶绿体总表面积与细胞表面积之比2.39，对叶绿体空间位置进行计算，得到叶绿体中心点至细胞壁距离平均为6.34μm，平均最近邻点距离9.29μm。从生成的图6细胞和叶绿体三维重构可视化图中，可进一步分析单颗叶绿体在叶肉细胞中的相对空间位置，确定叶绿体主要沿着细胞边界分布。
(4)之后，可以对保持活性的植物叶片进行三光子荧光双通道层析成像，并对叶片进行光照处理，期间重复采集同一视野的三光子荧光双通道层析成像，从而分析叶绿体在光照下的时空动态分布规律。
Claims (4)
1.一种基于三光子荧光显微术表征叶绿体三维结构信息的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
(1)采用抽真空的方式，将细胞壁染料标记到叶片细胞的细胞壁上；
(2)将上述叶片固定在三光子荧光显微镜的载物台上，采用飞秒激光激发，分别对叶绿体和细胞壁进行三光子荧光成像，获取叶片中同一区域的叶绿体和细胞壁的三光子层析成像图；
(3)对获取的植物叶片三维层扫图进行三维重建分析，提取叶片中叶绿体的单个体积、表面积、个数、总体积占细胞体积之比，总表面积与细胞表面积之比以及时空分布动态；
所述的叶绿体三光子荧光成像是基于叶绿素的三光子吸收，采用1600nm飞秒激光激发三光子荧光，标记细胞壁的染料为碘化丙啶染料，采用1600nm飞秒激光激发三光子荧光。
2.根据权利要求1所述的一种基于三光子荧光显微术表征叶绿体三维结构信息的方法，其特征在于：所述的抽真空采用如下步骤：
(1)在密封盖上钻有小孔的离心管中，装入碘化丙啶染料的重水溶液；
(2)将叶片从植株上摘下，用剪刀将叶子剪成小片，装入上述离心管中，此时叶片半浮在液面上；
(3)将装有叶片的离心管放入真空斧中，在真空泵的抽气下形成负压，静置三分钟，此时重水溶液中的气泡开始渗出，并伴随叶片下沉；
(4)拔开真空阀，释放真空釜中的负压，摇晃离心管使液体中的气泡溢出；重复抽气-静置-恢复过程3-4次，直到叶片完全下沉且再次抽气时无更多气泡溢出。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的一种基于三光子荧光显微术表征叶绿体三维结构信息的方法，其特征在于：步骤(3)具体是：
导入三光子荧光层析成像图；
在细胞壁三光子荧光成像通道选择叶肉细胞胞体所在的感兴趣区域；
提取感兴趣区域中细胞边界及囊括在内的叶绿体边界空间坐标点云，
三维重建，生成水密模型；
从水密模型中提取细胞和叶绿体对象体积、表面积和空间位置；
计算单个叶绿体体积、表面积、数量，求和后计算占整个细胞的比例，分析叶绿体时序位置变化。
4.根据权利要求3所述的一种基于三光子荧光显微术表征叶绿体三维结构信息的方法，其特征在于：还包括对边界空间坐标点云进行平滑处理。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310013337.5A CN115901711B (zh) | 2023-01-05 | 2023-01-05 | 一种基于三光子荧光显微术表征叶绿体三维结构信息的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310013337.5A CN115901711B (zh) | 2023-01-05 | 2023-01-05 | 一种基于三光子荧光显微术表征叶绿体三维结构信息的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115901711A CN115901711A (zh) | 2023-04-04 |
| CN115901711B true CN115901711B (zh) | 2023-08-25 |
Family
ID=86471284
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310013337.5A Active CN115901711B (zh) | 2023-01-05 | 2023-01-05 | 一种基于三光子荧光显微术表征叶绿体三维结构信息的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115901711B (zh) |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997011355A1 (en) * | 1995-09-19 | 1997-03-27 | Cornell Research Foundation, Inc. | Multi-photon laser microscopy |
| WO2007040003A1 (ja) * | 2005-10-03 | 2007-04-12 | Osaka University | 細胞内構造体の動態の観察方法および観察装置 |
| JP2010237554A (ja) * | 2009-03-31 | 2010-10-21 | Japan Science & Technology Agency | 蛍光顕微鏡、蛍光観察方法 |
| WO2015136583A1 (ja) * | 2014-03-11 | 2015-09-17 | 国立大学法人山口大学 | 二光子吸収化合物 |
| JP2016074787A (ja) * | 2014-10-03 | 2016-05-12 | 国立大学法人山口大学 | 三光子励起により発光する発光性組成物 |
| WO2018005623A1 (en) * | 2016-06-28 | 2018-01-04 | The Regents Of The University Of California | Fast two-photon imaging by diffracted swept-laser excitation |
| CN110208227A (zh) * | 2019-05-14 | 2019-09-06 | 复旦大学 | 一种单物镜光片显微成像系统 |
| CN114136930A (zh) * | 2021-01-14 | 2022-03-04 | 北京林业大学 | 一种快速鉴定植物叶绿体完整性的方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10420471B2 (en) * | 2013-06-13 | 2019-09-24 | Research Foundation Of The City University Of New York | Method of deep tissue imaging using multi-photon excitation of a fluorophore |
| WO2014205413A2 (en) * | 2013-06-21 | 2014-12-24 | Invenio Imaging Inc. | Multi-photon systems and methods |
| US11085018B2 (en) * | 2017-03-10 | 2021-08-10 | Prellis Biologics, Inc. | Three-dimensional printed organs, devices, and matrices |
-
2023
- 2023-01-05 CN CN202310013337.5A patent/CN115901711B/zh active Active
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997011355A1 (en) * | 1995-09-19 | 1997-03-27 | Cornell Research Foundation, Inc. | Multi-photon laser microscopy |
| WO2007040003A1 (ja) * | 2005-10-03 | 2007-04-12 | Osaka University | 細胞内構造体の動態の観察方法および観察装置 |
| JP2010237554A (ja) * | 2009-03-31 | 2010-10-21 | Japan Science & Technology Agency | 蛍光顕微鏡、蛍光観察方法 |
| WO2015136583A1 (ja) * | 2014-03-11 | 2015-09-17 | 国立大学法人山口大学 | 二光子吸収化合物 |
| JP2016074787A (ja) * | 2014-10-03 | 2016-05-12 | 国立大学法人山口大学 | 三光子励起により発光する発光性組成物 |
| WO2018005623A1 (en) * | 2016-06-28 | 2018-01-04 | The Regents Of The University Of California | Fast two-photon imaging by diffracted swept-laser excitation |
| CN110208227A (zh) * | 2019-05-14 | 2019-09-06 | 复旦大学 | 一种单物镜光片显微成像系统 |
| CN114136930A (zh) * | 2021-01-14 | 2022-03-04 | 北京林业大学 | 一种快速鉴定植物叶绿体完整性的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Time-resolved spectroscopic fluorescence imaging, transient absorption and vibrational spectroscopy of intact and photoinhibited photosynthetic tissue;Lukins, PB et al.;《LUMINESCENCE》;第20卷(第3期);第143-151页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115901711A (zh) | 2023-04-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP3194937B1 (en) | Method for controlling depth of imaging in tissues using fluorescence microscopy under ultraviolet excitation following staining with fluorescing agents | |
| US11869176B2 (en) | Hyperspectral imaging system | |
| Candeo et al. | Light sheet fluorescence microscopy quantifies calcium oscillations in root hairs of Arabidopsis thaliana | |
| CN109923401B (zh) | 高光谱成像系统 | |
| Lees et al. | Correlative two-photon and serial block face scanning electron microscopy in neuronal tissue using 3D near-infrared branding maps | |
| JPWO2014162744A1 (ja) | 細胞観察方法、細胞観察装置、細胞観察プログラム、細胞シート製造方法および細胞シート製造装置 | |
| US20050035305A1 (en) | Iterative optical based histology | |
| DE102020127320B3 (de) | Verfahren und Fluoreszenzmikroskop zur Ortsbestimmung einzelner fluoreszierender Farbstoffmoleküle durch adaptive Abtastung | |
| Cui et al. | Drop-ANd-See: a simple, real-time, and noninvasive technique for assaying plasmodesmal permeability | |
| Warnock et al. | Diatom species abundance and morphologically-based dissolution proxies in coastal Southern Ocean assemblages | |
| JP6284024B2 (ja) | 細胞生死判定システム、細胞生死判定方法 | |
| CN115901711B (zh) | 一种基于三光子荧光显微术表征叶绿体三维结构信息的方法 | |
| Liu et al. | Slide over: advances in slide-free optical microscopy as drivers of diagnostic pathology | |
| Noyce et al. | A practical method for staging grapevine inflorescence primordia in season 1, with improved description of stages | |
| CN111829859B (zh) | 一种高效杨树种子透明染色及其三维成像的方法 | |
| CN105424667B (zh) | 痕量微生物快速检测方法 | |
| Duncombe et al. | Imaging the delivery and behavior of cellulose synthases in Arabidopsis thaliana using confocal microscopy | |
| Santos et al. | Too bright for 2 dimensions: recent progress in advanced 3-dimensional microscopy of the kidney | |
| Bishop et al. | The use of a laser for correlating light and electron microscopic images in thick tissue specimens | |
| CN107505293A (zh) | 一种利用双光子显微镜分离动静脉血管的成像方法 | |
| CN107167400B (zh) | 一种石油包裹体中原油密度的检测方法 | |
| Husna et al. | Multi-modal image cytometry approach–from dynamic to whole organ imaging | |
| Luu et al. | More than double the fun with two-photon excitation microscopy | |
| Chang et al. | Increasing precision of lifetime determination in fluorescence lifetime imaging | |
| Danila | Measuring Plasmodesmata Density on Cell Interfaces of Monocot Leaves Using 3D Immunolocalization and Scanning Electron Microscopy |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |