KR100857592B1 - ＣｙＤｙｅ를 이용한 새로운 단백질 분석 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 단백질 분석방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 (A) 분석용 단백질 시료 및 대조구 단백질 시료를 서로 다른 CyDye로 각각 표지하는 단계, (B) (A)단계에서 표지된 시료 각 50~100ug 및 분석용 단백질 시료 1~5mg을 함께 2차원 전기영동하는 단계, (C) 형광 분석에 의해 (B)단계에서 전기영동한 겔(gel)을 분석하여 분석용 단백질과 대조구 단백질의 차이를 분석하는 단계 및 (D) (C)에서 분리된 스팟으로부터 단백질을 분리하여 동정하는 단계로 이루어진 것 단백질 분석 방법에 관한 것이다.

본 발명에 의하면 감도가 매우 높은 CyDye의 형광발색 차이로 정성·정량적인 분석을 실시하고, 동시에 MALDI-TOF를 이용한 단백질 동정을 가능하게 하여 재연성의 한계를 극복 할 수 있고, 분석에 드는 시간과 비용을 획기적으로 줄일 수 있다. 또한, 하나의 겔에서 두가지 단백질을 동시에 분석하는 것이 가능하므로 두가지 단백질을 상호 비교 분석하여 단백질을 동정할 때 유효하게 이용할 수 있다.

단백질 동정, 분석, 2차원 전기영동, MALDI-TOF, CyDye

Description

ＣｙＤｙｅ를 이용한 새로운 단백질 분석 방법{Novel Analytical Method for Protein Using CyDye}

도 1은 종래 방법에 의한 단백질 동정과 본 발명의 방법을 비교한 비교도.

도 2는 본 발명에 의한 임신소 혈청단백질의 비임신소 혈청단백질에 대한 pH 4.5~5.5 조건에서의 2D-DIGE 결과를 보여주는 사진.

도 3은 본 발명에 의한 임신소 혈청단백질의 비임신소 혈청단백질에 대한 pH 6~9 조건에서의 2D-DIGE 결과를 보여주는 사진.

도 4는 본 발명의 일 실시예의 단백질 분석에 의해 분리된 단백질의 동정 결과를 보여주는 스펙트럼.

도 5는 본 발명의 또 다른 일 실시예의 단백질 분석에 의해 분리된 단백질의 동정 결과를 보여주는 스펙트럼.

본 발명은 단백질 분석방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 CyDye를 이용하 여 동시에 2가지 단백질 시료의 비교 분석과 미량 단백질의 분석이 가능할 뿐 아니라, 동시에 단백질 분리의 재연성이 높고 분리된 단백질의 동정이 보다 용이한 단백질 분석방법에 관한 것이다.

2차원 전기영동(2-Dimensional gel electrophoresis)은 1975년 최초로 O'Farrell 에 의해 도입된 이후 매우 보편적으로 사용되고 있는 단백질 분리기술로 1차원으로는 단백질분자의 등전점(pI)에 의하여 분리하고, 2차적으로 단백질 분자량에 따라 분리하는 기술이다. 2차원 전기영동에 의하면 어떤 조직이나 세포에 함유되어 있는 모든 단백질을 분리하고, 특정 단백질의 분자량과 isoform과 같은 특성을 규명할 수 있다.

MALDI-TOF(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Fight)는 고분자 생화합물 연구에 있어 가장 정확하게 mass를 측정할 수 있는 방법 중 하나이다. 최근에는 이러한 2차원 전기영동을 통하여 분리된 단백질 스팟들을 도려내어 MALDI-TOF에 의해 특정 단백질을 동정하는데 많이 사용하고 있다. 보다 구체적으로, 2차원 전기영동 후 코마시(Coomassie blue stain)를 이용하여 염색하고 Gel에서 단백질 스팟들을 분석한 후 특정 스팟을 Gel에서 분리시켜 MALDI-TOF 분석하여 그 단백질을 동정하고 있는데, 아주 극미량의 단백질 샘플 탐색에는 한계가 있다. 극미량 단백질을 분리하여 탐색에 이용되고 있는 silver 염색법은 MALDI-TOF 분석에는 적합하지 않아 코마시 염색을 대체할 수 없다. 또한 두 단백질 시료의 비교 분석을 위해서는 각 시료에 대해 2차원 전기영동을 별도로 진행하여 비교해야 하므로 번거로울 뿐 아니라 재연성에도 문제가 있다.

이러한 Coomassie나 Silver 염색법에 한계를 극복하기 위해 2차원 전기영동 시 형광물질을 적용하여 단백질을 동정하는 2D-DIGE법(2D difference gel elctrophoresis)이 개발되었다. 2D-DIGE법은 2차원 전기영동시 단백질과 반응 하는 두개의 형광 dye Cy3(녹색)와 Cy5(적색)를 이용하여 하나의 2차원 전기영동 Gel 에서 두 개의 시료를 동시에 탐색할 수 있는 기술로, GE Healthcare Bio-Sciences사가 독점 라이센스를 획득하였으며, Cy2(청색)의 세번째 형광물질을 적용함으로써 3개의 단백질 시료를 동시에 탐색할 수 있게 되었다.

2D-DIGE 기법은 형광물질인 CyDye DIGE Fluor(Cy2(청색), Cy3(녹색), Cy5(적색): GE Healthcare Bio-Sciences, Sweden)로 3개의 단백질 시료를 각각 표지한 후 전기영동을 하고, 이를 DeCyder(GE Healthcare Bio-Scie=nces, Sweden)라는 DIGE-전용 Image 분석 프로그램에 의해 샘플 내 단백질들이 나타내는 형광발색의 차이를 정성적 및 정량적으로 분석하는 방법이다. 2D-DIGE 방법은 극미량의 샘플에 대한 이미지 분석에 있어 silver 염색방법의 sensitivity을 능가하는 것으로 알려져 있다. 현재 상용화 된 CyDye DIGE Fluor, minimal Dye(GE Healthcare Bio-Sciences, Sweden)의 경우 각 Cydye 당 50 ug의 단백질 시료량로 최적화된 실험조건이 추천되고 있다. 현재 이용되고 있는 코마시나 실버 염색법의 경우 단백질시료 500-1000ug가 필요한 것에 비하면 훨씬 적은 량으로 단백질 분리가 가능하다. 이러한 2D-DIGE 기법은 3개의 시료를 같은 Gel에서 분리할 수 있다는 특징과 더불 어, Cy2 형광 물질을 Internal Standard로 이용하여 Gel 간에서 오는 오차를 Internal Standard를 통해 상호 검출하여 보정을 해주므로 높은 정확도와 재연성을 나타내는 획기적인 장점을 가지고 있다.

그러나 CyDye로 표지된 단백질 시료로 2D 전기영동 후 분석된 단백질 스팟들을 MALDI-TOF/MS에 의해 단백질 동정하는데 각 스팟 당 분석하는데 필요한 양적인 문제가 있기 때문에, 2D-DIGE 기법을 이용하여 특정 스팟의 단백질 특성을 동정하기 위해서는 별도의 MALDI-TOF용 prep Gel를 따로 만들어야 하는 불편함과 이러한 prep Gel을 실시하면서 생기는 실험적인 오차의 문제점들이 있다. 단백질 동정이 가능할 정도로 많은 양의 단백질을 CyDye로 표지하여 2D-DIGE로 분석하는 경우에는, CyDye의 가격이 1mg 당 600만원 정도로 매우 고가이므로 경제성이 없을 뿐 아니라, 2D gel 상에서 형광이 너무 강하여 그 감도가 떨어지게 된다. 결국 2D-DIGE는 Gel 상에서의 단백질 분리는 높은 재연성과 감도를 가지고 있으나, 단백질 특성을 동정하기 위한 단계에서는 번거로움과 실험에서 가장 중요한 재연성이 떨어지는 단점이 있다.

본 발명은 상기와 같은 종래의 2차원 전기영동에 의한 단백질 분석 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, CyDye를 이용하여 동시에 2가지 이상 단백질시료의 비교 분석이 가능하고, 미량 단백질의 분석이 가능할 뿐 아니라, MALDI-TOF용 prep gel을 따로 만들 필요가 없어 재연성이 높고 단백질 동정이 보다 용이한 단백 질 분석방법을 제공하고자 하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 목적은 단백질 시험군과 단백질 대조군의 차이점을 하나의 전기영동 겔에서 분석하는 것과 동시에 같은 겔에서 MALDI-TOF용 스팟을 분리하여 단백질 동정이 가능한 분석방법을 제공하는 것이다.

전술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 단백질 분석 방법은 (A) 분석용 단백질 시료 및 대조구 단백질 시료를 서로 다른 CyDye로 각각 표지하는 단계, (B) (A)단계에서 표지된 시료 각 50~100ug 및 분석용 단백질 시료 1~5mg을 함께 2차원 전기영동하는 단계, (C) 형광 분석에 의해 (B)단계에서 전기영동한 겔(gel)을 분석하여 분석용 단백질과 대조구 단백질의 차이를 분석하는 단계 및 (D) (C)에서 분리된 스팟으로부터 단백질을 분리하여 동정하는 단계로 이루어진 것을 특징으로 한다.

상기 (A) 단계의 CyDye의 표지는 공지의 방법에 의해 이루어질 수 있으며, 분석용 단백질과 대조구 단백질 시료에 어떤 CyDye를 표지할 것인가는 임의로 선정될 수 있으며, 본 실시예에서도 확인할 수 있는 바와 같이 CyDye의 선정이 분석 결과에 영향을 미치는 것은 아니다.

본 발명의 가장 큰 특징은 하나의 전기영동 겔에 CyDye로 표지된 분석용 단백질 시료 및 대조구 단백질 시료 각 50~100 ug과 분석용 단백질 시료 1~5 mg을 함 께 전기영동하는 것에 의해 감도가 매우 높은 CyDye의 형광발색의 차이로 정성·정량적인 분석을 실시하고, 분석이 끝난 겔에서 스팟들을 분리하여 단백질 동정을 가능하게 하는 것이다. 본 발명의 실시예에서도 확인할 수 있듯이, 본 발명의 방법에 의하여 분석을 위해 형광 표지한 소량의 단백질시료와 단백질 동정을 위한 다량의 시료를 함께 이차원 전기영동한 경우, 형광 표지한 시료만을 이차원 전기영동한 것과 2D-DIGE 이미지가 같고, 코마시로 염색한 것과도 단백질 스팟들이 일치하는 양상으로 분리되었음을 알 수 있었다.

본 발명에서는 각각 다른 형광색을 나타내는 CyDye로 분석 시료와 대조구 시료를 각각 표지하는 것에 의해 2차원 전기영동 후 형광 분석에 의해 분석 시료와 대조구 시료의 단백질이 차이를 확인할 수 있다. 즉, 2D-DIGE 분석에서 분석용 시료에 표지된 CyDye의 색만을 나타내거나, 대조구 시료에 표지된 CyDye의 색만을 나타내는 스팟이 있다면, 이는 각각 분석용 시료에만 존재하거나 대조구 시료에만 존재하는 단백질에 기인한 것임을 알 수 있다.

또한 본 발명의 단백질 분석 방법은 (A) 단계에서 분석용 단백질 시료와 대조구 단백질 시료의 혼합물을 제3의 CyDye로 표지하여 (B) 단계에서 함께 전기영동할 수도 있다. 이와 같이 제3의 CyDye로 표지한 분석용 단백질 시료와 대조구 단백질 시료의 혼합물을 internal standard로서 사용하여 함께 전기영동하면, 단순한 오염을 분석용 단백질 시료와 대조구 단백질 시료의 차이로 잘 못 판독하는 오류를 피할 수 있다. 즉 internal standard를 사용하지 않는 경우에는 전기영동 겔의 오염에 의한 스팟과 유의한 차이에 의한 스팟을 구분할 수 없다. 그러나 internal standard를 사용하는 경우에는 대조구와 단백질 차이에 의한 스팟인 경우에는 internal standard의 스팟이 동일 위치에서 관측되지만, 단순 오염에 의한 spot일 경우에는 internal standard의 스팟 역시 동일 위치에서 관측되지 않으므로 단순한 오염에 기인한 스팟을 제외하는 것이 가능하다.

본 발명에서는 (C) 단계에서 automatic picker를 사용하여 분석용 시료와 대조구 시료의 단백질의 차이를 분석하고, 동시에 해당 스팟에 해당하는 단백질을 분리할 수도 있지만 분리를 보다 용이하게 하기 위하여 (C) 단계와 (D) 단계의 사이에 전기영동 겔을 코마시 염색할 수도 있다. 코마시 염색을 하면 스캐너와 같은 장비하에서 해당 스팟을 분리하지 않아도 되므로 전기영동 겔로부터 해당 스팟의 단백질의 분리하는 것이 보다 간편하다. 염색된 전기영동 겔로부터 해당 스팟의 단백질을 분리한 후 단백질을 동정하기 위해서는 공지의 방법에 따라 탈염색한 후 동정한다.

상기 단계에 의해 분리된 단백질은 단백질 동정의 시료로서 사용될 수 있다. 단백질 동정의 방법은 당분야에서 알려진 어떤 방법을 사용하여도 무방하며, 그 예로 MALDI-TOF 분석을 예로 들 수 있다.

도 1은 종래 기술에 의한 2차원 전기영동 단백질 분석방법과 본 발명의 일 실시예에 의한 단백질 분석방법을 비교한 비교도이다. 도 1의 A)는 기존 코마시염 색 방법을 나타낸 것으로 실험진행 기간은 5일이 소요되지만, 미량 단백질의 분석에 적용하기 어려운 문제가 있다. 도 1의 B)는 CyDye를 이용한 2D-DIGE 방법으로 MALDI-TOF용 prep gel 제조시간 포함하여 실험진행 기간이 5일 이상 소요되고 추가 노동이 필요하며 prep gel을 별도로 전기영동해야 하므로 재연성의 문제가 있다. 도 1의 C)는 본 발명의 일실시예에 의한 단백질 분석 방법으로 실험진행 기간 5일 소요되어 미량의 단백질 분석이 가능하고 재연성이 우수할 뿐 아니라 시간적·경제적 효율이 개선되었다. 그러나 도 1의 C)에서 세부적인 순서는 본 발명의 일 실시예에 의한 것일 뿐, 본 발명이 도 1의 C)로 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 염기성 조건에서 단백질을 분석하는 경우 단백질이 쉽게 변성되고 1차 전기영동에서 분리가 잘 안되는 문제가 있으므로 본 실시예에 기재된 바와 같이 이를 피하기 위해 strip을 rehydration한 후 형광 표지한 단백질 시료와 분석 시료를 함께 컵 로딩하여 2차원 전기영동할 수도 있다. 이와 같이 본 발명에서 (B) 단계의 2차원 전기영동의 시료 준비, 로딩, 전압 인가 등 구체적인 2차원 전기영동 방법은 당 분야에서 널리 알려진 공지의 방법 중 적절한 방법을 선정하여 사용할 수 있음은 당연하다.

이하, 소에서 임신 시 혈청에서 발현되는 단백질을 탐색하는 실시예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적인 목적일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1: 단백질 시료의 준비

1) 혈청으로부터 단백질 분리

혈청으로부터 혈청단백질을 분리해 내기 위해 임신혈청(인공수정 후 21일령)시료와 비임신 혈청 시료 각 200ul 당 200ul의 Lysis buffer(1% SDS, 1mM PMSF, Protease inhibitor cocktail(complete; Roche), 100mM Tris-HCl pH 7.0)를 각각 넣고 초음파 분쇄기(sonicator)를 이용 하여 분쇄한 후 얼음수조에서 냉각하였다. 냉각된 시료를 Shaker에 부착한 후 30분 이상 상온에서 반응하고 15000rpm, 4℃, 20분의 조건으로 원심분리하였다. 상등액을 취해 2-D Quant Kit(GE Heealthcare Bio-Science)사용하여 단백질을 정량하고 2mg과 50ug의 단백질을 분주하여 -70℃에 보관하며 사용하였다.

2) CyDye^TM의한 단백질의 형광 labeling

internal standard로 사용하기 위해 1)에서 준비한 임신 혈청단백질과 비임신 혈청단백질 각각 25ug씩의 혼합하여 50ug을 준비하였다.

pH4.5~5.5 범위에서의 분석을 위해, CyDye DIGE Flors(minimal dyes) kit(GE Heealthcare Bio-Science)를 사용하여 비임신 혈청단백질에 Cy3, 임신 혈청단백질에 Cy5, internal standard에는 Cy2로 표지하였다.

pH6~9 범위에서의 분석을 위해서는 비임신 혈청단백질에 Cy5, 임신 혈청단백 질에 Cy3, internal standard에는 Cy2로 표지하였다.

실시예 2: 2차원 전기영동

1) 1차 전기영동(Isoelectricfocusing, IEF)

① pH 4-7와 acidic range (pH3.5~4.5, pH4.5-5.5, pH5.5~6.7)의 경우

CyDye로 표지하지 않은 임신소 혈청단백질 2㎎을 Rehydration buffer(6M Urea, 2M Thiourea, 4% CHAPS, 0.4% DTT, 2% v/v IPG buffer pH4~7)와 섞어 총 volume이 400㎕가 되게 한 후, Immobiline pH gradient dry strip reswelling tray에 넣었다. pH 4~7의 18㎝ gradient dry strip을 용액 위에 덮은 후 커버 오일을 넣고 16시간 동안 rehydration 시켰다.

이 strip을 multiphor II(Amersham Biosciences)에 설치한 후, strip의 acidic쪽에 시료 loading(로딩) cup를 설치하였다. 실시예 1에서 CyDye로 각각 표지한 임신 혈청단백질, 비임신 혈청단백질 및 internal standard 각 50 ug의 혼합물로 이루어진 표지된 단백질 시료 150ug씩에 Rehydration buffer를 섞어 총 양이 110㎕가 되게 한 시료를 준비하여 설치된 cup에 넣고, 커버 오일로 위를 덮은 후, 100,000Vhr의 전기를 걸어 Isoelectricfocusing(IEF)을 수행하였다. 상기 방법에 의해 표지되지 않은 단백질시료는 동시에 CyDye로 표지된 단백질 시료와 함께 strip에서 같이 분리되어 진다.

② pH6-9 과 pH7-11의 경우

Rehydration buffer(7M Urea, 2M Thiourea, 4% CHAPS, 2.5% DTT, 10% v/v isopropanol, 5% v/v glycerol, 2% v/v IPG buffer pH6-9)를 섞어 총량이 350㎕가 되게 한 후 Immobiline pH gradient dry strip reswelling tray에 넣었다. 18㎝ pH 6-9 또는 pH7-11 gradient dry strip을 용액 위에 덮어 놓고 커버 오일을 넣은 후 16시간 동안 rehydration 시켰다.

이 strip을 multiphor II(Amersham Biosciences)에 설치한 후, strip의 basic쪽에 시료 loading(로딩) cup를 설치하였다. 실시예 1에서 CyDye로 각각 표지한 임신 혈청단백질, 비임신 혈청단백질 및 internal standard 각 50 ug의 혼합물로 이루어진 표지된 단백질시료 150ug과 2mg의 표지되지 않은 임신소 혈청과 Rehydration buffer(7MUrea, 2M Thiourea, 4%CHAPS, 2.5% DTT, 10% v/v isopropanol, 5% v/v glycerol, 2% v/v IPG buffer pH6-9, pH7-11)를 섞어 총량이 120㎕가 되게 준비하였다. 혼합된 시료를 로딩 cup에 넣고, 100,000Vhr의 전기를 걸어 Isoelectricfocusing(IEF)을 수행하였다.

2) 2차 전기영동(SDS-PAGE Electrophoresis)

① pH 4-7와 acidic range (pH3.5~4.5, pH4.5-5.5, pH5.5~6.7)의 경우

1)의 ①에서 IEF가 끝난 strip을 TBP equiliburation buffer(0.2mM Tributyl phosphine, 6M Urea, 2% SDS, 375mM Tris pH8.8, 20% Glycerol, 2.5% Acryamide) 10㎖에 넣고 15분간 가볍게 흔들어 주면서 equilibration을 실시 하였다. Equilibration이 끝난 strip을 고정된 8%-16% gradient gel의 상층에 넣고, SDS- PAGE running buffer(1.44% Glycine, 0.1% SDS, 0.3% Tris base)가 들어 있는 Ettan DALT twelve Large vertical system(Amersham Bioscience)에 고정 시켜 150mA의 전류로 16시간 동안 전기영동을 실시하였다.

② pH6-9 과 pH7-11의 경우

1)의 ②에서 IEF가 끝난 strip를 DTT equiliburation buffer(1% DTT, 6M Urea, 2% SDS, 375mM Tris pH8.8, 20% Glycerol, 2.5% Acryamide) 10㎖에 넣고 15분간 가볍게 흔들어 주면서 반응시켰다. DTT equilibration buffer를 버린 후 Iodoacetamide equiliburation buffer(4% Iodoacetamide, 6M Urea, 2% SDS, 375mM Tris pH8.8, 20% Glycerol, 2.5% Acryamide) 10㎖을 넣고 15분간 가볍게 흔들어 주면서 equilibration을 실시하였다. Equilibration이 끝난 strip를 고정된 8%-16% gradient gel의 상층에 넣고, SDS PAGE running buffer(1.44% Glycine, 0.1% SDS, 0.3% Tris base)가 들어 있는 Ettan DALT twelve Large vertical system(Amersham Bioscience)에 고정시켜 150mA의 전류로 16시간 동안 전기영동을 실시하였다.

3) Scanning 과 이미지 분석

2차원 전기연동이 끝난 gel plates를 증류수로 헹군 다음 Typhoon variable mode lmager를 이용하여 scanning 하였다. DeCyder softwere을 이용하여 분석 하고 통계학적 Data를 얻어 발현 차이를 보이는 단백질 spot들을 분석하였다.

도 2의 A)는 실시예 2에 의해 pH 4.5~5.5의 산조건에서 이차원 전기영동한 2D-DIGE 이미지 그림이고, 도 2의 B)는 CyDye로 표지한 시료(150ug)만의 2D-DIGE 이미지 그림으로 두 Image 그림 상에 나타나 있는 단백질 스팟들의 분리 양상에는 큰 차이가 없는 것으로 나타났다. 또한 Cy3으로 라벨링한 비임신 혈청단백질(녹색), Cy5으로 라벨링한 임신 혈청단백질(적색)(도 2의 C)) 및 같은 Gel을 Coomassie로 2차 염색한 그림(도 2의 D))에서 모두 단백질 스팟들이 같은 양상으로 분리되었음을 나타내고 있다.

도 3의 A)는 실시예 3에서 pH 6~9 strip을 이용하여 2mg의 임신소혈청 단백질 시료와 CyDye로 표지한 시료(150ug)를 동시에 2D-DIGE 실시한 이미지 그림으로 CyDye로 표지한 시료(150ug)만의 2D-DIGE 이미지 그림(도 3의 B)), Cy3으로 라벨링한 임신 혈청단백질(녹색), Cy5으로 라벨링한 비임신 혈청단백질(적색)(도 3의 C)) 및 같은 Gel을 Coomassie로 2차 염색한 그림(도 3의 D))에서 모두 단백질 스팟들이 같은 양상으로 분리되었음을 나타내고 있다.

4) Coomassie Brilliant Blue(CBB) G-250 염색

3차 증류수가 들어 있는 용기에 Scanning이 끝난 Gel을 증류수로 세척한 후 고정용액(40% v/v methanol, 5% v/v phosphoric acid) 1ℓ을 넣고 가볍게 흔들어 주면서 1시간 고정하였다. 이후 고정용액을 제거하고, CBB염색용액(17% g/v Ammonium sulfate, 3% v/v phosphoric acid, 0.1% g/v Coomassie G-250, 34% v/v methanol) 1ℓ를 넣고 가볍게 흔들어 주면서 12시간 이상 염색하였다. 염색한 Gel을 탈염색용액(1% acetic acid, 0.02% sodium azied)에 넣어 12시간 이상 Gel에서 탈염색을 실시하였다.

5) MALDI-TOF 와 ESI-MS/MS를 이용한 단백질 동정

4)의 Image 분석에서 차이를 보인 단백질 spot(도 2의 C1, D1 및 도 3의 A1)들을 잘라내어(1㎜ x 1㎜) 1.5㎖ microtube에 넣고 washing buffer(50% v/v acetonitrile, 25mM ammonium carbonate, pH7.8) 120㎕를 첨가 하여 CBB의 청색이 사라질 때까지 반복하여 탈 염색한 후 Vacuum 원심분리기를 이용하여 동결건조하였다. 건조한 Gel 조각에 5㎕의 trypsin buffer(0.02㎍ trypsin/㎖, 25mM ammonium carbonate)를 넣고 1시간 동안 rehydration 하고 Gel 조각에 25mM ammonium bicarbonate buffer를 추가하고 12시간 이상 37℃에서 12시간 반응시켰다. Extraction buffer(50% Acetonitrile, 0.1% Trifluoro acetic acid(TFA), 3차 증류수) 5㎕를 넣고 30분간 sonication을 실시하고 1㎕의 시료를 취하여 메트릭스(matrix) 용액(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid 10㎎/㎖ in 50% v/v acetonitrile, 0.1% TFA) 1㎕를 추가하여 섞은 후 96-well plate(Perseptive Biosystems, Framingham, MA, USA)에 깔고, 30분간 건조시켜 시료를 준비하였다. 96-well plate에 있는 peptide를 MALDI-TOF(Perseptive Biosystems, Framingham, MA, USA)로 분석하여 펩타이드 분자량을 측정한다. 측정된 펩타이드 분자량 데이터를 http://prowl.rockefeller. edu/prowl-cgi/profound.exe 사이트를 이용하여 Database 검색을 하여 단백질을 동정하였다.

도 4의 A)는 도 2에 표시된 D1 스팟을 확대한 사진이고, C)는 본 실시예의 방법에 의해 해당 스팟으로부터 분리한 단백질의 MALDI-TOF 스펙트럼이다. 도 4의 B)는 도 2에 표시된 C1 스팟을 확대한 사진이고, D)는 이 스팟으로부터 분리한 단백질의 MALDI-TOF 스펙트럼이다. 도 1의 C)와 D)의 동정 결과 두 스펙트럼에서 피크 값이 모두 일치하는 것으로 나타났으며, 같은 단백질인 Serum albumin precursor로 동정되었다.

도 5는 도 3에 표시된 A1 스팟의 분석 결과를 보여주는 그림으로 A)는 형광 분석, B)는 코마시 염색에 의한 분석 결과를 각각 보여준다. 도 5의 A)에서 이 A1 스팟은 붉은색 형광을 나타내어 임신소의 혈청에는 존재하지 않고 비임신소의 혈청에만 존재하는 단백질임을 알 수 있다. 도 5의 C)는 통상의 방법에 의해 2차원 전기영동 후 코마시 염색한 겔의 사진이다. A1 스팟에 해당하는 단백질을 본 실시예의 방법에 의해 분리하여 MALDI-TOF로 분석한 결과 (도 5의 D) Modified Bovine Fibrinogen으로 동정되었다.

이상과 같이 본 발명에 의하면 하나의 2-D Gel에 CyDye로 표지된 시료와 MALDI-TOF용 시료를 동시에 적용함으로써, sensitivity가 매우 가장 높은 CyDye의 형광발색 차이로 정성·정량적인 분석을 실시하고, 하나의 gel에서 분석과 동시에 MALDI-TOF를 이용한 단백질 동정을 가능하게 하여 재연성의 한계를 극복 할 수 있고, 분석에 드는 시간과 비용을 획기적으로 줄일 수 있다.

또한, 하나의 겔에서 두가지 단백질을 동시에 분석하는 것이 가능하므로 두 가지 단백질을 상호 비교 분석하여 차이가 있는 단백질을 동정할 때 유효하게 이용할 수 있다.

Claims (5)

1. (A) 분석용 단백질 시료 및 대조구 단백질 시료를 서로 다른 CyDye로 각각 표지하는 단계;

   (B) (A)단계에서 표지된 시료 각 50~100ug 및 분석용 단백질 시료 1~5mg을 함께 2차원 전기영동하는 단계;

   (C) 형광 분석에 의해 (B)단계에서 전기영동한 겔(gel)을 분석하여 분석용 단백질과 대조구 단백질의 차이를 분석하는 단계; 및

   (D) (C)에서 분리된 스팟으로부터 단백질을 분리하여 동정하는 단계;

   로 이루어진 것을 특징으로 하는 단백질 분석방법.
2. 제 1 항에 있어서,

   (A) 단계에서 분석용 단백질 시료와 대조구 단백질 시료의 혼합물을 제3의 CyDye로 표지하여 (B) 단계에서 함께 전기영동하는 것을 특징으로 하는 단백질 분석방법.
3. 제 1 항에 있어서,

   상기 (C)단계의 형광 분석은 자동 피커(automatic picker)를 사용하여 이루 어지는 것을 특징으로 하는 단백질 분석방법.
4. 제 1 항에 있어서,

   (C) 단계과 (D) 단계의 사이에 코마시 염색에 의한 이미지 분석 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 분석방법.
5. 제 1 한 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,

   (D) 단계의 단백질 동정은 MALDI-TOF에 의한 분석인 것을 특징으로 하는 단백질 분석방법.

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