CN105866429B - 基于自带电荷同位素试剂的生物分子标记和定量分析方法 - Google Patents

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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry

Abstract

本发明涉及一种基于自带电荷同位素试剂的生物分子标记和定量分析方法。将两组不同生理或病理条件的整体蛋白分别作为控制组与疾病组，分别进行赖氨酸ε‑氨基及N端氨基全部同重标记，分别标记为‑N(C11 13CH11N+OCH2)2和‑N(C12H11 15N+OCH2)2，其单个标记后氨基的质量差异为12.6mDa；同重标记后两组蛋白按等比例混合进行高分辨质谱和串级质谱分析得到一个数据组；对数据组进行定性、定量数据库搜索，得到蛋白质的ID及疾病组每一个蛋白质相对于控制组的相对比例，即疾病条件下所有蛋白的上调或下调情况。与现有技术相比，本发明不仅标记效率高，准确度高，便宜易得；而且自带电荷，将大大增强带标记蛋白的电喷雾电离和质谱分析灵敏度和效率。适用于整体蛋白质基于高分辨串级质谱分析的定量。

Description

基于自带电荷同位素试剂的生物分子标记和定量分析方法
技术领域
本发明涉及一种生物分子的定量方法，尤其是涉及一种基于自带电荷同位素试剂的生物分子标记和定量分析方法，主要涉及与生物质谱相关的系统生物学、蛋白质组学等技术领域。
背景技术
同位素、同重、或近同重标记现已广泛用于蛋白的定量分析。标记过程中，标记试剂与蛋白质N端氨基、C端羧基、或氨基酸序列上残基上的官能团中的一个或多个发生反应，生成新的共价官能团。这些新的官能团的电离效率往往较原来的官能团的低，从而导致标记后蛋白质的分析效率较低。
申请人前期在整体蛋白质定性定量分析方面已经做了较多的工作，有较好的基础。
在定量数据挖掘方面，公布号为CN103389335A的中国专利公布了一种鉴定生物大分子的分析装置和方法。公布号为CN 104765984A的中国专利公布了一种生物质谱数据库快速建立与搜索的方法。公布号为CN104359967A的中国专利公布了一种生物质谱重叠同位素轮廓的解析方法。上述专利中公布了同位素轮廓指纹比对算法(isotopic envelopefingerprinting，iEF)，直接在原始数据上进行匹配离子的搜索和蛋白质的鉴定。该算法无需对实验数据进行“去同位素”预处理，可以节省相应的时间；根据各个离子中是否有同位素峰缺失和同位素峰相对强度的偏差对理想及非理想实验数据进行很好的区分，保证蛋白鉴定的可信度；根据已知重叠离子的同位素峰相对强度关系对重叠实验数据进行有效的解析。基于该算法申请人成功地开发了整体蛋白数据库搜索引擎ProteinGoggle，在单个标准蛋白(泛素、肌红蛋白)及整体蛋白质组混合物(组蛋白H4家族翻译后修饰异构体、大肠杆菌)的定性鉴定中，表现出较高的可信度和较好的应用前景。在定量分析方面，ProteinGoggle有着它内在的和独特的潜在优势；一方面基于同位素轮廓及其中每个同位素的指纹比对可以快速精确地搜索同位素或同重标记的定量离子对；另一方面，搜索过程中每个离子中每个同位素峰的实验强度都被记录和输出，可以用来直接计算相对定量比。
在定量标记方面，公布号为CN105137088A的中国专利公布了一种整体蛋白质定量分析方法。公布号为CN105242050A的中国专利公布了一种不同生理或病理条件下整体蛋白质的定量分析方法，该专利对N端氨基进行同重标记，分别标记为-N(CH2D)2和-N(13CH3)2。上述两份专利均是基于重同位素的定量标记方法。
发明内容
本发明的目的就是为了提供一种标记效率高且标记蛋白电离效率高的整体蛋白质定量方法，本发明的方法可以实现相对或绝对标记定量；同时保证了分析的灵敏度和效率。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种基于自带电荷同位素试剂的生物分子标记和定量分析方法，包括以下步骤：
(1)将两组不同生理或病理条件的整体蛋白分别作为控制组与疾病组，分别进行赖氨酸ε-氨基及N端氨基全部同重标记，分别标记为-N(C11 13CH11N+OCH2)2和-N(C12H11 15N+OCH2)2，其单个标记后氨基的质量差异为12.6mDa；
(2)同重标记后两组蛋白按等比例混合进行高分辨质谱和串级质谱分析得到一个数据组；
(3)对数据组进行定性、定量数据库搜索，得到蛋白质的ID及疾病组每一个蛋白质相对于控制组的相对比例，即疾病条件下所有蛋白的上调或下调情况，上调或下调倍数最大的蛋白即为与该疾病发生、发展相关的蛋白。
优选地，步骤(1)中，控制组蛋白或疾病组蛋白，一组蛋白质用氰基硼氢化钠和含13C的N(3-醛基-4-羟基苄基)氯化吡啶鎓盐标记，另一组蛋白质用氰基硼氢化钠和含15N的N(3-醛基-4-羟基苄基)氯化吡啶鎓盐标记。
N(3-醛基-4-羟基苄基)氯化吡啶鎓盐为自带电荷同位素试剂，合成方法可依照文献【马慧敏，等。合成化学，2014,22(2)，230-233】来进行。
其中，含13C的N(3-醛基-4-羟基苄基)氯化吡啶鎓盐的合成采用13C标记多聚甲醛(如Cambridge Isotope Lab，99％，产品代码CLM-229-1，$720.00/1G)，含15N的N(3-醛基-4-羟基苄基)氯化吡啶鎓盐的合成采用15N标记的吡啶(如Cambridge Isotope Lab，98％+，产品代码NLM-305-0.5,$445.50/0.5G)。
优选地，步骤(1)中进行同重标记的反应过程和条件如下：蛋白溶解在乙酸钠缓冲溶液后，加入新配制的含13C的N(3-醛基-4-羟基苄基)氯化吡啶鎓盐或含15N的N(3-醛基-4-羟基苄基)氯化吡啶鎓盐，在搅拌条件下加入600mM的新配制的氰基硼氢化钠溶液，室温反应1小时后，用氨水淬灭。
优选地，所述的乙酸钠缓冲溶液为100mmol/L，pH为5-6。
优选地，所述的含13C的N(3-醛基-4-羟基苄基)氯化吡啶鎓盐或含15N的N(3-醛基-4-羟基苄基)氯化吡啶鎓盐溶液质量分数为4％(w/w)。
优选地，所述的氨水溶液体积分数为4％(v/v)。
步骤(2)所述的等比例混合指：按照控制组与疾病组的重量、体积或摩尔量以1:1比例进行混合。
步骤(3)中对数据组进行定性、定量数据库搜索，得到蛋白质的ID及疾病组每一个蛋白质相对于控制组的相对比例为本领域的常规技术，优选使用背景技术中介绍的整体蛋白数据库搜索引擎ProteinGoggle，同时也可以使用其他数据解析工具。
本发明涉及的方法同样适用于蛋白质序列中赖氨酸ε-氨基及N端氨基其他基于自带电荷的同位素标记、同重标记和全同重标记；同样适用于氨基酸其他特定官能团的基于自带电荷的同位素标记、同重标记和全同重标记。除蛋白质外，本发明涉及的方法同样适用于(但不局限于)多肽、代谢产物等的标记定量。
本发明的解析方法基于所述质谱的原始二级质谱，通过计算含标记基团碎片离子的平均相对强度从而计算标记蛋白在不同生理或病理条件下的相对强度。与现有技术相比，本发明的定量方法对整体蛋白质序列中赖氨酸ε-氨基及N端氨基的同重标记和其高分辨串级质谱标记碎片离子同位素轮廓指纹比对原位数据解析，标记效率高，准确度高，便宜易得；而且自带电荷，将大大增强带标记蛋白的电喷雾电离和质谱分析灵敏度和效率。适用于整体蛋白质基于高分辨串级质谱分析的定量。
附图说明
图1：定量分析流程图。
图2：蛋白质分子赖氨酸ε-氨基和N端氨基全同重二甲基标记示意图。
图3：自带电荷同位素试剂的合成。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例
一种基于自带电荷同位素试剂的生物分子标记和定量分析方法，如图1所示，包括以下步骤：
(1)将两组不同生理或病理条件的整体蛋白分别作为控制组与疾病组，分别进行赖氨酸ε-氨基及N端氨基全部同重标记，一组蛋白质用氰基硼氢化钠和含13C的N(3-醛基-4-羟基苄基)氯化吡啶鎓盐标记，另一组蛋白质用氰基硼氢化钠和含15N的N(3-醛基-4-羟基苄基)氯化吡啶鎓盐标记，分别标记为-N(C11 13CH11N+OCH2)2和-N(C12H11 15N+OCH2)2(如图2所示)，其单个标记后氨基的质量差异为12.6mDa；反应过程和条件如下：蛋白溶解在乙酸钠缓冲溶液(100mM,pH 5-6)后，加入新配制的4％(w/w)的含13C的N(3-醛基-4-羟基苄基)氯化吡啶鎓盐或含15N的N(3-醛基-4-羟基苄基)氯化吡啶鎓盐，在搅拌条件下加入600mM的新配制的氰基硼氢化钠溶液，室温反应1小时后，用4％(v/v)的氨水淬灭。
(2)同重标记后两组蛋白按等比例混合进行高分辨质谱和串级质谱分析得到一个数据组，等比例混合指：按照控制组与疾病组的重量、体积或摩尔量以1:1比例进行混合；
(3)对数据组进行定性、定量数据库搜索，得到蛋白质的ID及疾病组每一个蛋白质相对于控制组的相对比例，即疾病条件下所有蛋白的上调或下调情况，上调或下调倍数最大的蛋白即为与该疾病发生、发展相关的蛋白。对数据组进行定性、定量数据库搜索，得到蛋白质的ID及疾病组每一个蛋白质相对于控制组的相对比例为本领域的常规技术，优选使用背景技术中介绍的整体蛋白数据库搜索引擎ProteinGoggle，同时也可以使用其他数据解析工具。
N(3-醛基-4-羟基苄基)氯化吡啶鎓盐为自带电荷同位素试剂，合成方法可依照文献【马慧敏，等。合成化学，2014,22(2)，230-233】来进行，步骤如图3所示。其中，含13C的N(3-醛基-4-羟基苄基)氯化吡啶鎓盐的合成采用13C标记多聚甲醛(如Cambridge Isotope Lab，99％，产品代码CLM-229-1，$720.00/1G)，含15N的N(3-醛基-4-羟基苄基)氯化吡啶鎓盐的合成采用15N标记的吡啶(如Cambridge Isotope Lab，98％+，产品代码NLM-305-0.5,$445.50/0.5G)。
以上方法基于所述质谱的原始二级质谱，通过计算含标记基团碎片离子的平均相对强度从而计算标记蛋白在不同生理或病理条件下的相对强度。本发明的定量方法对整体蛋白质序列中赖氨酸ε-氨基及N端氨基的同重标记和其高分辨串级质谱标记碎片离子同位素轮廓指纹比对原位数据解析，标记效率高，准确度高，适用于整体蛋白质基于高分辨串级质谱的定量分析。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种基于自带电荷同位素试剂的生物分子标记和定量分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将两组不同生理或病理条件的整体蛋白分别作为控制组与疾病组，分别进行赖氨酸ε-氨基及N端氨基全部同重标记，分别标记为-N(C11 13CH11N+OCH2)2和-N(C12H11 15N+OCH2)2，其单个标记后氨基的质量差异为12.6mDa；
(2)同重标记后两组蛋白按等比例混合进行高分辨质谱和串级质谱分析得到一个数据组；
(3)对数据组进行定性、定量数据库搜索，得到蛋白质的ID及疾病组每一个蛋白质相对于控制组的相对比例，即疾病条件下所有蛋白的上调或下调情况，上调或下调倍数最大的蛋白即为与该疾病发生、发展相关的蛋白；
步骤(1)中，控制组蛋白或疾病组蛋白，一组蛋白质用氰基硼氢化钠和含13C的N(3-醛基-4-羟基苄基)氯化吡啶鎓盐标记，另一组蛋白质用氰基硼氢化钠和含15N的N(3-醛基-4-羟基苄基)氯化吡啶鎓盐标记；
含13C的N(3-醛基-4-羟基苄基)氯化吡啶鎓盐的合成采用13C标记多聚甲醛，含15N的N(3-醛基-4-羟基苄基)氯化吡啶鎓盐的合成采用15N标记的吡啶。
2.根据权利要求1所述的一种基于自带电荷同位素试剂的生物分子标记和定量分析方法，其特征在于，步骤(1)中进行同重标记的反应过程和条件如下：蛋白溶解在乙酸钠缓冲溶液后，加入含13C的N(3-醛基-4-羟基苄基)氯化吡啶鎓盐或含15N的N(3-醛基-4-羟基苄基)氯化吡啶鎓盐，在搅拌条件下加入氰基硼氢化钠溶液，室温反应1小时后，用氨水淬灭。
3.根据权利要求2所述的一种基于自带电荷同位素试剂的生物分子标记和定量分析方法，其特征在于，所述的乙酸钠缓冲溶液为100mmol/L，pH为5-6。
4.根据权利要求2所述的一种基于自带电荷同位素试剂的生物分子标记和定量分析方法，其特征在于，所述的含13C的N(3-醛基-4-羟基苄基)氯化吡啶鎓盐或含15N的N(3-醛基-4-羟基苄基)氯化吡啶鎓盐溶液质量分数为4％(w/w)。
5.根据权利要求2所述的一种基于自带电荷同位素试剂的生物分子标记和定量分析方法，其特征在于，所述的氨水溶液体积分数为4％(v/v)。
6.根据权利要求1所述的一种基于自带电荷同位素试剂的生物分子标记和定量分析方法，其特征在于，步骤(2)所述的等比例混合指：按照控制组与疾病组的重量、体积或摩尔量以1:1比例进行混合。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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US20040106150A1 (en) * 2000-12-22 2004-06-03 Wang Yingqi Karen Inverse labeling method for the rapid identification of marker/target proteins
CN101173926A (zh) * 2006-11-03 2008-05-07 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 稳定同位素18o标记蛋白质组双重定量方法与试剂盒
KR100857592B1 (ko) * 2007-06-05 2008-09-09 충남대학교산학협력단 ＣｙＤｙｅ를 이용한 새로운 단백질 분석 방법
CA2802057A1 (en) * 2010-06-16 2011-12-22 Abbvie Inc. Comparison of protein samples
EP2850430B1 (en) * 2012-05-18 2017-04-19 Dh Technologies Development Pte. Ltd. Analysis of a panel of cerebrotendinous xanthomatosis biomarkers using site specific derivation and lc/ms/ms workflow
CN104076098B (zh) * 2013-03-29 2015-08-19 中国科学院大连化学物理研究所 等重二甲基化标记蛋白质定量方法
CN104237363B (zh) * 2013-06-14 2017-02-08 中国科学院大连化学物理研究所 一种蛋白质定量方法
CN105137088A (zh) * 2015-08-27 2015-12-09 同济大学 一种整体蛋白质定量分析方法

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