DE602004009091T2

DE602004009091T2 - Kalibration von Peak-Pattern

Info

Publication number: DE602004009091T2
Application number: DE602004009091T
Authority: DE
Inventors: Rainer 76131 JAEGER
Original assignee: Agilent Technologies Inc
Current assignee: Agilent Technologies Inc
Priority date: 2004-12-15
Filing date: 2004-12-15
Publication date: 2008-01-10
Anticipated expiration: 2024-12-16
Also published as: EP1600771A1; US20070112534A1; EP1669753B1; EP1600771B1; DE602004004638D1; DE602004009091D1; EP1669753A1; DE602004004638T2

Description

Hintergrundtechnik
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Kalibrieren eines Proben-Peak-Musters.
Es gibt eine Vielzahl verschiedener Techniken zum Analysieren der Zusammensetzungen einer unbekannten Probe. Um die unbekannte Probe zu analysieren, könnte ein Proben-Peak-Muster erfasst werden, wobei die Peaks den Komponenten der unbekannten Probe entsprechen. Bevor jedoch die Proben-Peak-Muster für die weitere Analyse verwendet werden können, müssen sie bezüglich Kalibrierproben kalibriert werden, die eine Menge bekannter Zusammensetzungen aufweisen. Beispielsweise werden im Gebiet der DNA- oder Proteinanalyse Kalibrierproben verwendet, die eine Menge bestens bekannter DNA-Fragmente oder Proteine enthalten. Bevor die Kalibrierung ausgeführt werden kann, muss das Proben-Peak-Muster bzgl. einem oder mehreren Kalibrierungs-Peak-Mustern ausgerichtet werden. Die Genauigkeit der Kalibrierung hängt stark von der Genauigkeit dieses Ausrichtungsschrittes ab.
Parrish M. E. u.a. beschreiben in „Computer-Enhanced High-Resolution Gas Chromatography for the Discriminative Analysis of Tobacco Smoke", Anal. Chem., Band 53, Nr. 6, Mai 1981 (1981-05), S. 826-831, eine lineare Transformation, die auf den in jedem Chromatogramm vorhandenen und vom einem Anwender erkennbaren Peaks basiert.
Die US-Patentschrift 5 119 315 A beschreibt das Ausrichten einer Zeitaufzeichnung von Probendaten, z.B. ein Massenchromatogramm einer unbekannten Substanz, mit einer Zeitaufzeichnung von Referenzdaten wie z.B. ein Massenchromatogramm einer bekannten Substanz.
Beschreibung der Erfindung
Es ist eine Aufgabe der Erfindung, eine verbesserte zeitliche Ausrichtung eines Proben-Peak-Musters bereitzustellen. Die Aufgabe wird durch den bzw. die unabhängigen Ansprüche gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen werden durch den bzw. die abhängigen Ansprüche dargestellt.
Gemäß der Erfindung wird die Zeitskala in n-1 Teilintervalle unterteilt, und für jedes der Teilintervalle wird die Original-Zeitskala in eine transformierte Zeitskala umgeformt. Auf diese Weise kann erreicht werden, dass jeder der gemessenen Referenz-Peaks an eine entsprechende Referenzposition des Referenz-Peaks verschoben wird. Dies wird durch das Erklären einer linearen Transformation für jedes durch zwei benachbarte Referenz-Peaks begrenzte Teilintervall erreicht, wobei die lineare Transformation so eingerichtet wird, dass sowohl der linke als auch der rechte Referenz-Peak jeweils an seine entsprechende Referenzposition verschoben wird. Auf diese Weise wird eine stückweise Transformation der Original-Zeitskala festgelegt.
Im Allgemeinen sind die Referenzpositionen der Referenz-Peaks des Kalibrierungs-Peak-Musters bestens bekannt. Z.B. können diese Referenzpositionen von einem Hersteller der Kalibrierproben zur Verfügung gestellt werden. Alternativ können diese Referenzpositionen durch das Ausführen einer großen Anzahl von Referenz-Messungen und das Mitteln der gemessenen Positionen der Referenz-Peaks ermittelt werden.
Durch das Anwenden der Menge von n-1 linearen Transformationen wird die Original-Zeitskala in eine transformierte Zeitskala umgeformt, sodass alle Referenz-Peaks an ihre Referenzpositionen verschoben werden. So können alle nichtlinearen Verzerrungen und Artefakte kompensiert werden, die durch die Messanordnung eingeführt wurden. Durch das Anwenden der Menge linearer Transformationen kann die Vergleichbarkeit der Kalibrierungs-Peak-Muster, die zu verschiedenen Zeiten mit verschiedenen Mess-Systemen erfasst wurden, sichergestellt werden. Des Weiteren kann die Menge von n-1 linearen Transformationen auch auf Proben-Peak-Muster angewendet werden. Auf diese Weise werden Proben-Peak-Muster und Kalibrierungs-Peak-Muster vergleichbar, die zu verschiedenen Zeiten mit verschiedenen Messanordnungen erfasst wurden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform entsprechen die n Referenz-Peaks des Kalibrierungs-Peak-Musters n gekennzeichneten Fragmenten, die in einer Kalibrierprobe enthalten sind.
In einer nochmals anderen bevorzugten Ausführungsform wird die i-te lineare Transformation festgelegt als t_i'=scale_i·t_i+bias_i, wobei t_i eine Originalzeit, t_i' eine transformierte Zeit, scale_i einen Skalierungsfaktor und bias_i einen Versatz bezeichnet. Die i-te lineare Transformation wird auf das i-te Teilintervall angewendet. Die Parameter scale_i und bias_i können so gewählt werden, dass die zugehörigen Positionen des i-ten Referenz-Peaks und des (i+1)-ten Referenz-Peaks jeweils an ihre entsprechenden Referenzpositionen verschoben werden.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird ein erstes Kalibrierungs-Peak-Muster erfasst, bevor ein Proben-Peak-Muster erfasst wird, und ein zweites Kalibrierungs-Peak-Muster wird erfasst, nachdem ein Proben-Peak-Muster erfasst wurde. Dann wird eine erste Menge linearer Transformationen anhand des ersten Kalibrierungs-Peak-Musters festgelegt, und eine zweite Menge linearer Transformationen anhand des zweiten Kalibrierungs-Peak-Musters festgelegt. Aus der ersten und zweiten Menge linearer Transformationen wird eine interpolierte Menge n-1 linearer Transformationen hergeleitet, die auf die entsprechenden n-1 Teilintervalle des Proben-Peak-Musters angewendet wird. Vorzugsweise wird die Interpolation in Einklang mit den jeweiligen Messzeiten des ersten Kalibrierungs-Peak-Musters, des Proben-Peak-Musters und des zweiten Kalibrierungs-Peak-Musters ausgeführt.
Gemäß der Erfindung weist das Verfahren einen Schritt auf, in dem die n-1 linearen Transformationen auf die entsprechenden n-1 Teilintervalle eines Proben-Peak-Musters einer untersuchten Probe angewendet werden.
Durch das Anwenden der n-1 linearen Transformationen auf ein Kalibrierungs-Peak-Muster oder ein Proben-Peak-Muster können die transformierten Peak-Muster auf eine gemeinsame Zeitskala bezogen werden. Auf diese Weise werden Kalibrierungs-Peak-Muster und Proben-Peak-Muster vergleichbar, die zu verschiedenen Zeiten mit verschiedenen Messanordnungen erfasst wurden. Darüber hinaus ist es möglich, sowohl den Kalibrierungs-Peak-Mustern als auch den Proben-Peak-Mustern eine gleich große Achse zuzuordnen, wobei die gleich große Achse die jeweiligen Größen der Zusammensetzungen hinsichtlich der Basenpaare angeben kann.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform weist das Verfahren ferner einen Schritt auf, in dem die abgetasteten Datenwerte wenigstens eines der Kalibrierungs-Peak-Muster und des Proben-Peak-Musters auf solche Weise neu abgetastet werden, dass ein gleicher Abstand zwischen benachbarten abgetasteten Datenwerten erreicht wird. Auf diese Weise wird das weitere Verarbeiten des angepassten Kalibrierungs-Peak-Musters vereinfacht.
Ein Verfahren zum Kalibrieren eines Proben-Peak-Musters bzgl. einem ersten und einem zweiten Kalibrierungs-Peak-Muster wird folgendermaßen ausgeführt: Die jeweiligen Peak-Muster werden zu verschiedenen Zeiten erfasst. Die Kalibrierungs-Peak-Muster weisen jeweils einen ersten Referenz-Peak und wenigstens einen zweiten Referenz-Peak auf, und das Proben-Peak-Muster weist einen ersten Referenz-Peak, wenigstens einen der zweiten Referenz-Peaks und eine beliebige Anzahl von Peaks der untersuchten Stoffe auf. Das Verfahren weist einen ersten Schritt des Ausrichtens wenigstens eines zweiten Referenz-Peaks des ersten Kalibrierungs-Peak-Musters mit wenigstens einem entsprechenden zweiten Referenz-Peak des zweiten Kalibrierungs-Peak-Musters auf. Das Verfahren weist ferner einen Schritt auf, in dem eine Interpolation der jeweiligen Positionen des ersten Referenz-Peaks in dem ersten und zweiten Kalibrierungs-Peak-Muster ausgeführt wird, um eine Zeitabhängigkeit der Position des ersten Referenz-Peaks herzuleiten. Das Verfahren weist ferner einen Schritt des Ausrichtens des Proben-Peak-Musters bzgl. wenigstens einem der Kalibrierungs-Peak-Muster in einer Weise auf, sodass

– der erste Referenz-Peak des Proben-Peak-Musters mit einer interpolierten Position des ersten Referenz-Peaks gemäß der im vorangehenden Schritt ermittelten Zeitabhängigkeit ausgerichtet wird, und sodass
– wenigstens einer der zweiten Referenz-Peaks des Proben-Peak-Musters mit wenigstens einem entsprechenden zweiten Referenz-Peak der Kalibrierungs-Peak-Muster ausgerichtet wird.

Die Positionen der Peaks, die sich auf verschiedene Zusammensetzungen beziehen, können verschiedenen Arten der Zeitabhängigkeit unterliegen. Es könnte eine geringe Schwankung der Messbedingungen als eine Funktion der Zeit geben. Wegen der unterschiedlichen chemischen Struktur der Proben-Zusammensetzungen kann eine kleine Abweichung der Messbedingungen die Zusammensetzungen auf verschiedene Weise beeinflussen. Demgemäß können die Peaks des Proben-Peak-Musters und der Kalibrierungs-Peak-Muster verschiedenen Arten der Zeitabhängigkeit unterliegen. Insbesondere könnte eine relative Zeitverschiebung eines Peaks relativ zu anderen Peaks beobachtet werden.
Die Kalibrierungs-Peak-Muster weisen jeweils einen ersten Referenz-Peak und einen oder mehrere zweite Referenz-Peaks auf. Zusätzlich zu den Peaks, die sich auf die untersuchten Stoffe beziehen, umfasst das Proben-Peak-Muster auch den ersten Referenz-Peak und wenigstens einen der zweiten Referenz-Peaks. Falls eine Zeitverschiebung der Position des ersten Referenz-Peaks relativ zur Position des wenigstens einen zweiten Referenz-Peaks vorliegt, kann diese Zeitverschiebung von den beiden Kalibrierungs-Peak-Mustern hergeleitet werden, die zu verschiedenen Zeiten erfasst wurden. Einer oder mehrere der zweiten Referenz-Peaks des ersten Kalibrierungs-Peak-Musters werden mit entsprechenden zweiten Referenz-Peaks des zweiten Kalibrierungs-Peak-Musters ausgerichtet. Die Position des ersten Referenz-Peaks ist dann zu zwei verschiedenen Zeiten bekannt, und eine Zeitabhängigkeit der Position des ersten Referenz-Peaks kann daraus ermittelt werden. Nun ist die Zeitabhängigkeit der Position des ersten Referenz-Peaks bekannt.
Als Nächstes wird das Proben-Peak-Muster bzgl. wenigstens einem der Kalibrierungs-Peak-Muster ausgerichtet. Der Zeitpunkt, an dem das Proben-Peak-Muster erfasst wurde, ist bekannt. Von der bekannten Zeitabhängigkeit der Position des ersten Referenz-Peaks kann eine interpolierte Position des ersten Referenz-Peaks hergeleitet werden, die dem Zeitpunkt entspricht, an dem das Proben-Peak-Muster gemessen wurde. Nun kann die gemessene Position des ersten Referenz-Peaks des Proben-Peak-Musters mit dieser interpolierten Position ausgerichtet werden, die von dem ersten und zweiten Kalibrierungs-Peak-Muster hergeleitet wurde. Darüber hinaus wird wenigstens einer der zweiten Referenz-Peaks des Proben-Peak-Musters mit wenigstens einem entsprechenden zweiten Referenz-Peak aus einem der Kalibrierungs-Peak-Muster ausgerichtet.
Durch das Berücksichtigen der relativen Zeitverschiebung zwischen verschiedenen Referenz-Peaks des Kalibrierungs-Peak-Musters ist es möglich, eine sehr genaue Ausrichtung der Referenz-Peaks des Proben-Peak-Musters relativ zu den Referenz-Peaks der Kalibrierungs-Peak-Muster durchzuführen. Der Ausrichtungsschritt ist eine notwendige Voraussetzung für nachfolgende Kalibrierungsschritte. Somit wird auch die Genauigkeit einer nachfolgenden Kalibrierung verbessert.
Zum Ermitteln der Zeitabhängigkeit der Position des ersten Referenz-Peaks wird eine lineare Interpolation zwischen der Position des ersten Referenz-Peaks in dem ersten und zweiten Kalibrierungs-Peak-Muster ausgeführt. Allgemein ist die Zeitverschiebung des ersten Referenz-Peaks im Wesentlichen eine lineare Zeitverschiebung.
Das Proben-Peak-Muster wird erfasst, indem eine betrachtete Probe analysiert wird. Neben verschiedenen untersuchten Stoffen weist die betrachtete Probe eine Markierung und wenigstens ein gekennzeichnetes Fragment auf, wobei der erste Referenz-Peak des Proben-Peak-Musters der Markierung entspricht, und der eine oder die mehreren zweiten Referenz-Peaks des Proben-Peak-Musters dem einen oder den mehreren gekennzeichneten Fragmenten entsprechen. Es ist üblich, eine Markierung und wenigstens ein gekennzeichnetes Fragment zu einer untersuchten Probe hinzuzufügen, um eine Kalibrierung des erhaltenen Proben-Peak-Musters durchführen zu können. Beispielsweise könnte ein ziemlich kleines Molekül als ein Markiermolekül verwendet werden, während die gekennzeichneten Fragmente Moleküle beträchtlicher Größe sind. Deshalb kann sich das Wanderungsverhalten der Markierung bedeutend vom Wanderungsverhalten der gekennzeichneten Fragmente unterscheiden, und eine Zeitverschiebung zwischen dem ersten Referenz-Peak und dem wenigstens einen zweiten Referenz-Peak könnte beobachtet werden.
Das erste und zweite Kalibrierungs-Peak-Muster werden durch das Analysieren von Zusammensetzungen einer Kalibrierprobe erfasst, wobei die Kalibrierprobe die Markierung und eine Menge gekennzeichneter Fragmente aufweist. Ferner bevorzugt entspricht der erste Referenz-Peak der Kalibrierungs-Peak-Muster der Markierung, während sich der eine oder die mehreren zweiten Referenz-Peaks der Referenz-Peak-Muster auf die Menge gekennzeichneter Fragmente beziehen.
Eine so genannte Leiter kann als eine Kalibrierprobe verwendet werden. Eine Leiter ist eine Kalibrierprobe, die eine Vielzahl bestens bekannter Komponenten aufweist, wobei sich der Name "Leiter" von der Tatsache herleitet, dass das Kalibrierungs-Peak-Muster einer „Leiter" von Peaks gleicht, die sich auf die verschiedenen Komponenten beziehen. Beispielsweise bieten im Gebiet der DNA- und der Proteinanalyse viele Hersteller Leitern für Kalibrierzwecke an.
Die Zusammensetzungen der Kalibrierprobe und der untersuchten Probe werden in einem Trennungsfluss-Pfad getrennt. Z.B. können die jeweiligen Proben an einem Eingang des Trennungsfluss-Pfads bereitgestellt werden, und am Ausgang des Trennungsfluss-Pfads könnten die getrennten Zusammensetzungen der Probe als eine Funktion der Zeit erhalten werden.
Der Trennungsfluss-Pfad könnte beispielsweise als eine mit einer Art Packmaterial gefüllte Trennungssäule realisiert sein. Vorzugsweise wird eine der folgenden Trennungstechniken verwendet: Elektrophorese, Chromatographie, Elektrochromatographie.
Das Proben-Peak-Muster und die Kalibrierungs-Peak-Muster können durch das Feststellen der Fluoreszenzintensität der Zusammensetzungen, die in einem vorausgehenden Trennungsfluss-Pfad getrennt wurden, erfasst werden. Die Markierung ist ein Fluoreszenzmarker, und die Fragmente der Kalibrierprobe werden mit Fluoreszenzmarkierungen gekennzeichnet. Auch die Zusammensetzungen der untersuchten Probe werden mit Fluoreszenzmarkierungen gekennzeichnet. Demgemäß werden die jeweiligen Referenz-Peak-Muster durch das Feststellen der Fluoreszenzintensität als eine Funktion der Zeit erfasst.
Die Markierung kann Fluoreszenzlicht bei einer ersten Wellenlänge emittieren, während die gekennzeichneten Fragmente Fluoreszenzlicht bei einer zweiten Wellenlänge emittieren können, die von der ersten Wellenlänge abweicht. Manche der verfügbaren Leitern weisen zwei oder mehr verschiedene Fluoreszenz-Farbstoffe auf, die zum Emittieren von Fluoreszenzlicht bei zwei oder mehr verschiedenen Wellenlängen geeignet sind. Entsprechend gibt es Fluoreszenz-Erkennungseinheiten, die zum gleichzeitigen Verfolgen der Fluoreszenzintensität bei zwei oder mehr verschiedenen Wellenlängen geeignet sind.
Das Proben-Peak-Muster kann zwischen dem ersten und dem zweiten Kalibrierungs-Peak-Muster gemessen werden. Auf diese Weise wird die Interpolation der Position des ersten Referenz-Peaks genauer.
Die Erfindung kann teilweise oder vollständig durch eines oder mehrere geeignete Computerprogramme ausgeführt oder unterstützt werden, die gespeichert oder anderweitig auf irgendeiner Art von Datenträger bereitgestellt werden können und in oder durch eine beliebige Datenverarbeitungs-Einheit ausgeführt werden können.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Andere Aufgaben und viele der begleitenden Vorteile von Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind leicht zu erkennen und werden besser verstanden mit Bezug auf die folgende ausführlichere Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen. Eigenschaften, die im Wesentlichen oder funktionsmäßig gleich oder ähnlich sind, werden mit den gleichen Bezugszeichen bezeichnet.
1 zeigt eine Messanordnung;
2 stellt zwei Fluoreszenzintensitäts-Signale dar, die sich auf eine Kalibrierprobe beziehen;
3 zeigt zwei Fluoreszenzintensitäts-Signale, die sich auf eine untersuchte Probe beziehen;
4A zeigt gemessene Peaks in Abhängigkeit von einer absoluten Zeitskala;
4B stellt eine Ausrichtung von Peak-Mustern nach dem Stand der Technik dar;
4C zeigt eine alternative Ausrichtung von Peak-Mustern;
5 veranschaulicht eine relative Zeitverschiebung des unteren Markierungs-Peaks LM relativ zu den Leiter-Peaks;
6 zeigt die Auswirkungen der globalen Ausrichtung und der stückweisen Ausrichtung; und
7 stellt dar, wie eine stückweise Ausrichtung ausgeführt wird.
1 zeigt eine Messanordnung zum Trennen und Analysieren einer Flüssigkeitsprobe, die eine Vielzahl verschiedener Proben-Zusammensetzungen aufweist. Jede der Proben-Zusammensetzungen ist durch eine besondere Wanderungszeit gekennzeichnet, die für das Durchlaufen eines Trennungsfluss-Pfades 1 benötigt wird. Der Trennungsfluss-Pfad 1 könnte z.B. ein Elektrophorese-Flusspfad, ein Chromatographie-Flusspfad oder ein Elektro-Chromatographie-Flusspfad sein. Am Auslass des Trennungsfluss-Pfades 1 befindet sich eine Erkennungszelle. Die Erkennungszelle könnte z.B. als eine Fluoreszenz-Erkennungszelle 2 ausgeführt sein, die eine Lichtquelle 3 und eine Fluoreszenz-Erkennungseinheit 4 aufweist. Die Fluoreszenz-Erkennungszelle 2 ist zum Erkennen von Probenbändern fluoreszenzmarkierter Stoffe als eine Funktion der Zeit geeignet.
Bevor eine Probe untersucht werden kann, die eine Vielzahl unbekannter Stoffe aufweist, muss die in 1 gezeigte Messanordnung kalibriert werden. Zu diesem Zweck gibt es eine große Vielfalt verschiedener Kalibrierproben, die eine Menge bestens bekannter Zusammensetzungen verschiedener Größe aufweisen. Diese Zusammensetzungen können durch eine in 1 gezeigte Messanordnung getrennt und analysiert werden, wobei ein kennzeichnendes Kalibrierungs-Peak-Muster erhalten wird. Für jede Zusammensetzung der Kalibrier-Probe weist das Kalibrierungs-Peak-Muster einen zugehörigen Kalibrierungs-Peak auf. Da die Menge der Kalibrierungs-Peaks einer Leiter ähnelt, werden die Kalibrierproben oft als „Leitern" bezeichnet. Zahlreiche Hersteller produzieren Kalibrierproben oder „Leitern" für Elektrophorese-Systeme, Chromatographie-Systeme oder Elektrochromatographie-Systeme. Im Gebiet der DNA-Analyse werden Leitern verwendet, die eine Menge verschiedener DNA-Fragmente aufweisen, während im Gebiet der Protein-Analyse Kalibrierproben verwendet werden, die eine Menge verschiedener Proteine aufweisen.
Falls eine Fluoreszenzerkennung zum Nachweisen verschiedener Stoffe angewendet wird, werden Leitern verwendet, die mit Fluoreszenzmarkierungen gekennzeichnete Fragmente aufweisen. Wenn die Stoffe der Kalibrierprobe mit einfallendem Licht angeregt werden, emittieren die mit dem Stoff verbundenen Markierungen Fluoreszenzlicht. Es gibt auch Kalibrierproben oder „Leitern", die eine bei einer ersten Wellenlänge fluoreszierende Markierung und eine Menge gekennzeichneter Fragmente aufweisen, die Fluoreszenzlicht bei einer zweiten Wellenlänge emittieren.
2 zeigt zwei verschiedene Fluoreszenzintensitäts-Signale 5, 6 als eine Funktion der Zeit. Die beiden Fluoreszenzintensitäts-Signale 5, 6 wurden durch das Ermitteln der Fluoreszenzintensität bei zwei verschiedenen Wellenlängen erfasst. Die Signale aus 2 beziehen sich auf eine Kalibrierprobe, die eine Markierung und eine Menge gekennzeichneter Fragmente aufweist. Die Markierung ist ein kleines Farbstoff-Molekül, das zum Emittieren von rotem Fluoreszenzlicht geeignet ist. Im Allgemeinen sind die gekennzeichneten Fragmente größer als die Markierung. Sie sind mit Fluoreszenzmarkierungen gekennzeichnet, die zum Emittieren von grünem Fluoreszenzlicht geeignet sind. Zusätzlich zu den Fluoreszenzintensitäts-Signalen 5, 6 ist eine Zeitachse 7 dargestellt. Zuerst erscheinen die kleinen Markierungsmoleküle am Ausgang der Trennungssäule und dementsprechend erscheint ein unterer Markierungs-Peak LM im Fluoreszenzintensitäts-Signal 5, der sich auf das rote Fluoreszenzlicht bezieht. Als Nächstes erreichen die gekennzeichneten Fragmente die Erkennungszelle, wobei kleine, leichte Fragmente schneller durch die Trennungssäule wandern als große, schwere Fragmente. Deshalb weist das Fluoreszenzintensitäts-Signal 6, das sich auf grünes Fluoreszenzlicht bezieht, eine Menge von Leiter-Peaks LP1, LP2, LP3, ..., LPn auf, wobei der Leiter-Peak LP1 dem kleinsten gekennzeichneten Fragment und LPn dem größten gekennzeichneten Fragment entspricht.
Nachdem das Fluoreszenz-Peak-Muster der Kalibrierprobe erfasst wurde, wird eine interessierende Probe analysiert. Um eine Ausrichtung mit dem Kalibrierungs-Peak-Muster zu erlauben, wird der betrachteten Probe eine bestimmte Konzentration der Markierung und eine bestimmte Konzentration des größten gekennzeichneten Leiter-Fragments hinzugefügt. Dann werden die Zusammensetzungen der betrachteten Probe getrennt und die am Ausgang der Trennungssäule erhaltenen Probenbänder analysiert.
3 zeigt zwei Fluoreszenzintensitäts-Signale 8, 9, die durch das Analysieren der betrachteten Probe erhalten wurden. Das Fluoreszenzintensitäts-Signal 8 bezieht sich auf rotes Fluoreszenzlicht, während sich das Fluoreszenzintensitäts-Signal 9 auf grünes Fluoreszenzlicht bezieht. Ferner ist eine Zeitachse 10 dargestellt. Zuerst erscheint die Markierung am Säulenausgang, und ein zugehöriger unterer Markierungs-Peak LM tritt im Fluoreszenzintensitäts-Signal 8 auf. Als nächstes erreichen die sich auf die Zusammensetzungen der betrachteten Probe beziehenden Probenbänder die Fluoreszenz-Erkennungszelle. Die Proben-Zusammensetzungen wurden mit einer Fluoreszenzmarkierung gekennzeichnet, die zum Emittieren von grünem Fluoreszenzlicht geeignet ist. Dementsprechend weist das Fluoreszenzintensitäts-Signal 9 die Peaks 11 auf, die diesen Proben-Zusammensetzungen entsprechen. Zuletzt erscheint das größte gekennzeichnete Fragment an der Erkennungszelle, und dementsprechend weist das Fluoreszenzintensitäts-Signal 9 einen Leiter-Peak LPn auf.
4A zeigt eine Abfolge von Messungen, die sowohl Kalibriermessungen als auch Probenmessungen enthält. Zuerst wird eine Kalibrierprobe oder Leiter 1 untersucht, dann werden Proben-Peak-Muster der Proben S1 bis S4 erfasst, und zuletzt wird ein Kalibrierungs-Peak-Muster einer Leiter L2 gemessen. Unterhalb der Messungen gibt eine Zeitachse 12 eine absolute Zeitskala an, die zum Aufzeichnen der Peak-Muster verwendet wurde. Für jede der beiden Kalibrierproben-Messungen L1 und L2 sind die jeweiligen Positionen des unteren Markierungs-Peaks LM, des Peaks des ersten gekennzeichneten Fragments LP1 und des letzten gekennzeichneten Fragments LPn angegeben. Für jede der Proben-Messungen S1 bis S4 sind die Positionen des unteren Markierungs-Peaks LM und die Position des Peaks des letzten gekennzeichneten Fragments LPn angegeben.
Die Zeitachse 12 gibt eine absolute Zeitskala an, die zum Aufzeichnen der Peak-Muster verwendet wurde. Aus 4A ist zu erkennen, dass die absoluten Zeitpositionen der entsprechenden Peaks bedeutend variieren. Des Weiteren schwanken auch die Zeitintervalle zwischen dem unteren Markierungs-Peak LM und dem Peak des letzten gekennzeichneten Fragments LPn etwas. Diese Schwankung deutet auf ein Zusammendrängen oder eine Dehnung der absoluten Zeitskala hin, die z.B. von Fluktuationen der Zusammensetzung des Lösungsmittels, chemischen Modifikationen des Säulen-Packmaterials oder anderen Veränderungen der Messumgebung verursacht sein können.
Aus diesen Gründen ist es zum Erreichen der Vergleichbarkeit zwischen den Peak-Mustern notwendig, die absolute Zeitskala in eine relative Zeitskala umzuformen und die Peaks des Proben-Peak-Musters relativ zu den Peaks der Kalibrier-Proben-Muster auszurichten.
Nach einer in 4B dargestellten Lösung nach dem Stand der Technik wird dem unteren Markierungs-Peak LM der Kalibriermessungen L1 und L2 und den unteren Markierungs-Peaks LM der Probenmessungen S1 bis S4 ein erster fester Zeitwert 13 zugeordnet. Des Weiteren wird den jeweiligen Peaks LPn der Messungen L1, L2, S1 bis S4 ein zweiter fester Zeitwert 14 zugeordnet. Folglich werden die Positionen der entsprechenden unteren Markierungs-Peaks LM und die Positionen der entsprechenden Leiter-Peaks LPn ausgerichtet.
Indem den Peaks LM bzw. LPn jedes Peak-Musters feste Zeitwerte zugewiesen werden, wird eine relative Zeitskala für jedes der Peak-Muster L1, S1 bis S4, L2 eingerichtet. Nun können die absoluten Zeitwerte der Peaks, die in 4A gezeigt sind, in entsprechende relative Zeitwerte dieser relativen Zeitskala umgeformt werden.
Die in 4B gezeigte herkömmliche Lösung hat jedoch einige Nachteile. Beim Umformen der absoluten Zeitposition des Peaks LP1 der Kalibriermessung L1 in einen entsprechenden relativen Zeitwert wird ein relativer Zeitwert 15 des Peaks LP1 ermittelt. Beim Umformen des absoluten Zeitwerts des Peaks LP1 der Kalibriermessung L2 in einen entsprechenden relativen Zeitwert wird ein relativer Zeitwert 16 des Peaks LP1 erhalten. Offensichtlich stimmt der relative Zeitwert 16 des Peaks LP1, der von der Kalibriermessung L2 hergeleitet wurde, nicht mit dem von der Kalibriermessung L1 erhaltenen relativen Zeitwert 15 überein. Dies bedeutet, dass das von der Kalibriermessung L1 hergeleitete Verhältnis
von dem Verhältnis
abweicht, das von der Messung L2 hergeleitet wurde.
wobei ΔTLP1LM das Zeitintervall zwischen LM und LP1 gemäß der absoluten Zeitskala aus 4A und ΔTLPnLP1 das Zeitintervall zwischen LP1 und LPn gemäß der absoluten Zeitskala aus 4A bezeichnet.
Dieser Effekt beruht auf einer relativen Verschiebung zwischen der Position des unteren Markierungs-Peaks und den Positionen der gekennzeichneten Fragmente LP1 bis LPn. Die Fragmente sind mit einer Fluoreszenzmarkierung gekennzeichnet, während die Markierung ein freier Farbstoff ist, der an kein Fragment gebunden ist. Beim Durchlaufen der Trennungssäule weicht das Wanderverhalten des freien Farbstoffs deutlich vom Wanderverhalten der gekennzeichneten Fragmente ab.
5 veranschaulicht die relative Zeitverschiebung der Position des unteren Markierungs-Peaks relativ zu den Peak-Positionen der anderen Leiter-Peaks. 5 zeigt eine Menge verschiedener Kalibrierungs-Peak-Muster, die zu verschiedenen Zeitpunkten aufgezeichnet wurden. Zuerst wird die Kalibriermessung L1 ausgeführt, dann werden die vier Probenmessungen S1 bis S4 erfasst, gefolgt von einer anderen Kalibriermessung L2. Nachdem die Kalibriermessung L2 durchgeführt wurde, wird eine weitere Menge von vier Probenmessungen S5 bis S8 ausgeführt, gefolgt von einer dritten Kalibriermessung L3. Diese Abfolge von Kalibriermessungen wird fortgesetzt, wobei weitere Kalibriermessungen L4, L5 ausgeführt werden. Das erste Diagramm 17 aus 5 bezieht sich auf die Kalibriermessung L1. Das erste Fluoreszenzintensitäts-Signal 18 weist einen unteren Markierungs-Peak LM auf, während das zweite Fluoreszenzintensitäts-Signal 19 vier Leiter-Peaks LP1, LP2, LP3, LP4 aufweist. Die folgenden Diagramme 20 bis 23 beziehen sich jeweils auf die Kalibriermessungen L2 bis L5. Es ist erkennbar, dass die jeweiligen Positionen der Leiter-Peaks LP1 bis LP4 unverändert bleiben, während es eine Zeitverschiebung des unteren Markierungs-Peaks LM relativ zu den Leiter-Peaks LP1 bis LP4 gibt. Relativ zur Position 24 des Leiter-Peaks LP1 bewegen sich die jeweiligen Positionen 25a bis 25e des unteren Markierungs-Peaks LM stetig als eine Funktion der Zeit.
Die relative Zeitverschiebung zwischen den Peak-Positionen der Markierung einerseits und der gekennzeichneten Fragmente andererseits muss beim Ausrichten der in 4A gezeigten Peak-Muster berücksichtigt werden. Gemäß den Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, die Ausrichtung auf eine in 4C gezeigte Art auszuführen. In einem ersten Schritt werden der erste Leiter-Peak LP1 und der letzte Leiter-Peak LPn der Kalibriermessung L1 mit den Leiter-Peaks LP1 und LPn der Kalibrierprobe L2 ausgerichtet. Dies kann beispielsweise dadurch erfolgen, dass dem Leiter-Peak LP1 der Kalibriermessung L1 und dem Leiter-Peak LP1 der Kalibriermessung L2 ein erster fester Zeitwert 26 zugewiesen wird, und dem Leiter-Peak LPn der Kalibriermessung L1 und dem Leiter-Peak LPn der Kalibriermessung L2 ein zweiter fester Zeitwert 27 zugewiesen wird. Als eine Folge dieser Zuweisung wird der Peak LP1 von L1 mit dem Peak LP1 von L2 ausgerichtet und darüber hinaus der Peak LPn von L1 mit dem Peak LPn von L2 ausgerichtet.
Durch das Zuweisen eines ersten festen Zeitwerts an LP1 und eines zweiten festen Zeitwerts an LPn, sowohl für die Kalibriermessung L1 als auch die Kalibriermessung L2, wird eine relative Zeitskala eingerichtet. Daher wird sowohl für L1 als auch für L2 die absolute Zeitskala, die zum Messen der Peak-Muster verwendet wurde, in eine relative Zeitskala umgewandelt.
Durch das Verwenden der relativen Zeitskala von L1 kann der absolute Zeitwert 28 des in 4A gezeigten unteren Markierungs-Peaks LM in einen entsprechenden relativen Zeitwert 29 umgewandelt werden. Genauso kann der absolute Zeitwert 30 des in 4A gezeigten unteren Markierungs-Peaks LM in einen entsprechenden relativen Zeitwert 31 umgewandelt werden.
Im Allgemeinen weicht der relative Zeitwert 29 vom relativen Zeitwert 31 ab. Aus diesen zwei Werten kann jedoch eine Zeitverschiebung der Position des unteren Markierungs-Peaks relativ zu den Leiter-Peaks hergeleitet werden, vorzugsweise durch das Ausführen einer linearen Interpolation. In 4C ist die Zeitverschiebung des unteren Markierungs-Peaks LM als eine gerade Linie 32 angegeben. Anstelle einer linearen Interpolation kann eine aufwändigere Interpolationsart zum Modellieren der Zeitverschiebung des unteren Markierungs-Peaks verwendet werden.
Sobald die Zeitabhängigkeit der Peak-Position der unteren Markierung bekannt ist, können interpolierte relative Zeitwerte 33, 34, 35, 36 ermittelt werden, die die Peak-Position der unteren Markierung bei den entsprechenden Zeitpunkten angeben, an denen die Probenmessungen S1 bis S4 durchgeführt wurden.
Nun wird für jede der Probenmessungen S1 bis S4 die in 4A gezeigte absolute Zeitskala in eine relative Zeitskala so umgewandelt, dass die Position des unteren Markierungs-Peaks LM mit einem zugehörigen der interpolierten relativen Zeitwerte 33 bis 36 ausgerichtet wird, und die Position des Leiter-Peaks LPn mit dem zweiten festen Zeitwert 27 ausgerichtet wird. Für jede der Probenmessungen S1, S2, S3, S4 wird dadurch eine relative Zeitskala eingerichtet, dass dem unteren Markierungs-Peaks LM ein zugehöriger der relativen Zeitwerte 33 bis 36 zugewiesen wird, und der zweite feste Zeitwert 27 dem Leiter-Peak LPn zugewiesen wird. Auf diese Weise werden die absoluten Zeitwerte in entsprechende relative Zeitwerte umgewandelt, wobei die Zeitverschiebung des unteren Markierungs-Peaks berücksichtigt wird.
In 6A sind gemessene Zeitwerte der Leiter-Peaks LP1 bis LPn gezeigt, bevor eine Ausrichtung ausgeführt wird. Die Zeitachse 37 gibt eine absolute Zeitskala an, die bei der Datenerfassung verwendet wurde. Die in 6A gezeigten Daten beziehen sich auf 12 verschiedene Kalibriermessungen L1 bis L12.
6B zeigt dieselben Daten nach dem Ausführen einer Ausrichtung gemäß 4C. Auf der linken Seite ist eine Zeitachse 38 dargestellt, die eine relative Zeitskala angibt, wobei die relative Zeitskala gemäß 4C festgelegt wird. Für jede der 12 Kalibriermessungen L1 bis L12 sind die jeweiligen Peak-Positionen der Leiter-Peaks LP1 bis LPn angegeben. Aus 6B ist ersichtlich, dass sowohl die ersten Leiter-Peaks LP1 als auch die letzten Leiter-Peaks LPn perfekt ausgerichtet sind, während die Peak-Positionen der anderen Leiter-Peaks LP2 bis LP(n-1) noch immer abweichen können. Diese Abweichung ist jedoch weitaus geringer als die oben beschriebene Markierungsverschiebung. Darüber hinaus bezieht sich diese Abweichung nicht auf die verschiedenen chemischen Strukturen der Markierung und der gekennzeichneten Fragmente, sondern beruht vielmehr auf anderen Arten von Fluktuationen der Messanordnung.
Deshalb wird zusätzlich zu der in 4C gezeigten globalen Ausrichtung, die als ein erster Schritt ausgeführt wird, eine nachfolgende stückweise Ausrichtung durchgeführt.
7 stellt dar, wie eine stückweise Ausrichtung eines Kalibrierungs-Peak-Musters ausgeführt wird. Die stückweise Ausrichtung wird bzgl. einer Menge von Referenz-Zeitwerten der Leiter-Peaks LP1 bis LPn ausgeführt. Für jeden Leiter-Peak LPi wird ein Referenz-Zeitwert T_i' bereitgestellt, der die Referenzposition des Leiter-Peaks angibt, wobei die Menge der Referenz-Zeitwerte T_i', 1 ≤ i ≤ n, in einer relativen Zeitskala angegeben werden. Die Menge der Referenz-Zeitwerte könnte beispielsweise von einem Hersteller einer Kalibrierprobe erhalten werden. Alternativ könnten die Referenzpositionen der Leiter-Peaks ermittelt werden, indem eine große Anzahl von Referenzmessungen einer Kalibrierprobe durchgeführt wird und die Mittelwerte der relativen Zeitwerte der Kalibrierungs-Peaks ermittelt werden.
Im oberen Teil von 7 ist eine relative Zeitskala 39 gezeigt, wobei die Leiter-Peaks LP1, LP2, ... LPn erhalten wurden, nachdem eine globalen Ausrichtung gemäß 4C ausgeführt wurde. Zuerst wird eine Menge von Zeitintervallen [T_i; T_i+1] definiert, wobei T_i den relativen Zeitwert des Leiter-Peaks LPi und T_i+1 den relativen Zeitwert des Leiter-Peaks LP(i+1) bezeichnet. Für jedes der Intervalle, die sich von LPi bis LP(i+1) erstrecken, wird eine separate lineare Transformation so festgelegt, dass das Intervall [T_i; T_i+1] auf ein entsprechendes Zielintervall [T_i'; T_i+1'] einer Referenz-Zeitskala 40 abgebildet wird. T_i' bezeichnet den Referenz-Zeitwert des Leiter-Peaks LPi und T_i+1' den Referenz-Zeitwert des Leiter-Peaks LP(i+1). Auf diese Weise wird eine Menge von (n-1) linearen Transformationen erhalten.
Jede der (n-1) linearen Transformationen könnte z.B. folgendermaßen erklärt werden: ti'=scalei·ti + biasi,wobei scale_i einen Skalierungsfaktor, bias_i einen Versatz, t_i ∊ [T_i; T_i+1] einen relativen Zeitwert gemäß der relativen Zeitskala 39 und t_i' ∊ [T_i'; T_i+1'] einen entsprechenden relativen Zeitwert der Referenz-Zeitskala 40 bezeichnet. Jede der (n-1) linearen Transformationen wird auf ein entsprechendes Teilintervall [T_i, T_i+1], 1 ≤ i ≤ n – 1 der relativen Zeitskala 39 angewendet. Indem das Kalibrierungs-Peak-Muster dieser Menge von stückweisen Transformationen unterzogen wird, wird jeder Leiter-Peak LPi auf seinen Referenz-Zeitwert T_i' abgebildet.
Beim Ausführen der Kalibriermessung oder der Probenmessung werden die Probenwerte mit einer konstanten Frequenz aufgezeichnet. Deshalb ist der Abstand zwischen benachbarten Probenwerten konstant. Nachdem die Zeitintervalle jedoch auf die entsprechenden Ziel-Zeitintervalle abgebildet wurden, sind die Abstände zwischen benachbarten Probenwerten entweder gedehnt (41) zusammengedrängt (42). Deshalb wird in einem nächsten Schritt eine Neuabtastung 43 der Probenwerte ausgeführt. Als Ergebnis wird eine neu abgetastete Referenz-Zeitskala 44 erhalten.
Die von dem Kalibrierungs-Peak-Muster hergeleitete Menge linearer Transformationen kann auf nachfolgende Probenmessungen angewendet werden. Eine erste Möglichkeit besteht darin, die Menge von Transformationen, die von der Kalibriermessung L1 hergeleitet wurde, auf die nachfolgenden Probenmessungen S1 bis S4 anzuwenden. Eine andere Möglichkeit besteht darin, sowohl die vor dem Ausführen der Probenmessungen S1 bis S4 durchgeführte Kalibriermessung L1 als auch die Kalibriermessung L2, die nach dem Durchführen der Probenmessungen S2 bis S4 ausgeführt wird, zu berücksichtigen. Von L1 wird eine erste Menge linearer Transformationen und von L2 eine zweite Menge linearer Transformationen hergeleitet. Um irgendeine der Probenmessungen S1 bis S4, z.B. S2, zu korrigieren, wird eine interpolierte Menge von (n-1) linearen Transformationen von der ersten und der zweiten Menge linearer Transformationen hergeleitet.
In 6C sind die Kalibrierungs-Peak-Muster L1 bis L2 gezeigt, nachdem eine stückweise Ausrichtung gemäß 7 ausgeführt wurde. Es ist ersichtlich, dass eine Ausrichtung aller Leiter-Peaks LP1, LP2, ... LPn erreicht wurde.
Durch das Umformen der Kalibriermessungen sowie der Probenmessungen zu einer Referenz-Zeitskala ist es möglich, sowohl den Leiter-Peak-Mustern als auch den Proben-Peak-Mustern eine gemeinsame Zeitachse zuzuordnen. Auf diese Weise wird die Vergleichbarkeit unter verschiedenen Kalibriermessungen und Probenmessungen verbessert. Darüber hinaus können sowohl die Kalibrierungs-Peak-Muster als auch die Proben-Peak-Muster anstelle einer Zeitachse, die relative Zeitwerte angibt, anhand von Basenpaaren kalibriert werden. Insbesondere kann eine Größenachse 45 verwendet werden, die die Anzahl der entsprechenden Basenpaare angibt. Die verarbeiteten Signale können dann für die weitere Analyse, wie z.B. die Profilerstellung, verwendet werden.

Claims

Verfahren zum Bereitstellen einer zeitlichen Ausrichtung auf ein Peak-Muster, worin eine Menge von linearen Transformationen mit Bezug auf eine Referenz-Datenmenge eingerichtet wird, welche Daten über Referenzpositionen von n Referenz-Peaks eines Kalibrierungs-Peak-Musters aufweist; wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist: Unterteilen der Zeitachse des Kalibrierungs-Peak-Musters in eine Reihe von n-1 benachbarten Teilintervallen, wobei ein i-tes Teilintervall vom Referenz-Peak i bis zum Referenz-Peak i+1 des Kalibrierungs-Peak-Musters reicht und i eine ganze Zahl ist mit 2 ≤ i < n; Einrichten einer entsprechenden linearen Transformation für jedes der n-1 Teilintervalle, wobei die i-te lineare Transformation zum Abbilden des i-ten Teilintervalls auf ein entsprechendes i-tes Zielintervall geeignet ist, wobei das i-te Zielintervall von der Referenzposition des Referenz-Peaks i bis zur Referenzposition des Referenz-Peaks i+1 der Referenz-Datenmenge reicht; und Anwenden der n-1 linearen Transformationen auf die entsprechenden n-1 Teilintervalle eines Proben-Peak-Musters einer betrachteten Probe.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Kalibrierungs-Peak-Muster durch das Erkennen von Zusammensetzungen einer Kalibrierprobe erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Kalibrierprobe n gekennzeichnete Fragmente aufweist und die n Referenz-Peaks des Kalibrierungs-Peak-Musters den n gekennzeichneten Fragmenten entsprechen.
Verfahren nach Anspruch 1 oder einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die i-te lineare Transformation als t'_i = scale_i·t_i + bias_i eingerichtet ist, wobei t_i eine Originalzeit, t_i' eine transformierte Zeit, scale_i einen Skalierungsfaktor und bias_i einen Versatz bezeichnet.
Verfahren nach Anspruch 1 oder einem der vorangehenden Ansprüche, wobei ein erstes Kalibrierungs-Peak-Musters vor dem Proben-Peak-Muster erfasst wird und ein zweites Kalibrierungs-Peak-Muster erfasst wird, nachdem das Proben-Peak-Muster erfasst wurde, wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist: Ermitteln einer ersten Menge von linearen Transformationen von dem ersten Kalibrierungs-Peak-Muster, Ermitteln einer zweiten Menge von linearen Transformationen von dem zweiten Kalibrierungs-Peak-Muster, Herleiten einer interpolierten Menge von linearen Transformationen von der ersten und zweiten Menge von linearen Transformationen.
Verfahren nach Anspruch 1 oder einem der vorangehenden Ansprüche, das ferner einen Schritt des Neuabtastens der abgetasteten Datenwerte von wenigstens einem der Kalibrierungs-Peak-Muster und des Proben-Peak-Musters durch eine lineare Interpolation aufweist, die so beschaffen ist, dass ein gleicher Abstand zwischen benachbarten abgetasteten Datenwerten erreicht wird.
Softwareprogramm oder -produkt, vorzugsweise gespeichert auf einem Datenträger, das so beschaffen ist, dass es das Verfahren nach Anspruch 1 oder einem der vorangehenden Ansprüche ausführt, wenn es auf einem Datenverarbeitungs-System wie z.B. einem Computer betrieben wird.