CN104870980A - 基因型解析装置以及基因型解析方法 - Google Patents

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Abstract

提供一种无需使用花费工夫和费用的特别的矩阵标准品来进行电泳，实现实际的解析对象样品的电泳的同时实现光谱校准的技术。在基因型解析装置中，其特征在于，使用在实际的样品的电泳时所使用的已知的DNA片段信息即分子量标准品和等位基因阶梯来得到基准荧光光谱，对于没有使用等位基因阶梯的毛细管检测分子量标准品的荧光光谱的偏移量，并使用该偏移量使基准荧光光谱偏移来计算荧光光谱，由此进行光谱校准。

Description

基因型解析装置以及基因型解析方法
技术领域
本发明涉及一种使用电泳的基因型解析装置及其解析方法。
背景技术
当前，以犯罪搜查或血缘关系的判定等为目的，广泛使用基于DNA多型的解析的DNA鉴定。相同种类的生物的DNA具有大致相似的碱基序列，但在部分位置具有不同的碱基序列。将这样在个体之间在DNA上的碱基序列中发现多样性的情况称为DNA多型，与基因水平中的个体差的形成有关。
作为DNA多型方式之一，有短串联重复序列(short tandem repeat，STR)或微卫星。STR是重复数次至数十次2碱基至7碱基长度左右的较短序列的特征性的序列模式，已知该重复次数根据个体而不同。将解析特定基因座位中的STR重复次数的组合称为STR解析。
在以犯罪搜查等为目的的DNA鉴定中使用了STR解析，其利用了STR重复次数的组合在个体间不同的性质。在FBI(美国联邦调查局)或国际刑警组织中定义了十至十几个用于DNA鉴定的STR的座位(基因座)作为DNA标记，并解析这些STR序列的重复次数的模式。该STR的重复次数的不同根据等位基因(对立基因)的不同而出现，因此以下将各个DNA标记中的STR重复次数记载为等位基因。
为了提取一定量的作为DNA标记而使用的STR的位置的DNA，进行PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应)。PCR是如下的技术，即通过在目标DNA两端指定被称为引物(Primer)序列的固定的碱基序列，来仅重复并扩增夹在引物序列之间的DNA片段，由此取得一定量的目标DNA样品。
为了测量通过PCR得到的目标DNA片段的片段长度而进行电泳。电泳是利用了根据DNA片段的长度，带电的泳动路中的泳动速度不同(DNA片段越长泳动速度越小)的现象的DNA片段的分离方法。作为电泳方法，近年来大多使用作为泳动路而使用毛细管的毛细管电泳。
毛细管电泳中，向被称为毛细管的细管填充凝胶等泳动介质，在该毛细管内使样品的DNA片段泳动。然后，通过测量样品结束泳动一定距离(通常为从毛细管一端至另一端)所需要的时间来调查DNA片段长度。用荧光色素标识各样品即各DNA片段，通过置于毛细管终端部的光学检测器来检测泳动后的样品的荧光信号。
标识DNA片段的各荧光色素分别具有不同的光谱，但它们不是尖锐的，而是各个荧光色素之间有重叠。因此，在毛细管终端部中的光学检测器中，通过不同荧光色素标识的DNA片段具有相同程度的片段长度的情况下，由光学检测器得到的光谱成为不同荧光色素的光谱(以下，称为荧光光谱)的线性和，即加权和。因此，为了求出各个荧光色素的信号强度，根据由光学检测器得到的光谱，求出构成该光谱的各荧光色素的光谱的线性系数即权重值即可。该权重值相当于各荧光色素的信号强度。
为了求出该荧光色素的信号强度，各荧光光谱必须是预先已知的。各荧光光谱本来是根据与装置无关的荧光色素或泳动介质来唯一地决定的，但在实际的装置中，根据毛细管与荧光信号检测器的位置关系，在光学检测器上成像的荧光光谱偏移。因此，在更换毛细管时，需要在对目标样品进行电泳前预先求出荧光光谱并调整荧光光谱的位置的校准(以下，称为光谱校准)。另外，使用排列了多个毛细管的毛细管阵列对多个样品同时进行电泳的情况下，需要对各个毛细管求出荧光光谱。
接着，参照图2和图3对现有技术的光谱校准的一例进行说明。
图2是表示在设置于毛细管终端部的上述光学检测器上成像的图像的例子的图。通过CCD拍摄元件检测用衍射光栅向波长方向分离对毛细管终端部照射特定波长的激光而得到的各荧光色素的激励光而得到的图像。该图是对排列了8个毛细管(1)～(8)的毛细管阵列照射激光时的衍射光栅图像(图中的下段)。该图(下段)是纵轴表示毛细管排列方向，横轴表示波长方向的图，该图(上段)是表示与在下段所示的毛细管(4)的A-A’方向对应的信号强度的图。在该图(上段)中，表示纵轴采用表示信号强度的亮度值，横轴采用波长时的信号强度分布。如该图(上段)所示，特定毛细管的光谱可以得到纵轴表示该毛细管的信号强度，横轴表示波长的波形。
另外，在图2中示出了使用衍射光栅连续(实际上对每个像素离散)地测量光谱的例子，但在实用中，也可以是以更宽的波长间隔对上述光谱进行采样而得的数据。例如，如该图所示，也可以对各毛细管仅取得20个波长λ(0)～λ(19)的亮度值。此外，也可以取上述λ(0)～λ(19)的各个波长近旁的亮度值的相加平均。
此外，也可以不使用衍射光栅，而是高速地切换对各荧光色素仅过滤灵敏度最高的波长带的滤光器来进行拍摄。或者，也可以具备荧光色素数量的拍摄元件和与该荧光色素对应的滤光器，同时拍摄各荧光色素。这样的情况相当于在该图的光谱中，在与各荧光色素对应的样品位置对光谱进行了采样，因此同样能够应用之后的本发明的手段。
图3是表示光谱校准的处理流程的图。在步骤301，对称为矩阵标准品(Matrix Standard)的样品进行电泳。矩阵标准品是以取得荧光光谱并得到后述的矩阵为目的而进行电泳的试剂。
在此，使用图4A、图4B来说明矩阵标准品的概要。在图4A、图4B中假定获得5种荧光色素(LIZ、PET、NED、VIC、6FAM)的荧光光谱。在图4A中，纵轴取荧光强度，横轴取时刻，所述5种荧光色素在与各个荧光色素对应的时刻表示锐峰值。因此，为了得到各个荧光色素的荧光光谱，取得仅该荧光色素发光的时刻(在图4A中为t0、t1、t2、t3、t4)的光谱即可。因此，在矩阵标准品中，分别用不同的荧光色素标识了长度不同的5种DNA片段。与各个荧光色素对应的DNA片段的长度或长度的顺序信息是已知的。
接着，在步骤302，根据由步骤301的电泳得到的各时刻的光谱计算各荧光色素的强度。该处理的细节在后进行叙述。该处理可以对各个扫描时刻进行，也可以在积蓄了一定的时间间隔量的光谱数据后进行。图4A表示得到的荧光强度的波形的例子。
在图4A中示出了使以扫描时刻为横轴的各荧光色素的信号强度(以下，称为荧光强度)波形在一个图表上重叠的情况。在荧光强度波形中看到峰，该峰时刻相当于DNA片段长度。如上所述，在矩阵标准品中，对长度不同的DNA片段分别用不同的荧光色素进行了标识，因此在各峰时刻(t0、t1、t2、t3、t4)各荧光色素单独地发光。
因此，在步骤303中，检测图4A的荧光强度(信号强度)波形的峰时刻。对该峰检测处理进行后述。图4A表示得到了峰时刻t0、t1、t2、t3、t4的情况。如上所述，与各个荧光色素对应的峰时刻的出现顺序是已知的，因此能够确定与各个峰时刻对应的荧光色素的种类。该图表示在时刻t0，LIZ单独发光，在时刻t1，PET单独发光，在时刻t2，NED单独发光，在时刻t3，VIC单独发光，在时刻t4，6FAM单独发光。也就是说，各个时刻的光谱相当于各个荧光色素的荧光光谱。因此，取得各个峰时刻的光谱即可(参照图4B)。
然后，在步骤304中，使用该各荧光光谱计算后述的矩阵。该矩阵是用于从由检测器得出的光谱波形中得到各个荧光色素的强度的矩阵。将计算该矩阵的处理称为光谱校准。具有多个毛细管的情况下，需要对各个毛细管计算该矩阵。此外，在每次进行毛细管设置或部件更换等时需要进行该光谱校准。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:US2009/0228245说明书
发明内容
发明要解决的问题
但是，在上述的现有技术的光谱校准中，在进行实际解析对象的样品的电泳前，需要对矩阵标准品另外进行电泳，因此存在花费工夫和时间的问题。此外，矩阵标准品作为消耗品是必要的，因此对装置使用者来说存在价格增加的问题。
因此，本发明的目的是提供一种无需使用花费工夫和费用的特别的矩阵标准品来进行电泳，同时实现实际解析对象样品的电泳和光谱校准的技术。
用于解决问题的手段
作为解决上述问题的手段，在本发明的基因型解析装置中，其特征在于，使用在实际的样品的电泳时所使用的已知的DNA片段信息即分子量标准品(Size Standard)和等位基因阶梯来得到基准荧光光谱。
并且，对于不使用等位基因阶梯的毛细管，检测分子量标准品的荧光光谱的偏移量，并使用该偏移量使基准荧光光谱偏移来计算荧光光谱，由此进行光谱校准。
此外，对于不使用等位基因阶梯的毛细管，不使用上述偏移量，而是直接使用实际样品的电泳结果来进行光谱校准。
发明效果
根据本发明，不需要使用特别的矩阵标准品来进行电泳，因此能够在短时间且以低成本实现光谱校准。
附图说明
图1是表示实施例1的基因型解析装置的概要结构的图。
图2是表示在实施例1的电泳装置的光学检测器上成像的图像的例子的图。
图3是表示现有技术的光谱校准处理流程的图。
图4A是用于说明现有技术的光谱校准的概要的图。
图4B是用于说明现有技术的光谱校准的概要的图。
图5是表示实施例1的电泳装置的概要结构的图。
图6是表示实施例1的基因型解析装置的处理流程的图。
图7是表示实施例1的电泳处理流程的图。
图8是表示实施例1的光谱数据的保存例的图。
图9是表示等位基因阶梯的荧光强度波形的例子的图。
图10是表示实际样品的荧光强度波形的例子的图。
图11是用于说明高斯拟合的概要的图。
图12A是用于说明实施例1的分子量识别的概要的图。
图12B是用于说明实施例1的分子量识别的概要的图。
图13是用于说明实施例1的基准荧光光谱的取得概要的图。
图14是表示实施例1的基准荧光光谱取得处理的流程的图。
图15是用于说明等位基因阶梯所包含的等位基因信息的一例的图。
图16是用于说明实施例1的单色峰时刻的提取的一例的图。
图17是表示实施例1的荧光光谱计算处理的流程的图。
图18是表示实施例1的基准荧光光谱的一例的图。
图19A是用于说明实施例1的荧光光谱计算的概要的图。
图19B是用于说明实施例1的荧光光谱计算的概要的图。
图20是表示实施例1的STR解析的处理流程的图。
图21是用于说明实施例2的基准荧光光谱取得的概要的图。
图22是用于说明实施例2的基准荧光光谱的修正的一例的图。
图23是用于说明实施例2的基准荧光光谱的修正中的判定处理的一例的图。
图24是用于说明实施例3的荧光光谱取得的概念的图。
图25是表示实施例3的基因型解析装置的处理流程的图。
图26是表示实施例4的基因型解析装置的处理流程的图。
图27是表示实施例4的拉曼光谱的一例的图。
图28是用于说明实施例1的测量光谱的基线信号的概念的图。
图29是用于说明实施例1的测量光谱的时序数据中的基线信号的概念的图。
图30是用于说明假峰的概念的图。
图31是表示实施例5的基因解析装置的处理流程的图。
图32是用于说明实施例5的基因解析装置的假峰的判定条件的图。
图33是表示实施例5的基因解析装置的用户界面画面例的图。
具体实施方式
本发明提供一种与实际样品的电泳同时实现光谱校准的技术。
以下，参照附图对实施例进行说明。但是应注意本实施例仅为用于实现本发明的一例，而不对本发明的技术范围进行限定。此外，在各附图中对相同的结构赋予相同的参照符号。
实施例1
图1表示本发明的实施例1的基因型解析装置的结构。基因型解析装置101由数据解析装置112和电泳装置105构成。数据解析装置112由用于进行电泳控制或数据处理等的中央控制部102、进行向用户的信息提示或来自用户的信息输入的用户界面部103以及存储数据或装置的设定信息的存储部104构成。
中央控制部102由样品信息设定部106、电泳装置控制部108、荧光强度计算部110、峰检测部107、矩阵计算部109以及STR解析部111构成。对各个功能进行后述。
图5是电泳装置105的概要图。参照图5对电泳装置105的结构进行说明。
电泳装置105由如下部分构成：用于以光学方式检测样品的检测部516、用于将毛细管保持恒温的恒温槽518、用于向毛细管阴极端搬运各种容器的搬运机525、用于向毛细管施加高电压的高压电源504、用于检测从高压电源产生的电流的第1电流计505、用于检测流过阳极侧电极的电流的第2电流计512、由一根或多根毛细管502构成的毛细管阵列517以及用于向毛细管注入聚合物的泵机构503。
毛细管阵列517是包含多根(例如8根)毛细管的更换部件，包括载入头部(load header)529、检测部516以及毛细管头部。此外，在毛细管中发现破损或品质劣化时，更换成新的毛细管阵列。
毛细管由内径为数十～数百微米，且外形为数百微米的玻璃管构成，为了提高强度在表面上涂敷了聚酰亚胺。但是，被照射激光的光照射部成为了去除了聚酰亚胺膜的构造，以使内部的发光容易向外部泄露。在毛细管502的内部填充用于在电泳时提供泳动速度差的分离介质。分离介质存在流动性和非流动性双方，但在本实施例中使用流动性的聚合物。
检测部516是用于取得依存于样品的信息的部件。从光源514向检测部516照射激励光时，从样品产生信息光(具有依存于样品的波长的荧光)而向外部放出。该信息光通过衍射光栅532在波长方向上分光，通过光学检测器515检测分光后的信息光来分析样品。
毛细管阴极侧端527分别通过金属制的空心电极526被固定，成为毛细管前端从空心电极526突出0.5mm左右的状态。此外，对每个毛细管配备的空心电极全部成一体地安装在载入头部529。并且，所有空心电极526与搭载在装置本体上的高压电源504导通，在电泳或样品导入等需要施加电压时作为阴极电极而工作。
与毛细管阴极端侧527相反侧的毛细管端部(另一端部)通过毛细管头部被捆成一体。毛细管头部可以通过耐压气密与块507连接。并且，通过注射器506从另一端部向毛细管内填充新聚合物。为了提高测定性能，每次测定时实施毛细管中的聚合物重装。
泵机构503由注射器506和用于加压该注射器的机构系统构成。此外，块507是用于使注射器506、毛细管阵列517、阳极缓冲容器510以及聚合物容器509分别连通的连接部。
光学检测部由用于照射检测部516的光源514、用于检测检测部516内的发光的光学检测器515以及衍射光栅532构成。在检测通过电泳而分离的毛细管中的样品时，通过光源514照射毛细管的检测部516，对来自检测部516的发光通过衍射光栅532进行分光，并通过光学检测器515进行检测。
恒温槽518为了将恒温槽内保持恒定温度，用绝热材料覆盖并通过加热冷却机构520控制温度。此外，风扇519使恒温槽内的空气进行循环以及搅拌，将毛细管阵列517的温度在位置上保持均匀且恒定。
搬运机525具备3个电动机和线性致动器，可以在上下、左右以及纵深方向的3轴上移动。此外，在搬运机525的移动载物台530上可以载置至少1个以上的容器。并且，在移动载物台530上具备电动夹钳531，能够抓住或放下各容器。因此，可以根据需要将缓冲容器521、清洗容器522、废液容器523以及样品容器524搬送至毛细管阴极端527。另外，将不需要的容器保管在装置内的预定收纳所。
电泳装置105在通过通信电缆与数据解析装置112连接的状态下被使用。操作员可以通过数据解析装置112控制装置保有的功能，并接收发送通过装置内的检测器检测出的数据。
参照图6，根据本实施例对基因型解析装置的处理流程的概要进行说明。
首先，在步骤601中，进行解析对象的实际样品的电泳处理。
接着，在步骤602中，根据通过电泳得到的光谱波形数据计算各荧光色素的荧光强度。
然后，在步骤603中，根据荧光强度的波形检测峰。
接着，步骤604中，通过取得所得到的峰时刻与分子量标准品的已知DNA片段长度信息的映射，得到时刻与DNA片段长度的对应关系。将该处理称为分子量识别(Size Calling)。
之后，在步骤605中，取得基准毛细管的荧光光谱。在此，基准毛细管表示对后述的等位基因阶梯(Allelic ladder)进行电泳的毛细管。
接着，在步骤606中，计算其他毛细管的荧光光谱。
之后，在步骤607中，使用取得的荧光光谱计算矩阵。
然后，在步骤608中，使用得到的矩阵计算各荧光色素的荧光强度。
之后，在步骤609中，使用得到的荧光强度数据进行STR解析。
另外，图6所示的处理流程所示的步骤610表示也有跳过中途的步骤而直接进入步骤609，进行STR解析的情况。关于其具体情况进行后述。
以下，参照附图，对上述的各个步骤601～609中的处理细节进行叙述。
＜步骤601的说明＞
图7表示步骤601中的实际样品的电泳处理流程。
电泳的基本顺序可大致分为：样品准备(步骤701)、分析开始(步骤702)、泳动介质填充(步骤703)、预备泳动(步骤704)、样品导入(步骤705)以及泳动分析(步骤705)。
以下，对各步骤的处理进行详述。
步骤701：本装置的操作员在本装置上设置样品或试剂，作为分析开始前的样品准备(步骤701)。更具体而言，首先在图5所示的缓冲容器521和阳极缓冲容器510内装满用于形成通电路的一部分的缓冲液。缓冲液例如是各公司作为电泳用而出售的电解质液体。此外，向样品盘524的槽内分注作为分析对象的样品。样品例如是DNA的PCR产物。此外，向清洗容器522分注用于清洗毛细管阴极端527的清洗溶液。清洗溶液例如是纯水。此外，向注射器506内注入用于使样品电泳的分离介质。泳动介质例如是各公司作为电泳用而出售的聚丙烯酰胺系分离凝胶。并且，在预想到毛细管502的劣化的情况下，或变更毛细管502的长度的情况下，更换毛细管阵列517。
此时，作为设置在样品盘524上的样品，除了作为解析对象的DNA的实际样品外，还有阳性对照、阴性对照以及等位基因阶梯，分别在不同的毛细管中进行电泳。阳性对照例如是包含已知的DNA的PCR产物，是用于确认通过PCR正确地扩增了DNA的对照实验用样品。阴性对照是没有包含DNA的PCR产物，是用于确认在PCR的扩增物中没有产生操作员的DNA或尘土等的污染的对照实验用样品。
等位基因阶梯是包含多个在DNA标记中一般可能含有的等位基因的人工样品，通常作为DNA鉴定用试剂盒由试剂制造商提供。使用等位基因阶梯的目的是对各个DNA标记的DNA片段长度与等位基因的对应关系进行微调。对于等位基因阶梯进行后述。
此外，对于上述的实际样品、阳性对照、阴性对照以及等位基因阶梯的全部样品，混有被称为分子量标准品的、用特定的荧光色素标识了的已知的DNA片段。根据使用的试剂盒，向分子量标准品分配的荧光色素的种类不同。例如在图12A所示的分子量标准品试剂中，将长度为80bp至480bp之间的已知的DNA片段用荧光色素LIZ进行了标识。在后述的分子量识别中，为了得到扫描时刻与DNA片段长度的对应关系，对所有的毛细管的样品混合分子量标准品。
操作员指定等位基因阶梯的种类或分子量标准品的种类、荧光试剂的种类、在各个毛细管(对应的样品盘524上的槽)中设置的样品的种类等。在本实施例中，作为样品种类，指定实际样品、阳性对照、阴性对照以及等位基因阶梯中的某个种类。在数据解析装置112上，经由用户界面部103对样品信息设定部106设定这些信息。
步骤702：然后，完成上述样品准备(步骤701)后，操作员在图1所示的数据解析装置112上操作用户界面部103来指示分析开始。该分析开始指示被传送给电泳装置控制部108。通过电泳装置控制部108将分析开始信号发送给电泳装置105来开始分析。
步骤703：接着，在图1所示的电泳装置105中，开始泳动介质填充(步骤703)。该步骤可以在分析开始后自动地进行，也可以逐次通过从电泳装置控制部108发送控制信号而进行。泳动介质填充是向毛细管502内填充新的泳动介质，形成泳动路的步骤。
在本实施例1中的泳动介质填充(步骤703)中，首先，通过图1所示的搬运机525将废液容器523搬运至载入头部529的正下方，接住从毛细管阴极端527排出的使用过的泳动介质。然后，驱动注射器503向毛细管502填充新的泳动介质，废弃使用过的泳动介质。最后，向清洗容器522内的清洗溶液浸泡毛细管阴极端527，清洗被泳动介质污染的毛细管阴极端527。
步骤704：接着，进行预备泳动(步骤704)。该步骤可以自动地进行，也可以逐次通过从电泳装置控制部108发送控制信号而进行。预备泳动是向泳动介质施加预定的电压，使泳动介质成为适于电泳的状态的步骤。在本实施例的预备泳动(步骤704)中，首先，通过搬运机525向缓冲容器521内的缓冲液浸泡毛细管阴极端527，形成通电路。然后，通过高压电源504向泳动介质施加数分钟～数十分钟的数千伏～数十千伏程度的电压，使泳动介质成为适于电泳的状态。最后，向清洗容器522内的清洗溶液浸泡毛细管阴极端527，清洗被缓冲液污染的毛细管阴极端527。
步骤705：接着，进行样品导入(步骤705)。该步骤可以自动地进行，也可以逐次通过从电泳装置控制部108发送控制信号而进行。在样品导入(步骤705)中，将样品成分导入泳动路。在本实施例的样品导入(步骤705)中，首先，通过搬运机525向在样品盘524的槽内所保持的样品浸泡毛细管阴极端527。由此，形成通电路，成为向泳动路导入样品成分的状态。并且，通过高压电源504向通电路施加脉冲电压，向泳动路导入样品成分。最后，向清洗容器522内的清洗溶液浸泡毛细管阴极端527，清洗被样品污染的毛细管阴极端527。
步骤706：接着，进行泳动分析(步骤706)。该步骤可以自动地进行，也可以逐次通过从电泳装置控制部108发送控制信号而进行。在泳动分析(步骤706)中，通过电泳对样品中所包含的各样品成分进行分离分析。在本实施例的泳动分析(步骤706)中，首先，通过搬运机525向缓冲容器521内的缓冲液浸泡毛细管阴极端527，形成通电路。接着，通过高压电源504向通电路施加15kV左右的高电压，在泳动路中产生电场。通过产生的电场，泳动路内的各样品成分以依存于各样品成分性质的速度向检测部516移动。也就是说，样品成分通过其移动速度差被分离。然后，从到达检测部516的样品成分按照顺序进行检测。例如，在样品包含大量碱基长度不同的DNA的情况下，根据该碱基长度在移动速度产生差，从碱基长度较短的DNA开始按照顺序到达检测部516。在各DNA上安装有依存于其末端碱基序列的荧光色素。从光源514向检测部516照射激励光时，从样品产生信息光(具有依存于样品的波长的荧光)，向外部放出。通过光学检测器515检测该信息光。图2是通过光学检测器515检测出的图像的一例。泳动分析中，在光学检测器515中以一定的时间间隔检测该信息光，并将图像数据发送给数据解析装置112。或者，为了减少要发送的信息量，也可以发送图像数据中的仅一部分区域的亮度而不是发送图像数据。例如，可以对每个毛细管发送仅一定间隔的波长位置的亮度值。
在本实施例中，如图2的说明所述，仅向数据解析装置112发送上述图像数据中的、每个毛细管的20个波长λ(0)～λ(19)的亮度值数据。该亮度值数据表示各毛细管的光谱。将该光谱存储在存储部104(参照图8)。如图8所示，在存储部104中存储上述泳动分析中的所有检测时刻的所有毛细管的光谱。另外，在本实施例中期望存储所有检测时刻的光谱，但仅特定的峰时刻在STR解析中重要的情况下，也可以仅存储特定时刻周边的光谱。
步骤707：最后，若结束取得预定的图像数据，则停止电压施加，结束泳动分析(步骤707)。
以上为图6中的电泳处理(步骤601)的处理的一例。
＜步骤602的说明＞
接着，对图6中的荧光色素强度计算处理的一例进行说明。
根据在上述的电泳处理(步骤601)中得到的图像数据计算各荧光色素的强度(步骤602)。在图1中的荧光强度计算部110中进行该荧光强度计算处理。在荧光强度计算处理(步骤602)中，对各个时刻的各个毛细管的光谱乘以λ(0)～λ(19)的各个波长的各荧光色素的强度比率并相加即可。将其用矩阵表现时如(式1)所示。
在此，向量C为荧光强度向量，其要素CF、CV、CN、CP以及CL分别表示6FAM、VIC、NED、PET以及LIZ的荧光强度。
向量f是测量光谱向量，其要素f0至f19分别表示波长λ(0)至λ(19)的信号强度(亮度值)。或者，要素f0至f19也可以分别是波长λ(0)至λ(19)的近旁的信号强度的加算平均等。另外，通过光学检测器515检测的、各个波长λ(0)至λ(19)的测量信号中除了包含基于荧光色素的信号外，还包含来自向毛细管内充填的聚合物的拉曼散射光作为基线信号。因此，计算向量f时，需要预先去除该基线信号(参照图28)。
作为该基线信号的去除方法的一例，在装置出厂前预先求出拉曼散射光的光谱，将其作为基线信号存储在存储部104中。并且，可以从各个时刻的测量信号减去该基线信号来求出基于荧光色素的信号，并将其设为测量光谱向量f。或者，如图29所示，当观察各个波长(λ(0)至λ(19))的测量信号作为时序数据时，能够直观地区别基于荧光色素的信号和除此以外的基线信号。因此，也可以通过对各个波长(λ(0)至λ(19))的测量信号添加用于去除低频成分的高通滤波器来去除基线信号。或者，也可以将各时刻的近旁的最小值设为该时刻的基线信号值。
矩阵(Matrix)M是将测量光谱f变换为荧光强度向量的矩阵，其要素相当于各个波长下的各个荧光色素的强度比率。例如，式1的矩阵M的要素WF0是波长λ(0)下的荧光色素6FAM的荧光强度的比率。该值越高表示在该波长下向该荧光色素的强度的贡献越高。
[式1]
c = M f c = c F c V c N c P c L t f = f 0 f 1 ...... f 18 f 19 t M = w F 0 w F 1 w F 18 w F 19 w V 0 w V 1 w V 18 w V 19 w N 0 w N 1 ...... w N 18 w N 19 w P 0 w P 1 w P 18 w P 19 w L 0 w L 1 w L 18 w L 19 …(式1)
矩阵M本来根据荧光色素的种类和泳动路的条件而被唯一地决定，但实际上能够根据毛细管与检测器的位置关系而变动，因此在更换毛细管等时需要进行计算。求出该矩阵M的一连串的处理为光谱校准。
在本实施例中，假定预先通过测量得到了矩阵的初始值。此外，假定同样得到了用于得到初始矩阵的、后述的荧光光谱。并且，在本实施例中，假定在存储部104内对基因型解析装置对应的每个荧光试剂的种类或商品存储了通过预先测量而决定的初始矩阵以及用于得到该初始矩阵的荧光光谱(后述)。或者，也可以在存储部104内存储在上次的光谱校准中得到的矩阵以及此时的荧光光谱作为初始值。但是，如后所述，由于能够从荧光光谱得到矩阵、从矩阵得到荧光光谱，因此也可以仅存储某一方的信息。
然后，在图7的电泳处理的样品准备(步骤701)中，在样品信息设定部106中设定了荧光试剂的种类时，将与该荧光试剂的种类对应的矩阵的初始值传送给荧光强度计算部110。
或者，在存储部104内存储在上次的光谱校准中得到的矩阵，且此时的荧光试剂的种类与这次的荧光试剂的种类相同的情况下，也可以将上次的矩阵设为初始值。
使用该矩阵M的初始值，通过(式1)根据测量光谱计算各荧光色素的荧光强度。通过对各时刻的各毛细管的光谱进行该处理，能够得到各毛细管的荧光强度的时序数据。以下，将该荧光强度的时序数据表示为荧光强度波形。
图9和图10表示电泳(步骤601)后，在步骤602中得到的荧光强度的时间变化的例子。图9是对等位基因阶梯实施了电泳时的荧光强度波形的例子。图10是实际样品的荧光强度波形的例子。各个荧光强度的峰出现的时刻相当于用各个荧光色素标识的DNA片段的长度，该长度的不同相当于等位基因的不同。等位基因阶梯是包含多个在DNA标记中一般含有的等位基因的人工样品，因此已知在图9的荧光强度波形中观测到多个峰。在图10的实际样品的荧光强度波形中，对各个DNA标记包含1个或2个峰，在峰为1个的情况下，该峰的荧光强度与峰为2个的标记的荧光强度相比较高。在峰为1个的情况下表示同质结(来自父亲的等位基因与来自母亲的等位基因相同)，在峰为2个的情况下表示异质结(来自父亲的等位基因与来自母亲的等位基因不同)。另外，图10是一人对样品DNA有贡献的例子，若为多人的DNA混合的混合样品的情况下，有时根据该多人的贡献率，对一个DNA标记存在3个以上的峰。
＜步骤603的说明＞
接着，对图6中的峰检测处理的一例进行说明。
对通过图6的荧光强度计算处理(步骤602)得到的、上述的荧光强度波形进行峰检测(步骤603)。在峰检测中，主要是峰的中心位置(峰时刻)、峰的高度以及峰的宽度是重要的。峰的中心位置对应于DNA片段长度，对于等位基因的识别最重要。此外，峰的高度被用于同质结/异质结的识别或样品中的DNA浓度的大小等的品质评价。峰的宽度在评价样品或电泳结果的品质时也很重要。作为推定这样的实际数据的峰参数的方法之一，可以使用作为已知技术的高斯拟合。
图11表示高斯拟合的概念。如该图所示，高斯拟合是对一定区间的实际数据计算高斯函数g最近似于实际数据的参数(平均值μ、标准偏差σ以及最大振幅值A)的处理。作为表示实际数据的近似程度的指标，大多使用实际数据和高斯函数值的最小二乘误差。作为使该最小二乘误差最小的数值计算方法，可以使用高斯牛顿法等现有方法使参数最佳化。此外，也可以应用如专利文献1公开的、混合了2个以上的峰波形的情况或峰周边的数据不对称等情况下的用于提高精度的方法。并且，若决定了高斯函数g的方差σ，则通过在图11中所示的式子得到其半值宽度(FWHM：Full Width at Half Maximum)。可以将该值设定为峰宽度。
如上所述，对所有的荧光色素的荧光强度波形求出峰参数。此时，在峰宽度或峰高度不满足预先决定的阈值条件的情况下，也可以从峰中去除。
＜步骤604的说明＞
接着，对图6中的分子量识别处理的一例进行说明。
分子量识别是将通过电泳检测出DNA片段为止所需要的时间与DNA片段长度对应起来的处理，在本实施例中通过数据解析装置112中的STR解析部111来进行。具体如上所述，包含被称为分子量标准品的已知长度的DNA片段，且对用特定荧光色素将它们标识的试剂进行电泳。例如，在图12A所示的分子量标准品试剂中，对长度为80bp至480bp之间的已知的DNA片段用荧光色素LIZ进行标识。对通过所述的峰检测(步骤603)得到的峰的中心位置(即，峰时刻)对应已知的DNA片段长度。可以从这些峰时刻与已知的DNA片段长度的组合中，得到电泳时间与DNA片段长度的对应式。
图12B是表示求出该DNA泳动时间(t)与DNA片段长度(y)的关系式“y＝f(t)”的情况的图。标绘分子量标准品的已知DNA片段长度和与之对应的峰时刻，并求出对该标绘进行最佳近似的关系式y＝f(t)。作为f(t)，可以使用二次式或三次式等来进行使其二乘误差为最小的近似。此外，用户可以经由用户界面部103对STR解析部111指定使用怎样的近似式。对所有的毛细管求出这样得到的DNA泳动时间(t)与DNA片段长度(y)的关系式“y＝f(t)”并保持。使用该关系式，可以根据在各毛细管中测量的荧光强度波形的峰时刻求出此时的DNA片段长度。
＜步骤605的说明＞
接着，对图6中的基准荧光光谱取得处理的一例进行说明。
基准荧光光谱是通过将其偏移而成为用于求出其他毛细管的荧光光谱的基准的荧光光谱。在本说明书中，将对等位基因阶梯进行电泳的毛细管称为基准毛细管，将基准毛细管中的荧光光谱称为基准荧光光谱。在本实施例中，通过图1的数据解析装置112中的矩阵计算部109进行该处理。
若上述的基准荧光光谱处理的取得失败的情况下，也可以将所述的基准毛细管中的初始的荧光光谱(假定已保存在存储部104)设为基准荧光光谱。或者，也可以通过路径610使用应用了初始的矩阵的荧光强度波形来进行STR解析。
使用图13和图14说明基准荧光光谱取得处理(步骤605)。图13表示基准毛细管中的各荧光色素的荧光强度波形，即示意性地表示图9所示的波形。在该图中表示等位基因阶梯和分子量标准品的荧光强度波形，用6FAM、VIC、NED、PET标识了等位基因阶梯，用LIZ标识了分子量标准品。
图14是表示基准荧光光谱取得处理(步骤605)的处理流程的流程图。
如该图所示，在本实施例中，提取基准毛细管的上述5个荧光强度波形中的、仅用单一荧光色素观测峰的时刻(以下，称为单色峰时刻)(步骤1401)。然后，取得该单色峰时刻的光谱(步骤1402)，由此视为该颜色的荧光光谱。
以下，对步骤1401中的单色峰时刻的检测处理进行说明。
在图13中，T(V)、T(N)、T(F)、T(P)以及T(L)分别是荧光色素VIC、NED、6FAM、PET以及LIZ的单色峰时刻，在各个时刻视为没有相互向其他荧光色素的荧光强度的贡献。
上述的单色峰时刻可以根据对电泳装置设置的等位基因阶梯和分子量标准品的种类来决定。即，在等位基因阶梯和分子量标准品中必定公开该试剂所含有的DNA片段长度信息，并在后述的STR解析中使用这些信息。分子量标准品的已知的DNA片段长度，如以上所述在分子量识别中为了得到电泳时间与DNA片段长度的关系式而使用。等位基因阶梯的荧光强度波形如图9所示，在该图中观测到的峰相当于等位基因阶梯所含有的各DNA片段的长度。图15表示该等位基因阶梯所含有的DNA片段信息的一部分。
在该图中，作为等位基因阶梯的信息，示出了各荧光色素(Dye)标识的基因座名(Locus)，该基因座所含有的等位基因名(Allele)、与该等位基因对应的DNA片段长度(Length)以及离开各等位基因的中心位置的容许碱基长宽度(Min/Max)的信息。例如，在该图中DNA标记(基因座)D10S1248被用6FAM标识，作为其等位基因包含8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18，其DNA片段长度(单位为bp)分别为77、81、85、89、93、97、101、109、113、117。表示所有的等位基因具有正0.5bp、负0.5bp的容许宽度。该等位基因相当于荧光强度波形的1峰。在图15中仅示出了DNA标记D10S1248的信息的例子，但对于等位基因阶梯所包含的所有基因座公开了上述的信息。这样的等位基因阶梯的DNA片段长度信息预先被存储在存储部104中，在所述的样品准备(图7中的步骤701)中，在设定了等位基因阶梯的种类时，可以从存储部104向矩阵计算部109读入设定的种类的等位基因阶梯的DNA片段长度信息。因此，对于图9所示的等位基因阶梯的荧光强度波形的所有峰，该DNA片段长度是已知的，因此使用该已知信息来提取单色峰时刻即可。
图16表示使用附属于等位基因阶梯的DNA片段长度信息来提取单色峰时刻的例子。在该图中示出了各荧光强度波形的峰位置。另外，该图的横轴不是表示电泳时间而是表示DNA片段长度，但通过分子量识别使两者一一对应，因此无论是哪个本质上都是相同的。在图16(a)中并行示出了DNA片段长度为113bp至130bp之间所包含的所有荧光色素的峰。每个峰的最大容许宽度是从峰中心开始正负0.5bp。根据图16(a)的峰位置关系可知，可以在6FAM中提取峰1601(DNA片段长度为117bp)，在VIC中提取峰1602(DNA片段长度为125bp)，在NED中提取峰1603(DNA片段长度为127.3bp)作为各个荧光色素的单色峰时刻。同样地，在图16(b)中并行示出了在380bp附近所包含的所有荧光色素的峰。根据该图可知，在PET中可以提取峰1604(DNA片段长度384.5bp)作为单色峰时刻。同样地，在图16(c)中示出了在460bp附近的所有荧光色素的峰。根据该图可知，在荧光色素LIZ中可以提取峰1605(DNA片段长度460bp)作为单色峰时刻。
在没有得到上述单色峰时刻的情况下，也可以通过路径610使用应用了初始的矩阵的荧光强度波形来进行STR解析。
接着，对图14中的基准荧光光谱取得处理(步骤1402)进行叙述。
如以上图8的说明中所述，在本实施例中，将所有毛细管的所有检测时刻的光谱存储在存储部104中。因此，在上述的步骤1401中，以等位基因阶梯和分子量标准品的已知DNA片段长度信息为基础，提取基准毛细管中的单色峰时刻，并从存储部104取得该时刻的光谱。将其作为基准荧光光谱。如以上所述，进行图6中的基准荧光光谱取得处理(步骤605)。
＜步骤606的说明＞
接着，对图6中的荧光光谱计算的处理的一例进行说明。
该处理是以在步骤605中得到的基准荧光光谱为基础，求出基准毛细管以外的毛细管的荧光光谱的处理。在本实施例中，使用在所有毛细管中进行电泳的分子量标准品的荧光光谱来进行该处理。
图17表示荧光光谱计算处理(步骤606)的处理流程。在本实施例中，对基准毛细管以外的毛细管进行荧光光谱计算处理(步骤606)。首先，检测分子量标准品的单色峰时刻(步骤1701)。对于实际样品中的荧光强度波形的一例，已在图10中的说明中进行了叙述。在图10中的荧光色素LIZ的荧光强度波形中观测了多个与已知的DNA片段长度对应的峰，已经在步骤603中检测出了所有荧光强度波形中的峰时刻。使用该峰时刻信息提取荧光色素LIZ的单色峰时刻。即，与图14中的单色峰时刻检测(步骤1401)同样地，仅在荧光色素LIZ中找到峰存在的时刻即可。通常，分子量标准品具有比在实际样品的电泳中假定的最大值大的DNA片段长度的情况较多，因此也可以将相当于该最大的DNA片段长度的峰设为单色峰时刻。例如，在图16的例子中，峰1605(DNA片段长度为460bp)为该最大长度的DNA片段长度。如果因噪声等的影响，在步骤1701中不存在LIZ的单色峰时刻的情况下，通过图6中的路径610，可以在该毛细管中应用了初始的矩阵的状态下进行STR解析。
接着，取得该LIZ的单色峰时刻的LIZ的荧光光谱(步骤1702)。该处理与图14中的基准荧光光谱取得(步骤1402)同样地，从存储在存储部104中的所有时刻的所有毛细管的光谱中取得LIZ的单色峰时刻的光谱即可。其成为LIZ的荧光光谱。
接着，计算基准毛细管以外的毛细管(以下，记载为其他毛细管)中的荧光光谱从基准荧光光谱的偏移量(步骤1703)。在该偏移量的计算中使用标识分子量标准品的荧光色素(在本实施例中为LIZ)的荧光光谱。以下，使用图18、图19A、图19B对该偏移量的计算进行说明。
图18是以上所述的基准荧光光谱的一例。另外，在该图中正规化了所有荧光色素的荧光光谱的峰高度。此外，对于后述的偏移量，在该荧光光谱的数据的采样间隔较大的情况下，预先实施已知的样条插补等，设为相对于荧光光谱足够小的采样间隔。同样地，对于其他毛细管中的LIZ的荧光光谱波形，也对数据进行插补，以便成为相同的采样间隔。
然后，计算上述的基准荧光光谱中的LIZ的荧光光谱1801与其他毛细管中的荧光光谱1901之间的偏移量Δλ(参照图19A)。在该偏移量的计算中，例如将荧光光谱1801(进行了上述的插补的波形)设为f(n)，将荧光光谱1901(进行了上述的插补的波形)设为g(n)时，可以计算相互相关函数h(m)＝Σf(n)*g(m－n)，求出其值成为最大值的偏移量m，并将其设为Δλ。或者，可以对荧光光谱1801和荧光光谱1901进行上述的高斯拟合，求出各个峰波长，将该峰波长的差设为偏移量Δλ。
接着，通过使所有荧光色素的基准荧光光谱偏移上述Δλ，求出其他毛细管中的荧光光谱(图17中的步骤1704)。该处理如图19B所示，使在图18中得到的所有荧光色素的基准荧光光谱偏移Δλ即可。之后，根据插补后的荧光光谱新求出插补前的采样波长(在本实施例中为λ(0)至λ(19))的波形值即可。
如以上所述地得到其他毛细管中的荧光光谱。通过对基准毛细管以外的所有毛细管进行这样的处理，求出针对各毛细管的荧光光谱。
＜步骤607的说明＞
接着，对图6中的矩阵计算处理的一例进行说明。
在图6的流程中，使用在步骤606中得到的各毛细管的荧光光谱来计算矩阵M(步骤607)。在本实施例中，通过矩阵计算部109进行该处理。
以下，对某一个毛细管中的矩阵计算处理的实施例进行叙述，但对于其他毛细管也可以应用同样的处理。
将某个毛细管中的、在步骤606中得到5个种类的荧光色素6FAM、VIC、NED、PET以及LIZ的荧光光谱分别标记为向量SF、SV、SN、SP、SL。在此，将向量SF、SV、SN、SP、SL的维度设为20。即，如上所述，每个向量的要素是波长λ(0)～λ(19)中的各个荧光光谱的信号强度。并且，将在某时刻检测到的光谱设为向量f，将此时的荧光强度向量设为C。该向量f和向量C与(式1)相同。即，向量C的要素CF、CV、CN、CP以及CL分别表示6FAM、VIC、NED、PET以及LIZ的荧光强度。向量f的要素f0至f19分别表示波长λ(0)至λ(19)的信号强度(亮度值)。
此时，将以荧光光谱的向量SF、SV、SN、SP、SL为列而构成的矩阵S记为荧光光谱矩阵时，(式2)的关系式成立。从(式1)与(式2)的对比可知，矩阵M相当于荧光光谱矩阵S的逆矩阵。但是，荧光光谱矩阵S为非方阵((式2)中为20×5)，因此在该形式下无法得到其逆矩阵。这相当于对于未知数5(CF、CV、CN、CP以及CL)，条件式的数量为20时条件过多，因此无法得到满足全部条件式的未知数。
因此，已知不通过荧光光谱矩阵S的逆矩阵，而通过(式3)所示的矩阵(StS)-1St求出的矩阵M。将该(StS)-1St称为伪逆矩阵。此外，导出(式3)等价于通过最小二乘法求出5个未知数(CF、CV、CN、CP以及CL)，因此也将伪逆矩阵(StS)-1St称为最小二乘型一般逆矩阵。
[式2]
f = S c c = c F c V c N c P c L t f = f 0 f 1 ...... f 18 f 19 t S = s F s V s N s P s L = s F 0 s V 0 s N 0 s P 0 s L 0 s F 1 s V 1 s N 1 s P 1 s L 1 . . . . . . . . . . . . . . . s F 18 s V 18 s N 18 s P 18 s L 18 s F 19 s V 19 s N 19 s P 19 s L 19 …(式2）
[式3]
M＝(StS)-1St…(式3)
[式4]
S＝(MtM)-1Mt…(式4)
因此，在步骤607的矩阵计算处理中，对根据在步骤606中得到的荧光光谱而得到的荧光光谱矩阵S，计算(式3)的伪逆矩阵，由此能够得到矩阵M。对所有毛细管求出如上的矩阵，并保存它们。
另外，与(式3)同样地，根据(式1)与(式2)关系得到(式4)，因此能够根据矩阵信息容易地计算荧光光谱信息。
另外，在步骤607的矩阵计算处理中评价矩阵M的可靠性，在判定为可靠性较低的情况下，可以不使用该矩阵M，而是根据图6中的路径610，使用应用了初始矩阵的荧光强度波形来进行STR解析。作为该矩阵M的可靠性的指标的一例，例如可以对(式2〕示出的荧光光谱矩阵S列举通过S的转置矩阵与S的积而得到的矩阵的条件数(Condition Number)等。可以通过该矩阵的范数与其逆矩阵的范数的积来表现矩阵的条件数。将其用公式表示时如(式5)所示。
[式5]
ConditionNumber＝||(StS)||·||(StS)-1||…(式5)
作为范数的定义，有L1范数(矩阵要素的绝对值的总和)或L2范数(矩阵要素的平方的总和)等。(式5)所示的条件数表示通过数值解析求出其逆矩阵时的条件的好坏，在该条件数较大时，得到的逆矩阵的精度变差。即，通过(式3)求出矩阵M时的、(StS)的逆矩阵的精度变差，因此从该逆矩阵得到的矩阵M的可靠性也变低。通过(式5)得到的条件数高，表示因检测系统的噪声或泳动介质的劣化等某种原因，荧光光谱矩阵S的各荧光光谱的相互重叠程度变强，测量出的荧光光谱矩阵S的可靠性低。
＜步骤608的说明＞
接着，对图6中的荧光强度计算处理的一例进行说明。
在图6的流程中，使用上述矩阵M来计算各荧光色素的荧光强度(步骤608)。在本实施例中，通过荧光强度计算部110进行该处理。该荧光强度计算处理(步骤608)与在步骤602中叙述的处理同样地，使用在步骤607中得到的矩阵M，通过(式1)求出荧光强度向量C的各要素CF、CV、CN、CP以及CL。对各时刻求出该荧光强度向量C，并对每个荧光色素标绘为信号强度的时序数据时，可以得到图9或图10那样的荧光强度波形。
＜步骤609的说明＞
接着，对图6中的STR解析处理的一例进行说明。
在图6的流程中，使用上述每个荧光色素的荧光强度波形来进行STR解析(步骤609)。在本实施例中，通过STR解析部111进行该处理。
图20是表示STR解析的处理流程的图。如该图所示，STR解析处理由峰检测(步骤2001)、分子量识别(步骤2002)以及等位基因识别(Allele Calling)(步骤2003)这3个步骤构成。其中，峰检测(步骤2001)和分子量识别(步骤2002)分别与之前所述的峰检测(步骤603)和分子量识别(步骤604)的处理相同。即，与进行了步骤603和步骤604的处理时相比，在步骤607中变更矩阵M，还在步骤608中变更荧光强度波形，因此再次进行峰检测和分子量识别处理。
接着，对等位基因识别(步骤2003)的处理进行叙述。等位基因识别是对等位基因(如以上所述，相当于STR的重复次数)与DNA片段长度的对应关系进行微调的处理。在本实施例中，通过选择作为等位基因阶梯使用的试剂的种类，已得到等位基因阶梯所含有的所有基因座的信息(参照图15)，根据该等位基因阶梯信息得到各个等位基因与其DNA片段长度的对应关系。但是，在根据实际的等位基因阶梯的荧光强度波形(图9)中的各个峰得到的DNA片段长度和图15的等位基因阶梯信息所含有的DNA片段长度中，通常产生微小的偏差。将该偏差作为偏置信息，对各等位基因保持在存储部104中。通过使用该偏置信息对图15的等位基因阶梯信息进行微调，来微调等位基因与DNA片段长度的对应关系，提高针对实际样品的荧光强度的峰的等位基因判定的精度。
总结以上，在STR解析处理(步骤609)中，从实际样品的荧光强度波形中检测出峰(步骤2001)，其中，根据分子量标准品的峰时刻和已知的DNA片段长度信息求出峰时刻与DNA片段长度的对应式(步骤2002)，通过求出针对等位基因阶梯中的已知的等位基因的DNA片段长度，对等位基因与DNA片段长度的对应进行微调，基于该对应关系，根据实际样品中的荧光强度的峰判定等位基因(步骤2003)。
如上所述地求出针对所有基因座的等位基因，该等位基因的组合模式成为用于个人识别的基因型信息。
如上所述，在实施例1中，使用分子量标准品和等位基因阶梯来取得基准荧光光谱，通过参照分子量标准品的荧光光谱来求出从该基准荧光光谱的偏移量，通过使基准荧光光谱偏移该偏移量来计算所有毛细管中的荧光光谱，根据该荧光光谱计算出矩阵M。可以使用该矩阵从测量出的光谱中得到各荧光色素的荧光强度波形。通过这样的方法，不需要使用特别的矩阵标准品来进行电泳，而能够与实际样品的电泳同时进行光谱校准，取得荧光强度波形，因此能够减轻光谱校准所需要的时间和成本。
实施例2
对本发明的实施例2的基因型解析装置进行说明。
在实施例1的基因型解析装置中，将对于等位基因阶梯进行电泳的毛细管设为基准毛细管，提取基准毛细管中的等位基因阶梯和分子量标准品的单色峰时刻，并将该时刻的光谱设为基准荧光光谱。然后，通过使基准荧光光谱偏移，求出基准毛细管以外的所有毛细管中的荧光光谱，并由此计算所有毛细管的矩阵M。
但是如以上所述，理想的是通过与装置无关的荧光色素的种类、与其对应的激励光的波长以及毛细管的泳动介质的特性来唯一决定各个荧光色素的荧光光谱。
因此，在本发明的实施例2中，特征在于，不是仅根据等位基因阶梯的单色峰时刻求出基准荧光光谱，而是如上所述地，预先测量根据荧光色素的种类、激励光波长、泳动介质特性等决定的荧光光谱，通过与其进行比较、修正来求出基准荧光光谱。以下，将该预先测量的唯一的荧光光谱记为理想荧光光谱。理想荧光光谱波形在基因型解析装置的出厂前预先由装置制造商测量，或者在设置装置时由维护工程师来测量并存储在装置内。以下，参照附图，对本发明的实施例2的细节进行说明。
实施例2的基因型解析装置的结构与图1所示的实施例1的结构相同。实施例1与实施例2的不同点仅在于在矩阵计算部109中进行的求出基准荧光光谱的处理，除此以外的处理与实施例1相同。
图21是表示实施例2的矩阵计算部109中的、计算基准荧光光谱的处理的概念的图。
该图中的单色峰时刻检测(步骤2101)以及荧光光谱取得(步骤2102)处理与图14所述的基准荧光光谱取得处理(步骤605)中的单色峰时刻检测(步骤1401)和基准荧光光谱取得处理(步骤1402)相同，因此省略说明。
接着，在图21中的理想荧光光谱取得处理(步骤2103)中，取得存储在存储部104中的理想荧光光谱2107。如上所述，该理想荧光光谱2107在基因型解析装置的出厂前预先由装置制造商测量，或者在设置装置时由维护工程师来测量并存储在装置内的存储部104中。另外，在该图中作为荧光光谱仅描绘了一个种类的荧光色素的光谱，但可以对所有荧光色素进行同样的处理。
接着，在图21中的修正处理(步骤2104)中，根据理想荧光光谱2107与基准荧光光谱2106的比较来修正基准荧光光谱2106，从而得到最终的基准荧光光谱2108。
参照图22，对修正处理(步骤2104)的一例进行说明。
在该图中，如上所述，基准荧光光谱2106和理想荧光光谱2107分别是从存储在存储部104中的光谱中取得的数据。首先，进行它们的波长方向的对位(2201)。该处理可以使用实施例1中的荧光光谱计算(图6中的步骤606)中的、从基准毛细管的偏移量计算(图17中的步骤1703)的处理相同的方法。即，计算两个光谱的相互相关函数，并计算其值成为最大值的偏移量，由此能够校正双方光谱的偏差、即进行定位。或者，如上所述，也可以将高斯拟合应用于两个光谱，并将其峰的中心位置的差设成上述的偏移量。
如上所述地进行了波长方向的对位后，求出从基准荧光光谱2106减去理想荧光光谱2107而得的差分光谱(2202)。在该图中示出了通过预先决定的最大差分(DMAX)和最小差分(DMIN)对该差分光谱(2202)的值进行剪裁的情况。在该图中，DMAX和DMIN分别是以图中的偏置值为基准的被容许的差分的最大值和最小值，DMAX是正差分的最大值，DMIN是负差分的最小值。在该图中，偏置是表示基准荧光光谱2106相对于理想荧光光谱2107的整体的信号强度差的值，例如也可以将差分光谱的平均值设为偏置。将该偏置设为基准，将差分光谱的值域决定为[偏置+DMIN，偏置+DMAX]。然后，关于差分光谱的数据中的、不进入该值域的数据，通过该值域的最大值或最小值剪裁。
如上所述，在实施例2的基准荧光光谱的修正处理(步骤2104)中，针对从理想荧光光谱的差分，预先决定容许宽度并进行剪裁处理，由此能够减轻在测量时产生的光谱的噪声。另外，上述的修正处理为一例，并不局限于该例子，只要是根据与理想荧光光谱的比较来修正基准荧光光谱，则可以应用各种处理。
在上述的基准荧光光谱的修正处理(步骤2104)的例子中示出了剪裁从理想荧光光谱的差分的例子，但如果判定为测量出的基准荧光光谱的可靠性低的情况下，在修正处理(步骤2104)中，也可以将基准荧光光谱置换为理想荧光光谱。
使用图23对这样的处理的一例进行说明。在该图中，在步骤2301中比较用于表示基准荧光光谱的可靠性的值(Q值)与预先决定的阈值。在该图中，将该Q值设为其值越高基准荧光光谱的可靠性越低。作为该Q值的指标的一例，例如(式5)所示，对于荧光光谱矩阵S列举通过S的转置矩阵与S的积得到的矩阵的条件数(Condition Number)等。如上所述，通过(式5)得到的条件数高，表示因检测系统的噪声或泳动介质的劣化等某种原因，荧光光谱矩阵S的各荧光光谱的相互重叠程度变强，测量出的荧光光谱矩阵S的可靠性低。
因此，通过步骤2301中的比较，在上述Q值比阈值高的情况下，判定为该基准荧光光谱的可靠性低，不使用测量出的基准荧光光谱，而是将理想荧光光谱作为基准荧光光谱来置换(步骤2303)。但是，也可以根据需要，如图21所示地，使理想荧光光谱对基准荧光光谱的波长方向进行对位。
另一方面，通过步骤2301中的比较，在上述Q值比阈值低的情况下，判断为该基准荧光光谱的可靠性高，进行图22的说明中所述那样的基准荧光光谱的修正处理(步骤2303)。
另外，上述的基于理想荧光光谱的基准荧光光谱的置换(步骤2302)也可以应用于不使用等位基因阶梯的基因型解析。即，若是在STR解析中不需要较高碱基分解能力的用途的基因型解析(例如，食品检查等)，则不使用等位基因阶梯也能够进行等位基因的识别。在这样的情况下，如实施例1所示，使用等位基因阶梯信息不能取得基准荧光光谱。在这样的情况下，如步骤2302所示，将理想荧光光谱置作为基准荧光光谱来置换，求出对各个毛细管的偏移量，由此能够得到荧光光谱。
如上所述，在本发明的实施例2的遗传型解析装置中，其特征在于，不是仅根据等位基因阶梯的单色峰时刻求出基准荧光光谱，而是预先测量根据荧光色素的种类、激励光波长、泳动介质特性等决定的荧光光谱，并与其进行比较、修正来求出基准荧光光谱，由此进行光谱校准。如上所述，通过与理想荧光光谱的比较修正基准荧光光谱，从而能够减轻进行光谱校准时、测量时所产生的噪声等的影响。
实施例3
对本发明的实施例3的基因型解析装置进行说明。
在实施例1和实施例2的基因型解析装置中，将对于等位基因阶梯进行电泳的毛细管设为基准毛细管，求出了基准毛细管中的基准荧光光谱。然后，求出基准荧光光谱与基准毛细管以外的光谱之间的偏移量，使基准荧光光谱偏移该量，由此求出基准毛细管以外的所有毛细管中的荧光光谱，并计算出所有毛细管的矩阵M。
但是在实施例1和实施例2中，如上所述，根据从基准毛细管中的基准荧光光谱的偏移求出各个毛细管的荧光光谱，因此没有假定在毛细管之间荧光光谱的形状变化。实际上，因光学系统或测量系统的某种原因，存在荧光光谱的形状微小地不同的可能性。
因此，在本发明的实施例3中，其特征在于，不是使用从上述的基准荧光光谱的偏移，而是在各毛细管中使用对实际样品进行的电泳的光谱来求出荧光光谱。
以下，参照附图，对实施例3的基因型解析装置的细节进行说明。实施例3的基因型解析装置的结构与图1所示的结构相同。
图24是表示使用对实际样品进行的电泳的光谱来求出荧光光谱的处理概念的图。
在实施例1中，如图13和图16所示，从等位基因阶梯的荧光强度的波形中检测出各荧光色素的单色峰时刻，并将该单色峰时刻的光谱设为各个荧光色素的荧光光谱。
同样地，在实施例3中，从在各毛细管中通过针对测量对象的实际样品的电泳得到的荧光强度的波形中检测出单色峰时刻，并将该单色峰时刻的光谱设为各个荧光色素的荧光光谱。在图24中示出了以从针对实际样品的电泳得到的荧光强度的波形为基础，提取5个荧光色素6FAM、VIC、NED、PET、LIZ的各自的单色峰时刻T(F)、T(V)、T(N)、T(P)、T(L)的例子。在各个时刻，仅出现一个荧光色素中的峰，只要检测这样的时刻即可。
但是，在这样的单色峰时刻，初始矩阵不恰当的情况下，除了某荧光色的主峰外，有可能在与主峰相同的峰位置出现假峰(参照图30)。该假峰是由于各颜色的荧光光谱的重叠而生成的峰，在初始矩阵不恰当的情况下，基于该重叠的影响被较大地观测到。此外，在存在多个主峰的情况下，在该所有主峰中观测到该假峰。
在STR解析中，存在在相同时刻存在不同荧光色的峰的可能性。在这样的情况下，无法将较小一方的峰视为较大一方的峰的假峰。即，这是因为较小的峰为真峰，所以会求出消除了真峰的矩阵。
因此，优选谨慎地进行是假峰还是真峰的判定。以下，参照图32，表示用于判定为假峰的条件(C1)～(C4)的一例。
(C1)：主峰的峰时刻(T1)与假峰的峰时刻(T2)的差收敛在预先决定的时刻差内(即，T1≈T2)(图32(a))。
(C2)：主峰的峰高度(H1)、假峰的峰高度(H2)以及它们的比(H1/H2)都收敛在预先决定的值域内(图32(b))。
(C3)：满足上述条件的主峰和假峰的模式存在预先决定的个数以上(图32(c))。
(C4)：不存在主峰单独的峰(图32(c))。
上述条件(C3)和(C4)由于在不同的荧光色中所有真峰成为相同时刻的概率极低，因此认为能够有效地防止将真峰误检测为假峰。
然后，在实施例3中，在时序的荧光强度波形中，探索满足上述条件的假峰的模式，将该假峰的时刻设为上述的单色峰时刻，求出荧光光谱。
另外，为了作为单色峰时刻使用，理想的是进一步选择上述发现多个的假峰时刻中的、主峰和假峰的荧光色以外的荧光色素不发光的时刻(图32(d))。
另外，在图30或图32中示出了对一个主峰存在一个假峰的例子，但即使对一个主峰存在多个假峰，也可以应用同样的条件。此外，上述的条件为一例，本发明并不仅限于上述的条件。
但是，在针对实际样品的电泳中，因样品所包含的基因型的特性或样品中的DNA浓度的过量或不足等，不能保证一定得到必然适用于求出荧光光谱的单色峰时刻。即，由于在荧光色素之间峰位置重叠，或者峰的宽度宽等原因，有可能产生不存在如上所述的仅基于单一荧光色素的假峰的现象，或原本峰的强度较小或过大的现象。此外，若初始矩阵不恰当，则不能观测到如上所述的假峰。
因此，在实施例3中，其特征在于，判定从实际样品是否检测出所期望的单色峰时刻后，仅在单色峰存在的情况下使用实际样品的光谱来求出荧光光谱。
图25表示实施例3的遗传型解析装置的处理流程。
在步骤2501中，对包含等位基因阶梯、控制样品的所有样品的毛细管进行电泳。该电泳处理与实施例1中的电泳处理(图6中的步骤601)相同。
接着，在步骤2502中，以得到的电泳结果的光谱数据为基础，计算荧光强度。该处理与实施例1中的荧光强度计算处理(图6中的步骤602)相同，可以使用初始矩阵M按照(式1)的计算得到各荧光色素的荧光强度波形。
接着，在步骤2503中，对在步骤2502中得到的荧光强度波形进行峰检测处理。该处理与实施例1中的峰检测处理(图6中的步骤603)相同，可以使用高斯拟合等已知方法。
接着，在步骤2504中，进行分子量识别处理。该处理与实施例1中的分子量识别处理(图6中的步骤604)相同，根据向分子量标准品分配的荧光色素(在本实施例中为LIZ)的峰时刻和已知的DNA片段长度信息，得到电泳时间与DNA片段长度的关系式“y＝f(t)”。
接着，在步骤2505中，取得基准荧光光谱。该处理与实施例1中的基准荧光光谱取得处理(图6中的步骤605)相同，将包含等位基因阶梯的毛细管作为基准毛细管，检测基准毛细管中的单色峰时刻来取得基准荧光光谱。此外，如实施例2所述，进一步通过与理想荧光光谱的比较来进行基准荧光光谱的修正(参照图21)。如果在基准毛细管中没有检测出单色峰时刻而不能得到基准荧光光谱的情况下，向步骤2506a前进。
接着，在步骤2506a中，在包含实际样品的毛细管(基准毛细管以外的毛细管)中检测出单色峰时刻，判定该峰是否是用于取得荧光光谱的所期望的单色峰，即判定假峰的有无。作为单色峰是否是用于取得荧光光谱的所期望的判定基准的一例，列举(1)与其他荧光色素重叠的情况和(2)峰高度等。
上述(1)的与其他荧光色素重叠的情况的判定基准，以该峰时刻的其他荧光色素的荧光强度是否足够小为基准即可。此外，优选尽量远离其他荧光色素的峰时刻。
上述(2)的峰高度的判定基准，优选单色峰的强度适度地大。此外，应当去除峰高度过大而超出光学检测系统的动态范围的峰。因此，预先设定单色峰的强度的容许范围的上限值和下限值，并应当使用收敛在该容许范围内的峰时刻。
在上述步骤2506a的判定处理中，存在满足上述(1)、(2)双方的判定基准的单色峰时刻的情况(有假峰的情况)下，通过取得该峰时刻的光谱，将其作为荧光光谱即可(步骤2507)。
在上述步骤2506a的判定处理中，不存在满足上述(1)、(2)双方的判定基准的单色峰时刻的情况(无假峰的情况)下，向步骤2506b前进，并且，在步骤2505中取得了基准荧光光谱情况(有基准荧光光谱的情况)下，向步骤2508前进，进行与在实施例1中的图17的步骤606中叙述的荧光光谱计算处理相同的处理。即，根据基准毛细管中的基准荧光光谱的分子量标准品的光谱和其他毛细管中的分子量标准品的光谱的波形，如图19A、图19B所示地计算其他毛细管中的光谱从基准荧光光谱的偏移量(步骤2508)，使基准荧光光谱偏移该偏移量来计算其他毛细管的荧光光谱(步骤2509)。另外，作为步骤2508中的基准荧光光谱，与实施例1同样地，可以是等位基因阶梯和分子量标准品的荧光光谱，在其他毛细管中，已经存在根据实际样品和分子量标准品取得的荧光光谱的情况下，也可以将其作为基准荧光光谱来置换。此外，也可以将所述的初始的荧光光谱(假定已保存在存储部104中)设为基准荧光光谱。
如果在上述的步骤2506的判定处理中，不存在满足上述(1)、(2)双方的判定基准的单色峰时刻的情况(无假峰的情况)，在步骤2505中无法取得基准荧光光谱的情况(无基准荧光光谱的情况)下，或者不涉及上述的基准荧光光谱的有无的情况下，可以向路径2513前进，不进行新的矩阵M的计算，而对应用了初始矩阵的荧光强度波形进行STR解析。
之后，在步骤2510进行矩阵计算处理。该处理与实施例1中的矩阵计算处理(图6中的步骤607)相同，以得到的荧光光谱为基础，通过(式2)和(式3)计算矩阵M。与步骤607同样地，通过(式5)评价矩阵M的可靠性，在矩阵M的可靠性低的情况下，可以不使用该矩阵M，而是向路径2513前进，对应用了初始矩阵的荧光强度波形进行STR解析。
之后，在步骤2511进行荧光强度计算处理。该处理与实施例1中的荧光强度计算处理(图6中的步骤608)相同，通过(式1)对各时刻的光谱应用矩阵M，由此得到各荧光色素的荧光强度波形。
之后，在步骤2512进行STR解析。该处理与实施例1中的STR解析处理(图6中的步骤609)相同，通过进行图20所述的峰检测处理(步骤2001)、分子量识别处理(步骤2002)以及等位基因识别处理(步骤2003)，来求出针对所有基因座的等位基因，该等位基因的组合模式成为用于个人识别的基因型信息。
如上所述，在本发明的实施例3的遗传型解析装置中，其特征在于，不是使用从基准荧光光谱的偏移，而是在各毛细管中使用对实际样品进行的电泳的光谱来检测出单色峰，并以其为基础求出荧光光谱来进行光谱校准。根据实施例3，通过使用实际样品的良好的单色峰，与实施例1或实施例2相比，能够反映毛细管之间的荧光光谱的波形的微小差异，并以更高精度进行光谱校准。
此外，在本发明的实施例3的基因型解析装置中，不使用基准荧光光谱，因此即使对不使用等位基因阶梯的基因型解析也可以使用针对实际样品的电泳结果来进行光谱校准。
实施例4
对本发明的实施例4的基因型解析装置进行说明。
在实施例1和实施例2中，在基准毛细管中取得基准荧光光谱，而对于其他毛细管，通过偏移基准荧光光谱来计算各毛细管中的荧光光谱。在实施例3中，使用基于各毛细管中的实际样品的电泳的光谱来检测单色峰时刻，取得各个荧光光谱。但是，在实施例3中，在没有检测出所期望的单色峰时刻的情况下，也如实施例1或实施例2所示，通过使基准荧光光谱偏移来计算荧光光谱。
在这些上述的实施例中，使用分子量标准品的光谱来计算基准荧光光谱的偏移量。即，如之前在图19A、图19B中所述，根据基准毛细管中的分子量标准品的光谱和其他毛细管中的分子量标准品的光谱计算双方的光谱之间的波长的偏移量。
作为使用了上述的分子量标准品的用于偏移量的计算的条件，以从分子量标准品的荧光强度的波形能够毫无问题地检测出单色峰时刻为前提。然而，实际上存在因基准毛细管或其他毛细管中的分子量标准品的浓度不足等峰强度在所述的容许范围外的情况，或在单色峰时刻重叠了基于其他荧光色素的噪声的可能性等。在这样的情况下，认为使用分子量标准品进行所述的偏移量的计算并不恰当。
因此，在本实施例4中，其特征在于，为了计算该基准毛细管的偏移量，在进行电泳前，使用向毛细管仅填充了泳动介质的状态下的拉曼光谱的峰模式来计算毛细管之间的偏移量。
以下，参照附图，对实施例4中的基因型解析装置的处理进行说明。实施例4的基因型解析装置的结构与图1所示的结构相同。
图26是表示实施例4中的基因型解析装置的处理流程的图。
以下，对图26所示的步骤2601～2611的处理进行说明。
步骤2601：在实施例4中的基因型解析装置中，在进行电泳前取得拉曼光谱(步骤2601)。在取得拉曼光谱时，通过光学检测器515检测出通过实际的电泳处理中使用的光源514照射填充有电泳介质的毛细管而产生的拉曼散射光来得到摄影图像。该摄影图像与在图2中得到的图像相同，能够得到各个毛细管中的拉曼光谱。
图27示出了某毛细管中的拉曼光谱的例子。拉曼光谱的形状依存于光源的波长和泳动介质，在所有毛细管中相同，但根据毛细管与检测器的位置关系可能产生波长方向上的偏差。
步骤2602：因此，通过计算毛细管之间的、上述的拉曼光谱的形状的波长方向的偏移量，将其设为基准荧光光谱的偏移量。
作为该偏移量的计算方法，可以使用与实施例1中的从基准毛细管的偏移量计算处理(图17中的步骤1703)相同的方法。即，如上所述，可以在各个拉曼光谱中，通过样条插补等已知技术插补数据后，计算2个光谱的相互相关函数，求出使其值成为最大的偏移量。
或者，可以对各个拉曼光谱进行上述的高斯拟合。即，在拉曼光谱中光源的波长和泳动介质都是已知的，因此通过预先测量求出拉曼光谱的峰数量或该峰波长、各个信号强度比等。因此，通过阈值处理等检测出各个峰的大致位置，对该峰周边的数据应用上述的高斯拟合(参照图11)，能够得到各个峰波长。也可以对所有毛细管中的拉曼光谱求出这样的多个峰波长，并计算毛细管之间的各个峰波长的偏移量。
步骤2603：接着，对实际样品进行电泳。该处理与实施例1中的电泳处理(图7)相同。但是，该图中的泳动介质充填处理(步骤703)，由于在上述的拉曼光谱取得处理(步骤2601)中已经填充有泳动介质，因此也可以将其省略。
步骤2604：接着，以得到的电泳结果的光谱数据为基础，计算荧光强度。该处理与实施例1中的荧光强度计算处理(图6中的步骤602)相同，可以使用初始矩阵M，按照(式1)的计算得到各荧光色素的荧光强度波形。
步骤2605：接着，对在步骤2604中得到的荧光强度波形进行峰检测处理。该处理与实施例1中的峰检测处理(图6中的步骤603)相同，可以使用高斯拟合等已知方法。
步骤2606：接着，进行分子量识别处理。该处理与实施例1中的分子量识别处理(图6中的步骤604)相同，根据向分子量标准品分配的荧光色素(在本实施例中为LIZ)的峰时刻和已知的DNA片段长度信息，得到电泳时间与DNA片段长度的关系式“y＝f(t)”。
步骤2607：接着，取得基准荧光光谱。该处理与实施例1中的基准荧光光谱取得处理(图6中的步骤605)相同，将包含等位基因阶梯的毛细管作为基准毛细管，检测出基准毛细管中的单色峰时刻，取得基准荧光光谱。此外，也可以如实施例2所述，进一步通过与理想荧光光谱的比较，进行基准荧光光谱的修正(参照图21)。与实施例1的步骤605同样地，在未得到如上所述的单色峰时刻，未取得基准荧光光谱的情况下，可以将所述的基准毛细管中的初始的荧光光谱(假定已保存在存储部104中)设为基准荧光光谱。或者，也可以向路径612前进，使用应用了初始矩阵的荧光强度波形来进行STR解析。
步骤2608：接着，计算荧光光谱。该处理与实施例1中的荧光光谱计算处理(图17的步骤606)进行相同处理。但是，在偏移量的计算中不使用图19A所示的分子量标准品的光谱，而是使用在步骤2602中得到的偏移量。然后，通过使基准荧光光谱偏移该偏移量来计算基准毛细管以外的毛细管的荧光光谱。但是，在步骤2602中因拉曼光谱的信号强度低等原因，没有正确地得到上述偏移量的情况下，也可以与实施例1的步骤606同样地根据分子量标准品的光谱求出偏移量。此外，在步骤2602中也没有得到偏移量，并且从分子量标准品也没有得到偏移量的情况下(因噪声等不存在LIZ的单色峰时刻等原因)可以向路径2612前进，不进行新的矩阵计算，而使用应用了初始矩阵的荧光强度波形来进行STR解析。
步骤2609：之后，进行矩阵计算处理。该处理与实施例1中的矩阵计算处理(图6中的步骤607)相同，以得到的荧光光谱为基础，通过(式2)和(式3)计算矩阵M。与步骤607同样地，通过(式5)评价矩阵M的可靠性，在矩阵M的可靠性低的情况下，可以不使用该矩阵M，向路径2612前进，对应用了初始矩阵的荧光强度波形进行STR解析。
步骤2610：之后，进行荧光强度计算处理。该处理与实施例1中的荧光强度计算处理(图6中的步骤608)相同，通过(式1)对各时刻的光谱应用矩阵M，由此得到各荧光色素的荧光强度波形。
步骤2611：之后，进行STR解析。该处理与实施例1中的STR解析处理(图6中的步骤609)相同，通过进行图20所述的峰检测处理(步骤2001)、分子量识别处理(步骤2002)以及等位基因识别处理(步骤2003)，求出针对所有基因座的等位基因，该等位基因的组合模式成为用于个人识别的基因型信息。
如上所述，在本发明的实施例4的遗传型解析装置中，其特征在于，求出从基准荧光光谱的偏移量时，不是使用分子量标准品的光谱，而是使用在电泳之前测量的拉曼光谱。由此，即使在由于分子量标准品的荧光强度的峰较小或与其他荧光色素的信号重叠等而未得到单色峰的情况下，通过使用从拉曼光谱求出的偏移量，从基准荧光光谱进行偏移，从而能够计算各毛细管的荧光光谱。
另外，在本实施例4中作为分子量标准品的光谱的代替而使用拉曼光谱时，应慎重地决定成为其条件的分子量标准品的光谱的条件。即，在特定的毛细管中分子量标准品的荧光强度数据的品质极度变差时，存在未恰当地进行分子量识别的可能性，因此STR解析的结果本身的精度劣化。对于这样的状况的毛细管，考虑应中止STR解析本身。因此，应用实施例4时，应在分子量识别的品质不下降的范围内，决定应该使用拉曼光谱的条件。或者，也可以不依存于分子量标准品的品质，而始终根据本实施例4来计算偏移量。
实施例5
对本发明的实施例5的基因型解析装置进行说明。
在实施例3的基因解析装置中，在各毛细管中使用对实际样品进行的电泳的光谱，求出了荧光光谱。此时，从由实际样品得到的荧光强度波形中，探索能够观测单一荧光色中的假峰的时刻，并将该时刻设为单色峰时刻，来求出荧光光谱。
在实施例3中，在不观测上述的单色峰时刻的情况下，与实施例1或实施例2的基因型解析装置同样地，将对等位基因阶梯进行电泳的毛细管设为基准毛细管，并求出基准毛细管中的基准荧光光谱。然后，求出基准荧光光谱与基准毛细管以外的光谱之间的偏移量，并使基准荧光光谱偏移该量，由此求出基准毛细管以外的所有毛细管中的荧光光谱，计算所有毛细管的矩阵M。
但是，如实施例3所述，根据从基准毛细管中的基准荧光光谱的偏移来求出各个毛细管的荧光光谱，因此没有假定在毛细管之间荧光光谱的形状发生变化。实际上，因光学系统或测量系统的某种原因，存在荧光光谱的形状细微地不同的可能性。
因此，在不能观测假峰的情况下，在基于从上述的基准荧光光谱的偏移的荧光光谱中，存在不能得到恰当的矩阵的可能性。不能观测假峰时，毕竟也存在初始矩阵恰当的可能性，因此在实施例3方法中，存在得到比初始矩阵不恰当的矩阵的可能性。
因此，在实施例5的基因解析装置中，作为实施例3的变形例，其特征在于，仅根据各个毛细管中的荧光强度波形求出荧光光谱，而不是求出基于等位基因阶梯的基准荧光光谱。
以下，参照附图，对实施例5中的基因型解析装置的处理进行说明。实施例5的基因型解析装置的结构与图1所示的结构相同。
图31是表示实施例5中的基因型解析装置的处理流程的图。
以下，对图31所示的步骤3101～3107的处理进行说明。
在步骤3101中，对实际样品进行电泳。该处理与实施例1中的电泳处理(图7)相同。另外，在实施例5中，与实际样品同样地处理等位基因阶梯。
接着，在步骤3102中计算荧光强度。该荧光强度的计算方法与实施例1相同。另外，在本实施例中，若步骤3102为初次的荧光强度计算，则与实施例1同样地使用初始矩阵来进行计算。即，假定通过预先测量得到初始矩阵以及用于得到初始矩阵的荧光光谱，使用该初始矩阵，根据(式1)计算各荧光色的荧光强度波形。
如果步骤3102为第2次以后的荧光强度计算的情况下，即已经进行了本实施例的矩阵计算的情况下，也可以使用上次计算出的矩阵(后述的步骤3106)，根据(式1)计算各荧光色的荧光强度波形。
接着，在步骤3103中，对各荧光色的荧光强度波形进行峰检测。该处理与实施例1(图6的步骤603)相同。
接着，在步骤3104中，判定假峰的有无。如实施例3中的图30所示，用于步骤3102中的荧光强度波形的计算的矩阵不恰当的情况下，对于某荧光色的主峰，存在假峰出现在与主峰相同的峰位置上的可能性。因此，在步骤3104中，从在步骤3103中检测出的峰中探索这样的各荧光色中的假峰。
对于某荧光色的主峰没有检测出假峰的情况下，采用与在步骤3102使用的矩阵对应的荧光光谱。即，该处理相当于将对应于初始矩阵(式2)的荧光光谱矩阵S的某列向量用假峰时刻的光谱来置换。
若不存在针对某荧光色的假峰的情况下，视为该荧光光谱恰当，该荧光色的光谱不变更。并且，在所有的荧光色中没有检测出假峰的情况下，采用在步骤3102中所使用的矩阵作为最终矩阵，前进到步骤3107的STR解析。该步骤3107的STR解析的处理内容与实施例1相同。
在步骤3104中，在一个以上的荧光色中检测出假峰的情况下，向步骤3105前进，取得荧光光谱。
步骤3105的处理与实施例3相同，将假峰存在的时刻设为单色峰时刻，在步骤3105中将该时刻的测量光谱设为该荧光色的荧光光谱。
之后，在步骤3106中，根据得到的荧光光谱通过(式3)计算出矩阵。该处理与实施例1相同。之后，使用得到的矩阵返回到步骤3104，经由所述的荧光强度计算(步骤3102)、峰检测(步骤3103)再次进行假峰判定(步骤3104)。直到不能检测出假峰为止重复这样的处理，由此更新矩阵。
若恰当地进行了步骤3104中的假峰的探索，则通常通过重复一定次数的上述处理能够得到不检测出假峰的矩阵。但是，在假峰的探索不恰当的情况下，即使重复上述的处理也有可能检测出假峰。
在这样的情况下，实际上对上述的重复次数设置上限，在上述重复次数达到上限的情况下，例如优选进行采用假峰的水平最低的矩阵的、采用初始矩阵等处理。
此外，在步骤3104中的上述假峰的探索时，也可以通过用户界面部103提供变更假峰的判定条件来再次计算矩阵的单元。作为这样的假峰的判定条件的项目，例如列举在实施例3中叙述的假峰的高度相对于主峰的高度的比、主峰和假峰的高度的各自的最大值和最小值、主峰时刻与假峰时刻的时刻差、或矩阵的重复次数等。
图33表示这样的提示方式的一例。在该图中示出了在画面(3301)中提示用于重叠地表示各荧光的荧光强度波形的区域(3302)、设定上述的假峰判定条件值的区域(3303)等的例子。用户也可以使用用户界面部103中的、未图示的输入单元(例如，鼠标指针或键盘)来设定这些值。
此外，在图33中，通过画面(3301)确认基于上述的假峰判定的单色峰时刻的自动计算结果(3304)，并可以根据需要手动地变更各个颜色的单色峰时刻。如上所述，若用户能够确认、变更单色峰时刻，则能够得到更稳定的矩阵。
如上所述地，在本发明的实施例5的遗传型解析装置中，其特征在于，不是使用从基准荧光光谱的偏移，而是使用在各毛细管中对实际样品进行的电泳的光谱来检测单色峰，并以此为基础求出荧光光谱，由此进行光谱校准。此时，通过探索实际样品中的假峰，并重复计算不检测出该假峰的矩阵，能够得到更恰当的矩阵。
以上，对用于实施本发明的最佳的方式进行了说明，但本发明并不局限于上述实施例，在本发明的主旨的范围内可进行适当的变更。例如，也可以使用在内部形成了样品流路的微芯片式电泳装置。该情况下，将本说明书中的毛细管改称流路即可。此外，同样也可以将本发明应用于使用了平板凝胶的电泳装置中。
此外，也可以通过用于实现实施例功能的软件的程序代码来实现本发明。此时，将记录有程序代码的存储介质提供给系统或装置，该系统或装置的计算机(或者CPU或MPU)读出存储在存储介质中的程序代码。此时，从存储介质中读出的程序代码本身实现所述的实施例的功能，该程序代码本身和对其进行存储的存储介质构成本发明。作为用于供给这样的程序代码的存储介质，例如可以使用软盘、CD-ROM、DVD-ROM、硬盘、光盘、光磁盘、CD-R、磁带、非易失性存储卡以及ROM等。
此外，也可以根据程序代码的指示，由在计算机上运行的OS(操作系统)等进行实际处理的部分或全部，通过该处理实现所述的实施方式的功能。并且，可以将从存储介质读出的程序代码写入到计算机上的存储器后，根据该程序代码的指示，该计算机的CPU等进行实际处理的部分或全部，通过该处理实现所述的实施方式的功能。
此外，也可以经由网络传送实现实施方式的功能的软件的程序代码，由此，将其存储在系统或装置的硬盘或存储器等的存储单元或者CD-RW、CD-R等存储介质中，使用时由该系统或装置的计算机(或CPU或MPU)读出存储在该存储单元或该存储介质中的程序代码后执行。
能够从上述实施方式掌握的本发明的构成要件如以下所示。
(1)一种基因型解析方法，其向由多个流路构成的流路阵列照射激励光，并以通过对流路阵列中的发光进行分光而在光检测器上对光谱进行成像的电泳单元得到的光谱为基础，计算用多个荧光色素标识的DNA样品中的各个荧光强度，该基因型解析方法的特征在于，以通过针对该DNA样品的电泳得到的光谱为基础，求出多个荧光色素的基准荧光光谱，并使该基准荧光光谱在波长方向上偏移，由此求出各流路的荧光光谱。
(2)在上述(1)的基因型解析方法中，其特征在于，提取包含已知长度的DNA片段的样品的光谱中的、基于单一荧光色素的发光的光谱作为基准荧光光谱。
(3)在上述(1)的基因型解析方法中，其特征在于，将预先测量的理想荧光光谱设为基准荧光光谱。
(4)在上述(2)的基因型解析方法中，其特征在于，参照预先测量的理想荧光光谱来修正基准荧光光谱。
(5)在上述(1)的基因型解析方法中，其特征在于，提取作为基因型解析对象的实际样品的光谱中的、基于单一荧光色素的发光的光谱作为基准荧光光谱。
(6)在上述(1)至(5)的任一项的基因型解析方法中，其特征在于，通过提取各流路中的、用于标识分子量标准品的荧光色素的单一的荧光光谱来求出流路之间的荧光光谱的波长方向的偏移量，并使所述基准荧光光谱偏移该偏移量。
(7)在上述(1)至(5)的任一项的基因型解析方法中，其特征在于，通过测量各流路中的拉曼光谱，求出流路之间的荧光光谱的波长方向的偏移量，并使基准荧光光谱偏移该偏移量。
(8)在上述(1)的基因型解析方法中，其特征在于，判定是否能够提取作为基因型解析对象的实际样品的光谱中的、基于单一荧光色素的发光的光谱作为基准荧光光谱，在该判定为否的情况下，通过使基准荧光光谱偏移来求出所述的荧光光谱。
(9)一种基因型解析装置，其特征在于，该基因型解析装置具有：光源，其照射激励光；电泳装置，其具备由多个流路构成的流路阵列、向所述流路阵列的两端部施加电压的电压源以及检测从流路阵列发出的光的光检测器而构成；以及数据解析装置，其与电泳装置进行信息的接收发送，
向所述流路阵列投入具有用多个荧光色素标识的DNA片段的DNA样品，使用电压源一边使流路阵列中的DNA片段移动，一边从光源对流路阵列照射激励光，对通过照射而从所述流路阵列放出的发光进行分光而使光谱在光检测器上成像，在数据解析装置中，基于成像的光谱计算多个荧光色素的基准荧光光谱，并使该基准荧光光谱在波长方向偏移，由此求出各流路的荧光光谱。
(10)在上述(9)的基因型解析装置中，其特征在于，通过求出基准荧光光谱，并使该基准荧光光谱在波长方向偏移来求出各流路的荧光光谱。
(11)在上述(9)的基因型解析装置中，其特征在于，提取包含已知长度的DNA片段的样品的光谱中的、基于单一荧光色素的发光的光谱作为基准荧光光谱。
(12)在上述(9)的基因型解析装置中，其特征在于，将预先测量的理想荧光光谱设为基准荧光光谱。
(13)在上述(10)的基因型解析装置中，其特征在于，参照预先测量的理想荧光光谱来修正基准荧光光谱。
(14)在上述(9)的基因型解析装置中，其特征在于，提取作为基因型解析对象的实际样品的光谱中的、基于单一荧光色素的发光的光谱，由此求出基准荧光光谱。
(15)在上述(9)至(14)的任一项的基因型解析装置中，其特征在于，通过提取各流路中的、用于标识分子量标准品的荧光色素的单一的荧光光谱来求出流路之间的荧光光谱的波长方向的偏移量，并使所述基准荧光光谱偏移该偏移量。
(16)在上述(9)至(14)的任一项的基因型解析装置中，其特征在于，通过测量各流路中的拉曼光谱来求出流路之间的荧光光谱的波长方向的偏移量，并使所述基准荧光光谱偏移该偏移量。
符号说明
101 基因型解析装置、
102 中央控制部、
103 用户界面部、
104 存储部、
105 电泳装置、
106 样品信息设定部、
107 峰检测部、
108 电泳装置控制部、
109 矩阵计算部、
110 荧光强度计算部、
111 STR解析部、
112 数据解析装置。

Claims (12)

1.一种基因型解析方法，其特征在于，
向由多个流路构成的流路阵列分别投入具有用多个荧光色素标识的DNA片段的DNA样品，
一边使用电泳单元使所述DNA片段在所述流路阵列中移动，一边对所述DNA片段照射激励光，
基于对通过照射而从所述流路阵列放出的发光进行分光而得到的光谱，计算针对各个所述DNA片段的荧光强度波形，
基于计算出的各个所述荧光强度波形，求出所述多个荧光色素的荧光光谱。
2.根据权利要求1所述的基因型解析方法，其特征在于，
准备作为基因型解析对象的实际样品作为所述DNA样品，
从分光而得到的所述实际样品的光谱中提取基于单一荧光色素的发光的光谱，并根据提取出的所述光谱求出所述荧光光谱。
3.根据权利要求2所述的基因型解析方法，其特征在于，
通过探索所述荧光强度波形的假峰，提取所述基于单一荧光色素的发光的光谱。
4.根据权利要求3所述的基因型解析方法，其特征在于，
重复执行所述假峰的探索和所述荧光强度波形的计算，直到满足没有检测出所述假峰或重复次数达到设定上限值中的某个条件为止。
5.根据权利要求2至4中的任一项所述的基因型解析方法，其特征在于，
将所述荧光光谱设为以前所求出的荧光光谱。
6.根据权利要求5所述的基因型解析方法，其特征在于，
在所述假峰的探索中，显示所述假峰的检测条件或所述假峰的检测结果，用户能够一边参照该显示一边变更所述检测条件或所述检测结果。
7.一种基因型解析装置，其特征在于，具有：
光源，其照射激励光；
电泳装置，其具备由多个流路构成的流路阵列、向所述流路阵列的两端部施加电压的电压源以及检测从所述流路阵列发出的光的光检测器而构成；以及
数据解析装置，其与所述电泳装置进行信息的接收发送，
向所述流路阵列投入具有用多个荧光色素标识的DNA片段的DNA样品，
一边使用所述电压源使所述流路阵列中的所述DNA片段移动，一边从所述光源对所述流路阵列照射激励光，
对通过照射而从所述流路阵列放出的发光进行分光来使光谱在所述光检测器上成像，
在所述数据解析装置中，基于成像的光谱计算针对各个所述DNA片段的荧光强度波形，并基于计算出的各个所述荧光强度波形，求出所述多个荧光色素的荧光光谱。
8.根据权利要求7所述的基因型解析装置，其特征在于，
在使用作为基因型解析对象的实际样品来作为所述DNA样品的情况下，
在所述数据解析装置中，从分光而得到的所述实际样品的光谱中提取基于单一荧光色素的发光的光谱，并根据提取出的所述光谱求出所述荧光光谱。
9.根据权利要求8所述的基因型解析装置，其特征在于，
在所述数据解析装置中，通过探索所述荧光强度波形的假峰，提取所述基于单一荧光色素的发光的光谱。
10.根据权利要求9所述的基因型解析装置，其特征在于，
在所述数据解析装置中，重复执行所述假峰的探索和所述荧光强度波形的计算，直到满足没有检测出所述假峰或重复次数达到设定上限值中的某个条件为止。
11.根据权利要求8至10中的任一项所述的基因型解析装置，其特征在于，
将所述荧光光谱设为以前所求出的荧光光谱。
12.根据权利要求11所述的基因型解析装置，其特征在于，
在所述数据解析装置中的所述假峰的探索中，显示所述假峰的检测条件或所述假峰的检测结果，用户能够一边参照该显示一边变更所述检测条件或所述检测结果。
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