CN105424667B - 痕量微生物快速检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种痕量微生物快速检测方法，包括：(1)荧光标记：用荧光染料对目标微生物进行荧光标记；(2)溶液过滤：用无自发荧光的滤膜和换膜过滤器对样本溶液进行过滤，从而将目标微生物截留于滤膜上；(3)荧光信号的采集及样本的扫描：由中央控制单元同步进行荧光信号的采集和对滤膜的激光扫描，从而获得滤膜的目标微生物分布的二维图像和目标微生物的计数结果；本发明痕量微生物快速检测方法把荧光标记、溶液过滤、滤膜激光扫描及信号探测和处理结合为一体，通过设计自动检测系统简化了操作步骤，缩短了检测、计数及成像的时间，提高了检测的精度，实现了对痕量微生物的快速、准确、实时检测。

Description

痕量微生物快速检测方法

技术领域

本发明属于微生物检测领域，尤其涉及一种痕量微生物的快速检测方法。

背景技术

随着社会的快速发展，在工业生产、制药制水、食品药品监测等领域中，都亟需实现对痕量细菌的快速实时检测，从而保证工业生产电子元器件的质量，药品、水质及食品的质量安全。

当前对细菌的检测方法主要有经典的平板培养计数法、显微荧光计数法和当前热门的流式细胞术。

平板计数法计数准确，可靠度高，成本低，但因需进行细菌培养，检测速度慢，时间可长达48～72小时，不能满足特定场合的快速、实时性要求，同时，有些细菌的培养条件苛刻，当生长环境，如温度、营养物组成发生改变时，一些细菌会进入一种“活的不可培养”状态，导致计数结果不准确。

显微荧光计数法是先对目标物品进行染色处理后，置于荧光显微镜中进行观测，手动计数的方法。该方法检测时间较长，观测中存在较明显的离焦情况，一次所能观测的区域也较小，且手动计数存在很多不确定性，计数结果准确度不高。

流式细胞术是利用将标本预处理后，制成单细胞悬浮液，再进行具有特异性的、化学定量关系的染色后，悬浮液进入流动室，通过用激光激发，测定散射光和荧光，实现细菌形态及各种成分的检测。流式细胞术具有速度快，多参数检测的优点，但要求被测物浓度在几百到几千数量级，对于痕量微生物计数检测误差很大。

综上所述，目前虽然已有很多微生物检测方法与技术，但其中大多数方法的检测速度或检测精度上有很大不足，应用范围相当局限，尚不能实现痕量微生物的快速、多参数精确检测。

发明内容

针对现有技术微生物检测中存在的不足之处，本发明提供一种痕量微生物快速检测方法，该方法实现了对痕量微生物的快速实时检测。

为了解决上述技术问题，本发明提出的一种痕量微生物快速检测方法，包括以下步骤：

步骤一、采用粒径为小于0.1μm的荧光染料对目标微生物进行荧光标记；

步骤二、用孔径为0.2～1μm，且为无自发荧光的滤膜和换膜过滤器对样本溶液进行过滤，从而将目标微生物截留于所述滤膜上；

步骤三、由中央控制单元同步进行荧光信号的采集和对滤膜的激光扫描，从而获得滤膜的目标微生物分布的二维图像和目标微生物的计数结果；过程如下：

准直激光束经二维扫描振镜反射后进入扫描透镜，经由二维扫描透镜在被测滤膜上表面聚焦，发滤膜上的目标微生物吸收激光能量，通过能级跃迁，释放出荧光信号，该荧光信号由扫描透镜收集，之后投射到二维扫描振镜上，经二维扫描透镜反射后沿激光束入射反方向传播，然后依次通过二向分色镜、荧光滤光镜、聚焦透镜和共焦孔，进入光电探测器转换为模拟电信号，模拟电信号由数据采集卡转换为数字信号，并最终输出到中央控制单元，完成单点荧光信号采集；在中央控制单元控制下同步驱动振镜进行二维激光束扫描和荧光信号采集，完成对滤膜表面一个矩形区域的检测，获得的信号为一维信号；之后，对采集到的一维信号进行滤波、特征峰值提取、计数和二维图像重构处理，从而生成显示目标微生物分布状态的二维图像，并输出目标微生物的计数结果。

其中，步骤三中，对滤膜的激光扫描是利用激光扫描系统对步骤二获得的截留有微生物的滤膜进行激光扫描，所述激光扫描系统的光学景深大于10μm～200μm，优选30～100μm。所述激光扫描系统的波长根据步骤一所用的荧光染料特性决定，激光波长为所选用荧光染料的峰值吸收波长，所述激光扫描系统的功率设计为1～200mw，优选10～50mw

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)通用性好：可以实现对大多数微生物的检测，而可以检测区分死活细菌，具有良好的通用性。

(2)速度快：由于检测不需要进行培养，并且扫描的速度也非常快，因此，总体检测的速度很快，完成单个样本的检测时间在15分钟内(包括样本前期准备时间)。

(3)痕量检测：检测下限低，可以检测细菌的范围从1～50000，尤其对细菌数量在100以下的样本液仍可以完成快速、准确检测。

附图说明

图1为本发明痕量微生物快速检测方法的流程示意图；

图2为本发明痕量微生物快速检测方法实施步骤的流程示意图；

图3为本发明痕量微生物快速检测方法滤膜荧光检测流程示意图；

图4为本发明实施例提供的检测细菌液所得图片。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明技术方案作进一步详细描述，所描述的具体实施例仅对本发明进行解释说明，并不用以限制本发明。

本发明一种痕量微生物快速检测方法，其中，需要用到的器件通常包括中央控制单元、数据采集卡、光电探测器、激光器、二向分色镜、荧光滤光镜、聚焦透镜、二维扫描振镜、扫描透镜、滤膜和共焦孔，如图3所示；该检测方法包括以下步骤：

步骤一、荧光标记：采用粒径小于0.1μm的荧光染料对目标微生物进行荧光标记，所述荧光标记通过选取特定波长激发的荧光标记物，对微生物特定组分进行标记，荧光标记物与微生物特定组分结合后，在激光激发下，量子产率得到极大提高，荧光强度会得到极大增强；

步骤二、溶液过滤：选取孔径为0.2～1μm、且为无自发荧光的滤膜和换膜过滤器对样本溶液进行过滤，滤膜自身无荧光效应，通过滤膜对水溶液过滤，实现目标微生物与水的分离，由于荧光染料(粒径为小于0.1μm)自身不会被滤膜截留，因此，把目标微生物截留于所述滤膜上面；

步骤三、样本扫描：把过滤后的样本置于双振镜扫描检测系统平台中，点亮激光器，特定激发波长激光通过光路后，对目标微生物进行荧光激发，在检测系统中，通过设定大光束双振镜系统摆动的方式、速度，光斑随双振镜系统摆动而移动进行扫描，可以实现对目标微生物的快速移动扫描。即由中央控制单元同步进行对滤膜的激光扫描和荧光信号的采集，从而获得滤膜的目标微生物分布的二维图像和目标微生物的计数结果；过程是：准直激光束经二维扫描振镜反射后进入扫描透镜，经由二维扫描透镜在被测滤膜上表面聚焦，发滤膜上的目标微生物吸收激光能量，通过能级跃迁，释放出荧光信号，该荧光信号由扫描透镜收集，之后投射到二维扫描振镜上，经二维扫描透镜反射后沿激光束入射反方向传播，然后依次通过二向分色镜、荧光滤光镜、聚焦透镜和共焦孔，进入光电探测器转换为模拟电信号，模拟电信号由数据采集卡转换为数字信号，并最终输出到中央控制单元，完成单点荧光信号采集；在中央控制单元控制下同步驱动振镜进行二维激光束扫描和荧光信号采集，完成对滤膜表面一个矩形区域的检测，获得的信号为一维信号。之后，对采集到的一维信号进行滤波、特征峰值提取、计数和二维图像重构处理，生成显示目标微生物分布状态的二维图像，并输出目标微生物的计数结果。见图3。

本发明痕量微生物快速检测方法把荧光标记、溶液过滤、滤膜激光扫描、信号探测和信号处理结合为一体，通过对滤膜表面荧光信号检测实现对微生物的检测，简化了操作步骤，缩短了计数及成像的时间，提高了检测的精度，实现对痕量细菌的快速、准确、实时检测。

实施例1

本发明实施例提供的检测方法，参见图1，痕量微生物快速检测方法包括：荧光标记1，溶液过滤2，滤膜扫描3，荧光信号采集4，信号处理5，目标二维图像还原6；先用荧光标记物对细菌进行荧光标记，再用滤膜以及换膜过滤器对细菌液进行过滤，截留细菌于滤膜上，置于荧光检测系统中，用激光激发滤膜上的细菌，通过能级跃迁，释放出荧光信号，而后对荧光信号进行采集与处理，并进行计数以及二维图像显示。

所述荧光标记1通过选取特定波长激发的荧光标记物，对微生物特定组分进行标记，荧光标记物与微生物特定组分结合后，激光激发状态下，荧光会得到极大增强；

所述溶液过滤2通过选取孔径大小在0.4μm左右、无自发荧光的滤膜和换膜过滤器进行过滤，通过滤膜对水溶液过滤，实现细菌与水的分离，把细菌截留于滤膜上面。

所述滤膜扫描3既把过滤后的样本置于检测系统平台中，特定激发波长激光通过光路后，对目标物品进行荧光激发，在检测系统中，通过设定大光束双振镜系统摆动的方式、速度，光斑随双振镜系统摆动而移动进行扫描，可以实现对目标物品的快速移动扫描。二维扫描振镜在X轴和Y轴振镜控制卡的控制下，X轴振镜连续摆动，沿X轴方向以一定速度移动，完成后；Y轴振镜摆动，沿Y轴方向移动；完成后，X轴振镜连续摆动，再次沿X方向以一定速度移动，如此往复，从而完成对区域内滤膜的扫描。

所述荧光信号采集4，信号处理5既用激光激发目标物品，通过能级跃迁，释放出荧光，荧光被扫描透镜收集，而后通过振镜反射，荧光滤光镜过滤，进入光电转换器，把光信号转换为模拟电信号，然后通过数据采集卡，把模拟电信号转换为数字电信号，而后再送入PC中进行滤波、特征峰值提取和计数等处理。

所述二维图像还原6是把采集处理后的信号，以二维图像方式加以显示目标物品。

实施例2

参见图2，通过本发明痕量微生物快速检测方法，完成对细菌的快速扫描检测，获得检测图像，如图4所示。具体检测步骤如图2所示，

S1，选取特定荧光标记物标记细菌溶液，熟悉标记的具体条件，对溶液进行标记时，需要控制染料染色成功的一些条件，如暗室、常温等条件。

S2，用孔径大小在0.4μm左右的滤膜和换膜过滤器结合，对水溶液过滤，实现细菌与水的分离，把细菌截留于滤膜上面，在过滤中，需注意滤膜及过滤器的清洁，避免自体荧光颗粒等干扰物的干扰。

S3，滤膜置于平台上，中央控制单元发送指令控制激光器点亮，发送指令控制振镜摆动。

S4，二维扫描振镜在X轴和Y轴振镜控制卡的驱动下，连续摆动，从而完成对区域内滤膜的扫描。设定振镜的摆动方式，如正弦扫，三角波扫等，还需控制扫描的速度，设置波形的频率与幅值。

S5，返回荧光通过光电探测器，把光信号转换为模拟电信号，并进行模拟电信号的放大，在通过数据采集卡，把模拟电信号转换为数字电信号。

S6，数字电信号送入中央控制单元中进行滤波、特征峰值提取和二维图像重构等处理，而后生成细菌分布的二维图像，输出微生物计数结果，如图4所示。

尽管上面结合附图对本发明进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨的情况下，还可以做出很多变形，这些均属于本发明的保护之内。

Claims (3)

1.一种痕量微生物快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、采用粒径为小于0.1μm的荧光染料对目标微生物进行荧光标记；

步骤二、用孔径为0.2～1μm、且为无自发荧光的滤膜和换膜过滤器对样本溶液进行过滤，从而将目标微生物截留于所述滤膜上；

步骤三、由中央控制单元控制二维扫描振镜和数据采集卡同步进行对滤膜的激光扫描和荧光信号的采集，从而获得滤膜的目标微生物分布的二维图像和目标微生物的计数结果；过程如下：

准直激光束经二维扫描振镜反射后进入扫描透镜，经由扫描透镜在被测滤膜上表面聚焦，滤膜上的目标微生物吸收激光能量，通过能级跃迁，释放出荧光信号，该荧光信号由扫描透镜收集，之后投射到二维扫描振镜上，经二维扫描振镜反射后沿激光束入射反方向传播，然后依次通过二向分色镜、荧光滤光镜、聚焦透镜和共焦孔，进入光电探测器转换为模拟电信号，模拟电信号由数据采集卡转换为数字信号，并最终输出到中央控制单元，完成单点荧光信号采集；在中央控制单元控制下同步驱动二维扫描振镜进行二维激光束扫描和荧光信号采集，完成对滤膜表面一个矩形区域的检测，获得的信号为一维信号；之后，对采集到的一维信号进行滤波、特征峰值提取、计数和二维图像重构处理，从而生成显示目标微生物分布状态的二维图像，并输出目标微生物的计数结果；

对滤膜的激光扫描是利用激光扫描系统对步骤二获得的截留有微生物的滤膜进行激光扫描，所述激光扫描系统的光学景深为10μm～200μm，所述激光扫描系统的波长根据步骤一所用的荧光染料特性决定，激光波长与所选用荧光染料的峰值吸收波长一致，所述激光扫描系统的功率设计为1～200mw。

2.根据权利要求1所述痕量微生物快速检测方法，其特征在于，所述激光扫描系统的光学景深为30～100μm；所述激光扫描系统的功率设计为10～50mw。

3.根据权利要求1所述痕量微生物快速检测方法，其特征在于，所述激光扫描系统的功率设计为10～50mw。