CN104359963A - 一种水产品中四种嘌呤物质的快速检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水产品中四种嘌呤物质的快速检测方法，该方法包括以下步骤：(1)标准品的毛细管电泳数据采集；(2)标准曲线绘制；(3)前处理：将样品置于混合有机酸内，超声波细胞粉碎仪超声处理，之后立刻取出，放置在冰水内降温，之后0.45微米水相滤膜过滤，滤液备用；(4)计算：取滤液1.2ml，经毛细管电泳分离，以迁移时间来识别目标物质，以峰面积值来代入(2)中所述的方程中，经相关软件得出嘌呤含量值。本发明具有快速、准确、低成本的特点，适合推广应用。

Description

一种水产品中四种嘌呤物质的快速检测方法

技术领域

本发明属于嘌呤分析检测技术领域，涉及一种水产品中四种嘌呤物质的快速检测方法，具体地说，涉及一种基于超声波细胞粉碎-毛细管电泳联用的水产品中四种嘌呤物质的快速检测方法。

背景技术

嘌呤是一类有机化合物，在人体内主要以嘌呤核苷酸的形式存在，嘌呤在人体内代谢最终以尿酸的形式排出体外，尿酸在正常人体内能维持在特定水平。次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶的缺陷会引起嘌呤代谢异常，大量的外源性高嘌呤含量物质被摄入时，患者尿酸水平升高，从而引起痛风症。另外，患者血中尿酸含量升高，尿酸盐晶体可沉积于关节、软组织、软骨及肾等处，导致关节炎、尿路结石及肾疾病，因而，患有嘌呤代谢异常的人平时都应注意忌口。

水产品是人们常食用的一类食品，该类食品的嘌呤分布数据目前并不完善，更重要的是水产品随不同的烹饪方式以及贮藏方式的变化规律目前没有系统的完善数据。目前存在的水产品嘌呤物质的检测方法，大多数是利用热酸水解，干燥复溶，而后色谱检测的方法，检出时间非常长，操作步骤繁琐，检测成本较高。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题和不足，本发明提供了一种快速、准确、低成本的水产品中四种嘌呤物质的检测方法，是一种快速准确的检测水产品中鸟嘌呤、腺嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤的方法。

其技术方案为：

一种水产品中四种嘌呤物质的快速检测方法，包括以下步骤：

(1)、标准品的毛细管电泳数据采集：配制0.1mg/ml浓度的标准品单品，配制0.1mg/ml的混合标准品，使用毛细管电泳仪采集不同浓度四种嘌呤的迁移时间及峰面积，通过标准品单品和混合标准品迁移时间的对应关系来识别出峰次序；

(2)、标准曲线绘制：配制10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml五个梯度浓度的标准品单品以及五个梯度浓度的混合标准品，使用毛细管电泳仪采集不同浓度四种嘌呤的迁移时间及峰面积，使用软件将迁移时间作为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制四种嘌呤物质各自的拟合曲线，得出拟合方程；

(3)、前处理：将样品置于混合有机酸内，超声波细胞粉碎仪超声处理，之后立刻取出，放置在冰水内降温，之后0.45微米水相滤膜过滤，滤液备用；

(4)、计算：取1.2ml滤液，经毛细管电泳分离，以迁移时间来识别目标物质，以峰面积值来代入(2)中所述的方程中，经相关软件得出嘌呤含量值。

以上步骤(1)、(2)只需要在前期做一次，目的是建立拟合方程。以后的检测只需要执行步骤(3)、(4)即可。

优选地，步骤(1)中，毛细管长40厘米，75微米内径，聚酰亚胺涂渍，距出口末端8.5cm处烧制检测窗口，采用40毫摩尔每升的硼砂-氢氧化钠缓冲液，pH值为9.27，毛细管电泳采用静态压力进样，压力设定值为50mbar。柱温箱温度控制值为20℃，检测器选取二极管阵列检测器(DAD)，波长设定值为254纳米。

优选地，步骤(3)中，混合酸为甲酸、三氟乙酸、超纯水的混合物，配比为5∶5∶1，配制混合酸25ml，取样品1g，置于超声波细胞粉碎机内，超声波变径杆末端直径6mm，超声功率760瓦，工作\间歇时间设定为3s\2s，粉碎处理18分钟。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)、通过毛细管电泳-超声波细胞粉碎仪联用的方法，样品均可以在25分钟内完成前处理到最后检出的所有步骤，实现水产品中四种嘌呤物质的快速、准确检出。之前报道的相关检测方法中(热酸水解、蒸干复溶、色谱检测)，完成检测所用时间要远长于该方法。

(2)、方法操作简单，体现在三个方面：第一，标准曲线只需要做一次，以后直接通过软件计算便可检出结果。第二，样品前处理简单，超声波粉碎处理后冷却过滤即可上样。第三，可实现多个样品的连续进样。

(3)、检测成本较低。检测需要的药品涉及到混合酸、氢氧化钠、硼砂等，价格都比较低廉，而且使用量较少，成本较低；其次，毛细管电泳进样量非常小，每次只需要进纳升级别的样品即可进行检测，大大降低了检测成本。

(4)、方法精密度高，最低检出限检出为1.3mg/kg，动态线性范围在2-200mg/ml，加标回收率在89％-101％间。

附图说明

图1是标准品毛细管电泳图，其中，A：腺嘌呤；G：鸟嘌呤；H：黄嘌呤；X：次黄嘌呤；

图2是带鱼样品毛细管电泳图，其中，A：腺嘌呤；G：鸟嘌呤；H：黄嘌呤；X：次黄嘌呤；

图3是南美白对虾样品毛细管电泳图，其中，A：腺嘌呤；G：鸟嘌呤；H：黄嘌呤；X：次黄嘌呤。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步说明。

实施例1：带鱼中四中嘌呤物质的检测

具体检测步骤如下：(1)、标准品的毛细管电泳数据采集：毛细管长40厘米，75微米内径，聚酰亚胺涂渍，距出口末端8.5cm处烧制检测窗口。采用40毫摩尔每升的硼砂-氢氧化钠缓冲液，pH值为9.27。采用安捷伦7100毛细管电泳仪，采用静态压力进样，压力设定值为50mbar。柱温箱温度控制值为20℃。检测器选取二极管阵列检测器(DAD)，波长设定值为254纳米。配制0.1mg/ml浓度的标准品单品，配制0.1mg/ml的混合标准品，使用毛细管电泳仪采集不同浓度四种嘌呤的迁移时间及峰面积。通过标准品单品和混合标准品迁移时间的对应关系来识别出峰次序。具体出峰情况如图1。

(2)、标准曲线绘制：配制10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml五个梯度浓度的标准品单品以及五个梯度浓度的混合标准品，使用毛细管电泳仪采集不同浓度四种嘌呤的迁移时间及峰面积，使用软件Chemstation将迁移时间作为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制四种嘌呤物质各自的拟合曲线，得出拟合方程。见表1。

表1，四种标准物质的线性方程、检出限以及拟合方程(A：腺嘌呤；G：鸟嘌呤；H：黄嘌呤；X：次黄嘌呤)

(3)、前处理：将1g带鱼样品，置于配比为5∶5∶1的25ml甲酸、三氟乙酸、超纯水的混合有机酸内，置于超声波细胞粉碎机(采用新芝II型超声波细胞粉碎机，6号变幅杆)内，超声功率760瓦，工作\间歇时间设定为3s\2s。粉碎处理18分钟，之后立刻取出，放置在冰水内降温，0.45微米水相滤膜过滤，滤液备用。

(4)、计算：取滤液1.2ml，经毛细管电泳分离，分离条件同(1)中所述。以迁移时间来识别目标物质，出峰情况如图2，以峰面积值来代入(2)中所述的方程中，经相关软件得出嘌呤含量值，结果如表2。

表2：带鱼及南美白对虾定量结果

实施例2：南美白对虾中四中嘌呤物质的检测

具体检测步骤如下：(1)、标准品的毛细管电泳数据采集：毛细管长40厘米，75微米内径，聚酰亚胺涂渍，距出口末端8.5cm处烧制检测窗口。采用40毫摩尔每升的硼砂-氢氧化钠缓冲液，pH值为9.27。采用安捷伦7100毛细管电泳仪，静态压力进样，压力设定值为50mbar。柱温箱温度控制值为20℃。检测器选取二极管阵列检测器(DAD)，波长设定值为254纳米。配制0.1mg/ml浓度的标准品单品，配制0.1mg/ml的混合标准品，使用毛细管电泳仪采集不同浓度四种嘌呤的迁移时间及峰面积。通过标准品单品和混合标准品的迁移时间的对应关系来识别出峰次序。具体出峰情况如图1：

(2)、标准曲线绘制：配制10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml五个梯度浓度的标准品单品以及五个梯度浓度的混合标准品，使用毛细管电泳仪采集不同浓度四种嘌呤的时间值及峰面积值，使用软件Chemsation将迁移时间作为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制四种嘌呤物质各自的拟合曲线，得出拟合方程。见表1。

(3)、前处理：将1g带鱼样品，置于25ml配比为5∶5∶1的甲酸、三氟乙酸、超纯水的混合有机酸内，置于超声波细胞粉碎机(采用新芝II型超声波细胞粉碎机，6号变幅杆)内，超声功率760瓦，工作\间歇时间设定为3s\2s。粉碎处理18分钟，之后立刻取出，放置在冰水内降温，0.45微米水相滤膜过滤，滤液备用。

(4)、计算：取滤液1.2ml，经毛细管电泳分离，分离条件同(1)中所述。以迁移时间来识别目标物质，出峰情况如图3，以峰面积值来代入(2)中所述的方程中，经相关软件得出嘌呤含量值，结果如表2。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员，在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到技术方案的简单变换或等效替换，但均落入本发明的保护范围内。

Claims (3)

1.一种水产品中四种嘌呤物质的快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、标准品的毛细管电泳数据采集：配制0.1mg/ml浓度的标准品单品，配制0.1mg/ml的混合标准品，使用毛细管电泳仪采集不同浓度四种嘌呤的迁移时间及峰面积，通过标准品单品和混合标准品迁移时间的对应关系来识别出峰次序；

(2)、标准曲线绘制：配制10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml五个梯度浓度的标准品单品以及五个梯度浓度的混合标准品，使用毛细管电泳仪采集不同浓度四种嘌呤的迁移时间及峰面积，使用软件将迁移时间作为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制四种嘌呤物质各自的拟合曲线，得出拟合方程；

(3)、前处理：将样品置于混合有机酸内，超声波细胞粉碎仪超声处理，之后立刻取出，放置在冰水内降温，之后0.45微米水相滤膜过滤，滤液备用；

(4)、计算：取滤液1.2ml，经毛细管电泳分离，以迁移时间来识别目标物质，以峰面积值大小来代入(2)中所述的方程中，经相关软件得出嘌呤含量值。

2.根据权利要求1所述的水产品中四种嘌呤物质的快速检测方法，其特征在于，步骤(1)中，毛细管长40厘米，75微米内径，聚酰亚胺涂渍，距出口末端8.5cm处烧制检测窗口，采用40毫摩尔每升的硼砂-氢氧化钠缓冲液，pH值为9.27，毛细管电泳采用静态压力进样，压力值为50mbar，柱温箱温度控制值为20℃，检测器选取二极管阵列检测器(DAD)，波长值为254纳米。

3.根据权利要求1所述的水产品中四种嘌呤物质的快速检测方法，其特征在于，步骤(3)中，混合酸为甲酸、三氟乙酸、超纯水的混合物，配比为5∶5∶1，配制混合酸25ml，取样品1g，置于超声波细胞粉碎机内，超声波变径杆末端直径6mm，超声功率760瓦，工作\间歇时间设定为3s\2s，粉碎处理18分钟。