CN107860752A - 一种交流电模式下的纳米孔单分子荧光成像装置及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种交流电模式下的纳米孔单分子荧光成像装置及方法，该装置包括纳米孔成像池、交流信号提供系统和全内反射荧光成像系统；交流电位由交流信号发生系统产生，通过电流放大系统连接电极施加在纳米孔两侧。纳米孔荧光成像由全内反射荧光成像系统实现，纳米孔上、下两侧分别为低、高折射率介质，可实现激发光在纳米孔界面的全内反射。本发明在纳米孔两侧施加交流电位，可以对单分子的穿孔行为进行调控；交流电位的施加对纳米孔的稳定性有显著提高，扩大了工作电压的施加范围；通过全内反射荧光成像系统，实现对单个纳米孔的单分子信号实时荧光成像监控，具有高空间、时间分辨率及高灵敏度的优势。

Description

一种交流电模式下的纳米孔单分子荧光成像装置及方法

技术领域

本发明涉及纳米孔单分子分析技术领域，具体涉及一种交流电模式下的纳米孔单分子荧光成像装置及方法。

背景技术

纳米通道(孔)广泛存在于生物膜，通常起到输运生物分子和离子的生理功能，是生物体内物质和能量交换的基础，在生命过程中扮演着重要角色。物质在生物纳米通道中的选择性运输与多种生命活动密切相关，例如激素分泌、心脏搏动、跨膜质子梯度形成、神经兴奋与传导以及中枢神经系统的调控功能等。纳米通道的重要作用为人们所关注，有众多的研究聚焦于此，模拟生物体内纳米通道的体外人工纳米孔技术也就应运而生。目前应用较多的是以α-溶血素，MspA和phi29为主的生物纳米孔(直径为1-3纳米)以及基于无机材料(Si、Si₃N₄、Al₂O₃和玻璃等)，高分子聚合物和碳纳米管、石墨烯等人工固体纳米孔(直径为几十到几百纳米)。

当前，单分子分析技术相对于传统的分析表征技术，可以表征单个分子的结构与动态变化，为认识分子的结构与功能提供更加丰富的信息。纳米孔技术作为一种单分子分析技术，融合了纳米技术、生物技术和微电子技术的优势，具有无标记、高灵敏、高通量等性能，在核酸测序、单分子检测及单分子化学反应等方面有着巨大的应用价值，是当前世界发展的重要前沿研究领域之一，受到了国际科学界和高技术仪器公司的广泛关注和重视。

目前纳米孔技术的主要测量方式是直流恒电位法，即在纳米孔连通的两侧溶液中施加恒电位，驱动单个分析物分子通过纳米孔道，测量通过时产生的瞬时离子电流脉冲阻断行为(pA级)，测得的阻断持续时间、阻断电流幅度和信号频率可以反映单个分子的特性，通过对大量脉冲电流的统计分析可实现对分析物的检测。尽管离子电流信号可以一定程度反映分析物穿过纳米孔的信息，然而这种施加恒电位测量的纳米孔电流变化信号单一，无法直观地反映分析物穿孔过程中的构象变化及其与纳米孔之间相互作用等诸多信息。不仅如此，恒电位法较大的工作电压范围对纳米孔的稳定性会产生影响。恒电位模式下的纳米孔测量方法存在着不可避免的技术局限性。

发明内容

为了弥补现有纳米孔直流恒电位测量技术的不足，本发明的目的是一种交流电模式下的纳米孔单分子荧光成像装置及方法，可以对单分子的穿孔行为进行调控，扩大工作电压的施加范围。

为了达到上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种交流电模式下的纳米孔单分子荧光成像装置，包括纳米孔成像池、交流信号提供系统和全内反射荧光成像系统；

所述的纳米孔成像池为设有纳米孔膜的纳米孔检测池，纳米孔膜上开设有纳米孔；纳米孔上侧为正检测池，其内设有含有荧光探针和电解质的光密介质；纳米孔下侧为反检测池，其内设有含有指示离子和电解质的光疏介质，当荧光探针结合指示离子后可发光；两支电极的一端分别浸没于正检测池、反检测池的溶液中，另一端伸出纳米孔检测池；

所述的交流信号提供系统包括交流信号发生系统，交流信号发生系统输出接口与电流放大系统输入接口相连接，交变电场通过电流放大系统在纳米孔检测池中的两支电极之间施加交流电势；

所述的全内反射荧光成像系统包括激光光源、全内反射荧光成像光路、高数值孔径物镜和单光子检测器。

所述的电极之间施加交流电势驱动指示离子穿过纳米孔结合另一侧的荧光探针，产生荧光信号后被成像系统采集，成像系统生成具有交流振幅的荧光强度-时间曲线；

当单个分析物分子通过纳米孔时，阻碍指示离子通过纳米孔，荧光强度降低；单分子荧光信号通过单光子检测器实时采集，采样视野范围、采样频率可调。

所述的纳米孔膜在水平方向固定于纳米孔检测池中间，纳米孔检测池的上、下两侧的光密介质和光疏介质分别提供低折射率介质和高折射率介质，纳米孔所在位置为光密介质和光疏介质界面；

所述的反检测池下方以盖玻片作为基底；

所述的两支电极为银/氯化银电极对。

所述在全内反射荧光显微系统对纳米孔进行荧光成像时，激光光源发射的激发光由纳米孔下方的光密介质入射，当入射角为临界角时，激发光在纳米孔所处的光密介质和光疏介质的界面发生全内反射

所述的纳米孔上、下两侧的介质为水溶液或水凝胶，介质折射率通过改变水溶液中溶质种类、浓度或水凝胶浓度进行调控。

所述交流信号发生系统输出包括波形、频率、振幅、直流偏压在内的参数可控的交变电压信号。

所述的纳米孔为生物纳米孔或固态纳米孔；

所述的生物纳米孔包括α-溶血素纳米孔、MspA蛋白纳米孔和Phi29蛋白纳米孔；

所述的固态纳米孔包括Si纳米孔、Si₃N₄纳米孔、Al₂O₃纳米孔、高分子膜孔、石墨烯孔。

所述纳米孔上方介质中的荧光探针包括能特异性结合离子发荧光的罗丹明类、香豆素类、萘酰亚胺类、荧光素类和芘类化合物的荧光探针；

纳米孔下方介质中的指示离子包括可结合相应荧光探针的离子：Ca²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺和Al³⁺。

一种交流电模式下的纳米孔单分子荧光成像方法，包括以下操作：

(a)构建可进行全内反射荧光成像的纳米孔检测池：纳米孔膜在水平方向固定于检测池中间，将上、下两侧的正、反检测池分隔开；其中纳米孔上方的正检测池介质中含有荧光探针和电解质，下方的反检测池介质中含有相应的指示离子和电解质；反检测池下方以盖玻片作为基底，两支电极分别浸没于两侧正、反检测池溶液中，两支电极在纳米孔膜两侧施加电位；

(b)提供交流电参数可调控的交变电场源：将交流信号发生系统输出接口与电流放大系统输入接口相连接，交变电场通过电流放大系统在纳米孔检测池中的两支电极之间施加交流电势；

(c)通过全内反射荧光显微系统对纳米孔进行荧光成像实时监测；

(d)在全内反射荧光显微系统对纳米孔进行荧光成像时，激发光由纳米孔下方的光密介质入射，当入射角为临界角时，激发光在纳米孔所处的光密介质和光疏介质的界面发生全内反射；指示离子在电位驱动下通过纳米孔后特异性结合另一侧荧光探针发荧光，当单个分子通过纳米孔时，阻碍指示离子流，荧光强度发生瞬时降低。

所述纳米孔检测池上、下两侧的正、反检测池中分别提供低折射率介质和高折射率介质，纳米孔置于光密介质和光疏介质的水平方向界面；纳米孔上、下两侧的介质为水溶液或水凝胶。所述介质折射率通过改变水溶液中溶质种类、浓度或水凝胶浓度进行调控；

所述的交流信号发生系统输出波形、频率、振幅、直流偏压可控的交变电压。

本发明具有以下有益的技术效果：

不同于常规的恒电位直流测量纳米孔离子电流的方法，本发明构建了荧光成像检测池及方法，利用全内反射荧光成像系统对单分子通过纳米孔的行为进行实时监测，同时利用交流信号发生系统在纳米孔两侧施加参数可调的交流电场，实现交流电模式下的纳米孔单分子荧光成像。本发明可以对单分子的穿孔行为进行调控。同时交流电位的施加对纳米孔的稳定性有显著提高，扩大了工作电压的施加范围。进一步，通过全内反射荧光成像系统，实现对单个纳米孔的单分子信号实时荧光成像监控，具有高空间、时间分辨率及高灵敏度的优势，可直观地表征分析物穿过纳米孔的动态过程。本发明可应用于多种生物大分子(DNA、RNA、多肽、蛋白等)的分析检测。

本发明在纳米孔单分子荧光成像中引入了交变电场，该交流微扰可对单分子通过纳米孔的行为和速度进行调控，同时能最大程度地保证纳米孔的稳定性。对纳米孔进行的荧光成像，弥补了传统直流电测量模式中信号单一的缺陷，单分子成像的信息具有很好的空间分辨率，有利于研究分子与纳米孔的相互作用，丰富了实时追踪穿孔过程与穿孔动力学信息，及便于了解生物分子穿孔机制。此外，该交流电模式下的荧光成像方法不受纳米孔膜电容的影响，避免了传统电流测试中膜电容带来的背景信号。本发明将极大丰富了单分子分析技术的研究范围和拓宽了其应用领域。

附图说明

图1A为交流电模式下的纳米孔荧光成像仪器示意图。

图1B为交流电模式下纳米孔单分子荧光成像原理图。

图2为水溶液液滴在水平水凝胶表面形成磷脂双分子层示意图。

图3A为交流电模式下单分子荧光成像测试得到的单个纳米孔成像的荧光-时间曲线。图3B为图3A中“*”号指示的单分子信号放大图以及相应的成像图。标尺：5微米。

图4为在固定的交流振幅下，改变交流电位频率的单分子荧光成像测试。交流电位振幅为10mV，偏压为75mV，频率分别为5Hz(A)、10Hz(B)、20Hz(C)、40Hz(D)和60Hz(E)。

图5为在固定的交流频率下，改变交流电位振幅的单分子荧光成像测试。交流电位频率为10Hz，偏压为75mV，振幅分别为1mV(A)、5mV(B)、10mV(C)、15mV(D)和20mV(E)。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做详细描述。

一种交流电模式下的纳米孔单分子荧光成像装置，包括纳米孔成像池、交流信号提供系统和全内反射荧光成像系统；

所述的纳米孔成像池为设有纳米孔膜的纳米孔检测池，纳米孔膜上开设有纳米孔；纳米孔上侧为正检测池，其内设有含有荧光探针和电解质的光密介质；纳米孔下侧为反检测池，其内设有含有指示离子和电解质的光疏介质，当荧光探针结合指示离子后可发光；两支电极的一端分别浸没于正检测池、反检测池的溶液中，另一端伸出纳米孔检测池；

所述的交流信号提供系统包括交流信号发生系统，交流信号发生系统输出接口与电流放大系统输入接口相连接，交变电场通过电流放大系统在纳米孔检测池中的两支电极之间施加交流电势；

所述的全内反射荧光成像系统包括激光光源、全内反射荧光成像光路、高数值孔径物镜和单光子检测器。

所述的电极之间施加交流电势驱动指示离子穿过纳米孔结合另一侧的荧光探针，产生荧光信号后被成像系统采集，成像系统生成具有交流振幅的荧光强度-时间曲线；

当单个分析物分子通过纳米孔时，阻碍指示离子通过纳米孔，荧光强度降低；单分子荧光信号通过单光子检测器实时采集，采样视野范围、采样频率可调。

具体的，所述的纳米孔膜在水平方向固定于纳米孔检测池中间，纳米孔检测池的上、下两侧的光密介质和光疏介质分别提供低折射率介质和高折射率介质，纳米孔所在位置为光密介质和光疏介质界面；

所述的反检测池下方以盖玻片作为基底；

所述的两支电极为银/氯化银电极对。

在全内反射荧光显微系统对纳米孔进行荧光成像时，激光光源发射的激发光由纳米孔下方的光密介质入射，当入射角为临界角时，激发光在纳米孔所处的光密介质和光疏介质的界面发生全内反射。

所述的纳米孔上、下两侧的介质为水溶液或水凝胶，介质折射率通过改变水溶液中溶质种类、浓度或水凝胶浓度进行调控。交流信号发生系统输出包括波形、频率、振幅、直流偏压在内的参数可控的交变电压信号。

具体的，所述的纳米孔为生物纳米孔或固态纳米孔；

所述的生物纳米孔包括α-溶血素纳米孔、MspA蛋白纳米孔和Phi29蛋白纳米孔；

所述的固态纳米孔包括Si纳米孔、Si₃N₄纳米孔、Al₂O₃纳米孔、高分子膜孔、石墨烯孔。

纳米孔上方介质中的荧光探针包括能特异性结合离子发荧光的罗丹明类、香豆素类、萘酰亚胺类、荧光素类和芘类化合物的荧光探针；

纳米孔下方介质中的指示离子包括可结合相应荧光探针的离子：Ca²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺和Al³⁺。

一种交流电模式下的纳米孔单分子荧光成像方法，包括以下操作：

(a)构建可进行全内反射荧光成像的纳米孔检测池。检测池如图1A所示，将纳米孔膜水平固定于检测池中间，使纳米孔上、下两侧的正、反检测池分隔开。反检测池下表面覆盖盖玻片作为基底。接着在正、反检测池中分别加入电解质介质，分别为低折射率介质和高折射率介质，使纳米孔置于光密介质和光疏介质的界面。两支电极分别浸没于两侧的正、反检测池溶液中，两支电极在纳米孔膜两侧施加电位，电极为银/氯化银电极。

具体的，纳米孔上、下两侧的介质为水溶液或水凝胶。所述介质折射率通过改变水溶液中溶质种类、浓度或水凝胶浓度进行调控。

(b)在纳米孔两侧施加交流电位。交变电场由参数可调的交变电场源产生。交流信号发生系统输出接口和电流放大系统输入接口连接。交变电场通过电流放大系统在纳米孔检测池中的两支电极之间施加交流电势。

具体的，交流信号发生系统可输出波形(正弦波、方波、锯齿波等)、频率、振幅、直流偏压等参数可控的交变电压。

(c)通过全内反射荧光显微系统对纳米孔进行荧光成像实时监测。成像系统主要设备包括：激光光源、全内反射荧光成像光路、高数值孔径物镜、单光子检测器。在全内反射荧光显微系统对纳米孔进行荧光成像时，将物镜聚焦至纳米孔界面。

(d)在全内反射荧光显微系统对纳米孔进行荧光成像时，激发光由纳米孔下方的光密介质入射，当入射角为临界角时，激发光在纳米孔所处的光密介质和光疏介质的界面发生全内反射；指示离子在电位驱动下通过纳米孔后特异性结合另一侧荧光探针发荧光，当单个分子通过纳米孔时，阻碍指示离子流，荧光强度发生瞬时降低。

激发光由纳米孔下方的光密介质入射，当入射角为临界角时，激发光在纳米孔所处的光密介质和光疏介质的界面发生全内反射。

如图1-B所示，纳米孔上方的正检测池介质中含有荧光探针，下方的反检测池介质中含有相应的指示离子。指示离子在电位驱动下通过纳米孔后特异性结合另一侧荧光探针发荧光。当单个检测分子通过纳米孔时，阻碍指示离子流，荧光强度发生瞬时降低。在交流电位下，实时测量得到的荧光-时间信号会呈现与交流电位频率一致的振动波形。单分子荧光信号通过单光子检测器实时采集，采样视野范围、采样频率可控制。

下面给出具体的实施例。

(a)纳米孔的构建和检测池组装：

选用α-溶血素作为材料构建纳米孔，选择聚甲基丙烯酸甲酯材料制成的纳米孔检测池。α-溶血素是一种常用的生物纳米孔，可自发嵌入人工磷脂双分子层中。纳米孔下方反池中的高折射率介质选择用1％水凝胶。将质量比1％的琼脂糖溶解在含0.75mol L^-1CaCl₂、10mmol L^-1HEPES,pH 7的溶液中，加热后使水凝胶发生水合作用，并将琼脂糖溶液旋涂在盖玻片上，冷却后形成固态的水凝胶薄层，厚度均匀并小于100μm。该水凝胶薄层的折射率大于水溶液。将检测池覆盖在盖玻片的水凝胶薄层上，用加热的1％水凝胶进行密封，使盖玻片固定在检测池底部，水凝胶薄层作为反池中的介质，将Ag/AgCl电极浸入水凝胶中。

在水凝胶薄层上方的圆柱形正池中加入含有9.5mg mL^-1磷脂的十六烷溶液，静置15分钟后，用微型加液器在磷脂溶液中加入50～80nL水溶液(1.5mol L^-1KCl，10mmol L^{- 1}HEPES,20μmol L^-1Fluo-4,50μmol L^-1EDTA,pH7)，该水溶液中含20μM钙离子荧光探针Fluo-4，以及10pgμL^-1α-溶血素。荧光探针Fluo-4为Ca²⁺特异性探针，自身无荧光，可特异性结合Ca²⁺发光。

如图2所示，水凝胶薄层旋涂在盖玻片上，折射率大于水溶液。液滴溶液中包含α-溶血素蛋白与荧光探针Fluo-4。α-溶血素蛋白可自发嵌入磷脂双分子层形成稳定的纳米孔。

在磷脂/十六烷溶液中，水溶液液滴和水凝胶表面可自发形成磷脂单分子层，当两者表面磷脂单层接触时，自发组装形成为水平方向的磷脂双分子层，该人工磷脂层将液滴与水凝胶隔开。当水溶液液滴和水凝胶都浸入磷脂的十六烷溶液中，在液滴和水凝胶表面可自发形成磷脂单层。当两者表面磷脂单层接触时，自发形成为磷脂双分子层，将液滴中溶液与水凝胶隔开。利用XYZ微操作器将Ag/AgCl电极插入正检测池中的液滴中，通过液滴和水凝胶中的一对电极在磷脂两侧施加电位。

荧光探针Fluo-4为Ca²⁺特异性探针，不结合Ca²⁺时不发光。当有一个α-溶血素蛋白自发嵌入磷脂层时，形成纳米孔，连通液滴与水凝胶中的电解质，施加电位后可产生稳定的离子电流。电位驱动水凝胶中的Ca²⁺通过纳米孔，结合液滴中的探针Fluo-4发光。

(b)交流电位的施加：

交变电场由参数可调的交变电场源产生。交流信号发生系统的函数输出接口和电流放大系统输入接口连接。交变电场通过电流放大系统在纳米孔检测池中的两支电极之间施加交流电势。交流信号发生系统可输出波形(正弦波、方波、锯齿波等)、频率、振幅、直流偏压等参数可控的交变电压。

(c)对纳米孔进行全内反射荧光成像：

全内反射荧光成像系统主要设备包括：激光光源、全内反射荧光成像光路、高数值孔径物镜、单光子检测器。在全内反射荧光显微系统对纳米孔进行荧光成像时，将物镜聚焦至纳米孔界面，即水平磷脂层界面。激发光为488nm波长，由固态激光光源产生，功率调至10mW。激发光的入射角由微操作器调节，调节范围为90°。激发光由纳米孔下方的光密介质入射，当入射角为临界角时，激发光在纳米孔所处的光密介质和光疏介质的界面发生全内反射。纳米孔上方的正检测池介质中含有荧光探针Fluo-4，下方的反检测池介质中含有相应的指示离子Ca²⁺。Ca²⁺在电位驱动下通过纳米孔后特异性结合另一侧荧光探针Fluo-4发出稳定的荧光信号。当单个分子通过纳米孔时，阻碍Ca²⁺流通过纳米孔，荧光强度发生瞬时降低。单分子荧光信号通过单光子检测器实时采集，采样视野范围、采样频率通过软件进行控制。

(d)核酸单分子信号测试：

选择用发卡型(Hairpin)结构DNA作为分析样品，实验中，正检测池的液滴中含有0.5μmol L^-1的DNA样品。图3A显示了在交流电模式下得到的单个DNA分子通过一个纳米孔的荧光成像信号(交流电位频率为10Hz，振幅为10mV，偏压为75mV。液滴中水溶液为：1.5molL^-1KCl，10mmol L^-1HEPES,20μmol L^-1Fluo-4,50μmol L^-1EDTA,pH 7，分析物为0.5μmol L^-1发卡型DNA。水凝胶中溶液为：0.75mol L^-1CaCl₂,10mmol L^-1HEPES,pH 7)。所施加的正弦交流电位频率为10Hz，振幅为10mV，直流部分偏压为75mV。在记录中，纳米孔及磷脂双分子层保持了良好的稳定性。单个纳米孔的荧光信号通过自编Matlab程序读取。程序读取纳米孔荧光成像信号中心灰度值最大的5×5个像素点，并取平均值，可获得该纳米孔荧光信号F_信号随时间变化的曲线。再将上述荧光信号F_信号进行归一化处理：设定纳米孔周围的荧光背景F_背景为0，设定无分析物通过时的开孔荧光信号F₀为1。

图3B中显示当单个DNA分子通过纳米孔时，纳米孔的成像信号瞬时减弱，荧光信号强度发生暂态降低，该信号反映了单个发卡型DNA的解折叠动态过程。同时，在交流电位下，实时测量得到的荧光-时间信号呈现与交流电位频率一致的振动波形。该稳定的振动波形来源于交流电位对Ca²⁺通过纳米孔行为的调控。同时，该正弦振动波形的振幅较小，不会掩盖单分子信号，保持了较好的信噪比。此外，该交流电模式下的荧光成像方法不受纳米孔膜电容的影响，避免了传统电流测试中膜电容带来的背景信号，保持了很好的信噪比。

图4显示了在交流电压的振幅恒定情况下，改变交流电位频率时的单分子荧光成像信号结果。其中正弦交流电位振幅为恒定的10mV，直流部分偏压设定为75mV，频率分别为5Hz(A)、10Hz(B)、20Hz(C)、40Hz(D)和60Hz(E)。液滴中水溶液为：1.5mol L^-1KCl，10mmol L^-1HEPES,20μmol L^-1Fluo-4,50μmol L^-1EDTA,pH 7，分析物为0.5μM发卡型DNA。水凝胶中溶液为：0.75mol L^-1CaCl₂,10mmol L^-1HEPES,pH 7。

单个纳米孔的荧光-时间曲线显示，随着交流频率从5Hz提高至60Hz，测得的荧光信号的振幅逐渐减小。说明交流频率越高，在一个交流周期内通过纳米孔的Ca²⁺越少，引起的荧光强度变化越小。

图5显示了在交流电压的频率恒定的情况下，改变交流电位振幅时的单分子荧光成像信号结果。其中正弦交流电位频率为恒定的10Hz，直流部分偏压设定为75mV。液滴中水溶液为：1.5mol L^-1KCl，10mmol L^-1HEPES,20μmol L^-1Fluo-4,50μmol L^-1EDTA,pH 7，分析物为0.5μmol L^-1发卡型DNA。水凝胶中溶液为：0.75mol L^-1CaCl₂,10mmol L^-1HEPES,pH 7。

单个纳米孔的荧光-时间曲线显示，随着交流振幅从1mV增加至20mV，测得的荧光信号的振幅逐渐增大。说明交流振幅越大，电位振幅引起的一个交流周期中通过纳米孔的Ca²⁺越多，引起的荧光强度变化越大。

上述可施加的交流电位的频率范围为：100μHz～1MHz；交流振幅范围为：±100mV；直流偏压范围为：±200mV。在上述电位条件下，纳米孔及其电流可保持很好的稳定性。

以上叙述仅为本发明的示范性实施举例，根据本发明的基本方法，纳米孔检测池的构建、纳米孔膜材料、荧光探针和指示离子的选择可以有多种变化和组合，它们由本发明的权利要求书加以限定。

Claims (10)

1.一种交流电模式下的纳米孔单分子荧光成像装置，其特征在于，包括纳米孔成像池、交流信号提供系统和全内反射荧光成像系统；

所述的纳米孔成像池为设有纳米孔膜的纳米孔检测池，纳米孔膜上开设有纳米孔；纳米孔上侧为正检测池，其内设有含有荧光探针和电解质的光密介质；纳米孔下侧为反检测池，其内设有含有指示离子和电解质的光疏介质，当荧光探针结合指示离子后可发光；两支电极的一端分别浸没于正检测池、反检测池的溶液中，另一端伸出纳米孔检测池；

所述的交流信号提供系统包括交流信号发生系统，交流信号发生系统输出接口与电流放大系统输入接口相连接，交变电场通过电流放大系统在纳米孔检测池中的两支电极之间施加交流电势；

所述的全内反射荧光成像系统包括激光光源、全内反射荧光成像光路、高数值孔径物镜和单光子检测器。

2.如权利要求1所述的交流电模式下的纳米孔单分子荧光成像装置，其特征在于，所述的电极之间施加交流电势驱动指示离子穿过纳米孔结合另一侧的荧光探针，产生荧光信号后被成像系统采集，成像系统生成具有交流振幅的荧光强度-时间曲线；

当单个分析物分子通过纳米孔时，阻碍指示离子通过纳米孔，荧光强度降低；单分子荧光信号通过单光子检测器实时采集，采样视野范围、采样频率可调。

3.如权利要求1所述的交流电模式下的纳米孔单分子荧光成像装置，其特征在于，所述的纳米孔膜在水平方向固定于纳米孔检测池中间，纳米孔检测池的上、下两侧的光密介质和光疏介质分别提供低折射率介质和高折射率介质，纳米孔所在位置为光密介质和光疏介质界面；

所述的反检测池下方以盖玻片作为基底；

所述的两支电极为银/氯化银电极对。

4.如权利要求1所述的交流电模式下的纳米孔单分子荧光成像装置，其特征在于，在全内反射荧光显微系统对纳米孔进行荧光成像时，激光光源发射的激发光由纳米孔下方的光密介质入射，当入射角为临界角时，激发光在纳米孔所处的光密介质和光疏介质的界面发生全内反射。

5.如权利要求1或4所述的交流电模式下的纳米孔单分子荧光成像装置，其特征在于，所述的纳米孔上、下两侧的介质为水溶液或水凝胶，介质折射率通过改变水溶液中溶质种类、浓度或水凝胶浓度进行调控。

6.如权利要求1所述的交流电模式下的纳米孔单分子荧光成像装置，其特征在于，交流信号发生系统输出包括波形、频率、振幅、直流偏压在内的参数可控的交变电压信号。

7.如权利要求1所述的交流电模式下的纳米孔单分子荧光成像装置，其特征在于，所述的纳米孔为生物纳米孔或固态纳米孔；

所述的生物纳米孔包括α-溶血素纳米孔、MspA蛋白纳米孔和Phi29蛋白纳米孔；

所述的固态纳米孔包括Si纳米孔、Si₃N₄纳米孔、Al₂O₃纳米孔、高分子膜孔、石墨烯孔。

8.如权利要求1所述的交流电模式下的纳米孔单分子荧光成像装置，其特征在于，纳米孔上方介质中的荧光探针包括能特异性结合离子发荧光的罗丹明类、香豆素类、萘酰亚胺类、荧光素类和芘类化合物的荧光探针；

纳米孔下方介质中的指示离子包括可结合相应荧光探针的离子：Ca²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺和Al³⁺。

9.一种交流电模式下的纳米孔单分子荧光成像方法，其特征在于，包括以下操作：

(a)构建可进行全内反射荧光成像的纳米孔成像池：纳米孔膜在水平方向固定于检测池中间，将上、下两侧的正、反检测池分隔开；其中纳米孔上方的正检测池介质中含有荧光探针和电解质，下方的反检测池介质中含有相应的指示离子和电解质；反检测池下方以盖玻片作为基底，两支电极分别浸没于两侧正、反检测池溶液中，两支电极在纳米孔膜两侧施加电位；

(b)提供交流电参数可调控的交变电场源：将交流信号发生系统输出接口与电流放大系统输入接口相连接，交变电场通过电流放大系统在纳米孔检测池中的两支电极之间施加交流电势；

(c)通过全内反射荧光成像系统对纳米孔进行荧光成像实时监测；

(d)在全内反射荧光显微系统对纳米孔进行荧光成像时，激发光由纳米孔下方的光密介质入射，当入射角为临界角时，激发光在纳米孔所处的光密介质和光疏介质的界面发生全内反射；指示离子在电位驱动下通过纳米孔后特异性结合另一侧荧光探针发荧光，当单个分子通过纳米孔时，阻碍指示离子流，荧光强度发生瞬时降低。

10.如权利要求9所述的一种交流电模式下的纳米孔单分子荧光成像方法，其特征在于，所述纳米孔检测池上、下两侧的正、反检测池中分别提供低折射率介质和高折射率介质，纳米孔置于光密介质和光疏介质的水平方向界面；纳米孔上、下两侧的介质为水溶液或水凝胶。所述介质折射率通过改变水溶液中溶质种类、浓度或水凝胶浓度进行调控；

所述的交流信号发生系统输出波形、频率、振幅、直流偏压可控的交变电压。