CN109475795A - 用于自动对准、校准和标准化电泳数据的系统和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种使用电泳装置改进对分析物的分析的系统和方法。本发明的示例性方法可以例如结合电泳分离(例如毛细管电泳)在自动峰值检测中提供有用结果(例如，可用数据的数量和质量)的产率的增加。在各个实施例中，系统虚拟化原始数据，将迁移时间转换成虚拟单位，从而使得能够进行分析物电泳图的视觉比较和对未知分析物的可靠测量。分析物可以例如是任何有机或无机分子，包括但不限于核酸(DNA、RNA)、蛋白质、肽、聚糖、代谢物、次级代谢物、脂质或以上各项的任何组合。分析物检测可以通过任何方法执行，所述任何方法包括但不限于荧光检测或UV吸收。此外，本发明提供了基于样品、基于仪器、基于运行和基于迁移时间的分析物峰值的一致比较。

Description

用于自动对准、校准和标准化电泳数据的系统和方法
技术领域
本发明涉及用于标准化电泳仪器以产生对准数据的自动化方法，该对准数据例如在分析物筛选、研究、定性或定量测量和诊断用途中是有用的。
背景技术
多年来，毛细管电泳(Capillary Electrophoresis，CE)已被用作例如在生命科学、生物科学和制药学领域中的分析技术。(参见，例如克利夫兰州立大学化学教育家YANXU：毛细管电泳(Capillary Electrophoresis)，纽约：斯普林格出版社，1996年2月，第1卷第1期；该文章以整体引用的方式并入本文。)然而，即使在今天，在分析物测量中使用电泳数据常常也是困难且耗时的。在许多情况下，科学家和工程师必须在对分析物或分析物的混合物进行峰值积分和最终检测之前手动调整原始电泳数据。该领域中的中众所周知的挑战与来自电泳分离过程和仪器检测系统的数据的可变性的性质有关。众所周知，批次间(run-to-run)的数据或仪器间(instrument-to-instrument)的数据可以在迁移时间内变化到可以使数据不适合分析物的定性或定量分析的程度。测量分析物混合物通常期望的目标是建立特征分析物的标准物库(standard library)的能力(该标准库例如通过质谱法来表征)，然后使用该库来比较已知的分析物。
发明内容
接下来提供本发明的根据各种实施例的各个方面的非限制性概述。
本发明的各个方面提供了例如在分析物检测和量化中使用的用于标准化(虚拟化)电泳数据的系统和方法。
本发明的各种实施例提供了例如在电泳装置中执行部分对准或完全对准的方法。根据各种实施例，例如，所述方法可以包括诸如以下的步骤：
(i)将原始分离数据、电流以及可选地在分离过程中收集到的电势数据进行组合，以使得到的分离数据曲线可以与一个或多个参考分离曲线对准；
(ii)根据在该点处的电流值，增加或减少原始分离数据的每个点的时间值；以及，
(iii)可选地及另外地，根据在该点处的电势值，增加或减少原始分离数据的每个点的时间值。
本发明的其他方面涉及用于增加在自动峰值检测中有用结果的产率的方法和装置。
在各种实施例中，用于增加在自动峰值检测中有用结果的产率的方法可以例如包括以下：
(i)测量分离通道中的电流；
(ii)使包含一种或多种未知分析物的样品沿着通道电泳；
(iii)在通道的检测区域处光学检测一种或多种分析物；
(iv)收集所检测到的信号数据；以及
(v)通过使用所测量的电流的方法处理所收集的信号数据。
在各种实施例中，步骤(v)的处理可以例如包括在峰值检测期间校正数据中的疑难问题。
本发明的各个方面涉及用于使用电泳分离对包括一种或多种未知分析物的样品进行分析的改进系统。所述系统可以例如包括：
(a)分离通道，其包括分离介质；
(b)电源，其用于在所述分离通道上施加电势以使样品沿所述分离通道迁移；
(c)检测器，其用于测量与沿着所述分离通道迁移的样品相关联的作为时间的函数的信号强度；
(d)计算部分，其计算机可读介质，该计算机可读介质包括包含具体化为可执行指令的软件代码，所述可执行指令用于：
(i)接收第一数据集，所述第一数据集包括随时间变化的对应于已知的梯标准物的电泳分离的多个信号峰值；
(ii)为峰值迁移时间分配相应的标准化值，所述标准化值以虚拟单位表示；
(iii)将多项式曲线拟合到所述梯标准物，生成第一多项式模型；
(iv)确定所述第一多项式模型中与原点的偏移；
(v)使用所述偏移来平移所述第一多项式模型以穿过所述原点，生成平移后的第一多项式模型；
(vi)通过所述第一多项式模型再利用所述第一数据集并确定至少两个预测残差，其中，所述残差表示接收峰值和建模峰值之间在时间上的不匹配程度；
(vii)将三次样条曲线拟合到所述残差，生成三次样条模型分量；
(viii)接收第二数据集，所述第二数据集包括随时间变化的对应于混合物的电泳分离的一个或多个峰值，所述混合物包括(a)未知分析物、(b)上界标准物以及(c)下界标准物；
(ix)确定上界标准物的峰值；
(x)将所述平移后的第一多项式模型的斜率和曲率等比例调整为所述上界标准物，生成上界标准物模型；
(xi)使用所述上界标准物模型确定下界标准物的峰值；
(xii)将多项式曲线拟合到所述下界标准物、所述上界标准物和所述原点，生成第二多项式模型；
(xiii)将(a)所述第二多项式模型、(b)所述三次样条模型分量和(c)所述偏移进行组合，生成最终参考模型；以及
(xiv)使用所述最终参考模型将所述第二数据集合转换为虚拟单位；以及
(e)处理器，用于执行计算机可读介质上的计算机可读代码。
在各种实施例中，所述分离通道包括细长毛细管的纵向孔。
根据各种实施例，所述多项式曲线包括四阶多项式曲线或更低阶的多项式曲线。例如，可以采用二次多项式。
在各种实施例中，所述已知的梯标准物包括葡聚糖，以及所述虚拟单位包括葡萄糖单位。
本发明的各个方面涉及一种用于使用电泳分离对包括一种或多种未知分析物的样品进行分析的改进系统，其中，所述系统包括：
(a)分离通道，其包括分离介质；
(b)电源，其用于在所述分离通道上施加电势以使样品沿所述分离通道迁移；
(c)检测器，其用于测量与沿着所述分离通道迁移的样品相关联的作为时间的函数的信号强度；以及
(d)计算部分，其包括计算机可读介质，所述计算机可读介质包括包含具体化为可执行指令的软件代码，所述可执行指令用于：
(i)接收第一数据集，所述第一数据集包括随时间变化的对应于已知的梯标准物的电泳分离的多个信号峰值；
(ii)为峰值迁移时间分配相应的标准化值，所述标准化值以虚拟单位表示；
(iii)将多项式曲线拟合到所述梯标准物，生成第一多项式模型；
(iv)确定所述第一多项式模型中与原点的偏移；
(v)使用所述偏移来平移所述第一多项式模型以穿过所述原点，生成平移后的第一多项式模型；
(vi)接收第二数据集，所述第二数据集包括随时间变化的对应于混合物的电泳分离的一个或多个峰值，所述混合物包括(a)一种或多种相应的未知分析物、(b)上界标准物以及(c)下界标准物；
(vii)确定上界标准物的峰值；
(viii)将所述平移后的第一多项式模型的斜率和曲率等比例调整为所述上界标准物，生成上界标准物模型；
(ix)使用所述上界标准物模型确定下界标准物的峰值；
(x)将多项式曲线拟合到(a)所述上界标准物、(b)所述下界标准物和(c)所述原点，生成第二多项式模型；
(xi)将所述第二多项式模型和所述偏移进行组合，生成最终参考模型；以及
(xii)使用所述最终参考模型将所述第二数据集转换为虚拟单位。
在各种实施例中，所述多项式曲线包括四阶多项式曲线或更低阶的多项式曲线。
根据各种实施例，所述已知的梯标准物包括葡聚糖，所述虚拟单位包括葡萄糖单位。
本发明的其他方面涉及一种使用电泳装置对来自分离的样品数据执行对准的方法。例如，所述方法可以包括以下步骤：
(i)在分离通道上施加电势以在所述分离通道中生成电流并在所述通道中分离包括未知分析物的样品，使得产生作为时间的函数的信号的电泳图；(ii)在上述分离过程中，测量所述分离通道的末端之间的作为时间的函数的电流；(iii)将所述电流相对于时间进行积分，以提供作为时间的函数的累积电流；(iv)使用参考标准物，构建参考模型，所述参考模型将累积电流值与迁移时间值相关联的；以及(v)使用所述参考模型，将针对所述样品所观察到的迁移时间值调整为归一化电流时间值；使得所述样品的电泳图被对准。
根据各种实施例，所述方法还包括识别所述电泳图中与所述样品中的未知分析物相关的峰值。
根据各种实施例，使用二次多项式拟合构建所述参考模型。
根据各种实施例，所述方法还包括：使用一个或多个附加参考模型进一步对准来自步骤(v)的所述归一化电流时间值，所述一个或多个附加参考模型将所述归一化电流时间值与标准化虚拟单位相关联。
根据各种实施例，所述一个或多个附加参考模型使用梯标准物和至少一个划界标准物来构建。
本发明的另外方面涉及一种用于对来自样品混合物的电泳分离的数据执行对准的方法。
在各种实施例中，例如，所述方法可以包括以下步骤：(a)使用第一参考模型对原始样品数据执行初始对准，所述第一参考模型将峰值迁移时间值与累积电流值相关联；以及(b)使用一个或多个附加参考模型对步骤(a)中所述对准后的数据执行第二对准，所述一个或多个附加参考模型将步骤(a)中对准后的数据与标准化虚拟单位相关联。
根据各种实施例，所述一个或多个附加参考模型使用梯标准物和至少一个划界标准物来构建。
在各种实施例中，所述划界标准物包括所述样品混合物的一部分。
根据各种实施例，第二参考模型使用上界标准物来构建。在一些实施例中，所述第二参考模型进一步使用下界标准物来构建。
进一步地，本发明的其他方面涉及一种非暂时性的计算机可读产品，该计算机可读产品包含一组指令，用于由计算机执行以分析使用电泳装置分离的样品混合物的一种或多种分析物。在各种实施例中，例如，该程序可以包含用于实现以下步骤的代码：
(i)接收第一数据集，所述第一数据集包括随时间变化的对应于已知的梯标准物的电泳分离的多个信号峰值；
(ii)为峰值迁移时间分配相应的标准化值，所述标准化值以虚拟单位表示；
(iii)将多项式曲线拟合到所述梯标准物，生成第一多项式模型；
(iv)确定所述第一多项式模型中与原点的偏移；
(v)使用所述偏移来平移所述第一多项式模型以穿过所述原点，生成平移后的第一多项式模型；
(vi)通过所述第一多项式模型再利用所述第一数据集并确定至少两个预测残差，其中，所述残差表示接收峰值和建模峰值之间在时间上的不匹配程度；
(vii)将三次样条曲线拟合到所述残差，生成三次样条模型分量；
(viii)接收第二数据集，所述第二数据集包括随时间变化的对应于混合物的电泳分离的一个或多个峰值，所述混合物包括(a)未知分析物、(b)上界标准物以及(c)下界标准物；
(ix)确定上界标准物的峰值；
(x)将所述平移后的第一多项式模型的斜率和曲率等比例调整为所述上界标准物，生成上界标准物模型；
(xi)使用所述上界标准物模型确定下界标准物的峰值；
(xii)将多项式曲线拟合到所述下界标准物、所述上界标准物和所述原点，生成第二多项式模型；
(xiii)将(a)所述第二多项式模型、(b)所述三次样条模型分量和(c)所述偏移进行组合，生成最终参考模型；以及
(xiv)使用所述最终参考模型将所述第二数据集转换为虚拟单位。
当结合附图阅读以下描述时，将更全面地理解本发明的这些和其他的目的和特征。
附图说明
将参考以下示例性而非限制性的图示讨论本公开的各种实施例，其中，相同元件的编号相同，在附图中：
图1示出了根据各种实施例的对原始电泳数据收集的采集；
图2示出了根据各种实施例的使用毛细管电泳装置的来自典型分离的电泳迹线；特别地示出了包括荧光高分子梯的多个低聚物的迁移，图中在y轴上示出了荧光数据，在x轴上示出了迁移时间，单位为秒；
图3示出了根据各种实施例的用作内部标记的分析物控制的电泳图的示例，图中在y轴上为来自正常分离的荧光数据，在x轴上为迁移时间，单位为秒；
图4示出了根据各种实施例的具有分析物加分析物对照物的混合物的样品的电泳图的示例，图中在y轴上为来自正常分离的荧光数据，在x轴上为迁移时间，单位为秒；
图5示出了根据各种实施例的来自正常分离的电流数据的示例，图中在y轴上为来自正规分离的电流数据，在x轴上为迁移时间，单位为秒；
图6示出了根据各种实施例的用于执行预对准电流归一化的算法的曲线图；
图7示出了根据各种实施例的用于执行在预对准过程中使用的基于电流的归一化和转换的整个过程；
图8示出了根据各种实施例的用于对准的高分子梯校准阶段中使用的自动化过程；
图9示出了根据各种实施例的在校准阶段之前从高分子梯中提取峰值的详细算法步骤；
图10示出了根据各种实施例的构建梯模型的高级算法流程；
图11A示出了根据各种实施例的在未知样品电泳图中搜索和找到上界标准物(UBS，Upper Bracketing Standard)的步骤；
图11B示出了根据各种实施例的使用多项式模型来搜索UBS；
图12示出了根据各种实施例的用于从梯校准结合样品UBS来引导样品模型的算法，以能够使得后续搜索样品下界标准物(LBS，Lower Bracketing Standard)；
图13示出了根据各种实施例的寻找样品LBS的过程；
图14示出了根据各种实施例的从LBS和UBS生成基础(二次)样品模型的过程；
图15示出了根据各种实施例的将来自梯校准的三次样条分量与基础(二次)样品模型拼接及合并以给出最终的样品模型用于进行对准的过程；
图16示出了根据各种实施例的对准的最终步骤，其中，原始或预对准数据被转换成虚拟化的绝对糖单位x轴数据；
图17示出了根据各种实施例的来自一组聚糖混合物的电泳图的代表性示例；
图18示出了根据各种实施例的使用图17中的原始集作为输入的一组典型的完全转换的(虚拟化的、对准的)的电泳图；以及
图19单独示出了根据各种实施例的仅使用电流的预对准阶段的结果。
具体实施方式
现在将参考各种实施例。虽然将结合各种实施例描述本发明，但是应该理解的是，并不旨在将本发明限制于那些实施例。相反，本领域技术人员能够理解，本发明旨在涵盖各种替换、修改和等同的实施例。
根据各种实施例，图1提供了示例性数据收集系统的框图并且示出了荧光高分子梯100、未知分析物混合物(样品)101和用作分析中的标记物或划界物的标准物/对照物(standards/controls)的使用。在各种实施例中，此类分析物可以具有附着于分析物的合适的荧光染料标签，使得荧光染料可在电泳装置或系统中被检测到。可以使用多种类型的已知电泳装置中的任何一种。在各种实施例中，使用包括一个或多个细长的分离通道(例如毛细管)的电泳装置，样品可注入该分离通道中并进行电泳分离。
在各种实施例中，例如，可以通过沿一个或多个分离通道施加电势来执行电泳分离，每个分离通道由沿着毛细管的长度纵向延伸的相应的细长孔(elongate bore)限定。可以将相应的样品中的一种或多种未知分析物注入一个或多个相应的毛细管中进行分离和检测。合适的分离物或筛分物、基质或聚合物可填充每个毛细管，例如固定凝胶或原位凝胶或聚合物晶格、或者可流动的聚合物制剂。然后可以对样品进行电泳，使得样品沿着它们相应的分离通道迁移以提供对一种或多种分析物的分离。诸如激光或LED之类的能量源可以被配置为在沿着每个毛细管的限定位置处将激发光束引导到检测区域或窗口。激发光束可以激发与一种或多种未知分析物中的每一种相关联的染料，使得所述染料发光。然后，从样品区域发射的光可以通过一个或多个适当的透镜/滤光器装置(例如，聚光透镜、激光滤光器和聚焦透镜)，使得聚焦的光入射到能够检测来自检测区的发射的合适的检测器上，该检测器例如一个或多个光电倍增管(PMT)或电荷耦合器件(CCD相机)。来自检测器的电子信号可以提供关于分析物样品的特征或序列的信息。
此外，在这方面，所捕获的图像可以被转换成可读形式，称为电泳图，然后可以从该电泳图中确定关于关注的分析物的存在或信息。图2中示出了电泳图(也称为迹线或时间序列图)的一个示例。图2的电泳图是峰值形式的随时间变化的所采样的信号数据的图示。在所描绘的实施例中，信号数据代表使用毛细管电泳装置的典型的电泳分离或电泳运行。特别地，图2示出了从包含荧光高分子梯的多个低聚物的迁移中检测到的信号，其中在y轴上为荧光数据，在x轴上为迁移时间，单位为秒。在各种实施例中，电泳迹线可以包括例如：下标记(LM，lower marker)和上标记(UM，upper marker)。这些标记物中的任一个或两个可以设置为样品缓冲液的一部分，并且可以用于样品对准。例如在Shen Hu、Dovichi、NormanJ的文章用于分析生物聚合物的毛细管电泳(Capillary Electrophoresis for theAnalysis of Biopolymers)(2002年6月15日出版的分析化学(Analytical Chemistry)，第74卷第12期，第2833页第18段，AN:7152955；该文章以整体引用的方式并入本文)中，描述了本领域技术人员适用或容易适应的各种毛细管电泳装置和技术与本发明结合使用。
本发明的各种实施例考虑使用诸如专利号为8,778,155和8,784,626的美国专利、以及公开号为2015/0338347的美国专利申请中所教导的电泳装置和方法，所有这些专利资源都属于BiOptic公司；并且每个专利都以整体引用的方式并入本文。例如，公开号为2015/0338347的美国专利教导了通过毛细管电泳进行聚糖糖型分析的方法，以及用于聚糖分析(例如分析N-聚糖)的毛细管电泳装置。毛细管电泳装置使用集成的双光纤进行辐射激发和发射检测。毛细管电泳装置被配置成执行双色检测以进行数据分析。辐射激发源用于激发待分析的样品溶液中的两种发射荧光团或染料。一种发射染料用于标记样品，另一种发射染料用于为样品试验提供参考标记(例如，葡聚糖梯)。应用两个检测器(例如，光电倍增管)同时检测来自染料的荧光发射。对两个检测器收集到的数据进行处理以进行自动峰识别。本发明非常适合于这种处理，并且可以在自动峰值检测中提供增强的结果，例如质量和数量增强的信息。
在各种实施例中，如本文中所设想的系统的其他方面可以例如包括处理站。根据各种实施例，例如，处理站可以与例如如上文所描述的电泳装置连接以进行通信。这种处理站可以例如包括中央处理单元(CPU)和数字存储器。CPU可以执行存储器中的指令以收集和处理数字数据。在一些实施例中，处理站可以与毛细管电泳装置集成在其壳体内或作为其壳体的一部分。替代地或另外地，处理站的至少一部分可以设置在电泳装置的外部。在各种实施例中，处理站包括通用数字计算机(诸如麦金塔计算机(Macintosh)或个人计算机(PC))和/或具有显示功能的输入输出设备。在各种实施例中，可以提供人机接口设备(HID，Human Interface Device)，HID包括例如外部可访问的键盘、输入/输出单元(例如，鼠标)和一个或多个显示器(例如LCD或OLED显示器面板)。
根据各种实施例，一个或多个软件程序安装在处理站的计算部分上，和/或安装在可以收集和分析数据的链接的计算机上。该软件程序可以例如包括(i)数据收集程序以及(ii)峰值分析程序。在各种实施例中，数据收集程序可以在信息生成时处理该信息，然后，可以运行峰值分析程序。在各种替代实施例中，峰值分析程序可以与数据收集程序同时运行。可以在运行期间或运行之后随时间绘制一个或多个发射信号。峰值分析程序确定的适当的参数用于增强峰值。可以将所分析的数据重新绘制为一系列校正后峰值，这些校正后的峰值表示样品中的未知分析物的生物分子单元序列(即色谱图或电泳图)。在一些替代实施例中，不执行重新绘制步骤，而是将发射信号的初始绘制延迟到可以生成包括校正后峰值的绘图的时间，或者延迟到该时间之后。结果可以存储在样品文件中，该样品文件可以包括例如原始数据、电泳图、分子结构信息和用户输入的任何文件信息。在一些实施例中，还可以针对每个样品生成仅包含文本的第二文件。该文本文件适于在其他应用程序(例如，数据库搜索)中使用。
如下文所述，峰值分析程序可以接收数据，该数据包括由与一个或多个毛细管相关联的一个或多个传感器检测到的信号数据或信息。可以检测与毛细管电泳装置有关的各种附加数据或信息中的任何一种，并将所检测到的数据或信息传送到峰值分析程序以增强自动峰值检测的结果。在本发明的各种实施例中，例如，可以使用热电偶、电位器和/或压敏电阻。在一些实施例中，采用数字传感器；在一些实施例中，使用模拟传感器；并且在各种实施例中，将这些类型的传感器混合使用。在各种实施例中，使用MEMS技术在微观尺度上将一个或多个传感器制造为微型传感器。在各种实施例中，这里所使用的优选传感器基本具有以下特征：(i)对测量的属性灵敏；(ii)对使用期间可能遇到的任何其他属性不灵敏；以及(iii)不影响测量的属性。
根据各种实施例，可以采用一个或多个传感器来检测接近每个毛细管的环境或在每个毛细管的环境内的一种或多种相应的物理属性。该检测可以例如是基本上局部化的、和/或沿着区域或跨区域的。例如，在各种实施例中，检测是跨区域进行的，例如当检测跨越毛细管的电势时，该检测例如纵向地跨越每个毛细管长度的区域进行。
在各种实施例中，根据本发明的毛细管电泳装置配备有至少一个传感器，该至少一个传感器用于检测每个毛细管的传导电流(本文中，有时简称为“电流”)。该传感器可以适用于生成与检测到的电流成比例的信号。电流测量流过分离通道(即毛细管电泳的毛细管孔)的电荷量。在一些实施例中，毛细管电泳装置配备有至少一个传感器，用于检测每个毛细管上的电压差。
当测量的电流在本发明的方法中用作输入变量以增加自动峰值检测中的有用结果的产率时，发现该测量的电流是具有意料不到的益处。例如，在使用测量的电流但不使用测量的电压差的各种实施例中，可以实现上述意料不到的结果；并且，在使用测量的电流以及测量的电压差的其他实施例中，也可以实现上述意料不到的结果。重要的是，根据本发明的各种实施例，在电泳运行期间收集的数据的处理中利用分离通道中的测量的电流，可以改善电泳装置的总体功能和通用性。例如，根据这样的方法的各种实施例，方法可以包括：测量分离通道中的电流，使包括一种或多种未知分析物的样品沿着通道进行电泳，在通道的检测区域对一种或多种分析物进行光学检测，收集所检测的信号数据，并通过采用测量的电流作为变量的方法处理所收集的信号数据。该处理可以例如包括在峰值检测期间校正数据中的疑难问题(例如，一个或多个错误)。
根据各种实施例，选择的电泳装置可用于生成信号数据(被称为相对荧光单位(RFU))，该信号数据作为时间(迁移时间)的函数，这给出了单个电泳图曲线，如图1中示出的对应于相应的样品100、101和102的电泳图曲线104、105和106所示。根据各种实施例，图2示出了典型的葡聚糖(聚合物高分子)梯电泳图107。可以分离或合成来自序列梯(ladder)107的分析物的子集，以产生在分析中所使用的标准物或对照物。如图3所示的具有这种标准物的电泳图108可以在分析物迁移时间范围的开始、中间以及结束具有分析物。根据本发明的各种实施例，在混合物中分析物峰值的迁移时间范围的下端(LBS)处和上端(UBS)处的分析物对照物(称为标记物或划界标准物)可用作对准过程的一部分，而其他的分析物对照物可用作验证设备。图4示出了显示了典型的样品电泳图109，该样品电泳图109在分离之前将LBS标记物和UBS标记物添加到样品中。
在电泳期间，带电粒子从一个电极移动到另一个电极。该带电粒子的运动可能仅部分地受许多因素影响，或者与待测量的目标粒子的属性无关。根据本发明的各种实施例，执行预对准步骤或过程以用于减少或消除由这些因素引起的变化。在各种实施例中，在电泳期间产生的电流可用于实现该校正。电流测量流过导管(例如毛细管电泳的毛细管)的电荷量。因此，在各种实施例中，可以采用电流数据来估计从过程开始到该过程的每个后续的时间点流过了多少电荷。在没有变化的情况下，技术人员将预期每次重复该过程时在每个时间点流动相同数量的电荷。根据一些实施例，估计电荷量的一种方式是对于过程中的每个点，先添加当前点之前(包括当前点)的所有点的电流值(总和(积分)矢量)。然后可以构建x、y值的图，其中x将是上面所描述的电流总和，y将是观察到该总和时的实际时间值。图6中，曲线111提供了这种图的示例。在该过程没有变化的情况下，技术人员将预期相同的“和”值对应于所有样品的相同时间。如果不是，则可以将其强制视为参考时间值以产生在没有变化的情况下获得的时间，并且如各种实施例所设想的那样，该过程包括预对准过程。因此，在各种实施例中，对于每个新样品，可以针对每个点计算该每个新样品自身的电流总和，并且可以调整该样品在该点的时间值以与虚拟或物理参考样品中的时间值匹配。
图5示出了包括对应于RFU分离的电流随迁移时间间隔的变化的示例的电泳图，通常表示为110。图5中的电流数据可以例如用于在这里被称为“预对准”的过程中转换或归一化迁移时间标度。然而，应该注意的是，该术语并不表示由该步骤产生的对准程度或完整性，而是用于区分该步骤与后续的采用诸如葡聚糖多聚体和划界标准物之类的标准物的对准过程。在一些实施例中，预对准可用于产生从部分对准到完全对准的对准。
本发明的各个方面涉及仅基于单个样品测量来预对准数据的过程。在各种实施例中，在电泳装置中进行部分对准或完全对准的方法可包括以下步骤：
a.将原始分离数据、电流以及可选地在分离过程中采集到的电势数据进行组合，以使得到的分离数据曲线与一个或多个参考分离曲线对准；
b.针对原始分离数据的每个点，根据在该点处的电流值，增加或减少时间值；以及，
c.可选地，针对原始分离数据的每个点，根据在该点处的电势值，增加或减少时间值。
接下来，描述基于电流来预对准数据的过程和方法步骤的示例性实施例。下面是对这些步骤的描述。
图6示出了根据各种实施例的预对准的示例，其中梯度用来整体基于电流形成参考模型112而没有标准物或对照物存在。(在各种实施例中，可以以甚至不需要梯度峰值发现的方式来构造该过程)。根据各种实施例，该参考模型可以是多项式或三次样条。在该示例中，使用二次多项式。根据各种实施例，该模型112将电流的总和(积分)与迁移时间拟合。接下来，在各种实施例中，可以测量未知样品，并且可以使用相同的过程来计算电流的总和(积分)以及构造模型111。在各种实施例中，然后可以将电流总和值200输入到模型112中以给出新的输出(电流归一化后的)迁移时间114。在各种实施例中，该从原始采样时间113到基于参考梯度114的归一化时间的转换可以用于对准每个后续的注入(分离)电泳数据，其中，每个未知样品都可以从最初的原始迁移时间转换为相同单位的通用标度。图7是示出根据各种实施例的使用RFU数据115、电流116以及可选地电压117作为到预对准过程的输入以给出以初始迁移时间标度(例如，秒)对准的电泳图数据的整个过程的流程图。在各种实施例中，图7中的预对准产生所得到的电泳图120中的原始单位(秒)的x轴，并且如将看到的与后续的对准过程的唯一不同在于：将120处的x轴单位转换为虚拟单位，称为“VU”。
梯校准
图8示出了根据各种实施例的在下一阶段中的初始步骤，其中示出了梯校准的整个过程，在这种情况下，使用原始数据或预对准数据作为输入。可以为观察到的梯分量的峰值迁移时间分配标准化值。在各种实施例中，例如，该标准化值以虚拟单位(VU)表示，例如高分子单位(MU)或均聚物单位(HU)。例如，已知的梯标准物(ladder standard)可包含葡聚糖的均聚物，其迁移时间可表示为葡萄糖单位(GU)。在一些实施例中，已知的梯标准物包含不同大小的寡核苷酸，其迁移时间表示为核苷酸单位(NU)。在任何情况下，可以通过将曲线与梯均聚物的迁移时间拟合来计算VU值。该曲线后续可用于根据针对包括一种或多种未知分析物的样品观察到的迁移时间来分配VU值。
在这方面，继续参考图8，梯122具有在123中检测和提取的峰值，其中来自每个峰值的迁移时间与对应于梯中的分析物的高分子长度的虚拟单位127匹配。迁移时间的典型单位例如包括秒，而每个峰值的半随机虚拟单位(VU)是从1开始的整数，其以1为增量增加到15或更多(参见图8中y轴的数据)。根据各种实施例，处理开始于计算多项式129中的偏移128并确定该偏移，然后在各种实施例中可以使用该偏移来平移多项式模型129以给出穿过原点128的截距。在各种实施例中，该平移偏移可以存储为VU偏移以供以后使用。
梯峰值检测和提取
图9示出了根据各种实施例的自动梯峰提取处理的细节。在各种实施例中，可以找到最高峰值130并且可以基于一些可接受的百分比131(例如，在各种优选实施例中可以采用30％)计算相对阈值，但是该技术对精确的等级不灵敏；相反，可以使用一些截断来使得搜索过程终止。根据各种实施例，搜索可以从对所有有意义的峰值进行从左到右的扫描(箭头132)开始，直到峰值下降到阈值131以下。需要注意的是，本领域普通技术人员可以选择或设计术语“有意义”的合适定义。出于本示例性描述的目的，并且根据本发明的各种实施例，术语“有意义”被定义为表示在电泳图中高度>0.025*的最高峰的未饱和的任何峰值。对于该阶段中的每个峰值，在各种实施例中，可以在连续峰值之间找到间距，然后将这些间隙制成集合。在各种实施例中，可以根据该间隙集合计算最小值、最大值、初始间隙、平均值、中值以及方差。在各种实施例中，根据这些统计，计算可接受间隙的下限值和上限值。需要注意的是，可以使用多种方法来建立上限和下限，包括均值或中值加上或减去一定的方差量。本发明的各种优选实施例采用来自所有间隙的集合的最小间隙作为最小允许的间隙，并且将在搜索中找到的第一间隙的值加上间隙中的第一变化值的两倍作为上限。在各种实施例中，这些下限和上限基于梯数据的变化而不是基于先验的间隙值或固定百分比，由此实现自适应提取过程。
根据各种实施例，从阈值131上方的最右边的峰值逆向操作(箭头133)对第一梯峰值执行搜索，一旦找到具有低于下限或高于上限的间隙(与先前的峰值的迁移时间改变)的第一峰值就停止；换句话说，如果该间隙与在第一阶段中发现的其余梯峰值不一致时就停止。在各种实施例中，一旦找到第一梯峰值，可以开始从左到右的新的搜索(箭头134)，并且在这种情况下，技术人员能够完全预期至少回到他或她停在30％阈值的前一点。在各种实施例中，在该遍历期间可以例如针对信号的异常下降测试峰值，例如每个峰值不能下降到先前的峰值的50％以下，这加强了形状的连续性。在一些实施例中，可选的测试包括限制峰值超过先前的峰值的200％。在各种实施例中，可以在该搜索(箭头134)中应用预先建立的间隙测试限制。在各种实施例中，一旦找到来自第一峰值的至少10个峰值，则可以进行另外的测试135，其中可以使用新的间隙测试，测试间隙的范围是最后3个间隙平均值的[0.5，1.5]。根据各种实施例，一旦找到最小数量的有效梯峰值(136是最后的峰值)或者峰值信号下降到低于有意义的水平，则整个提取过程可以终止。或者，换句话说，一旦找到最后一个有意义的峰值，提取过程就可以终止。
模型细化(残差拟合)
如各种实施例所设想的那样，图10示出了在使用梯峰值构建基础梯二次模型之后的算法流程。在各种实施例中，梯数据137可以通过模型138循环再利用，并且可以在139中计算预测残差140、143。这些残差140、143例如可以示出针对每个峰值(拟合优度)的数据137和模型138之间的不匹配(时间)。在各种实施例中，实际的残差点可以用作标准物三次样条的输入(结点143)，并且可以在142中计算残差的新三次样条拟合以产生新三次样条模型144。在各种实施例中，该三次样条模型144加上来自梯的基础模型138可以准确地表示梯数据137，而没有通常与在数据集边缘附近的高阶多项式拟合相关联的问题。模型144匹配每个结点处的VU值。梯峰值与样条中的三次拟合之间的小步长可以减少失真，并且提供在已知的梯控制点之间连续且平滑的功能。
单位归一化
根据各种实施例，图10中的最后的步骤可以包括针对三次样条模型的x轴时间标度[0.0，1.0]进行归一化，举例来说，该分量可以用于后续的转换。
UBS峰值检测
根据各种实施例，一旦如图11A中所示梯模型被建立，算法可以如在146处示出的搜索UBS峰值147。在各种实施例中，搜索过程146检查未知样品电泳图145中的峰值，如图11A中所示。在各种实施例中，该过程可以基于以下假设：假设UBS峰值是在从右到左搜索中找到的第一个有意义的峰值。尽管该算法的各种实施例使用了所述UBS，并且各种优选实施例采用该先来先服务(first-come-first-serve)方法，但应注意的是，可以使用替代方法来找到UBS。目标是找到一有效的UBS峰值。可以使用能够找到有效的UBS峰值的任何合适且可靠的方法，如本领域技术人员已知的方法。
图11B示出了使用多项式模型159B搜索UBS。在各种实施例中，过程161B例如包括将x轴的迁移时间转换为虚拟化VU，使得先验指定的UBS能够被使用。在此阶段使用VU的基本原理是排除知道UBS在原始迁移时间中的位置的需要。从预测的UBS位置，计算在VU空间中的搜索窗164B，其中优选的窗可以包括例如大于预期的UBS-1.0VU的所有值。提供在窗中查找UBS的第二步骤163B可以包括在搜索窗中查找最强峰值。
LBS峰值检测
根据各种实施例，图12示出了在150中描绘的估计(投影)LBS预测模型以仅使用在148处的样品UBS和在149处的先前的基础梯模型(二次)来搜索LBS的方法。在各种实施例中，该步骤的目的是根据样品构建新模型以找到样品LBS所在的VU区域。在各种实施例中，用于实现此目的的方法可以包括使用样品UBS修正梯模型，以使得对二次模型的斜率和曲率的进行等比例的改变以使UBS样品峰值拟合。图13示出了搜索样品LBS的示例性过程，其中将在157处描绘的样品电泳图输入到158处的LBS预测模型中。图13在159处示出了如何导出LBS预测模型160。根据各种实施例，LBS模型158用于预测LBS在原始样品中的位置。在各种实施例中，过程160例如包括将x轴的迁移时间转换为虚拟化VU，使得先验指定的LBS能够被使用。在各种实施例中，根据预测的LBS位置，可以计算在VU空间中的搜索窗161、162，其中在各种实施例中，优选窗包括+/-0.5VU。在此阶段使用VU的基本原理是排除知道LBS在原始迁移时间中的位置的需要。根据各种实施例，在窗中搜索LBS的第二步骤可以包括寻找最强峰值163、164。
对准
参照图14，示出了上述过程中的示例性的下一步骤，其中算法系统使用LBS165、UBS166，在167处计算通过原点170的在168处的新的样品二次模型。LBS171、UBS172和原点170足以生成二次预测模型169。图15示出了根据各种实施例是如何将二次样品模型173、174、176与在178处归一化的三次样条分量175、177在179处进行组合以产生最终的样品模型180。在各种实施例中，178中使用的提供实现该组合的示例性步骤包括去除三次样条中响应时间的单位，并将范围归一化为[0.0，1.0]，从而使得能够通过匹配LBS和UBS控制点将该分量直接添加到样品模型中。根据各种实施例，可以例如如图16所示完成整个过程，其中，在181处描绘的原始输入数据被发送到182处的最终模型，并在183处进行处理以产生对准的虚拟化VU的x轴数据。根据各种实施例，在183处的过程可以基于通过最终模型将原始的x轴值从时间(秒)转换为VU，例如：
全模型：VU(i)＝f样品(i)+g单位_矢量(i)+VU偏移
其中，
i＝x轴索引
f＝二次样品模型
g＝梯的三次样条分量
VU偏移＝初始梯多项式的截距的常数
需要注意的是，本发明的各种实施例考虑了各种替代结构；例如：
(1)VU(i)＝f样品(i)+VU偏移，其中，未使用三次样条的步骤；
(2)VU(i)＝f2样品(i)加VU偏移，其中，基础样品模型f2＝LBS投影模型152(如图12中所示)并且不需要也不包括LBS173、176(如图13中所示)；
(3)VU(i)＝f2样品(i)+g单位_矢量(i)+VU偏移，其中基础样品模型f2＝LBS投影模型152(如图12中所示)并且不需要也不包括LBS173、176(如图13中173、176所示)。在这种情况下，替选项(3)与替选项(2)的不同之处在于使用了三次样条分量。
根据各种实施例，采用四阶和更低阶的多项式。例如，各种实施例提供使用一个或多个二次拟合来管理和操作数据系统，例如标准物梯数据。一些优选实施例例如提供了二次多项式曲线的使用，并且还提供了插值三次样条分量以拟合已知的梯数据。
根据各种实施例，基于上述替代构建过程，可以示出在分析中存在多种选项，因此，本领域技术人员将理解，本发明的方法在实践中是非常灵活的。例如，在各种实施例中，对于禁止使用下界标准物(LBS)的应用，替代构建过程(2)可以是合适且有效的。换句话说，对于本系统的各种实施例，跳过一个步骤可以是设计的一部分并且是该系统的功能所固有的。图17示出了根据各种实施例的来自聚糖混合物集合的电泳图185的代表性示例。图18示出了根据各种实施例的使用图17中所示的原始集合185作为输入的完全转换的(虚拟化的、对准的)的典型集合的电泳图186(a typical set of fully transformedelectropherograms 186)。在该示例中，从基于电流的预对准开始、到梯模型、样品LBS和UBS加上三次样条分量，使用完整的端到端过程。图19示出了根据各种实施例的仅使用电流的预对准阶段的结果187。
以下实施例仅用于说明目的，并不应该被理解为任何形式的限制。
示例A
在图1中示出了所使用的实验装置，其中，框图显示了使用数据收集系统以及葡聚糖梯100、未知的聚糖混合物(样品)101和聚糖标准物/对照物。
电泳装置使用以相对荧光单位(RFU)生成的信号数据作为时间(迁移时间)的函数，以给出如针对100、101和102中的相应的样品示出在104、105和106中示出的电泳图曲线。图2显示典型的葡聚糖梯电泳图107。可以分离或合成来自序列梯107的聚糖的子集以产生在分析时所使用的聚糖标准物或对照物的集合，具有这种标准物的电泳图108(图3中所示)可以在分析物迁移时间范围的开始、中间以及结束具有分析物。在混合物中聚糖峰值的迁移时间范围的下端(LBS)处和上端(UBS)处的聚糖对照物(也称为标记或划界标准物)用作对准过程的一部分，而其他的聚糖对照物可用作验证设备。图4示出了显示了典型的样品电泳图109，该样品电泳图109在分离之前将LBS标记和UBS标记添加到样品中。
图5示出了对应于RFU分离的电流110随迁移时间间隔的变化。图5中的电流数据用于在被称为“预对准”的过程中转换或归一化迁移时间标度。该预对准用于产生对准，该对准校正了数据集中的大多数变化。
图6示出了用于执行电流预对准的过程，其中计算每个点的电流总和，然后调整该样品在该点的时间值以与参考样品中的时间值匹配。
此外,图6示出了预对准，其中，序列梯用于整体基于电流形成参考模型112并且不需要标准物或对照物。该参考模型使用二次多项式拟合创建。模型112将电流的总和(积分)与迁移时间拟合。接下来，测量未知的聚糖样品，并且使用相同的过程来计算电流的总和(积分)以及构造模型111。然后将电流总和值200输入到模型112中以给出新的输出(电流标归一化后的)迁移时间114。使用从原始采样时间113到基于参考梯114的归一化时间的转换来对准每后续注入(分离)电泳数据，其中，每个未知样品都从最初的原始迁移时间转换为相同单位的通用标度。图7示出了使用RFU数据115、电流116和电压117，以秒级的原始迁移时间标度给出对准的电泳图数据的整个过程。图7中的预对准得到以原始单位(秒)的x轴，并且与后续的对准过程(如将示出的)的唯一不同在于：将x轴单位转换为称为“VU”虚拟单位。
梯校准
图8示出了在下一阶段中的初始步骤，其中示出了聚糖梯校准的整个过程，在这种情况下，使用预对准数据作为输入。梯122具有在123中检测和提取的峰值，其中来自每个峰值的迁移时间与对应于葡聚糖梯的聚合物或葡萄糖单位长度的聚糖单位(GU)127匹配。迁移时间以秒为单位来测量，GU标度从1开始，以1为增量递增到15或更多(参见图8中y轴上的数据)。该处理中的初始步骤是计算梯峰值数据124的二次多项式125、126拟合中的偏移并确定该偏移，然后使用该偏移来平移二次模型129以给出穿过原点128的截距，该平移偏移被存储为“GU偏移”以供以后使用。
梯峰值检测和提取
图9示出了自动的梯峰值提取处理的细节。找到最高峰值130并且基于一些可接受的百分比131来计算相对阈值，在这种情况下该百分比为30％。从左到右扫描(箭头132)搜索所有有意义的峰值，直到峰值高度下降到相对阈值131以下。对于该阶段中的每个峰值，在连续峰值之间找到间距，然后将这些间隙制成集合。根据该间隙集合计算最小值、最大值、初始间隙、平均值、中值以及方差。根据这些统计，计算可接受的间隙的下限值和上限值。将基于所有间隙的集合的最小间隙作为最小允许的间隙，并且将在搜索中找到的第一间隙的值加上间隙中的第一变化值的两倍作为上限。从阈值131上方的最右边的峰值逆向操作(箭头133)，该算法搜索第一梯峰值，一旦找到间隙低于下限或高于上限的第一峰值就停止。一旦找到第一梯峰值，就开始从左到右的新的搜索(箭头134)。在此遍历期间，测试峰值信号的异常下降，其中每个峰值不能下降到先前的峰值的50％以下。在该搜索(箭头134)中应用预先建立的间隙测试限制。一旦我们从第一个峰值找到10个峰值，我们就执行了一个新的间隙测试，该测试要求间隙的范围是在最后3个间隙平均值的[0.5,1.5]。一旦找到梯峰值18，整个提取过程终止。
模型细化(残差拟合)
图10示出了在使用梯峰值构建基础梯二次模型之后的步骤。梯数据137通过模型138循环再利用，并且在139中计算预测残差140、143。这些残差140、143示出针对每个峰值(拟合优度)的数据137和模型138之间的不匹配(时间)。实际的残差点用作标准物三次样条的输入(结点143)，并且在142中计算残差的新三次样条拟合以产生新三次样条模型144。该三次样条模型144加上来自梯的基础模型138准确地表示梯数据，在每个节点(结点)143处具有无差错表示。梯峰值与样条中的三次拟合之间的小步长几乎消除了失真，并且提供了在已知的梯控制点之间的连续且平滑的功能。
单位归一化
图10中的最后的步骤用于针对三次样条模型的x轴时间标度[0.0，1.0]进行归一化，该三次样条用于后续的转换。
UBS峰值检测
在如图10中那样建立梯模型之后，另外参考图11A，该算法搜索146UBS峰值147。搜索过程146检查未知聚糖样品电泳图145中的峰值，如图11A中所示。该过程基于以下假设：假设UBS峰值会在从右到左搜索中找到第一个有意义的峰值。
LBS峰值检测
图12示出了如何创建LBS预测模型150以仅使用样品UBS148和使用先前的基础梯模型(二次)149来搜索LBS。该步骤的目的是根据样品构建新模型以找到样品LBS所在的位置。我们能够使用样品UBS峰值并以相等的比例调整梯模型的斜率和曲率，以使二次模型与我们的UBS样品峰值拟合。图13示出了用于搜索样品LBS的过程，其中聚糖样品电泳图157被输入到LBS预测模型158、159、160中，并且LBS模型160用于预测LBS在原始样品中的位置。过程160包括将x轴的迁移时间转换为虚拟化GU，使得先验指定的LBS能够被使用。根据预测LBS位置，计算GU空间中的搜索窗161、162，其中优选窗是+/-0.5GU。在此阶段使用GU的基本原理是排除知道LBS在迁移时间(秒)中的位置的需要，因为LBS的位置无法提前知道。用于找到在窗中的LBS的第二步骤涉及寻找最强峰值163、164。
对准
图14示出了上述过程中的下一步骤，其中算法系统使用LBS165、UBS166，在167中计算通过原点170的新样品二次模型168。LBS171、UBS172和原点170足以生成二次预测模型169。图15示出了是如何将二次样品模型173、174、176与归一化178的三次样条分量175、177在179处进行组合以产生最终的样品模型180。178中使用的提供实现该组合的步骤通过去除三次样条中响应时间的单位来允许这种组合，并将范围归一化为[0.0，1.0]，从而使得能够通过匹配LBS和UBS控制点将该分量直接添加到样品模型中。如图16所示完成整个过程，其中，原始输入数据181被发送到最终模型182，并且被处理183以产生对准的虚拟化GU的x轴数据。183的过程基于通过最终模型将原始的x轴值从时间(秒)转换为GU，例如：
全模型：GU(i)＝f样品(i)+g单位_矢量(i)+GU偏移
其中，
i＝x轴索引
f＝二次样品模型
g＝梯的三次样条分量
GU偏移＝初始葡聚糖梯多项式的截距的常数
图17示出了来自聚糖混合物集合的电泳图185的代表性示例。图18示出了根据各种实施例的使用图17中所示的原始集合185作为输入的完全转换的(对准的)的典型集合的电泳图186。在该示例中，从基于电流的预对准开始、到梯模型、样品LBS和UBS以及三次样条分量，使用完整的端到端过程。图19示出了仅使用电流的预对准阶段的结果187。
示例B
在本示例的子部分(1)到(5)中，如下文所述，提供了示例性协定(exemplaryprotocols)，其中，
EC-电流；
RM-参考模型；以及
导管＝分析物导管－在电泳期间分析物通过移动穿过的导管，例如，毛细管电泳中，毛细管的纵向孔。
示例B，子部分(1)
1.提供了一种用于使用电泳系统的电流和电势数据利用参考曲线来执行部分对准或完全对准的示例性定义，包括以下步骤：
1.1.可以在每个样品的分离过程期间执行以下操作。
1.1.1.测量分离(图3的曲线图108)，。
1.1.2.测量或估计导管的末端之间的电势。
1.1.3.在电场的影响下测量或估计流过导管的电流(图5的曲线图110)。
1.1.4.记录每次测量的时间。
1.2.收集在[1.1]中描述的针对多个样品的测量值。样品可包括未知样品和梯样品。
1.3.选择参考样品并使用电流数据和电势数据构建数学模型。
1.3.1.通过将实际的采样周期(秒)除以任意的参考采样周期(秒)，计算所收集的EC数据的采样周期归一化因子(参见图5的曲线图110)。
1.3.2.使用所收集的EC数据计算EC积分矢量(参见图5的曲线图110)，其中，矢量的每个元素是前一个元素与在当前点处的EC值乘以采样周期归一化因子的总和。
1.3.3.通过将所计算的EC积分矢量中的每个元素除以在该测量点处的电势(伏特)，使用所收集的电势数据来执行可选的电势归一化。
1.3.4.使用所记录的时间构建时间矢量(T)，使得对于上面所计算的每个Si(EC积分)值存在可用的时间值Ti。
1.3.5.构建参考模型，该参考模型将上面所计算的S(EC积分)值与T(时间)值相关联。一种方法包括使用(S，T)点的二次拟合，其中，S是输入(自变量)，T是输出(因变量)。该公式可以被指定为参考模型(RM)。可以使用替代多项式模型来获得类似的结果，由此该方法不限于二次方程式。得到的参考EC曲线的一个示例是图6中的112。
1.4.使用在[1.3.5]中计算的参考模型(RM)来对准目标电泳图(以下步骤参见图6)。
1.4.1.使用上面的步骤[1.3.1]、步骤[1.3.2]和可选的步骤[1.3.3]构建目标曲线的EC积分矢量。所得到的结果是图6中的111。
1.4.2.对于目标曲线的每个时间TTi，找到该目标曲线的对应的EC值STi。
1.4.3.用STi来替换RM(公式1.4)中的S并计算TRi。图6是找到目标曲线的新时间值的图形表示。
1.4.4.TRi是目标曲线的点i的新时间。
示例B，子部分(2)
2.提供了一种用于使用电泳系统的电流和电势数据利用参考梯来执行部分对准或完全对准的示例性协定，包括以下步骤：
2.1.可以在每个样品的分离过程期间执行以下操作。
2.1.1.测量分离(图3中的曲线图108)。
2.1.2.测量或估计导管的末端之间的电势。
2.1.3.在电场的影响下测量或估计流过导管的电流(图5的曲线图110)。
2.1.4.记录每次测量的时间。
2.2.收集在[2.1]中描述的针对多个样品的测量值。样品可包括未知样品和梯样品。
2.3.选择参考样品并使用电流数据和电势数据构建数学模型。
2.3.1.通过将实际的采样周期(秒)除以任意的参考采样周期(秒)，计算所收集的EC数据的采样周期归一化因子(图5的曲线图110)。
2.3.2.使用所收集的EC数据计算EC积分矢量(图5的曲线图110)，其中，矢量的每个元素是前一个元素与当前点的EC值乘以采样周期归一化因子的总和。
2.3.3.通过将所计算的EC积分矢量中的每个元素除以在该测量点处的电势(伏特)，使用所收集的电势数据执行可选的电势归一化。
2.3.4.通过选择在时间轴上的单个点来表示峰值位置，使用所收集的分离数据来执行梯峰值提取(图2中的曲线图107)。构建(S，T)点的阵列，其中S是每个峰值的EC积分值，T是每个峰值的时间(秒)。
2.3.5.构建参考模型，该参考模型将上面所计算的S(EC积分)值与T(时间)值相关联。一种优选方法包括使用(S，T)点的二次拟合，其中，S是输入(自变量)，T是输出(因变量)。我们将该该公式称为参考模型(RM)。可以使用替代多项式模型来获得类似的结果，由此该方法不限于二次方程式。所得到的参考EC曲线的一个示例是图6中的112。
2.4.使用在[2.3.5]中计算的参考模型(RM)来对准目标电泳图(以下步骤参见图6)。
2.4.1.使用上面的步骤[2.3.1]、步骤[2.3.2]和可选的步骤[2.3.3]来构建目标曲线的EC积分矢量。所得到的结果是图6中的111。
2.4.2.对于目标曲线的每个时间TTi，找到该目标曲线的对应的EC值STi。
2.4.3.用STi来替换RM(公式1.4)中的S并计算TRi。图6是找到目标曲线的新时间值的图形表示。
2.4.4.TRi是目标曲线的点i的新时间。
示例B，子部分(3)
3.提供了一种用于使用电泳系统的电流和电势数据利用参考曲线而没有构建RM来执行部分对准或完全对准的示例性协定，包括以下步骤：
3.1.可以在每个样品的分离过程期间执行以下操作。
3.1.1.测量分离(图3中的曲线图108)。
3.1.2.测量或估计导管的末端之间的电势。
3.1.3.在电场的影响下测量或估计流过导管的电流(图5的曲线图110)。
3.1.4.记录每次测量的时间。
3.2.收集在[3.1]中描述的针对多个样品的测量值。样品可包括未知样品和梯样品。
3.3.选择参考样品并使用电流数据和电势数据构建数学模型。
3.3.1.通过将实际的采样周期(秒)除以任意的参考采样周期(秒)，计算所收集的EC数据的采样周期归一化因子(图5的曲线图110)。
3.3.2.使用所收集的EC数据计算EC积分矢量(图5的曲线图110)，其中，矢量的每个元素是前一个元素与当前点的EC值乘以采样周期归一化因子的总和。得到的参考EC曲线的一个例子是图6中的112。
3.3.3.通过将所计算的EC积分矢量中的每个元素除以在该测量点处的电势(伏特)，使用所收集的电势数据执行可选的电势归一化。
3.3.4.使用所记录的时间构建时间矢量(T)，使得对于上面所计算的每个Si(EC积分)值存在可用的时间值Ti。
3.4.使用参考EC积分矢量与在(3.3)中计算的时间矢量来对准目标电泳图(以下步骤参见图6)。
3.4.1.使用上面的步骤[3.3.1]、步骤[3.3.2]和可选的步骤[3.3.3]来构建目标曲线的EC积分矢量。所得到的结果是图6中的111。
3.4.2.对于目标曲线的每个时间TTi，找到该目标曲线的对应的EC值STi。
3.4.3.在SR中找到该点，其中，SRi＝STi，然后找到与该点对应的TRi。
图6是找到目标曲线的新时间值的图形表示。
3.4.4.TRi是目标曲线的点i的新时间。
示例B，子部分(4)
4.一种用于使用上述子部分(1)、子部分(2)和子部分(3)中的电泳系统的电流和电势数据执行部分对准或完全对准的参考曲线选择的示例性协定，包括以下步骤：
4.1.以上在子部分(1)、子部分(2)和子部分(3)中描述的参考曲线可以从单次运行中的一条或多条曲线中进行选择并在同一运行期间使用。
4.2.以上在子部分(1)、子部分(2)和子部分(3)中描述的参考曲线可以从单次运行中的一条或多条曲线中进行选择并保存以在同一系统(仪器)的其他运行中使用。
4.3.以上在子部分(1)、子部分(2)和子部分(3)中描述的参考曲线可以从单次运行中的一条或多条曲线中进行选择并保存以在其他系统(仪器)的其他运行中使用。
4.4.以上在子部分(1)、子部分(2)和子部分(3)中描述的参考曲线可以从来自一个或多个仪器的一次或多次运行的一条或多条曲线中进行选择并保存以供将来使用。
示例B，子部分(5)
5.一种用于使用上述子部分(1)和子部分(2)中的电泳系统的电流和电势数据执行部分对准或完全对准的参考模型选择的示例性协定，包括以下步骤：
5.1.以上在子部分(1)和子部分(2)中描述的参考模型(RM)可以使用来自相同板的参考样品或梯来构建，并且在对准目标样品时运行。
5.2.已上在子部分(1)和子部分(2)中描述的参考模型(RM)可以使用来自一个板或一次运行的参考样品或梯来构建，然后应用于来自不同板或运行的目标曲线。
5.3.上述参考模型(RM)可以在每次需要时根据参考曲线来计算或保存，并在每次需要时再次使用。
出于所有目的，本文所述的所有参考文献都通过引用整体明确地并入本文。
本领域技术人员现在可以从上文的描述中可以理解本文的广泛教导可以以各种形式实现。因此，虽然已经结合各种实施例和示例描述了本发明，但是本发明的范围不旨在并且不应该被解释为受限于此。在不脱离本发明的范围的情况下，可以进行各种改变和修改。

Claims (17)

1.一种使用电泳分离对包括未知分析物的样品进行分析的改进系统，所述系统包括：
(a)分离通道，其包括分离介质；
(b)电源，其用于在所述分离通道上施加电势以使样品沿所述分离通道迁移；
(c)检测器，其用于测量与沿着所述分离通道迁移的样品相关联的作为时间的函数的信号强度；以及
(d)计算部分，其包括计算机可读介质，所述计算机可读介质包括包含具体化为可执行指令的软件代码，所述可执行指令用于：
(i)接收第一数据集，所述第一数据集包括随时间变化的对应于已知的梯标准物的电泳分离的多个信号峰值；
(ii)为峰值迁移时间分配相应的标准化值，所述标准化值以虚拟单位表示；
(iii)将多项式曲线拟合到所述梯标准物，生成第一多项式模型；
(iv)确定所述第一多项式模型中与原点的偏移；
(v)使用所述偏移来平移所述第一多项式模型以穿过所述原点，生成平移后的第一多项式模型；
(vi)通过所述第一多项式模型再利用所述第一数据集并确定至少两个预测残差，其中，所述残差表示接收峰值和建模峰值之间在时间上的不匹配程度；
(vii)将三次样条曲线拟合到所述残差，生成三次样条模型分量；
(viii)接收第二数据集，所述第二数据集包括随时间变化的对应于混合物的电泳分离的一个或多个峰值，所述混合物包括(a)未知分析物、(b)上界标准物以及(c)下界标准物；
(ix)确定所述上界标准物的峰值；
(x)将所述平移后的第一多项式模型的斜率和曲率等比例调整为所述上界标准物，生成上界标准物模型；
(xi)使用所述上界标准物模型确定所述下界标准物的峰值；
(xii)将多项式曲线拟合到所述下界标准物、所述上界标准物和所述原点，生成第二多项式模型；
(xiii)将(a)所述第二多项式模型、(b)所述三次样条模型分量和(c)所述偏移进行组合，生成最终参考模型；以及
(xiv)使用所述最终参考模型将所述第二数据集转换为虚拟单位。
2.根据权利要求1所述的系统，其中，所述分离通道包括细长毛细管的纵向孔。
3.根据权利要求1所述的系统，其中，所述多项式曲线包括四阶多项式曲线或更低阶的多项式曲线。
4.根据权利要求1所述的系统，其中，所述已知的梯标准物包括葡聚糖，所述虚拟单位包括葡萄糖单位。
5.一种使用电泳分离对包括未知分析物的样品进行分析的改进系统，所述系统包括：
(a)分离通道，其包括分离介质；
(b)电源，其用于在所述分离通道上施加电势以使样品沿所述分离通道迁移；
(c)检测器，其用于测量与沿着所述分离通道迁移的样品相关联的作为时间的函数的信号强度；以及
(d)计算部分，其包括计算机可读介质，所述计算机可读介质包括包含具体化为可执行指令的软件代码，所述可执行指令用于：
(i)接收第一数据集，所述第一数据集包括随时间变化的对应于已知的梯标准物的电泳分离的多个信号峰值；
(ii)为峰值迁移时间分配相应的标准化值，所述标准化值以虚拟单位表示；
(iii)将多项式曲线拟合到所述梯标准物，生成第一多项式模型；
(iv)确定所述第一多项式模型中与原点的偏移；
(v)使用所述偏移来平移所述第一多项式模型以穿过所述原点，生成平移后的第一多项式模型；
(vi)接收第二数据集，所述第二数据集包括随时间变化的对应于混合物的电泳分离的一个或多个峰值，所述混合物包括(a)一种或多种相应的未知分析物、(b)上界标准物和(c)下界标准物；
(vii)确定所述上界标准物的峰值；
(viii)将所述转换后的第一多项式模型的斜率和曲率等比例调整为所述上界标准物，生成上界标准物模型；
(ix)使用所述上界标准物模型确定所述下界标准物的峰值；
(x)将多项式曲线拟合到(a)所述上界标准物、(b)所述下界标准物和(c)所述原点，生成第二多项式模型；
(xi)将所述第二多项式模型和所述偏移进行组合，生成最终参考模型；以及
(xii)使用所述最终参考模型将所述第二数据集转换为虚拟单位。
6.根据权利要求5所述的系统，其中，所述多项式曲线包括四阶多项式曲线或更低阶的多项式曲线。
7.根据权利要求5所述的系统，其中，所述已知的梯标准物包括葡聚糖，所述虚拟单位包括葡萄糖单位。
8.一种使用电泳装置对来自分离的样品数据执行对准的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)在分离通道上施加电势以在所述分离通道中生成电流并在所述通道中分离包括未知分析物的样品，使得产生作为时间的函数的信号的电泳图；
(ii)在上述分离过程中，测量所述通道的末端之间的作为时间的函数的电流；
(iii)将所述电流相对于时间进行积分，以提供作为时间的函数的累积电流；
(iv)使用参考标准物，构建参考模型，所述参考模型将累积电流值与迁移时间值相关；以及
(v)使用所述参考模型，将针对所述样品所观察到的迁移时间值调整为归一化电流时间值；
使得所述样品的电泳图被对准。
9.根据权利要求8所述的方法，还包括：
识别所述电泳图中与所述样品中的所述未知分析物相关的峰值。
10.根据权利要求8所述的方法，其中，使用二次多项式拟合构建所述参考模型。
11.根据权利要求8所述的方法，还包括：
使用一个或多个附加参考模型进一步对准来自步骤(v)的所述归一化电流时间值，所述一个或多个附加参考模型将所述归一化电流时间值与标准化虚拟单位相关联。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述一个或多个附加参考模型使用梯标准物和至少一个划界标准物来构建。
13.一种对来自样品混合物的电泳分离的数据执行对准的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)使用第一参考模型对原始样品数据执行初始对准，所述第一参考模型将峰值迁移时间值与累积电流值相关联；以及
(b)使用一个或多个附加参考模型对步骤(a)中所述对准后的数据执行第二对准，所述一个或多个附加参考模型将步骤(a)中对准后的数据与标准化虚拟单位相关联。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述一个或多个附加参考模型使用梯标准物和至少一个划界标准物来构建。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述划界标准物包括所述样品混合物的一部分。
16.根据权利要求14所述的方法，其中，所述第二参考模型使用上界标准物来构建。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述第二参考模型进一步使用下界标准物来构建。
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