CN106226414A - 利用hplc法测定婴幼儿配方奶粉中核苷酸的方法 - Google Patents

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Abstract

一种利用HPLC法测定婴幼儿配方奶粉中核苷酸的方法，其步骤如下：一、准确称取配方奶粉样品5.0g，加入25ml、50～60℃水溶解转移至50ml容量瓶中进行超声提取；二、向容量瓶中加入5ml质量浓度为13％的高氯酸，定容至刻度；滤纸过滤，取25ml初滤液用氢氧化钠调节pH至6.75～6.85，定容至50ml容量瓶，滤纸过滤，微孔滤膜过滤；三、在254nm检测波长下，采用Welch NCOT‑C18色谱柱，以四丁基硫酸氢铵‑磷酸盐缓冲溶液和甲醇作为流动相，对步骤二的滤液进行洗脱。本方法可以使五种核苷酸及其它杂质得以有效的分离检测，总体添加回收率在96～105％之间，重复性条件下精密度为0.95～3.33％，线性相关性良好，检出限、定量限低，具有较高的准确性、精密性及可靠性且方法灵敏度较高。

Description

利用HPLC法测定婴幼儿配方奶粉中核苷酸的方法
技术领域
本发明属于食品检测技术领域，涉及一种婴幼儿配方奶粉中五种核苷酸的检测方法。
背景技术
核苷酸(Nucleotides，简称NTs)是组成核酸大分子的基本结构单位，是代谢上极为重要的生命物质，它是脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的前体以及它们的分解产物，几乎参与细胞代谢的所有过程。将核苷酸添加到乳代品中，对婴儿特别是新生儿免疫调节功能、提高记忆力、改善肠道菌群及促进脂质代谢等方面都发挥重要作用，因此国内外乳品企业已广泛的把核苷酸(NTs)，作为食品添加剂应用于婴幼儿奶粉中。
目前国内外关于核苷酸的检测方法主要包括离子色谱法、高效液相色谱-质谱法、高效液相色谱法等，其中：离子色谱法操作简便，准确度高，受其他因素干扰小，但试剂对去离子水要求极高，流动相种类也很少，且色谱柱通透性较差，重现性较差，检测成本高，难以广泛推广使用；高效液相色谱-质谱法的操作较为复杂、成本高、局限性较大，制约了其广泛应用；高效液相色谱法更具有发展空间，然而高效液相色谱法由于核苷酸带负电荷的磷酸基团的存在，至使分辨率不足，核苷酸极性很大，预在普通C18柱上得到很好保留和分离较难，很难将腺嘌呤核苷和次黄嘌呤核苷完整分离，所以该方法仍需进一步研究考证。
发明内容
本发明的目的是提供一种简便、高率、经济和适用的利用HPLC法测定婴幼儿配方奶粉中核苷酸的方法，该方法可以检测分离五种核苷酸(NTs)及其它杂质，能够有效分离各物质，以满足实际工作的需要。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种利用HPLC法测定婴幼儿配方奶粉中核苷酸的方法，包括如下步骤：
一、准确称取配方奶粉样品5.0g，加入25ml、50～60℃水溶解转移至50ml容量瓶中进行超声提取。
本步骤中，所述超声提取时间为5～20min，优选为10min。
二、向步骤一的容量瓶中加入5ml质量浓度为13％的高氯酸，定容至刻度；滤纸过滤，取25ml初滤液用氢氧化钠调节pH至6.75～6.85，定容至50ml容量瓶，滤纸过滤，0.22μm微孔滤膜过滤。
三、在254nm检测波长下，采用Welch NCOT-C18色谱柱，以四丁基硫酸氢铵-磷酸盐缓冲溶液和甲醇作为流动相，对步骤二的滤液进行洗脱。
本步骤中，所述流动相中，四丁基硫酸氢铵-磷酸盐缓冲溶液和甲醇的体积比为90～97∶3～10，优选95∶5。
本步骤中，所述流动相的pH＝3.0～3.5，优选pH＝3.3。
本步骤中，所述四丁基硫酸氢铵-磷酸盐缓冲溶液中，四丁基硫酸氢铵的浓度为1.4mmol/L。
本发明具有如下有益效果：
1、最终确定最佳样品前处理方法为：超声提取时间为10min，经13％高氯酸溶液去除蛋白处理后，在254nm检测波长下，采用WelchNCOT-C18(300×4.6mm，5μm)色谱柱，并采用1.4mmol/L四丁基硫酸氢铵磷酸盐缓冲溶液(pH3.3)和体积分数为5％的甲醇作为流动相进行等度洗脱等条件下可以使五种核苷酸(胞嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸、鸟嘌呤核苷酸、次黄嘌呤核苷酸和腺嘌呤核苷酸)及其它杂质得以有效的分离检测。
2、通过方法学验证(准确度、精密度、线性范围、检出限、定量限、不确定度研究)来考察方法的可行性。结果表明本方法的总体添加回收率结果在96～105％之间，重复性条件下精密度为0.95～3.33％，线性相关性良好，检出限、定量限低，具有较高的准确性、精密性及可靠性且方法灵敏度较高。
附图说明
图1为离子对为四丁基磷酸氢铵的标准品色谱图；
图2为离子对为四丁基溴化铵的标准品色谱图；
图3为离子对为四丁基硫酸氢铵的标准品色谱图；
图4为色谱柱为Welch NCOT-C18的标准品色谱图；
图5为流动相比例为磷酸盐∶甲醇＝90∶10的标准品色谱图；
图6为流动相比例为磷酸盐∶甲醇＝90∶10的样品色谱图；
图7为流动相比例为磷酸盐∶甲醇＝93∶7的标准品色谱图；
图8为流动相比例为磷酸盐∶甲醇＝93∶7的样品色谱图；
图9为流动相比例为磷酸盐∶甲醇＝95∶5的标准品色谱图；
图10为流动相比例为磷酸盐∶甲醇＝95∶5的样品色谱图；
图11为流动相pH值为3.0的标准品色谱图；
图12为流动相pH值为3.3的标准品色谱图；
图13为流动相pH值为3.5的标准品色谱图；
图14为调节pH处理样品的色谱图；
图15为冰乙酸处理样品的色谱图；
图16为高氯酸处理样品的色谱图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
本发明通过对色谱条件(检测波长、色谱柱、离子对试剂、流动相比例及pH值)和样品前处理(样品提取时间、蛋白沉淀剂种类)两方面进行多次试验尝试筛选，获得了一种适用于五种游离核苷酸的分离检测方法。具体内容如下：
一、试剂和仪器
甲醇(CH3OH)，磷酸二氢钾(KH2PO4)，磷酸氢二钾(K2HPO4)，冰乙酸(CH3COOH)，高氯酸(HClO4)，盐酸(HCl)，氢氧化钠(NaOH)，四丁基硫酸氢铵(C16H37NO4S)，四丁基溴化铵(C16H36BrN)，四丁基磷酸氢铵(C16H36NH2O4P)，腺嘌呤核苷一磷酸(AMP)标准物质，胞嘧啶核苷一磷酸(CMP)标准物质，鸟嘌呤核苷一磷酸(GMP)标准物质，尿嘧啶核苷一磷酸(UMP)标准物质，次黄嘌呤核苷一磷酸(IMP)标准物质；梅特勒ME204，德国BANDELIM RK1028H超声波振荡器，北京赛多利PB-10PH计，德国MILLIPORE Milli-Q纯水仪，美国Waters e2695高效液相色谱仪配2489UV紫外检测器，Waters Symmetry C18(250×4.6mm，5μm)WelchNCOT-C18(300×4.6mm，5μm)。
二、样品前处理条件
试验选取一段、二段、三段三种类型的配方粉为测试样品。准确称取三种类型样品5.0g(精确至0.1mg)三份，加入25ml、50～60℃水溶解转移至50ml容量瓶中，超声提取。
三、色谱条件-标准品为基础
实施例1：离子对试剂
检测条件：
仪器：Waters高效液相色谱仪，Waters UV紫外检测器，检测波长：254nm；
色谱柱：Waters Symmetry C18(250×4.6mm，5μm)；
流动相比例：磷酸盐缓冲液∶甲醇＝1000∶10；
流动相pH值：3.0；
流速：1mL/min；
进样量：10μL；
柱温：35±1℃。
离子对试剂：四丁基硫酸氢铵、四丁基溴化铵、四丁基磷酸氢铵。
结果见图1～3。从图分离情况看出，使用四丁基磷酸铵离子对试剂时，在色谱柱上的保留时间时间最短，且峰型差，基线不平；使用四丁基溴化铵时，最后一个峰AMP的保留时间延长至14min，但色谱峰与杂质峰不能很好地分离开来；只有使用四丁基硫酸氢铵，5个组分峰能完全分离，峰型对称，基线平稳，如图3所示，但其中IMP与AMP峰没有完全分离，这可通过改变其它条件进一步优化，所以确定使用四丁基硫酸氢铵。
实施例2：色谱柱
检测条件：
仪器：Waters高效液相色谱仪，Waters UV紫外检测器，检测波长：254nm；
色谱柱：Welch NCOT-C18(300×4.6mm，5μm)；
流动相比例：磷酸盐缓冲液∶甲醇＝1000∶10；
流动相pH值：3.0；
流速：1mL/min；
进样量：10μL；
柱温：35±1℃。
结果见图4，通过使用Welch NCOT-C18色谱柱所检测到的色谱峰表明，5种色谱峰的峰型、柱效都有明显改善，增强了疏水性较弱的CMP与固定相的作用力，避免了复杂基质的干扰，5种NTs在该色谱柱都得到良好的保留，因此选择Welch NCOT-C18(300×4.6mm，5μm)色谱柱。
实施例3：流动相比例
检测条件：
仪器：Waters高效液相色谱仪，Waters UV紫外检测器，检测波长：254nm；
色谱柱：Welch NCOT-C18(300×4.6mm，5μm)；
流动相比例：磷酸盐缓冲液∶甲醇＝90∶10、95∶5、97∶3；
流动相pH值：3.0；
流速：1mL/min；
进样量：10μL；
柱温：35±1℃。
结果见图5～10，当加入甲醇的体积分数为10％时，色谱峰保留时间最短，17min左右色谱峰全部出峰，但样品峰之间无法完全分离，其中UMP色谱峰丢失；当加入甲醇的体积分数为7％时，标准品可完整分离，但样品CMP色谱峰与前方杂质峰重叠；当加入甲醇的体积分数为5％时，样品峰与标准品峰分离情况均良好。最终确定选择流动相的比例为：磷酸盐缓冲溶液∶甲醇＝95∶5。
实施例4：流动相pH
检测条件：
仪器：Waters高效液相色谱仪，Waters UV紫外检测器，检测波长：254nm；
色谱柱：Welch NCOT-C18(300×4.6mm，5μm)；
流动相比例：磷酸盐缓冲液∶甲醇＝95∶5；
流动相pH值：3.0；3.3；3.5；
流速：1mL/min；
进样量：10μL；
柱温：35±1℃。
结果见图11～13，从图的分离情况看出，pH为3.0～3.5之间的流动相中5种游离NTs以及杂质峰在色谱柱上均能得到较好的分离，保留时间随流动相pH的降低而保留时间缩短，综合色谱峰的分离情况考虑，最终确定最佳流动相pH值为3.3，色谱峰分离效果好且检测时间可以控制在30min之内。
实施例5：沉淀剂的选择
检测条件：
仪器：Waters高效液相色谱仪，Waters UV紫外检测器，检测波长：254nm；
色谱柱：Welch NCOT-C18(300×4.6mm，5μm)；
流动相比例：磷酸盐缓冲液∶甲醇＝95∶5；
流动相pH值：3.3；
流速：1mL/min；
进样量：10μL；
柱温：35±1℃。
(1)冰乙酸沉淀：向容量瓶中加入5.0ml质量分数为10％冰乙酸，定容至刻度，滤纸过滤，0.22μm微孔滤膜过滤。
(2)高氯酸沉淀：向容量瓶中加入5.0ml质量分数为13％高氯酸，定容至刻度；滤纸过滤，取25ml初滤液用氢氧化钠调节pH至6.75～6.85，定容至50ml容量瓶，滤纸过滤，0.22μm微孔滤膜过滤。
(3)调pH来沉淀：将充分溶解的样品溶液用5.0mol/L和0.1mol/L盐酸溶液先调节pH值调至1.7，静止1min，用5.0mol/L和0.1mol/L氢氧化钠调pH到4.50～4.60，转入50ml容量瓶中并定容，滤纸过滤，0.22μm微孔滤膜过滤。
结果见图14～16，由图的分离情况看出，样品在6min左右时，杂质峰较多，高氯酸去杂质的能力最强，在CMP后有一较大杂质峰，而冰乙酸和调节pH法都无法将该种杂质峰分离开来，造成结果的假阳性。对上述沉淀方法进行了比较，最后采用13％高氯酸作为沉淀剂处理样品。
实施例6：超声时间的选择
检测条件：
仪器：Waters高效液相色谱仪，Waters UV紫外检测器，检测波长：254nm；
色谱柱：Welch NCOT-C18(300×4.6mm，5μm)；
流动相比例：磷酸盐缓冲液∶甲醇＝95∶5；
流动相pH值：3.3；
流速：1mL/min；
进样量：10μL；
柱温：35±1℃。
对实施例5中超声提取部分分别设定0min、5min、10min、15min、20min的提取时间，将上述处理后的样品进行上机测定。进行游离NTs含量测定比较试验，以NTs总含量为提取目标，研究超声时间的变化对提取量的影响。
表1不同超声时间对总含量的影响
注：同行数据后字母标记不同表示差异显著，检测误差为0.05水平。
由表1可以看出，随着超声时间的增加，目标物色谱峰响应值有明显影响，在所考察范围内，当超声时间在0～15min时，CMP含量和总含量值均显著增大(p＜0.05)，CMP值的变化较其它四组变化幅度大，NTs的总含量随超声时间的增长呈明显的上升趋势，随着超声时间的增加，NTs提取率增大，当超声作用时间为10min时，NTs提取率达到最大值21.23mg/100g。超声作用时间继续增加时，NTs提取率开始略微下降。下降的原因可能是超声时间的延长增加了超声作用强度，从而破坏了NTs结构。因此，综合考虑，选择10min作为奶粉中核苷酸的超声最佳提取时间。

Claims (9)

1.一种利用HPLC法测定婴幼儿配方奶粉中核苷酸的方法，其特征在于所述方法步骤如下：
一、准确称取配方奶粉样品5.0g，加入25ml、50～60℃水溶解转移至50ml容量瓶中进行超声提取；
二、向步骤一的容量瓶中加入5ml质量浓度为13％的高氯酸，定容至刻度；滤纸过滤，取25ml初滤液用氢氧化钠调节pH至6.75～6.85，定容至50ml容量瓶，滤纸过滤，微孔滤膜过滤；
三、在254nm检测波长下，采用Welch NCOT-C18色谱柱，以四丁基硫酸氢铵-磷酸盐缓冲溶液和甲醇作为流动相，对步骤二的滤液进行洗脱。
2.根据权利要求1所述的利用HPLC法测定婴幼儿配方奶粉中核苷酸的方法，其特征在于所述超声提取时间为5～20min。
3.根据权利要求1所述的利用HPLC法测定婴幼儿配方奶粉中核苷酸的方法，其特征在于所述超声提取时间为10min。
4.根据权利要求1所述的利用HPLC法测定婴幼儿配方奶粉中核苷酸的方法，其特征在于所述微孔滤膜的孔径为0.22μm。
5.根据权利要求1所述的利用HPLC法测定婴幼儿配方奶粉中核苷酸的方法，其特征在于所述流动相中，四丁基硫酸氢铵-磷酸盐缓冲溶液和甲醇的体积比为90～97∶3～10。
6.根据权利要求1所述的利用HPLC法测定婴幼儿配方奶粉中核苷酸的方法，其特征在于所述流动相中，四丁基硫酸氢铵-磷酸盐缓冲溶液和甲醇的体积比为95∶5。
7.根据权利要求1、5或6所述的利用HPLC法测定婴幼儿配方奶粉中核苷酸的方法，其特征在于所述流动相的pH＝3.0～3.5。
8.根据权利要求1、5或6所述的利用HPLC法测定婴幼儿配方奶粉中核苷酸的方法，其特征在于所述流动相的pH＝3.3。
9.根据权利要求1、5或6所述的利用HPLC法测定婴幼儿配方奶粉中核苷酸的方法，其特征在于所述四丁基硫酸氢铵-磷酸盐缓冲 溶液中，四丁基硫酸氢铵的浓度为1.4mmol/L。
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