CN104508473A - 用于具有原位校准的凝胶电泳的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

除其他事项外，本发明涉及用于进行具有原位校准的电泳的方法。该方法包括将一定体积的测试样品与一定体积或一定量的校准样品结合以形成最终体积，其中，该体积的校准样品包括已知浓度的校准物并且最终体积包括测试样品与校准样品的已知比率。该方法还包括将上样部分沉积在电泳凝胶的接收孔中，其中，所述上样部分是最终体积的一部分，并且沿着电泳凝胶的共用分离泳道分开上样部分使得测试样品的组分以及校准物沿着共用分离泳道彼此分离。该方法还包括检测共用分离泳道内的校准物以及分离的测试样品组分并且基于检测，测量校准物和分离的测试样品组分的水平，从而进行具有原位校准的电泳。

Description

用于具有原位校准的凝胶电泳的组合物和方法
相关申请的引用
本申请要求于2012年5月29日提交的美国临时专利申请第61/652,608号和于2013年3月13日提交的美国临时专利申请第61/779,567号的优先权，通过引用将其各自的全部内容结合于此。
技术领域
本发明涉及凝胶电泳领域，并且具体地是在电泳基质内原位校准。
背景技术
电泳是在大小、电荷，以及其他物理性质的基础上用来分离带电荷物质的技术。电泳中，在电场的作用下带电荷物质通过导电电泳介质迁移，其可以是(但不要求是)凝胶。定位在电泳介质任一端的活化的电极提供了用于迁移的驱动力。分子的性质(包括它们的电荷和质量)决定了电场引起它们通过电泳介质迁移的快速程度。
许多重要的生物分子，如氨基酸、肽、蛋白质、核苷酸，和核酸具有可电离基团。因为这些在任何特定pH下可电离的基团，许多重要的生物分子作为带电荷物质存在于溶液中。该带电荷物质使得医生和科学家能够使用电泳分离核酸和蛋白质。
使用电泳分离生物或其他类型的分子依赖于不同的力，包括电荷和质量。当生物样品，如蛋白质或DNA在缓冲液中混合并且施加至电泳介质中时，这两种力共同作用。使用电泳来分离是可能的，因为分子通过电场的迁移速率依赖于电场的强度、分子的电荷、大小和形状，以及分子通过其移动的缓冲液的离子强度和温度。在电泳期间，基于分子的电荷，施加的电场致使分子移动穿过电泳介质的孔。一个电极上的电位排斥该分子而另一电极的电位同时吸引该分子。电泳介质的摩擦力也有助于通过尺寸分离分子。通常，解除所施加的电场后，该分子可被染色。染色后，可以在从电泳介质的一端到另一端展开的一系列的带中看见分离的大分子。如果这些带足够清楚，通过固定大分子以及清洗电泳介质以除去缓冲液，可以单独检查和研究这些区域中的分子。
电泳凝胶的灌胶，如聚丙烯酰胺或琼脂糖的灌胶，通常是通过在凝胶表面创建一系列样品孔来完成。通常使用移液枪、注射针、电泳梳，或相似的样品递送设备将要分析的液体混合物上样至孔中。然而，样品内条带的分辨率仅与使用样品的宽度一样好，并且由于小样品体积受到表面张力(建立超过在特定孔中添加样品所期望的分辨率的胶束直径)这类条带的分辨率较差并且可改变。此外，微体积通常以2-D样的方法施加，其防止体积施加。进一步，凝胶内的样品动力学相对于无溶液化学被限制；自由度的损害负面影响了均一的产物或加合物的显影，除了在定位的区域(其通常在尺寸上仅有几个样品泳道)。由于这些原因，在1uL水平下样品可再现性通常太不精确以至于不为临床或分析所接受。
此外，不使用外部的方法确定电泳基质内分离的测试样品部分的浓度存在极大的困难。尝试在电泳检测内结合这类内参标准都没有成功。由于可变的亲和力和染料的结合特性，多价抗血清和多种蛋白质的传统的尝试失败。特性和位置参照的定量标记物是可用的，但没有使用内部参考标准，其允许用于电泳分离部分的浓度不依赖外部方法绝对定量。
在该领域不存在预测技术。电泳一直是并且仍然是“全部”化学性质的分析衍生物，其中，样品的全部组分经受同样的处理。不通过沉淀、捕获，或其他方法除去组分；它们在相同的基质上分离并且通过逆转该过程而重新结合。该事实限制了电泳产生绝对量值的能力。常规的电泳测量了相对浓度，即，它计算了作为来自翻译为信号以产生电泳图的检测条带的曲线下面积的百分数部分。具体地，电泳后染色凝胶通过光密度计的光学系统以产生电泳图，其是分离条带的可视化图或曲线图。光密度计是特殊的分光光度计，其测量穿过固体样品发射的光，如清晰的或者透明但染色的凝胶。使用光密度测定，光密度计将条带表示为峰。这些峰构成了曲线图或电泳图并且打印在记录器用纸或电脑显示器上。用光密度测定法测量吸光度和/或荧光。积分器或微处理器评估每个峰下的面积并且将每个报告为总样品的百分数。例如，如果电泳用于血清蛋白的分离，各条带的浓度来自该百分比和总蛋白质浓度；如果电泳用于酶的分离，各条带酶的活性来自该百分比和总的酶活性。
因此，常规的电泳只能对样品中检测到的所有条带分配相对的百分比值。例如，如果针对胆固醇显影多个条带，由光密度计提供的相对百分数和外部提供的总胆固醇值成比例地分布于部分之间，以确定绝对浓度。例如由光密度计检测两个条带-第一个是检测出的总信号的25％以及第二个是75％。假如总分析物浓度为200mg/mL，第一条带是50mg/mL(0.25x200mg/mL)，第二条带是150mg/mL(0.75x 200mg/mL)。在凝胶上和/或每个单个的样品上不存在方法以提供校准物。
因为电泳图案仅仅作为其分辨率是有用的，并且由于上面提到的问题，对于消除与凝胶电泳技术相关的样品间的变化性以及样本内的误差的方法和/或系统存在极大需要。
本发明旨在克服本领域中的这些和其他的缺陷。
发明内容
本发明的一个方面涉及用于进行具有原位校准的电泳的方法。该方法包括将一定体积的(a volume of)测试样品与一定体积或一定量的(aquantity of)校准样品结合以形成最终体积，其中，该体积或量的校准样品包括已知浓度的校准物并且最终体积包括测试样品与校准样品的已知比例。该方法还包括在电泳凝胶的上样孔中沉积上样部分，其中，上样部分是最终体积的一部分并且沿着电泳凝胶的共同分离泳道分离上样部分，使得测试样品的组分和校准物沿着共同分离泳道彼此分开。该方法还包括检测所述共同分离泳道内的校准物和测试样品的分离的成分，并基于检测，测量了校准物和测试样品的分离的组分的水平，从而进行具有原位校准的电泳。
本发明提供了重要的和出人意料的优点。在简单的例子中，用与测试样品的未知组分相同的报告物将待测的已知浓度的分析物(即，校准物)预标记。加标记的内标和未知组分按体积结合并且应用校准物和未知样品二者，并且同时进行电泳。分析显示未知部分的电泳图以计算相对于内部参考标准(即，校准物)的未知组分的浓度。因此，给定已知浓度的内部标记校准物，以及校准物和样品的限定体积比的情况下，单点校准物的方案可以用来计算未知分析物的浓度(如本领域技术人员所熟知的)。在本申请中公开的方法消除了方法间的浓度变化以及对于外部检验的需要，并且提供了加强的样品内控制和置信度，节省了时间，成本和方法间的变化。
附图说明
图1是显示提供用于进行如本发明所描述的电泳的测试样品(例如，生物样品)和校准样品的示例性的初始体积的示意图。该实施例的生物样品含有一种或多种感兴趣的组分(未知物或分析物)并且校准样品包括如本发明描述的校准物。该体积的校准样品包括已知浓度的校准物。该体积的测试样品包括未知浓度的一种或多种感兴趣的组分。测试样品的体积和校准样品的体积各自都是已知的。如示意图示出的，所述体积的测试样品和所述体积的校准样品结合或混合成最终已知的体积(即，校准样品的体积+测试样品的体积)。
图2是示出了示例性凝胶电泳仪和梳子涂布器的示意图。可以用电泳梳将混合样品施加到凝胶。该电泳梳可以包括一维的齿阵列，每个能在一个单个的起始线上将约1微升样品递送至凝胶用于对应于电泳梳的齿的每个电泳泳道。如图2所示，该凝胶与施加的样品的每一侧的电极接触。该装置可以包括含有位于其体积内的如图2所示的电泳装置的外壳，在进行凝胶电泳之前，它装有缓冲溶液。
图3是一个示意图，显示了进行凝胶电泳后示例性的电泳凝胶，从而分离测试样品的一种或多种组分和校准物。如该示例性实施例所示，每个泳道中的校准物和测试样品的一种或多种组分通过凝胶电泳分离并且用荧光材料标记。
图4A-4B是示出了进行凝胶电泳后在示例性电泳凝胶上检测荧光强度的示意图。图4A示出了使用检测装置以检测来自电泳样品泳道内的测试样品(Iu)的组分或未知物上的荧光材料(或荧光标记)的荧光强度(I)。图4B示出了检测来自在与图4A示出的待检测的测试样品的组分相同的泳道中的已知的校准样品(Ic)上的荧光材料(或荧光标记)的荧光强度。连同已知浓度的校准物和已知的体积可以使用这两个测量的强度以计算一种或多种组分的浓度。如图4A和4B所示，检测设备可以包括计算装置，其包括，例如光学检测软件。
图5A-5E示出了根据本发明的一个实施方式进行具有原位校准的凝胶电泳的结果。具体地，将含有未知浓度的脂颗粒的四种血清样品与相应的已知浓度的荧光素标记的白蛋白混合。该样品进行凝胶电泳，然后与荧光素标记的抗apoB抗体接触。所得凝胶的图像示于图5A，以及该图像分别对应于在图5B-5E中再产生的样品1-4的每一个。然后用荧光计扫描该凝胶，将所得的峰绘制如图5B-5E所示。在图5B-5E中，在左侧的凝胶的图像中LDL、VLDL、LP(a)，以及校准物可视觉上辨别并且右图示出了根据本发明的分离的组分的定量结果。
具体实施方式
本发明的一个方面涉及用于进行具有原位校准的电泳的方法。该方法包括将一定体积的测试样品与一定体积或一定量的校准样品结合以形成最终体积，其中，所述一定体积或一定量的校准样品包括已知浓度的校准物并且最终体积包括测试样品和校准样品的已知比例。该方法还包括在电泳凝胶的接收孔中沉积上样部分，其中，上样部分是最终体积的一部分并且沿着电泳凝胶的共同分离泳道分离上样部分，使得测试样品的组分和校准物沿着共同分离泳道彼此分开。该方法还包括检测所述共同分离泳道内的校准物和测试样品的分离的成分，并基于检测，测量了校准物和测试样品分离的组分的水平，从而进行具有原位校准的电泳。
该测试样品可以是生物样品。合适的生物学样品或生物样品包括人体生物基质、尿、血浆、血清，以及人脂蛋白部分。例如，该样品可以是新鲜的血液或储存的血液或血液部分。该样品可以是专门针对本发明测定所获得的血液样品，或者是为了其他目的获得的血液样品(其可以被二次取样以用于根据本发明描述的方法的应用)。例如，生物样品可以是全血。使用标准的临床方法可以从受试者获得全血。生物样品也可以是血浆。通过抗凝血离心可以从全血样品获得血浆。该生物样品也可以是血清。可以按照需要通过稀释于适当的缓冲溶液中来预处理样品，如果需要的话将其进行浓缩，或将其通过任何数量的方法进行分级，所述方法包括但不限于超速离心、通过快速高效液相层析(FPLC)进行分级、或沉淀。可以使用多种标准水性缓冲溶液中任何一种，使用多种缓冲液中的一种，如磷酸盐，Tris等(在生理至碱性pH下)。
如上所述，该方法包括将一定体积的测试样品与一定体积或一定量的校准样品结合以形成最终体积，其中，所述体积的校准样品包括已知浓度的校准物并且最终体积包括测试样品与校准样品的已知比例(如，体积比)。
如本领域普通技术人员应该理解的，可以用一定体积的校准物或用，例如已知量的校准物进行该方法。贯穿本文的描述，应该理解的是，提及一定体积的校准物，可以替代已知量的校准物。例如可以在样品杯或孔的壁上干燥校准物并且在加入所述体积的测试样品后重新溶解。特别地，在样品孔内干燥该校准物后，剩余的残余物保持校准物浓度，如荧光标记的校准物的浓度，而不影响体积。在加入样品后，可以重新构成标记的校准物并且结合至样品-校准物“混合物”的最终体积内而不影响脂质颗粒浓度。为了方便和简明，电泳样品孔可以在样品沉积之前以这种方式制备。因此，本发明的另一方面涉及以这种方式制备的电泳凝胶，以及包括这样的凝胶和用于进行本发明描述的方法的说明书的试剂盒。
将所述体积的测试样品与所述体积的校准样品结合以形成最终体积，这可以通过任何合适的方法进行。可以将该体积的校准样品加入到一定体积的测试样品中或可以将一定体积的测试样品加入到一定体积的校准样品中，只要校准样品中的校准物的浓度是已知的，并且最终体积包括测试样品与校准样品的已知比率(如，体积比率)。以这种方式，计算在最终体积中的测试样品的组分的浓度是可能的。
例如，将储备内标(校准物)与待分析样品混合(例如，按体积)(参照图1)。标准和未知样品的报告物和化学计量可以被表征。使用，例如，光密度计扫描分离的部分。在电泳图的相应的曲线下的面积与通过内部参照标准提供的信号对比。给定已知的体积比(即，限定的线性)，单点校准，以及因此，使用原位校准物来确定测试样品中组分的浓度的能力是可能的。
在一个简单的例子中，用与测试样品的未知组分相同的报告物将待测量的已知浓度的分析物(即，校准物)，预标记。该标记的校准物和未知物按体积结合并且施加校准物和未知样品两者并且同时电泳。分析显示未知部分的电泳图以计算相对于内部参考标准(即，校准物)的未知组分的浓度。因此，在给定已知浓度的内部标记校准物，以及校准物和样品的限定的体积比的情况下，单点校准的方案(即用单个参考内标校准，这对于本领域技术人员是已知的)可以用来计算未知分析物的浓度。该方法消除了方法间的浓度变化以及消除了对外部测试的需要(例如，提供总分析物浓度)，并提供增强的样品内的对照和置信。
因此，该方法还可以包括基于校准物的测量水平、测试样品的分离的组分的测量水平以及测试样品和校准样品的已知比率(例如，体积比)，计算最终体积中的测试样品的组分的浓度。
例如，试管中可以包含含有一种或多种感兴趣的生物分子的已知体积的测试样品。第二试管可以含有具有已知体积和已知浓度的荧光标记校准物，如荧光标记的白蛋白的校准样品。校准物的初始浓度可以表示为CCi并且校准物的初始体积或量可以表示为Va。未知物的初始浓度(在本实施例中，感兴趣的一种或多种生物分子)可以表示为CUi以及未知物的初始体积可以表示为VUi。
校准样品和测试样品(包含一种或多种感兴趣的生物分子)的初始体积(或量)可以组合以产生最终体积VF，和最终浓度CCf和CUf使得：
VF＝VCｉ＋VUi
C Cf = C Ci · V Ci V F
C Uf = C Ui · V Ui V F
已知组合体积和已知校准物浓度的结合样品称为上样样品。该上样样品可以施加到电泳凝胶并且可以进行电泳，将校准物与未知物分离，并且将未知组分彼此分离。
包含识别或结合测试样品中一种或多种感兴趣的未知组分的标记抗体的抗血清可施加至凝胶并使其孵育很短的时间。然后可以清洗凝胶以除去凝胶中/上的未结合的抗体和/或材料。以这种方式，将凝胶中感兴趣的未知物与用同校准物相同的标记物标记的抗体结合。
在该实施例中，检测系统或设备可以配置以检测抗体和校准物上的荧光标记。例如，荧光检测单元可以用来激发荧光标记并且测量来自标记的荧光强度。来自未知物上的标记抗体的荧光强度可以表示为IU以及来自校准物标记的荧光强度可表示为IC。未知物和所述校准物可以被标以相同的标记物，该校准物是直接的并且未知物通过结合的抗体相连，使得仅由于不同数目的颗粒的性质，来自每一种的各荧光强度是不同的。颗粒数量与浓度直接相关，对于校准物这是已知的。未知物的初始浓度CUf因此可以根据以下关系式计算：
C Ui = C Cf V Ui * I U V F * I C .
如上所述，该方法包括在电泳凝胶的接收孔中沉积上样部分，其中，上样部分为最终体积的一部分，并且沿着所述电泳凝胶的共同分离泳道分离上样部分使得测试样品的组分和校准物沿着共同分离泳道彼此分离。
凝胶电泳可以是一维或二维的。也可以进行等电点聚焦。
适于与本发明一起使用的电泳凝胶基质是本领域技术人员所熟知的。例如，合适的凝胶基质包括，但不限于，琼脂糖或聚丙烯酰胺。SDS-PAGE(聚丙烯酰胺)凝胶基于它们的尺寸分离蛋白质，因为SDS使蛋白外面覆盖负电荷。通过电荷分离琼脂糖凝胶上的蛋白质。
不同尺寸的电泳凝胶可含有各种数量的泳道(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)。可以探测来自单个个体或受试者的生物样品以确定多个组分，和/或可以测试来自多个个体的血清。用于在不同尺寸的凝胶上进行电泳的方案是相似的，除了做出修改以优化在该尺寸凝胶上的分离。
如上所述，该方法还可以包括将上样部分沉积至电泳凝胶上。该方法可以包括在电泳凝胶中的接收孔中沉积上样部分。该方法还可以包括将上样部分沉积至没有接收孔的电泳凝胶上。可以用电泳梳、移液器(如微量移液器)等进行沉积。电泳梳可以是特别有用的以制造沉积，因为梳子的齿可以将样品的细线沉积至凝胶基质上，从而降低样品的扩散。在凝胶中缺乏样品储槽的凝胶系统中，用移液器以沉积样品将导致在两个维度中扩散的样品环。扩散的样品将导致电泳之后最终凝胶中分辨率的下降，因为样品分子在该环的所有点上开始。通过用一维梳齿沉积样品(参照图2)，降低扩散，以及样品分子从单条线上开始；优越的分辨率结果和每快凝胶上更短的泳道/更多的样品是可能的。
如上所述，该方法包括：检测共同分离泳道内的校准物和测试样品的分离的组分并且基于该检测测量校准物和测试样品分离的组分的水平。
分离的校准物和测试样品的组分的实例以及分离的校准物和测试样品的组分的检测的示意图示于图3、4A和4B。
合适的检测方法包括使用，例如，一种或多种结合于待测量的分析物(即，抗体靶标)或它们的部分(例如，校准物或测试样品的分离的组分，或它们的部分)的抗体。所述抗体可以结合到能够产生或引起产生检测信号的信号产生分子，从而允许检测与抗体靶标结合的抗体。通过使用第二抗体识别第一抗体，也可以检测和测量结合于抗体靶标的抗体，其中所述第二抗体结合到能产生或引起可检测信号产生的信号产生分子，由此允许检测与抗体靶标结合的抗体。
如上面所指出的，在一些实施方案中，测试样品的一种或多种组分和/或校准物的可被固定在电泳凝胶中，例如，通过免疫固定技术。该技术包括将校准物和通过电泳分离的一种或多种组分与抗血清接触。该抗血清可以包括第一抗体或其片段，使得第一抗体或其片段结合校准物。该抗血清也可以包括第二抗体或其片段，使得第二抗体或其片段结合所述一种或多种分离的组分。该技术还包括清洗电泳凝胶以除去凝胶中未结合的材料。
如本文中使用的，术语“抗体”意在包括来自天然来源或重组来源的完整的免疫球蛋白以及完整的免疫球蛋白的免疫活性部分(即，抗原结合部分)。本发明的抗体可以以各种形式存在，包括，例如多克隆抗体、单克隆抗体、细胞内抗体，抗体片段(例如Fv、Fab和F(ab)2)，以及单链抗体(scFv)、嵌合抗体和人源化抗体(Ed Harlow and David Lane,USINGANTIBODIES:ALABORATORY MANUAL(Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1999)；Houston等,"Protein Engineering of Antibody BindingSites:Recovery of Specific Activity in an Anti-Digoxin Single-Chain FvAnalogue Produced in Escherichia coli,"Proc Natl Acad Sci USA85:5879-5883(1988)；Bird等,"Single-Chain Antigen-Binding Proteins,"Science 242:423-426(1988),通过引用将其全部结合于此)。
使用本领域已知的技术进行用于单克隆抗体产生的方法(MONOCLONAL ANTIBODIES-PRODUCTION,ENGINEERING ANDCLINICAL APPLICATIONS(Mary A.Ritter and Heather M.Ladyman eds.,1995),通过引用将其全部结合于此)。用于产生多克隆抗体的方法也是已知的(Ed Harlow and David Lane,Using Antibodies:A Laboratory Manual(ColdSpring Harbor Laboratory Press,1988),通过引用将其全部结合于此).
除了全抗体外，本发明包括这类抗体的结合部分。这样的结合部分包括单价Fab片段、Fv片段(如，单链抗体，scFv)、单可变VH和VL结构域、以及二价的F(ab')2片段、双-scFv、双抗体、三抗体、微型抗体等。这些抗体片段可以通过常规的方法，如蛋白水解片段化的步骤制备，如James Goding，MONOCLONAL ANTIBODIES:PRINCIPLES ANDPRACTICE 98-118(Academic Press,1983)和Ed Harlow and David Lane,ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL(Cold Spring Harbor Laboratory,1988)描述的，通过引用将其整体结合于此，或其他本领域已知的方法。
合适的校准物包括通过凝胶电泳可以与测试样品的组分分离并且可以检测的物质。校准物和/或测试样品的组分也可各自直接连接至能产生或引起产生可检测信号的信号产生分子或用其标记。信号产生分子直接或间接地结合到每个校准物并且测试样品的组分可以是彼此可区别的。此外，信号产生分子可以直接或间接地结合到每个校准物以及任何组合的测试样品中的组分。例如，校准物可以直接结合到信号产生分子(例如，用荧光材料预标记)以及测试样品的组分间接地结合到信号产生分子。可替代地，测试样品的两种或更多种组分的可以各自直接或间接地结合到信号产生分子。
校准物可以是蛋白质或多肽。例如，校准物可以是白蛋白。该校准也可以是产生或能够产生可检测信号的化合物。例如，校准物可以是荧光物质、发光物质、生物发光物质，或本文描述的任何其他合适的信号产生分子。
在电泳凝胶中，校准物与测试样品的成分是可区分的。例如，校准物可以是或连接至信号产生分子，其与连接至测试样品的是可区分的。在凝胶电泳期间，该校准物也可以以比测试样品的组分更快的速度在电泳凝胶上迁移，或者在凝胶电泳期间，该校准物可以以比测试样品的组分更慢的速度在电泳凝胶上迁移。
能够产生或导致产生可检测信号的合适的信号产生分子对于本领域技术人员是熟知的。可检测的信号包括通过放射性测量、比色测量、荧光测量、尺寸分离或沉淀方法，或本领域中已知的其他方法，适合于检测和/或测定的任何信号。
能够产生或产生导致可检测信号的信号产生分子的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料，正电子发射金属，以及非放射性顺磁性金属离子。该信号产生分子可以直接连接或者偶联至抗体或使用本领域已知的技术通过中间体(如，例如，在本领域中已知的接头)间接连接或偶联。根据本发明，参见，例如美国专利第4,741,900号关于可以结合于抗体用作诊断剂的金属离子。另外的实例包括，但不限于，各种酶。酶的实例包括，但不限于，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或乙酰胆碱酯酶；辅基复合物，例如，但不限于，链亲和素/生物素以及抗生物素蛋白/生物素。荧光材料的实例包括，但不限于，伞形酮、荧光素、异硫氰酸酯荧光素、若丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白。发光材料的实例包括，但不限于，鲁米诺。生物发光材料的实例包括，但不限于，荧光素酶、萤光素，和水母蛋白。放射性物质的实例包括，但不限于，铋(213Bi)、碳(14C)、铬(的51Cr)、(153Gd、159Gd)5镓(68Ga、67Ga)、锗(68Ge)、钬(166Ho)、铟(115In、113In、112In、11LLN)、碘(1311、1251、1231、1211)、镧(140La)、镥(177Lu)、锰(54Mn)、钼(99Mo)、钯(103Pd)、磷(32P)、镨(142Pr)、钷(149Pm)、铼(186Re、188Re标记)、铑(105Rh)、钌(97Ru)、钐(153Sm)、钪(47Sc)、硒(75Se)、锶(85Sr)、硫(35S)、锝(99Tc)、铊(201Ti)、锡(113Sn、117Sn)、氚(3H)、氙(133Xe)、镱(169Yb、175Yb)、钇(90Y)、锌(65Zn)。另外的实例包括使用各种正电子发射断层技术的正电子发射金属，以及非放射性顺磁性金属离子。
该方法也可以包括使测试样品的分离组分和/或校准物与能够与信号产生分子相互作用的试剂接触，其中，所述信号产生分子在与试剂接触后产生可检测的信号，并且其中，检测包括检测可检测的信号。例如，当荧光素酶作用于合适的荧光素底物上时会发光。也可以使用耦合到可检测的信号或部分，如，例如，酶(例如，萤光素酶)、荧光团，或发色团的第二抗体。
用于检测测试样品组分以及校准物的信号产生分子可以是彼此互相区分的。测试样品的组分和校准物可以结合到彼此互相区分的信号产生分子。这允许例如，至少两个信号产生分子的混合物(cocktailing)可以直接或间接地结合到所述测试样品组分或校准物。这也允许两个或更多个信号产生分子的混合物(cocktailing)直接或间接结合到校准物和测试样品的两种或更多种不同的组分(例如，脂蛋白颗粒或它们的一部分)，每一个产生或能够产生不同的或可区别的可检测信号。这允许单个电泳泳道中探测多种抗原或分析物。这种混合(cocktailing)的实例在于2013年2月28日提交的命名为“荧光原位检测一级电泳基质内的脂质颗粒载脂蛋白”的美国临时专利申请第61/770406号中描述，通过引用将其全部结合于此。
例如，如上面所指出的，信号产生分子可以包括荧光材料。荧光标记和分子中天然荧光的检测是本领域中公知的分析化学和生物学的方法。用于检测荧光的仪器可以包括以下组分：具有较宽的光学带宽的光源，如灯泡或激光作为刺激光的光源。使用光学滤光器以选择在期望刺激波长处的光并且将它照射到样品上。光学滤光器基本上在任何波长都是可用的，并且通常通过在期望的传输波长部分下，沉积薄膜层来构建。然后将离开光学滤波器的光施加到样品上以刺激荧光分子。
然后分子在其特征的荧光波长下发光。此光由合适的透镜收集并随后在进入检测装置(如光电倍增管、光导电池，或半导体光检测器)之前，穿过中心在特征波长的第二光学滤波器。因此，只有期望的特征波长的光被检测以确定荧光分子的存在。因此，测试样品的组份和校准物可以直接或间接地连接至在不同的，可区别的荧光波长下发光的荧光分子上。
荧光标记在单个区域中可以是多重的，使得它们光学上不同。例如，5种不同的荧光标记，红色、绿色、蓝色、黄色、橙色和可施加至相同的有限区域并且通过光学检测软件可独立地检测以及区分。例如，LifeTechnologies的Alexa Fluor产品线包括至少19种独特的染料，其可以组合用于标记不同的抗体从而标记和识别单个抗原。
测试样品的组分可以包括至少两种不同的组分、至少三种不同的组分、至少四种不同的组分、至少五种不同的组分、至少六种不同的组分、至少七种不同的组分、至少八种不同的组分等。因此，测试样品的每个不同的组分可以直接或间接连接至彼此相区别的信号产生分子，并且与直接或间接地结合到校准物上的信号产生分子可区别。
光学系统可以定量荧光信号，并自动归一化信号值以产生相对密度或颗粒数。例如，通过归一化每种染料的消光/发射系数或量子相对量，可以确定浓度或数量的相对值(例如，脂蛋白颗粒数)。
该系统和方法还可以包括用于检测可检测信号的设备或装置的使用，其中，该检测表示测试样品的特定组分或校准物的水平。基于所述信号产生分子的检测,该设备还可以定量测试样品的特定组分(如特定载脂蛋白和/或脂蛋白颗粒)和/或校准物的水平。
测试样品的一种或多种组分可以包括脂蛋白颗粒或它们的部分，并且，其中，该检测包括检测脂蛋白颗粒或它们的部分。
脂蛋白颗粒或它们的部分可以选自由载脂蛋白A、载脂蛋白B、载脂蛋白C、载脂蛋白D、载脂蛋白E、载脂蛋白H、脂蛋白(a)、高密度脂蛋白、中等密度脂蛋白、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白、乳糜微粒、脂蛋白X、它们的氧化变体和混合物组成的组。
如本文中所使用的术语“脂蛋白颗粒”、“脂质蛋白质颗粒”，“脂质颗粒”等是指包含蛋白质和脂质二者的颗粒。下文中对脂蛋白颗粒的实例进行更详细地描述。
如本文所用的术语“脂蛋白颗粒数”是指存在于体液中的脂蛋白颗粒的数量。
如本文所用的术语“载脂蛋白”是指与脂质结合形成脂蛋白颗粒的蛋白。以下更详细地描述载脂蛋白类型的实例。载脂蛋白的独特性质是其与脂蛋白颗粒的化学计量关系，提供脂蛋白颗粒数的估计，这将在下面更详细地描述。
作为背景知识，脂肪酸、胆固醇、单酰基甘油，和胆汁酸在肠中吸收。胆汁酸见于肠胆汁并且通过形成微团以乳化脂肪有助于脂肪的消化。胆汁酸储存在胆囊中，直到进食后分泌到肠中。肠上皮细胞合成甘油三酯。胆固醇的部分酯化形成胆固醇酯。肠细胞从甘油三酯、胆固醇酯、磷脂、游离胆固醇，和载脂蛋白形成乳糜微粒。
根据本发明的可检测的特定脂蛋白颗粒或它们的部分包括，但不限于，载脂蛋白A、载脂蛋白B、载脂蛋白C、载脂蛋白D、载脂蛋白E、载脂蛋白H、脂蛋白(a)、高密度脂蛋白、中等密度脂蛋白、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白、乳糜微粒、脂蛋白X、它们的氧化变体或混合物。
载脂蛋白是脂蛋白颗粒的蛋白质组分。载脂蛋白包被脂蛋白颗粒，其包括胆固醇酯和甘油三酯。脂蛋白颗粒的外壳是由未酯化的胆固醇、磷脂和载脂蛋白组成。载脂蛋白的独特性质是其与脂蛋白颗粒的化学计量关系，提供了脂蛋白颗粒数的估计值。这些脂蛋白颗粒提供了在整个血流中循环疏水性组分的方式。不同的脂蛋白颗粒包括乳糜微粒-P、VLDL-P、IDL-P、LDL-P、LP(a)-P和HDL-P。脂蛋白颗粒在大小、形状、密度、载脂蛋白构成和脂质构成上不同。每个类别共享相似的物理特性，同时在每个类别中存在异质性。通过改变条件，就可以在一种类别中显示不同的颗粒。这样做有临床的优点，因为例如，一个类别可以是动脉粥样硬化生成的(artherogenic)以及一个类别可以是动脉粥样硬化保护的(artheroprotective)。
载脂蛋白A(Apo A)家族构成在HDL-P和富含甘油三酯的脂蛋白颗粒中的发现的主要蛋白质。Apo A，作为HDL的部分，涉及从肝外组织去除游离胆固醇并且也起着卵磷脂酰基转移酶的活化作用。载脂蛋白A激活该酶，促使胆固醇从组织中转移到HDL，并且也涉及在肝脏中HDL的识别和受体结合。
存在多种形式的载脂蛋白A。最常见的形式是Apo A-I和Apo A-II。载脂蛋白A(A-I、A-II，和A-IV)发现于乳糜微粒和HDL中。Apo A-I是连接到HDL的主要载脂蛋白A。Apo A-I负责激活卵磷脂-胆固醇酰基转移酶并且Apo A-II调节活化。卵磷脂-胆固醇酰基转移酶将游离胆固醇转化为胆固醇酯。当脂肪在肠道吸收时，Apo A-IV分泌增加。Apo A-IV还可以起到激活卵磷脂-胆固醇酰基转移酶的作用。
发现Apo A-I比Apo A-II占更大的比例(约3：1)。更低水平的ApoA通常与心血管疾病(CVD)和周围血管疾病的存在相关。Apo A-I可能是比HDL-胆固醇(HDL-C)更好的动脉粥样硬化的预测物。某些遗传性疾病引起Apo A-I不足并且关联低水平HDL颗粒。这些患者也往往有具有带有升高的LDL颗粒的高血脂症。这有助于动脉粥样硬化的加速速率。在α脂蛋白血症(也称为家族性高密度脂蛋白缺乏症)中Apo A水平可能非常低。
HDL和它的主要载脂蛋白Apo A-I在来自巨噬细胞的胆固醇流出物中的作用已被广泛研究。虽然HDL竞争Apo A-I结合，但是Apo A-I不是HDL结合的竞争物。这一观察表明，HDL和Apo A-I至少部分通过不同的受体结合至巨噬细胞。例如，前-β-HDL和无脂Apo A-I是清除受体(scavenger receptor)(SR-BI)的较差的配体，这解释HDL的结合缺少Apo A-I的竞争。相反，它已显示的Apo A-I可以与HDL分离，从而使无脂Apo A-I可用于通过HDL竞争Apo A-I结合位点。Lorenzi等,"Apolipoprotein A-I but not high-density lipoproteins are internalised byRAWmacrophages:roles of ATP-binding cassette transporter Al and scavengerreceptor."BIJ MolMed.86:171-183(2008),通过引用将其整体结合于此。Apo A-II，HDL的另一组分，在动物模型中已表明是促动脉粥样硬化的。Meyers等,"Pharmacologic elevation of high-density lipoproteins:recentinsights on mechanism of action and atherosclerosis protection."Curr OpinCardiol.19(4):366-373(2004),通过引用将其整体结合于此。
载脂蛋白B(Apo B-100和Apo B-48)是LDL的蛋白质成分。一个分子Apo B存在于每个LDL的磷脂层中。超过90％的LDL颗粒由Apo B组成。Apo B在LDL复合物中起到溶解胆固醇的作用，这进而增加LDL的运输能力用于后续在动脉壁上沉积LDL胆固醇。该沉积导致心血管疾病。Apo B也是乳糜微粒、VLDL、IDL，和Lp(a)的蛋白质成分。Apo B是具有2个异构形式的较大的两亲性螺旋糖蛋白：Apo B-100(在肝细胞合成)和Apo B-48(乳糜微粒的结构蛋白)。乳糜微粒包含Apo B-48，而含有Apo B的其他脂蛋白颗粒含有Apo B-100。
Apo B调节酶的活性，这些酶作用于脂蛋白颗粒，保持脂蛋白颗粒复合物的结构完整性，并通过作为特异性的细胞表面受体的配体促进脂蛋白颗粒的摄取。作用于脂蛋白颗粒上的酶包括但不限于，脂蛋白脂酶、卵磷脂-胆固醇酰基转移酶、肝甘油三酯脂酶，和胆固醇酯转移蛋白。升高水平的Apo B见于高脂蛋白血症。Apo B-100中不存在无β脂蛋白血症的形式。高水平的Apo B-100可能存在于高脂蛋白血症、急性心绞痛和心肌梗死。在乳糜微粒滞留疾病中Apo B-48保留在肠道中。
公认的是含有Apo B的脂蛋白颗粒的血浆浓度升高与发展动脉粥样硬化疾病的风险增加相关联。病例对照研究发现血浆Apo B的浓度在确定具有冠状动脉心脏疾病(CHD)的患者中比其他血浆脂质和脂蛋白颗粒更加具有区别性。参见De Backer等,"European Guidelines on CardiovascularDisease Prevention in Clinical Practice。Third Joint Task Force of Europeanand other Societies on Cardiovascular Disease Prevention in Clinical Practice,"Eur Heart J 24:1601-1610(2003)；Walldius&Jungner,"Apolipoprotein BandApolipoprotein A-I:Risk Indicators of Coronary Heart Disease and Targetsfor Lipid-modifying Therapy,"J Intern Med 255(2):188-205(2004)；Walldius,等,"The apoB/apoA-I ratio:A Strong,New Risk Factor for CardiovascularDisease and a Target for Lipid-Lowering Therapy—A Review of theEvidence,"J Intern Med.259(5):493-519(2006)；Yusuf et al.,"Effect ofPotentially Modifiable Risk Factors Associated with Myocardial Infarction in52Countries(the INTERHEART Study):Case-control Study,"Lancet364:937-52(2004),通过引用将其整体结合于此)。前瞻性的研究已经确认了使用Apo B确定CHD风险，虽然Apo B的浓度比血清脂质更好地预测风险的程度是不同的。Apo B是所有动脉粥样硬化或潜在动脉粥样硬化颗粒的组分，包括极低密度脂蛋白颗粒(VLDL-P)、中等密度脂蛋白颗粒(IDL-P)、低密度脂蛋白颗粒(LDL-P)和脂蛋白(a)颗粒(LP(a)-P)，并且每个颗粒含有一分子Apo B。因此，Apo B提供了在循环中动脉粥样硬化脂蛋白颗粒的数量的直接测量。总Apo B是不均一的。总Apo B被上述各种颗粒中存在的Apo B影响。单独测量总Apo B而不分离颗粒，并不表示其与哪个颗粒相连接。
现在有一个明确的共识，即Apo B比低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)更强烈地预测心血管疾病(CVD)并且来自美国糖尿病协会(ADA)和美国心脏病学院(ACC)最近的共识会议报告确认Apo B的测量的重要性(见Kannel等，"Cholesterol in the Prediction of Atherosclerotic Disease,"AnnIntern Med 90:85-91(1979)以及Jeyarajah等,"Lipoprotein Particle Analysisby Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy,"Clin Lab Med 26:847-70(2006)，通过引用将其整体结合于此)。升高水平的Apo B和LDL-P意味着个体对于心血管疾病具有增加的风险。升高水平的Apo B和LP(a)-P意味着个人对于心血管疾病具有增加的风险。
另外，已经表明Apo B/Apo A-I的比率与如在Apo脂蛋白相关死亡风险(AMORIS)所示的心肌梗死(MI)，中风和其它CV症状的风险是密切相关的(见Walldius&Jungner,"Apolipoprotein B and ApolipoproteinA-I:Risk Indicators of Coronary Heart Disease and Targets forLipid-modifying Therapy,"J Intern Med 255(2):188-205(2004)；Walldius,et al,"The apoB/apoA-I ratio:A Strong,New Risk Factor for Cardiovascular Diseaseand a Target for Lipid-Lowering Therapy—A Review of the Evidence,"JIntern Med.259(5):493-519(2006)；Walldius等,"Stroke Mortality and the ApoB/Apo A-I Ratio:Results of the AMORIS Prospective Study."J InternMed.259:259-66(2006),通过引用将它们整体结合在此)以及INTERHEART(Yusuf等,"Effect of Potentially Modifiable Risk FactorsAssociated with Myocardial Infarction in 52Countries(the INTERHEARTStudy):Case-control Study,"Lancet 364:937-52(2004)以及Yusuf等,"Obesityand the risk of myocardial infarction in 27,000participants from 52countries:a case-control study,"Lancet 366:1640-9(2005),通过引用将其整体结合于此)的研究。
载脂蛋白C(Apo C-I，C-II，C-III)是乳糜微粒、VLDL颗粒、IDL颗粒、和HDL颗粒的组分。Apo C-II是脂蛋白脂酶的活化剂并且它的缺乏导致乳糜微粒和甘油三酯的积累。高水平的Apo C-II是心绞痛和心肌梗塞的指示剂。载脂蛋白C-II(Apo C-II)是特异类型的蛋白，发现于从胃肠道吸收的大颗粒。还发现在极低密度脂蛋白颗粒(VLDL-P)中，它主要由是胆固醇组成。Apo C-II是负责毛细血管中脂蛋白脂酶(LPL)激活的Apo脂蛋白，并且由此开始乳糜微粒颗粒和VLDL-P的分解代谢。它还发现于HDL-P中。这种Apo C-II缺陷与空腹期间严重的高甘油三酯血症和高乳糜微粒血症共同存在。
Apo C-II测量可以帮助确定高血脂(高血脂症)的特定类型或原因。具有家族性脂蛋白脂酶缺乏症的人可能有大量的Apo C-II。与高Apo C-II水平相关的其它疾病包括心绞痛和心脏病。低的Apo C-II水平见于具有所谓的家族性Apo C-II缺乏的罕见疾病的人。
在极低密度脂蛋白颗粒(VLDL-P)中发现Apo脂蛋白C-III(ApoC-III)。Apo C-III抑制脂蛋白脂酶和肝脂酶并且认为它能够抑制富含甘油三酯颗粒的肝摄取。至少在VLDL-P和HDL-P中发现Apo C-IV。
Apo A-I、Apo C-III和Apo A-IV基因在大鼠和人类基因组中都有着密切的联系。A-I与A-IV基因转录自相同的链，而A-I与C-III基因是趋同转录的(convergently transcribed)。ApoC-III水平的增加引起高甘油三酯血症的发展。
Apo脂蛋白D是HDL的次要组分。高浓度的Apo D与各种疾病，如乳腺巨囊性疾病(gross cystic disease of the breast)和阿尔茨海默氏病相关。
在乳糜微粒和IDL中发现Apo脂蛋白E(Apo E-2，E-3和E-4)。在肝细胞和外周血细胞中，Apo E结合至受体。Apo E对于富含甘油三酯的脂蛋白颗粒成分的正常的代谢是至关重要的。最初认为Apo E在脂蛋白颗粒代谢和心血管疾病中是重要的。它在脂质运输至组织中，胆固醇从器官向肝脏运输，通过清除VLDL和乳糜微粒在脂蛋白颗粒代谢中，以及在动脉粥样硬化病变形成中起作用。脂蛋白颗粒的Apo E部分介导Apo E脂蛋白颗粒连接至LDL受体。通过连接至血小板上的位点，连接至HDL-P的Apo E抑制拮抗剂诱导的血小板聚集。存在Apo E基因的三种不同的等位基因，Apo E e2、e3和e4。Apo E e4与晚期发作阿尔茨海默氏病的升高的风险相关。
载脂蛋白H起到连接心磷脂的作用。抗心磷脂抗体被发现于梅毒、硬化和狼疮中，并且在一些疾病中，抗体需要Apo H处于激活状态，并通过血小板抑制血清素的释放并且防止血小板聚集。通过血小板，Apo H也抑制血清素释放并且防止血小板凝集。
对于不同的个体，以及不同时期的相同个体，脂蛋白颗粒曲线是不同。乳糜微粒产生于肠道中，并且将消化的脂肪运输至组织。脂蛋白脂酶水解甘油三脂以形成脂肪酸。乳糜微粒是最大的浮游性微颗粒之一。在肝脏中的乳糜微粒代谢后由游离的脂肪酸形成VLDL。脂蛋白脂酶水解甘油三脂以形成脂肪酸。IDL是VLDL的未水解甘油三酯。由于肝脂酶IDL成为LDL。HDL在胆固醇从外周组织中向肝脏的转移中起作用。在肝脏和肠道合成HDL。
LDL颗粒结合至LDL受体。受体结合后，从血液中除去LDL。细胞利用LDL内的胆固醇用于细胞膜和激素的合成。LDL在动脉壁上沉积LDL胆固醇，这会导致心血管疾病。当它在动脉壁内侧积累时，LDL导致炎症。巨噬细胞被吸引到发炎处，并且当它们吸收LDL时，则变成泡沫细胞造成进一步的炎症。更小的，更致密的LDL比更大的，浮游的LDL含有更多的胆固醇酯。
脂蛋白(α)颗粒(LP(a)-P)的结构是通过二硫键件Apo脂蛋白A结合到Apo脂蛋白B的LDL样颗粒的结构。脂蛋白(a)颗粒似乎发挥凝血作用，并且可以刺激免疫细胞在动脉壁上沉积胆固醇。高脂蛋白(a)-P水平表示心血管疾病的风险较高。具体地，更高水平的更缓慢地迁移，更多的阴极性的，Lp(a)-P条带可以是用于心血管疾病的较高风险的指示物，因为它可以与较小的更多动脉粥样硬化生成的Lp(a)-P异构形式相关。
因此，LP(a)-P在诊断和统计的风险评估中是有用。LP(a)-P可用于促进LDL-P的斑块沉积。在动脉粥样硬化生成的事件中，LP(a)-P的水平增加。
LP(a)-P可以具有在血栓形成和动脉粥样硬化之间的联系，干扰纤维蛋白溶解级联反应中的纤维蛋白溶酶原功能。许多研究已经证明高血浆LP(a)-P浓度与各种心血管疾病，包括外周血管疾病、脑血管疾病，和过早冠状动脉疾病的关系。特别地，美国老年人中的一个较大的研究，证明了LP(a)-P的水平升高独立预测中风，来自血管疾病的死亡，和来自男性的各种原因导致的死亡的风险增加(参见Fried et al.,"The CardiovascularHealth Study:Design and Rationale,"Ann.Epidemiol.,3:263-76(1991)通过引用将其整体结合于此)。
已使用低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)用于测量评估心血管风险。然而，由于HDL-C的变化性，Apo B是循环的LDL颗粒数(LDL-P)的更好的量度，因此与传统的LDL-C相比是更可靠的风险指示物，因为存在Apo B和LDL颗的1：1的化学计量。总Apo B的总数包括但不限于LDL-P的Apo B的补充物(较大的漂浮微粒和较小的致密颗粒)，+VLDL+IDL+LP(a)+乳糜微粒。在超过单个测量或传统的LDL-C测试的动脉粥样硬化心脏疾病的危险方面，Apo B水平和相关的脂蛋白颗粒的测量提供了另外的信息。空腹血浆胰岛素水平和LDL粒径的测量也提供有用的信息。
也可以检测出上述脂蛋白的氧化变体。脂蛋白的氧化变体有助于动脉粥样硬化生成，其中氧化导致细胞内钙增加、降低能量产生、活化细胞因子、膜损伤，所有这些都导致细胞凋亡、坏死，并且最终导致细胞死亡。
当反应基团从LDL颗粒上的多不饱和脂肪酸吸收氢原子时，通常开始氧化。形成脂质过氧基和烷氧基基团，这进而可以在附近的脂肪酸中引发氧化，导致脂质过氧化的扩展。脂蛋白的这些氧化形式比天然脂蛋白更迅速地被巨噬细胞吸收，并且这导致巨噬细胞胆固醇的积累以及随后泡沫细胞形成并且抑制组织巨噬细胞和内皮细胞运动。该事件的级联反应导致血管功能障碍和粥样硬化病变形成及活化。
随后可以通过可检测信号或部分的测量来定量电泳凝胶中脂蛋白颗粒或它们的部分的存在。然后可以根据已知的化学计量关系计算颗粒数(例如，Apo B和LDL颗粒的1:1的化学计量关系)。颗粒数可以通过与表征样品中的总脂质颗粒或脂质颗粒浓度类别的单个的分析的比较来定量。这样单独的分析可以是超离心、NMR或可以表征样品中的颗粒浓度或总颗粒数的任何其它分析方法。在脂质颗粒电泳和脂质颗粒定量中使用的所述样品可以是相同样品的不同等分部分。
因此，本发明的另一方面涉及通过实施用于进行具有原位校准的电泳的方法评估存在于生物样品中的特定的载脂蛋白和/或脂蛋白颗粒水平的方法，其中，测试样品的组分包括脂蛋白颗粒或它们的部分，并且其中，检测包括检测脂蛋白颗粒或它们的部分。
以这种方式，通过评估生物样品中存在的特定载脂蛋白和/或脂蛋白颗粒的水平，可确定受试者是否处于心血管疾病的增加的风险中。该方法还可以包括使载脂蛋白和/或脂蛋白颗粒的确定的水平与对照或参考值相关联，以确定该受试者是否处于心血管疾病的增加的风险中的步骤。
该评估可以包括通过将生物样品沉积至电泳凝胶并进行凝胶电泳分离存在于生物样品中的脂蛋白颗粒；检测由电泳凝胶上相应的载脂蛋白和/或脂蛋白颗粒和校准物的信号产生分子产生的可检测的信号；并且基于该检测确定存在于生物样品中的不同载脂蛋白和/或脂蛋白颗粒水平。如上所述，信号产生分子可以直接或间接地(例如，通过抗体)结合至载脂蛋白和/或脂蛋白颗粒和校准物。如果间接地结合(例如，通过抗体)，评估也可以包括在适合形成脂蛋白-抗体-信号产生分子复合物和/或校准物-抗体-信号产生分子复合物的条件下使生物样品与结合到信号产生分子的抗体接触，并且清洗该凝胶，以除去或基本上除去未结合的抗体并且检测由电泳凝胶上的相应载脂蛋白和/或脂蛋白颗粒和校准物的信号产生分子所产生的可检测的信号。同样如上所述，该方法也可用第一抗体和第二抗体进行，其中，第二抗体结合至信号产生分子。在该实施例方式中，评估还可以包括，在适合形成脂蛋白-第一抗体复合物和/或校准物-第一抗体复合物的条件下使生物样品与第一抗体接触并清洗该凝胶以除去或基本上除去未结合的第一抗体；在适合形成脂蛋白-第一抗体-第二抗体-信号产生分子复合物和/或校准物-第一抗体-第二抗体-信号产生分子复合物的条件下使脂蛋白-第一抗体复合物和/或校准物-第一抗体与结合至信号产生分子的第二抗体接触并且清洗该凝胶，以除去或基本除去未结合的第二抗体；并且检测由电泳凝胶上的相应载脂蛋白和/或脂蛋白颗粒以及校准物的信号产生分子产生的可检测的信号。
如上所述，直接或间接地结合到每个校准物和测试样品的组分(例如，一种或多种载脂蛋白和/或脂蛋白颗粒)的信号产生分子是彼此可区别。此外，信号产生分子可以直接或间接地结合到每个校准物和测试样品的组分(例如，一种或多种载脂蛋白和/或脂蛋白颗粒)的任何组合。例如，校准物可以直接结合至信号产生分子(例如，用荧光材料预标记的)并且测试样品的组分间接结合到信号产生分子。可替代地，测试样品中两种或更多种组分(例如，一种或多种载脂蛋白和/或脂蛋白颗粒)可各自直接或间接地结合到信号产生分子。
如本领域中公知的，上下文中脂质相关的健康风险、心血管病症和心血管疾病的风险的相关性指的是得到的脂蛋白尺寸分布与人口死亡率和风险因素的统计相关性。上下文中监测心血管风险的相关性(例如，用于响应治疗干预)是指在两个时间点(例如，进行治疗干预前后)脂蛋白大小分布的比较。
该关联可以包括将不同的载脂蛋白和/或脂蛋白颗粒的测定的水平与对照或参考值相关联以确定该受试者是否处于心血管疾病增加的风险中。
该关联还可以包括将受试者分配至选自由高风险，中度风险和低风险(或最佳)的组成的组中的风险类别用于发展或具有心血管疾病。对于用于生化标志物(例如，但不限于，胆固醇和脂蛋白水平)的截止值有完善的建议用于确定风险。例如，抗-ApoB结合/检测可以与截止值估计相关联用于基于LP(a)-P和LDL-P分配风险类别。例如，对于分配这样的风险类别的截止值(cut off value)可以是如下：LP(a)-P：<75nmol/L最佳、76-125nmol/L中等风险，>126nmol/L高风险；LDL-P：<1000nmol/L最佳，1000-1299nmol/L中等风险，>1300nmol/L高风险。
上述一种或多种不同的脂蛋白颗粒或它们的部分可以至少包括载脂蛋白B和低密度脂蛋白。检测到升高水平的载脂蛋白B和低密度脂蛋白颗粒表明个体已经具有心血管疾病升高的风险。由于Apo B和VLDL之间存在1：1的化学计量，升高的ApoB与VLDL-P是算术相关的。
不同的脂蛋白颗粒或它们的部分可以至少包括载脂蛋白B与脂蛋白(a)。检测到升高水平的脂蛋白(a)颗粒和LP(a)异构形式表明个体具有心血管疾病升高的风险。
本发明还包括基于测定的心血管疾病的风险选择治疗方案。例如，根据本发明描述的方法，可以确定个体处于升高的风险，然后基于该升高的风险，可以选择治疗方案。
该选择的治疗方案可以包括药物或补充剂。如本领域已知的，合适的药物或补充剂包括出于降低血清胆固醇，降低LDL、IDL，和VLDL、LP(a)和/或升高HDL的目的给予的那些。
合适的药物的实例包括抗炎剂、抗血栓形成剂、抗血小板剂，纤维蛋白溶解剂、降脂剂、直接凝血酶抑制剂、糖蛋白IIb/IIIa受体抑制剂、结合于细胞粘附分子并抑制白血细胞附着到这类分子的能力的试剂、钙通道阻断剂、β-肾上腺素受体阻断剂、血管紧张素系统抑制剂，或它们的组合。
所选择的治疗方案还包括基于测定的心血管疾病的风险对改变或保持生活方式的选择提出建议。生活方式的选择可能涉及改变饮食、改变锻炼、减少或消除吸烟，或它们的组合。
还可以生成报告，除其他事项外，其包括所选择的治疗方案的说明。在一些实施方案中，脂蛋白分析的结果以这样的报告报导。在脂蛋白及其它脂质分析的上下文中的报告是指提供给以下人员的报告，例如患者、临床医生、其它健康护理提供者、流行病学家等，其包括生物样本的分析结果，例如来自个体的血浆样本。如本领域中已知的，报告可以印刷或电子形式，或以便于分析、检查和/或其中数据归档的任何形式呈现。报告可包括识别关于报告的单独受试者的信息，包括但不限于姓名、地址、性别、标识信息(例如，社会保障号，保险号)等。报告可以包括样品中脂质的生化特性，例如但不限于甘油三酯、总胆固醇、LDL胆固醇，和/或HDL胆固醇等。报告可以进一步包括脂蛋白的特征，以及因此在通过本发明提供的方法制备的样品上进行的参考范围。术语“参考范围”以及类似的术语是指本领域中已知的生物样品的成分的浓度，以反映在个体的群体中典型正常的观察范围。分析报告中的脂蛋白的示例性表征可以包括VLDL、IDL、LP(a)、LDL和HDL，和其亚类的浓度和参考范围。报告可以进一步包括脂蛋白大小分布的趋势。
本发明还可以进一步包括将选择的治疗方案给予受试者。因此，本发明的另外的方面涉及治疗具有所确定的心血管疾病增加的风险的受试者的方法。
本发明还涉及监测发展心血管疾病的风险的方法。该方法包括在第一时间点测定受试者是否处于心血管疾病的升高的风险中，并且在一个或多个稍后的时间点重复所述该测定(例如，治疗性介入的过程中治疗性介入前后或在进行的时间点)。在每一个进行的时间点所确定的风险与来自一个或多个较早的时间点的确定的风险相比较，以评估受试者的发展心血管疾病的风险是增加还是减少，从而监测发展心血管疾病的风险。此方法可以包括基于发展心血管疾病所确定的风险分配风险类别以及比较在进行的时间点分配的风险类别(例如，比较在第一时间点确定的第一风险类别和在第二时间点取得的第二个风险类别)，从而监测发展心血管疾病的风险。
实施例
实施例1-具有原位校准的凝胶电泳
使用上述材料和方法进行具有原位校准的凝胶电泳。特别地，含有未知浓度脂颗粒的四种血清样品与相应的已知浓度的荧光素标记的白蛋白(其是校准物)混合。
然后对样品进行凝胶电泳。具体地，将75uL的样品分配到相应的样品孔中，该样品孔包含之前在样品杯的壁上干燥的已知浓度的校准物。样品沉积后，校准物由未知样品重新溶解形成具有样品和校准物的已知比率的终体积。在该实验中，四个样品中的每一个沿着单一电泳泳道加载入单独的电泳孔中。装入凝胶的样品的部分然后沿电泳凝胶的相应的共同分离泳道分开，使得测试样品的组分和校准物根据大小和电荷沿着相应的分离泳道彼此分离。
分离一旦完成，将抗-Apo B和抗BSA白蛋白“混合物”(cocktail)抗血清施加到其中样品已经运行的泳道。在这种情况下，用与白蛋白对照相同的荧光素标记抗apoB抗体。然而，如上面所描述的，校准物(例如，白蛋白)可能已被不同于抗apoB抗体的信号产生分子标记。抗apoB抗体附着在样品脂蛋白的表面上的apo B蛋白上。LDL、VLDL和Lp(a)包括apo B。因此，这些结合到抗-apoB抗体的脂颗粒和结合到抗BSA-白蛋白抗体的BSA白蛋白校准物被“固定”在凝胶基质中。剩余的抗血清通过典型的印记按压方案除去并且随后在合适的液体中再水化，以实现去除过量的未结合的抗血清。该过程可重复，以实现充分去除未结合的抗血清。在此情况下，再水化溶液是Tris缓冲盐溶液，常见于IFE清洗方案。图5A示出获得的凝胶的图像。
干燥后然后用荧光计扫描该凝胶(BioRad ChemiDoc MP imager)，绘制所得的峰如图5B-5E所示。应该注意的是凝胶不需要干燥。在图5B-5E中，在左侧凝胶的图像中目测可以识别LDL、VLDL、LP(a)和校准物，并且在右侧显示根据本发明的分离组分的量化结果(分别为样品1-4)。如本文中所描述的，使用已知浓度的校准物可以生成相对浓度并转换为绝对浓度或颗粒数。
尽管本发明已经示出并详细描述优选的实施方式，但是，显然，相关领域的技术人员可以进行各种修改，添加，替换等，而不背离本发明的精神，因此，这些都被认为是在本发明的范围内，本发明的范围在随附权利要求中限定。

Claims (21)

1.一种用于进行具有原位校准的电泳的方法，所述方法包括：
将一定体积的测试样品与一定体积的校准样品结合以形成最终体积，其中，所述体积的校准样品包括已知浓度的校准物并且所述最终体积包括测试样品和校准样品的已知体积比；
在电泳凝胶的接收孔中沉积上样部分，其中，所述上样部分是所述最终体积的一部分；
沿着所述电泳凝胶的共用分离泳道分离所述上样部分使得所述测试样品的组分和校准物沿着所述共用分离泳道彼此分开；
在所述共用分离泳道内检测所述校准物和测试样品的分离组分；并且
基于所述检测测量所述校准物和所述测试样品的分离组分的水平，从而进行具有原位校准的电泳。
2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括：
基于所述校准物的测定水平、所述测试样品的分离组分的测定水平、和测试样品与校准样品的已知体积比，计算所述最终体积中的所述测试样品的组分的浓度。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述测试样品的组分和所述校准物各自结合到能产生或引起可检测信号产生的信号产生分子。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述方法进一步包括：使所述测试样品的分离组分和/或校准物与能够与所述信号产生分子相互作用的试剂接触，其中，在与所述试剂接触后所述信号产生分子产生可检测的信号，并且其中，所述检测包括检测所述可检测的信号。
5.根据权利要求3所述的方法，其中，所述测试样品的组分和所述校准物结合至彼此可区别的信号产生分子。
6.根据权利要求3所述的方法，其中，所述测试样品的组分包含至少两种不同的组分。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，至少两种组分中的每一种结合至不同的可检测信号，每种所述可检测信号是彼此可区别的。
8.根据权利要求3所述的方法，其中，所述可检测的信号是通过辐射测量、比色测量、发光测量、或荧光测量方法可检测的。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述测试样品中的所述一种或多种组分包括脂蛋白颗粒或它们的部分，并且其中，所述检测包括检测所述脂蛋白颗粒或它们的部分。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述脂蛋白颗粒或它们的部分选自由以下组成的组：载脂蛋白A、载脂蛋白B、载脂蛋白C、载脂蛋白D、载脂蛋白E、载脂蛋白H、脂蛋白(a)、高密度脂蛋白、中等密度脂蛋白、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白、乳糜微粒、脂蛋白X、它们的氧化变体和混合物。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述沉积是用电泳梳进行。
12.根据权利要求1所述的方法，其中，所述校准物是荧光团。
13.根据权利要求1所述的方法，其中，所述校准物包括蛋白质。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述校准物包括白蛋白。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述白蛋白偶联至信号产生分子。
16.根据权利要求14所述的方法，其中，所述白蛋白偶联至荧光团。
17.根据权利要求1所述的方法，其中，在凝胶电泳期间，所述校准物以比所述测试样品的组分更快的速度在电泳凝胶上迁移。
18.根据权利要求9所述的方法，其中，在凝胶电泳期间，所述校准物以比脂蛋白颗粒更快的速度在电泳凝胶上迁移。
19.根据权利要求1所述的方法，其中，所述测试样品是生物样品。
20.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述检测之前，固定所述校准物和所述分离组分。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，通过免疫固定技术固定所述校准物和分离组分，所述免疫固定技术包括：
使所述校准物和分离组分与包含第一抗体或其片段和第二抗体或其片段的抗血清接触，使得所述第一抗体或其片段结合所述校准物以及所述第二抗体或其片段结合所述分离组分；并且
清洗所述电泳凝胶以除去所述凝胶中未结合的物质。
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