CN104122344B - 肉种鸽组织及血清中谷氨酰胺含量的测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了肉种鸽组织及血清中谷氨酰胺含量的测定方法，方法：色谱仪为岛津LC-20AT高效液相色谱仪，固定相反相C18柱（SHIMADZU？？VP-ODS？5um？150*4.6mm），流动相A液为50mmol/L乙酸钠溶液（PH=6.50）：乙腈=97：3，流动相B液为乙腈：水=2:1，柱温40℃，检测波长254nm，洗脱时间24min，流速1ml/min，进样量5μl，结果：谷氨酰胺(Gln)的保留时间为10.144min，检出限为0.19mg/L（S/N=2），定量限为0.95mg/L（S/N=10）线性范围172.3～689.5mg/L，R2=0.9995，日间精密度RSD值均不大于2.34%。结论:通过对肉鸽不同组织及血液进行合理处理，用高效液相色谱仪能够快速、准确测定肉鸽血液、肌肉及十二指肠的谷氨酰胺(Gln)含量，为基础研究和临床应用研究提供有效的技术和数据支持。

Description

肉种鸽组织及血清中谷氨酰胺含量的测定方法
技术领域
本发明涉及一种测定肉鸽组织及血清中谷氨酰胺含量的方法，属于色谱分析技术领域。
背景技术
骨骼肌中含有谷氨酰胺合成酶，该酶位于细胞质中，它催化谷氨酸和氨合成谷氨酰胺(Gln)，骨骼肌是谷氨酰胺(Gln)合成的主要组织，十二指肠是利用谷氨酰胺(Gln)主要器官，谷氨酰胺(Gln)在血液循环和体内游离氨基酸含量最高。谷氨酰胺（Gln）是5碳氨基酸，含有两个氨基(α-氨基和酰胺基)。在生理pH条件下，谷氨酰胺（Gln）羧基带负电荷，氨基带正电荷，分子净电荷为零，属于中性氨基酸。由于它含两个氨基特性，决定了它在器官之间氮的运输和作为氨载体的重要性，循环中30%～35%的氨基酸转运依靠谷氨酰胺（Gln）完成，故Gln被称之为氮梭(nitrogenshuttle)。同时其碳源作为能量，每克分子谷氨酰胺完全氧化可产生30mol/L分子的ATP。谷氨酰胺（Gln）是肠粘膜细胞、淋巴细胞、成纤维细胞的主要能源。肉鸽作为特禽，生产有其特性，成年种鸽产蛋后孵化和哺喂出生乳鸽到22日龄，体内营养代谢水平很高，血液中的谷氨酰胺（Gln）可维持鸽体高水平的生长激素，保持种鸽持续的生产能力；十二指肠中谷氨酰胺（Gln）可维持粘膜的正常形态，提高肠粘膜的营养物质的吸收；骨骼肌中谷氨酰胺（Gln）含量提高，可缩种鸽短产蛋间隔，提高年产蛋量。
至今尚未发现专门针对肉鸽组织及血液中谷氨酰胺含量的测定方法，亟需建立一套适用性强、效率高而且精确的测定方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种测定肉鸽组织及血液中谷氨酰胺含量的方法，通过对肉鸽不同组织及血液进行合理处理，用高效液相色谱仪能够快速、准确测定肉鸽血液、肌肉及十二指肠的谷氨酰胺(Gln)含量，为基础研究和临床应用研究提供有效的技术数据支持。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：肉种鸽组织及血清中谷氨酰胺含量的测定方法，包括以下步骤：
（1）衍生化试剂的配制：分别配制100mM的异硫氰酸苯酯和1M的三乙胺备用；
（2）色谱柱的制备：色谱仪为岛津LC-20AT高效液相色谱仪，固定相反相C18柱（SHIMADZUVP-ODS5um150*4.6mm），流动相A液为50mmol/L乙酸钠溶液（PH=6.50）：乙腈=97：3，流动相B液为乙腈：水=2:1；
（3）标准液的制备：取10ml谷氨酰胺(Gln)加入到25ml容量瓶，用纯水溶解定溶，放入4℃冰箱保存，并逐级稀释至3/4、1/2的浓度，2倍浓度现配现用；
（4）标准液的测定和标准液测定结果处理：将步骤（3）中标准液300μl加入1.5ml离心管中，然后加入步骤（1）中的150μl异硫氰酸苯酯和150μl三乙胺，混合室温反应一小时，加600μl正己烷萃取杂质，15000pm/min离心5min取下层清液，用步骤（2）的色谱柱进行测定，柱温40℃，检测波长254nm，洗脱时间24min，流速1ml/min，进样量5μl；制定标准曲线和标准品色谱图；
（5）取样：分别从乳鸽血液、胸部肌肉和十二指肠中取样，具体来讲，血液中谷氨酰胺取样步骤：乳鸽静脉采血2ml加入到含肝素的离心管，在转速2800pm/min温度4℃下离心10min，取0.4ml血液注入到20mgSSA（5-磺基水杨酸）样品管中，涡旋混合后，迅速在液氮中冷却，然后在-80℃保存；
胸部肌肉中谷氨酰胺取样步骤：乳鸽16d颈静脉放血后，腹部毛清理干净，剥离腹部皮肤，采集胸部肌肉，用剪刀剪成0.5mm块，放入EP管中，迅速在液氮中冷却，然后在-80℃保存待测；
十二指肠中谷氨酰胺(Gln)取样步骤：打开乳鸽腹腔，取出十二指肠，放于平皿中，剖开十二指肠，露出肠粘膜，除去上层肠内容物，用手术刀片刮取肠粘膜层，放入EP管中，迅速在液氮中冷却，然后在-80℃保存待测
（6）试验样品的处理：血液样品的处理：将SSA血液样品从-80℃取出并在室温下解冻后，在3000g（5790RPM）4℃条件下离心15min，以去除蛋白沉淀，上清液转入样品管后置于样品架于4℃保存备用；肌肉和十二指肠粘膜组织样品的处理：肌肉、十二指肠粘膜组织样品在-80℃取出，称取样品0.2g，用0.2mlPBS（磷酸盐缓冲液）作稀释液，匀浆器中研磨，用1.0ml0.66M冰冻后的高氯酸进行匀浆200s，匀浆后的样品于4℃、RCF为3000g离心5min，取0.8ml上清液用0.4ml0.66M磷酸钾中和，形成的高氯酸钾沉淀离心除去（4℃RCF为3000g离心5min）离心后的上清液在-20℃保存备用。
（7）试验样品的衍生反应和测定：分别取步骤（6）处理过的三类样品各300μl放入三个对应的1.5ml离心管中，然后分别加入步骤（1）中的150μl异硫氰酸苯酯和150μl三乙胺，混合室温反应一小时，加600μl正己烷萃取杂质，15000pm/min离心5min取下层清液，用步骤（2）的色谱柱进行测定，柱温40℃，检测波长254nm，洗脱时间24min，流速1ml/min，进样量5μl；
（8）试验结果的处理：分别对血液样品、肌肉和十二指肠粘膜组织样品制定谷氨酰胺曲线色谱图并得出结论。
作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤（1）中衍生化试剂的配制方法为：精确吸取1220μl异硫氰酸苯酯于100ml容量瓶中，用乙腈溶解进行定容，得到所述100mM异硫氰酸苯酯；精确吸取14.00ml三乙胺加入100ml容量瓶中，加乙腈溶解并定容，得到所述1M三乙胺。
作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤（2）中流动相的配制方法为：将500毫升超纯水和3.4g无水乙酸钠用12%乙酸调节PH在6.50，与15ml乙腈混合，超声脱气后备用得到流动相A液；将40ml乙腈加10ml超纯水混合脱气备用得到流动相B液。
作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤（4）和步骤（7）中均采用梯度洗脱，流速为1ml/min，流动相A液起始柱压为4.1MPA，测完用流动相B液小流速洗柱10min以上。
作为本发明的一种优选技术方案，所述梯度洗脱时间依次选取0.01min、14min、14.01min、18min、18.01min和24min，梯度浓度依次为0、25、100、100、0。
作为本发明的一种优选技术方案，所述含20mgSSA（5-磺基水杨酸）样品管的制备方法为：200g/LSSA溶液（称取一定数量SSA，用无水乙醇溶解后，配置成所要求的浓度），将上述SSA溶液取0.1ml置于1.0ml离心管内，在50℃下蒸干乙醇后盖好于室温下保存。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：通过对肉鸽不同组织及血液进行合理处理，科学选用衍生化试剂和色谱条件，用高效液相色谱仪能够快速、准确测定肉鸽血液、肌肉及十二指肠的谷氨酰胺(Gln)含量，为基础研究和临床应用研究提供有效的技术数据支持。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明的梯度程序图。
图2是本发明谷氨酰胺标准液的标准曲线图。
图3是本发明谷氨酰胺标准液的曲线色谱图。
图4是本发明鸽血液样品中谷氨酰胺的曲线色谱图。
图5是本发明鸽肌肉样品中谷氨酰胺的曲线色谱图。
图6是本发明鸽十二指肠样品中谷氨酰胺的曲线色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。
一种测定肉鸽组织及血液中谷氨酰胺含量的方法，包括以下步骤：
（1）衍生化试剂的配制：分别配制100mM的异硫氰酸苯酯和1M的三乙胺备用；
（2）色谱柱的制备：色谱仪为岛津LC-20AT高效液相色谱仪，固定相反相C18柱（SHIMADZUVP-ODS5um150*4.6mm），流动相A液为50mmol/L乙酸钠溶液（PH=6.50）：乙腈=97：3，流动相B液为乙腈：水=2:1；
（3）标准液的制备：取10ml谷氨酰胺(Gln)加入到25ml容量瓶，用纯水溶解定溶，放入4℃冰箱保存，并逐级稀释至3/4、1/2的浓度，2倍浓度现配现用；
（4）标准液的测定和标准液测定结果处理：将步骤（3）中标准液300μl加入1.5ml离心管中，然后加入步骤（1）中的150μl异硫氰酸苯酯和150μl三乙胺，混合室温反应一小时，加600μl正己烷萃取杂质，15000pm/min离心5min取下层清液，用步骤（2）的色谱柱进行测定，柱温40℃，检测波长254nm，洗脱时间24min，流速1ml/min，进样量5μl；制定标准曲线和标准品色谱图；
相关数据如下：
5ul下的AREA 浓度（mg/ml）
1904902 0.16548
3802308 0.33096
5934080 0.49644
7905935 0.66
R2=0.9995
结果：谷氨酰胺(Gln)的保留时间为10.144min，检出限为0.19mg/L（S/N=2）。线性范围172.3～689.5mg/L，R2=0.9995，日间精密度RSD值均不大于2.34%。
（5）取样：分别从乳鸽血液、胸部肌肉和十二指肠中取样，具体来讲，血液中谷氨酰胺取样步骤：乳鸽静脉采血2ml加入到含肝素的离心管，在转速2800pm/min温度4℃下离心10min，取0.4ml血液注入到20mgSSA（5-磺基水杨酸）样品管中，涡旋混合后，迅速在液氮中冷却，然后在-80℃保存；
胸部肌肉中谷氨酰胺取样步骤：乳鸽16d颈静脉放血后，腹部毛清理干净，剥离腹部皮肤，采集胸部肌肉，用剪刀剪成0.5mm块，放入EP管中，迅速在液氮中冷却，然后在-80℃保存待测；
十二指肠中谷氨酰胺(Gln)取样步骤：打开乳鸽腹腔，取出十二指肠，放于平皿中，剖开十二指肠，露出肠粘膜，除去上层肠内容物，用手术刀片刮取肠粘膜层，放入EP管中，迅速在液氮中冷却，然后在-80℃保存待测
（6）试验样品的处理：血液样品的处理：将SSA血液样品从-80℃取出并在室温下解冻后，在3000g（5790RPM）4℃条件下离心15min，以去除蛋白沉淀，上清液转入样品管后置于样品架于4℃保存备用；肌肉和十二指肠粘膜组织样品的处理：肌肉、十二指肠粘膜组织样品在-80℃取出，称取样品0.2g，用0.2mlPBS（磷酸盐缓冲液）作稀释液，匀浆器中研磨，用1.0ml0.66M冰冻后的高氯酸进行匀浆200s，匀浆后的样品于4℃、RCF为3000g离心5min，取0.8ml上清液用0.4ml0.66M磷酸钾中和，形成的高氯酸钾沉淀离心除去（4℃RCF为3000g离心5min）离心后的上清液在-20℃保存备用。
（7）试验样品的衍生反应和测定：分别取步骤（6）处理过的三类样品各300μl放入三个对应的1.5ml离心管中，然后分别加入步骤（1）中的150μl异硫氰酸苯酯和150μl三乙胺，混合室温反应一小时，加600μl正己烷萃取杂质，15000pm/min离心5min取下层清液，用步骤（2）的色谱柱进行测定，柱温40℃，检测波长254nm，洗脱时间24min，流速1ml/min，进样量5μl；血液样品、肌肉样品和十二指肠样品的保留时间分别为10.405min、10.285min和10292min；
（8）试验结果的处理：分别对血液样品、肌肉和十二指肠粘膜组织样品制定谷氨酰胺曲线色谱图并得出结论。
所述步骤（1）中衍生化试剂的配制方法为：精确吸取1220μl异硫氰酸苯酯于100ml容量瓶中，用乙腈溶解进行定容，得到所述100mM异硫氰酸苯酯；精确吸取14.00ml三乙胺加入100ml容量瓶中，加乙腈溶解并定容，得到所述1M三乙胺。
所述步骤（2）中流动相的配制方法为：将500毫升超纯水和3.4g无水乙酸钠用12%乙酸调节PH在6.50，与15ml乙腈混合，超声脱气后备用得到流动相A液；将40ml乙腈加10ml超纯水混合脱气备用得到流动相B液。
所述步骤（4）和步骤（7）中均采用梯度洗脱，流速为1ml/min，流动相A液起始柱压为4.1MPA，测完用流动相B液小流速洗柱10min以上。
所述梯度洗脱时间依次选取0.01min、14min、14.01min、18min、18.01min和24min，梯度浓度依次为0、25、100、100、0。
所述含20mgSSA（5-磺基水杨酸）样品管的制备方法为：200g/LSSA溶液（称取一定数量SSA，用无水乙醇溶解后，配置成所要求的浓度），将上述SSA溶液取0.1ml置于1.0ml离心管内，在50℃下蒸干乙醇后盖好于室温下保存。
结论：
用岛津LC-20AT高效液相色谱仪，固定相反相C18柱（SHIMADZUVP-ODS5um150*4.6mm），流动相A液为50mmol/L乙酸钠溶液（PH=6.50）：乙腈=97：3，流动相B液为乙腈：水=2:1，柱温40℃，检测波长254nm，洗脱时间24min，流速1ml/min，进样量5μl，结果：谷氨酰胺(Gln)的保留时间为10.144min，检出限为0.19mg/L（S/N=2），定量限为0.95mg/L（S/N=10）线性范围172.3～689.5mg/L，R2=0.9995，日间精密度RSD值均不大于2.34%，用高效液相色谱仪可以快速、灵敏测定肉鸽血液、肌肉及小肠的谷氨酰胺(Gln)含量。
测定中，鸽小肠谷氨酰胺(Gln)保留时间为10.292min，鸽肌肉谷氨酰胺(Gln)保留时间为10.285min。鸽血清中保留时间为10.405min，与标准品保留时间相符，试验结果可靠、有效。
本发明对样品处理的创新点如下：
1、鸽血清加入SSA，处理后，在3000g（5790RPM）4℃离心15min，可以去除蛋白沉淀，减少血清中杂蛋白的干扰。同时，测定的峰值正确。
2、肌肉、十二指肠粘膜组织样品在-80℃取出，称取样品0.2g，用0.2mlPBS作稀释液，匀浆器中研磨，用1.0ml0.66M冰冻后的高氯酸进行匀浆200s，匀浆样于4℃RCF为3000g离心5min，取0.8ml上清液用0.4ml0.66M磷酸钾中和。形成的高氯酸钾沉淀离心除去（4℃RCF为3000g离心5min）离心后的上清液，测定峰值正确。
上述描述仅作为本发明可实施的技术方案提出，不作为对其技术方案本身的单一限制条件。

Claims (6)

1.肉种鸽组织及血清中谷氨酰胺含量的测定方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）衍生化试剂的配制：分别配制100mM的异硫氰酸苯酯和1M的三乙胺备用；
（2）色谱柱的制备：色谱仪为岛津LC-20AT高效液相色谱仪，固定相反相C18柱，流动相A液为50mmol/L乙酸钠溶液：乙腈=97：3，流动相B液为乙腈：水=2:1；
（3）标准液的制备：取10ml谷氨酰胺(Gln)加入到25ml容量瓶，用纯水溶解定溶，放入4℃冰箱保存，并逐级稀释至3/4、1/2的浓度，2倍浓度现配现用；
（4）标准液的测定和标准液测定结果处理：将步骤（3）中标准液300μl加入1.5ml离心管中，然后加入步骤（1）中的150μl异硫氰酸苯酯和150μl三乙胺，混合室温反应一小时，加600μl正己烷萃取杂质，15000pm/min离心5min取下层清液，用步骤（2）的色谱柱进行测定，柱温40℃，检测波长254nm，洗脱时间24min，流速1ml/min，进样量5μl；制定标准曲线和标准品色谱图；
（5）取样：分别从乳鸽血液、胸部肌肉和十二指肠中取样，具体来讲，血液中谷氨酰胺取样步骤：将乳鸽静脉血2ml加入到含肝素的离心管，在转速2800pm/min温度4℃下离心10min，取0.4ml血液注入到20mgSSA（5-磺基水杨酸）样品管中，涡旋混合后，迅速在液氮中冷却，然后在-80℃保存；
胸部肌肉中谷氨酰胺取样步骤：将乳鸽的胸部肌肉用剪刀剪成0.5mm块，放入EP管中，迅速在液氮中冷却，然后在-80℃保存待测；
十二指肠中谷氨酰胺(Gln)取样步骤：将乳鸽十二指肠的肠粘膜层放入EP管中，迅速在液氮中冷却，然后在-80℃保存待测；
（6）试验样品的处理：血液样品的处理：将SSA血液样品从-80℃取出并在室温下解冻后，在3000g、4℃条件下离心15min，以去除蛋白沉淀，上清液转入样品管后置于样品架于4℃保存备用；肌肉和十二指肠粘膜组织样品的处理：肌肉、十二指肠粘膜组织样品在-80℃取出，称取样品0.2g，用0.2mlPBS（磷酸盐缓冲液）作稀释液，匀浆器中研磨，用1.0ml0.66M冰冻后的高氯酸进行匀浆200s，匀浆后的样品于4℃、RCF为3000g离心5min，取0.8ml上清液用0.4ml0.66M磷酸钾中和，形成的高氯酸钾沉淀离心除去，离心后的上清液在-20℃保存备用；
（7）试验样品的衍生反应和测定：分别取步骤（6）处理过的三类样品各300μl放入三个对应的1.5ml离心管中，然后分别加入步骤（1）中的150μl异硫氰酸苯酯和150μl三乙胺，混合室温反应一小时，加600μl正己烷萃取杂质，15000pm/min离心5min取下层清液，用步骤（2）的色谱柱进行测定，柱温40℃，检测波长254nm，洗脱时间24min，流速1ml/min，进样量5μl；
（8）试验结果的处理：分别对血液样品、肌肉和十二指肠粘膜组织样品制定谷氨酰胺曲线色谱图并得出结论；
其中，所述步骤（4）和步骤（7）中均采用梯度洗脱，流速为1ml/min，流动相A液起始柱压为4.1MPA，测完用流动相B液小流速洗柱10min以上；所述梯度洗脱程序为：测定开始，混合流动相在0min-14min时间内，流动相A液从100%浓度下降到75%浓度，同时流动相B液从0%浓度升高到25%浓度，进行洗脱；从14.01min-18min时间内，为100%浓度的流动相B液洗脱；18.01min-24min时间内，为100%浓度的流动相A液洗脱。
2.根据权利要求1所述的肉种鸽组织及血清中谷氨酰胺含量的测定方法，其特征在于：所述步骤（1）中衍生化试剂的配制方法为：精确吸取1220μl异硫氰酸苯酯于100ml容量瓶中，用乙腈溶解进行定容，得到所述100mM异硫氰酸苯酯；精确吸取14.00ml三乙胺加入100ml容量瓶中，加乙腈溶解并定容，得到所述1M三乙胺。
3.根据权利要求1或2所述的肉种鸽组织及血清中谷氨酰胺含量的测定方法其特征在于：所述步骤（2）中流动相的配制方法为：将500毫升超纯水和3.4g无水乙酸钠用12%乙酸调节PH在6.50，与15ml乙腈混合，超声脱气后备用得到流动相A液；将40ml乙腈加10ml超纯水混合脱气备用得到流动相B液。
4.根据权利要求3所述的肉种鸽组织及血清中谷氨酰胺含量的测定方法，其特征在于：所述含20mgSSA（5-磺基水杨酸）样品管的制备方法为：取0.1ml的200g/LSSA溶液置于1.0ml离心管内，在50℃下蒸干乙醇后盖好于室温下保存。
5.根据权利要求1所述的肉种鸽组织及血清中谷氨酰胺含量的测定方法，其特征在于：所述固定相反相C18柱的规格为：SHIMADZUVP-ODS5um150*4.6mm；所述流动相A液的PH值为6.50；
所述SSA血液样品的离心转速为5790RPM，所述高氯酸钾沉淀的离心条件为：温度为4℃，RCF为3000g，离心时间为5min。
6.根据权利要求4所述的肉种鸽组织及血清中谷氨酰胺含量的测定方法，其特征在于：所述200g/LSSA溶液的制备方法为：称取20gSSA，溶于100ml无水乙醇中，溶解后，即可配制成200g/LSSA溶液。
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