CN108593807A - 一种基于高效液相色谱法检测海产品中嘌呤含量的方法 - Google Patents

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励建荣
任丽琨
王当丰
于海凤
宋敏杰
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Abstract

本发明提供一种基于高效液相色谱法检测海产品中嘌呤含量的方法，通过标准曲线的绘制及线性回归方程的计算得到嘌呤含量值。该方法快速、重现性好，操作简单，流动相配置简单，不需要进行调pH等繁琐的步骤，更重要的是，该方法精密度高，最低检出限为0.01mg/L，线性范围在0.1‑200mg/L之间，加标回收率在96％‑102％之间，可广泛应用于海产品嘌呤含量检测。

Description

一种基于高效液相色谱法检测海产品中嘌呤含量的方法
技术领域
本发明属于嘌呤分析检测技术领域，具体为一种旋转蒸发-高效液相色谱法联用对食品中嘌呤物质含量的检测方法。
背景技术
嘌呤是一种生物碱，在体内承担着重要的生理作用。人体内的嘌呤主要来自于核酸的氧化分解，其约占总嘌呤的80％，被称为内源性嘌呤。外源性嘌呤占20％，主要来源于食物摄取。嘌呤在人体内代谢的终产物为尿酸，正常男性尿酸值低于0.45mmol/L，女性则不超过0.357mmol/L。当人体嘌呤代谢紊乱或尿酸排泄受阻时会引起高尿酸血症继而诱发痛风。研究表明，减少体内嘌呤含量可以有效降低尿酸含量，从而减少痛风发病率。因此，痛风病人在日常饮食中要了解食品的嘌呤含量，注意忌口。
根据食物中嘌呤含量可将其分为三类，低嘌呤食品(＜25mg/100g)、中等嘌呤食品(25～150mg/100g)和高嘌呤食品(150～1000mg/100g)。海产品虽富含人体必需微量元素，可降低心血管疾病风险，但其也是公认的高嘌呤食品之一，过量食用海产品会提高痛风发病率。目前海产品嘌呤分布数据并不完善，且现有的嘌呤检测方法(毛细管电泳法)重现性差，分离能力较弱，对pH要求较高。高效液相色谱法分辨率及灵敏度较高，重复性好，并可在短时间内精确地检测出嘌呤含量。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于高效液相色谱法检测海产品中嘌呤含量的方法，可以准确、高效的检测海产品中腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤含量。
本发明采用如下技术方案：
一种基于高效液相色谱法检测海产品中嘌呤含量的方法，包括以下步骤：
(1)样品前处理：将样品置于离心管中，加入混合酸对样品进行水解，将冷却后的水解液旋转蒸发至干，残余物用流动相复溶，复溶后的液体离心，之后取上清液过滤后备用；
(2)计算：取滤液，经高效液相色谱检测，以保留时间来识别目标嘌呤，将峰面积值代入线性回归方程中，得出嘌呤含量值。
其中，线性回归方程为：
其中，Y为峰面积，X为样品质量浓度。
进一步的，上述线性回归方程涉及的标准曲线绘制方法如下：
a.标准备液的制备：称取腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤，分别用超纯水定容，配置浓度为1200mg/L的单品标准贮备液，4℃保存；再配置300mg/L的混合标准贮备液，通过单品标准贮备液和混合标准贮备液高效液相色谱法保留时间的对应关系来识别出峰次序；
b.标准曲线的绘制：取等体积步骤a中制备的浓度为1200mg/L的单品标准贮备液，并用超纯水稀释配制成终浓度分别为200mg/L、100mg/L、50mg/L、10mg/L、5mg/L、1mg/L、0.5mg/L、0.1mg/L的混合标准品，经0.22μm微孔滤膜过滤后，使用高效液相色谱采集不同浓度四种嘌呤的保留时间及峰面积。以峰面积(Y)及样品质量浓度(X)作线性回归。
优选的，步骤a中，色谱柱选用Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6mm×250mm，5μm)，以水/冰乙酸/30％四丁基氢氧化铵(体积比997/1.5/1.5):甲醇＝99：1作为流动相，流速0.8mL/min，柱温25℃，检测波长254nm，进样量10μL。
优选的，步骤(1)中，称取0.2g样品加入混合酸100℃水浴10min后迅速冷却，冷却后75℃旋转蒸发至干，残余物用流动相复溶，将复溶后的液体以6000r/min的转速离心10min。
优选的，所述的混合酸由5mL三氟乙酸和5mL甲酸组成。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)节省时间，色谱分析一个样品需要10min，样品处理可在30min内完成。
(2)重复性好，对同一混标连续进样6次，得到其相对标准偏差均小于0.7％。
(3)操作简单，流动相配置简单，不需要进行调pH等繁琐的步骤。
(4)方法精密度好，最低检出限(limits of detection，LOD)为0.01mg/L。线性范围在0.1-200mg/L之间，加标回收率在96％-102％之间。
附图说明
图1混合标准贮备液高效液相色谱图；
图2大菱鲆鱼肉样品高效液相色谱图；
图3海鲈鱼内脏样品高效液相色谱图。
其中，①腺嘌呤、②鸟嘌呤、③次黄嘌呤、④黄嘌呤。
具体实施方式
下面通过具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从商业途径获得。高效液相色谱仪采用岛津高效液相色谱LC 2030
实施例1：标准曲线的绘制
(1)标准贮备液制备：准确称取0.012g腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤。分别用超纯水定容至10mL(超声助溶)，配置浓度为1200mg/L的单品标准贮备液，4℃冰箱保存。此外配置300mg/L的单品标准贮备液及混合标准贮备液，通过单品标准贮备液和混合标准贮备液高效液相色谱法保留时间的对应关系来识别出峰次序。设置色谱条件为色谱柱Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6mm×250mm，5μm)，流动相为水-冰乙酸-30％四丁基氢氧化铵(V/V/V＝997/1.5/1.5)：甲醇＝99：1，流速0.8mL/min，柱温25℃，检测波长254nm，进样量10μL。实验结果如图1所示。
(2)标准曲线的绘制：取等体积步骤(1)中制备的浓度为1200mg/L的单品标准贮备液，并用超纯水稀释配制成终浓度分别为200mg/L、100mg/L、50mg/L、10mg/L、5mg/L、1mg/L、0.5mg/L、0.1mg/L的混合标准品。经0.22μm微孔滤膜过滤后，使用高效液相色谱采集不同浓度四种嘌呤的保留时间及峰面积。以峰面积(Y)及样品质量浓度(X)作线性回归。见表1。
表1线性试验结果
对同一混合标准贮备液连续进样六次，其相对标准偏差均小于0.7％。
实施例2
大菱鲆鱼肉样品中四种嘌呤含量的测定
(1)样品前处理：称取0.2g绞碎的大菱鲆鱼肉置于50ml离心管中，加入由5mL三氟乙酸以及5mL甲酸组成的混合酸，100℃水浴10min，对样品进行水解。将冷却后的水解液75℃旋转蒸发至干，残余物用流动相复溶，将复溶后的液体以6000r/min的转速离心10min，之后取上清液过0.22μm滤器后备用。
(2)计算：取1.0ml滤液，经高效液相色谱检测，以保留时间来识别目标嘌呤，将峰面积值代入表1所示线性回归方程中，得出四种嘌呤含量值。结果见表2。
实施例3
海鲈鱼内脏样品中四中嘌呤含量的测定
(1)样品前处理：称取0.2g绞碎的海鲈鱼内脏置于50ml离心管中，加入由5mL三氟乙酸以及5mL甲酸组成的混合酸，100℃水浴10min，对样品进行水解。将冷却后的水解液75℃旋转蒸发至干，残余物用流动相复溶，将复溶后的液体以6000r/min的转速离心10min。之后取上清液过0.22μm滤器后备用。
(2)计算：取1.0ml滤液，经高效液相色谱，以保留时间来识别目标嘌呤，将峰面积值代入线性回归方程中，得出四种嘌呤含量值。结果见表2。
表2样品中四种嘌呤的含量(mg/kg)
以上所述，仅为本发明创造较佳的具体实施方式，但本发明创造的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明创造披露的技术范围内，根据本发明创造的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明创造的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种基于高效液相色谱法检测海产品中嘌呤含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)样品前处理：将样品置于离心管中，加入混合酸对样品进行水解，将冷却后的水解液旋转蒸发至干，残余物用流动相复溶，复溶后的液体离心，之后取上清液过滤后备用；
(2)计算：取滤液，经高效液相色谱检测，以保留时间来识别目标嘌呤，将峰面积值代入线性回归方程中，得出嘌呤含量值。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，线性回归方程为：
其中，Y为峰面积，X为样品质量浓度。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，线性回归方程涉及的标准曲线绘制方法如下：
a.标准备液的制备：称取腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤，分别用超纯水定容，配置浓度为1200mg/L的单品标准贮备液，4℃保存；再配置300mg/L的混合标准贮备液，通过单品标准贮备液和混合标准贮备液高效液相色谱法保留时间的对应关系来识别出峰次序；
b.标准曲线的绘制：取等体积步骤a中制备的浓度为1200mg/L的单品标准贮备液，并用超纯水稀释配制成终浓度分别为200mg/L、100mg/L、50mg/L、10mg/L、5mg/L、1mg/L、0.5mg/L、0.1mg/L的混合标准品，经0.22μm微孔滤膜过滤后，使用高效液相色谱采集不同浓度四种嘌呤的保留时间及峰面积，以峰面积及样品质量浓度作线性回归。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤a中，色谱柱选用Agilent ZORBAXEclipse XDB-C18(4.6mm×250mm，5μm)，以水/冰乙酸/30％四丁基氢氧化铵(体积比997/1.5/1.5):甲醇＝99：1作为流动相，流速0.8mL/min，柱温25℃，检测波长254nm，进样量10μL。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，称取0.2g样品加入混合酸100℃水浴10min后迅速冷却，冷却后75℃旋转蒸发至干，残余物用流动相复溶，将复溶后的液体以6000r/min的转速离心10min。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述的混合酸由5mL三氟乙酸和5mL甲酸组成。
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