CN115380208A - 电泳装置以及分析方法 - Google Patents

Abstract

本公开的电泳装置的特征在于，具备：样品的电泳路径；分光元件，其对来自所述电泳路径内的所述样品的光进行分光；光检测器，其对由所述分光元件分光后的光进行检测；以及运算部，其基于来自所述光检测器的信号，求出所述光的光谱，所述运算部使用针对每个泳动条件或荧光色素确定的校正系数来校正所述光谱。

Description

电泳装置以及分析方法

技术领域

本公开涉及电泳装置以及分析方法。

背景技术

作为分析DNA的碱基序列或碱基长度的方法，电泳法广为人知。作为使用了电泳的分析方法之一，有毛细管电泳。毛细管电泳是在被称为毛细管的细管中填充丙烯酰胺等分离介质来进行电泳的技术。更具体而言，将含有DNA的试样配置于毛细管的一端，在该状态下对毛细管的两端施加高电压时，带负电的带电粒子即DNA取决于自身的大小即碱基长度而在毛细管内向阳极侧移动。然后，通过测量试样在固定距离(通常从毛细管的试样注入端到信号检测部)泳动所需的时间，能够分析DNA的碱基长度。各DNA用荧光色素标记，因激发光的照射而发出荧光。所述荧光由光检测器检测。

在基于毛细管电泳的DNA的分析中，出于谋求分析的迅速化的目的，有时使用多种荧光色素。多个荧光色素接受激发光的照射而分别发出不同的荧光。将对该荧光进行分光而在光检测器上取得的光谱称为荧光光谱。各荧光色素分别具有不同的荧光光谱，但它们并不尖锐，各个荧光色素彼此具有重叠。因此，在光检测器中，用不同的荧光色素标记的DNA片段具有相同程度的片段长度时，由光检测器得到的荧光的光谱为多种荧光色素的荧光光谱的线性和、即加权和。为了根据该状态求出各个荧光色素的信号强度(荧光强度)，只要根据由光检测器得到的光谱求出构成该光谱的各荧光色素的光谱的线性系数、即权重值即可。

为了求出该权重值，各荧光光谱必须是预先已知的。各荧光光谱本来不取决于装置而由荧光色素、分离介质一元化地决定。但是，在实际的装置中，由于各种理由，荧光光谱发生变动。其中众所周知的是毛细管与光检测器的位置关系。因此，在更换毛细管时，在对分析对象的样品(以下记作“实际样品”)进行电泳之前，需要预先求出该装置和该毛细管中的荧光光谱的操作。将该操作称为“光谱校准”。另外，在使用排列有多个毛细管的毛细管阵列，对多个样品同时进行电泳的情况下，需要对各个毛细管求出荧光光谱。

在此，说明现有技术的光谱校准的一例。

图1是表示在多毛细管电泳装置的光检测器上成像的衍射光栅像(下段)以及与衍射光栅像的A-A’方向对应的毛细管的信号强度分布的图(上段)。多毛细管电泳装置通过向毛细管照射特定波长的激光而利用衍射光栅在波长方向上分离从各荧光色素放射的荧光，利用CCD等光检测器检测分离出的光，取得衍射光栅像。然后，从衍射光栅像中取得信号强度分布(光谱)。

图1的下段是对排列有4根毛细管的毛细管阵列照射激光时的衍射光栅像，纵轴表示毛细管的排列方向，横轴表示波长方向。在图1的上段，纵轴表示信号强度(亮度值(RFU))，横轴表示波长。另外，图1示出了使用衍射光栅连续地(实际上按每个像素离散地)测量光谱的例子，但也可以是以较宽的波长间隔对上述光谱进行采样而得到的数据。例如，如图1的衍射光栅像所示，对于各毛细管，也可以仅取得20个波长λ(0)～λ(19)的信号强度。另外，也可以取波长λ(0)～λ(19)各自的波长附近的信号强度的加法平均。

图2是表示现有的光谱校准方法的流程图。

在步骤S101中，操作员进行矩阵标准品的电泳。矩阵标准品是用于取得荧光光谱并得到后述的矩阵的试剂。矩阵标准品包含分别用不同的荧光色素标记的长度不同的4种DNA片段。与各个荧光色素对应的DNA片段的长度或长度的顺序的信息是已知的。

图3A是表示通过进行矩阵标准品的电泳而得到的信号强度的波形的图，纵轴表示信号强度，横轴表示时刻。在步骤S101中，设想得到4种荧光色素(ROX、TMR、R110、R6G)的荧光光谱，图3A表示将各荧光色素的信号强度波形重叠于一个图表的状态。如图3A所示，在与标记有各个荧光色素的DNA片段的长度相当的时刻出现尖锐的峰。长度不同的DNA片段分别用不同的荧光色素标记，因此在各峰时刻(t0、t1、t2、t3)各荧光色素单独发光。因此，通过取得仅特定的荧光色素发光的时刻(在图3A中为t0、t1、t2、t3、t4)的光谱，得到各个荧光色素的荧光光谱。

返回到图2，在步骤S102中，多毛细管电泳装置的运算控制电路根据在步骤S101中得到的信号强度的各时刻的光谱计算荧光强度。本步骤的处理可以对各个扫描时刻进行，也可以在蓄积了固定的时间间隔量的光谱数据之后进行。

在步骤S103中，运算控制电路检测图3A的信号强度波形的峰时刻。如上所述，由于与标记有各个荧光色素的DNA片段的长度对应的峰的出现顺序是已知的，因此能够根据峰的出现时刻来鉴定荧光色素的种类。在图3A中，示出了在时刻t0，ROX单独发光，在时刻t1，TMR单独发光，在时刻t2，R110单独发光，在时刻t3，R6G单独发光的情况。各时刻的光谱相当于各荧光光谱。即，通过取得各个峰时刻的光谱，可知各荧光光谱。

图3B是从图3A的信号强度波形取得的荧光光谱，纵轴表示荧光强度，横轴表示波长。如图3B所示，运算控制电路根据信号强度波形取得各荧光色素的荧光光谱。

返回到图2，在步骤S104中，运算控制电路使用各荧光光谱取得矩阵M。以下的数式1表示取得了20个波长λ(0)～λ(19)的信号强度的情况下的矩阵M的一例。矩阵M的要素在各峰时刻相当于各个波长的各个荧光色素的信号强度的强度比率。该比率例如是针对各荧光色素的波长间的最大值的比例。例如，数式1的要素WX1是时刻t0、波长λ(1)的荧光色素ROX的荧光强度的比率。该值越高，意味着该波长对荧光强度的贡献越高。矩阵M用于根据由光检测器得到的光谱波形得到各个荧光强度。

[数式1]

以上，步骤S101～S104的操作是光谱校准。在存在多个毛细管的情况下，需要对各个毛细管取得矩阵M。另外，光谱校准需要在每次进行毛细管设置、部件更换等时实施。

通过光谱校准得到的矩阵M也被称为基准光谱，理想的是与实际样品的荧光光谱相同。但是，实际上，有时在基准光谱与实际样品的荧光光谱之间产生偏离。若产生偏离，则无法正确地计算权重值，记录错误的荧光强度。在严重的情况下，在与主峰相同的峰时刻出现伪峰。

图4是出现了伪峰的情况下的荧光光谱。伪峰是由于各颜色的荧光光谱的重叠而产生的，在基准光谱与实际样品的荧光光谱之间产生偏离时，观测到该重叠所带来的影响较大。另外，在存在多个主峰的情况下，在该全部的主峰中观测到该伪峰。

基准光谱与实际样品的荧光光谱间的偏离大致起因于光谱校准时与实际样品泳动时的荧光色素、泳动条件的差异而产生。即，操作员每次改变在实际样品中使用的荧光色素、泳动条件时，都需要重新进行光谱校准，因此会增加麻烦和费用。

专利文献1公开了“一种基因解析装置，其特征在于，使用在实际的样品的电泳时使用的已知的DNA片段信息即分子量标准品和等位基因阶梯来得到基准荧光光谱，对于不使用等位基因阶梯的毛细管，检测分子量标准品的荧光光谱的位移量，使用该位移量使基准荧光光谱位移来计算荧光光谱，由此进行光谱校准”(参照该文献的摘要)。由此，不需要使用特别的矩阵标准品进行电泳，因此能够以短时间并以低成本实现光谱校准。

分子量标准品是指用特定的荧光色素标记的已知的DNA片段的混合物。等位基因阶梯是指用与实际样品相同的荧光色素标记的已知的DNA片段的混合物。在专利文献1所记载的运用中，分子量标准品在电泳时与全部试样混合。然后，等位基因阶梯通过与实际样品不同的毛细管进行分析。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2014-117222号公报

发明内容

发明所要解决的课题

然而，专利文献1中，使用特定的荧光色素算出毛细管间的荧光光谱的偏移量，未设想所述偏移量因荧光色素而不同的情况。因此，根据荧光色素的不同，有时无法得到适当的基准光谱，在基准光谱与实际样品的荧光光谱之间产生偏离，产生伪峰。另外，在专利文献1的实施例3中，举出了对每个毛细管进行光谱校准的例子。但是，为此，需要由单色的荧光色素构成的峰。因此，在多个峰重叠的样品中，有时无法得到基准光谱。作为结果，在基准光谱与实际样品的荧光光谱之间可能产生偏离。根据以上内容，专利文献1的方法难以应用于任意的荧光色素、任意的样品，因此每当变更泳动条件、荧光色素时都需要重新进行光谱校准。因此，操作员的麻烦和费用增大。

因此，本公开提供减轻了操作员的麻烦和费用的电泳装置以及分析方法。

用于解决课题的手段

为了解决上述课题，本公开的电泳装置的特征在于，具备：样品的电泳路径；分光元件，其对来自所述电泳路径内的所述样品的光进行分光；光检测器，其对由所述分光元件分光后的光进行检测；以及运算部，其基于来自所述光检测器的信号，求出所述光的光谱，所述运算部使用针对每个泳动条件或荧光色素确定的校正系数来校正所述光谱。

另外，本公开的另一电泳装置的特征在于，具备：样品的电泳路径；分光元件，其对来自所述电泳路径内的所述样品的光进行分光；光检测器，其对由所述分光元件分光后的光进行检测；以及运算部，其基于所述光检测器的信号，计算出所述光的信号强度，所述光检测器以信号取得宽度取得所述信号，所述信号取得宽度被设定成多个荧光色素的光谱间的相关系数为预定值以上。

根据本说明书的记述、附图，与本公开相关的进一步的特征将变得清楚。另外，本公开的方式通过要素以及多种要素的组合以及以后的详细的记述和所附的请求专利保护的范围的方式来实现。

本说明书的记述只不过是典型的例示，在任何意义上都不限定本公开的请求专利保护的范围或应用例。

发明效果

根据本公开，不需要在每次变更泳动条件、荧光色素时重新进行光谱校准。其结果是，减轻了操作员的麻烦和费用。上述以外的课题、结构以及效果通过以下的实施方式的说明而变得明确。

附图说明

图1是表示由多毛细管电泳装置检测出的荧光的信号强度(上段)和波长(下段)的图。

图2是表示现有的光谱校准方法的流程图。

图3A是用于说明现有技术的光谱校准的概要的图。

图3B是用于说明现有技术的光谱校准的概要的图。

图4是用于说明伪峰的图。

图5是表示第1实施方式的多毛细管电泳装置的概略图。

图6是表示恒温槽内的光学系统的结构的概略图。

图7是表示第1实施方式的校正系数的计算方法的流程图。

图8A是说明第1实施方式中的矩阵M’的计算概要的图。

图8B是说明第1实施方式中的矩阵M’的计算概要的图。

图9是表示实际样品的电泳中的校正系数的应用方法的流程图。

图10是实际样品的电泳方法的流程图。

图11是用于说明高斯拟合的图。

图12是表示第2实施方式的样品的分析方法的流程图。

图13是表示实验例1的结果的图。

图14是表示第3实施方式的样品的分析方法的流程图。

图15A是表示实验例2中使用的荧光色素的图。

图15B是表示实验例2的结果的图。

图16是表示第5实施方式的样品的分析方法的流程图。

图17A是实验例3中取得的荧光光谱。

图17B是在实验例3的对照实验中取得的荧光光谱。

图18是表示第6实施方式的样品的分析方法的流程图。

具体实施方式

以下，参照附图对实施方式进行说明。在附图中，有时功能上相同的要素也用相同的编号显示。此外，附图示出了遵循本公开的技术原理的实施方式和安装例，但这些是用于理解本公开的，决不用于限定性地解释本公开的技术。本说明书的记述只不过是典型的例示，在任何意义上都不限定本公开的请求专利保护的范围或应用例。

在本实施方式中，本领域技术人员为了实施本公开而充分详细地进行了说明，但需要理解的是，其他的安装、形态也是可能的，能够不脱离本公开的技术思想的范围和精神地进行结构、构造的变更、多样的要素的置换。因此，不能将以后的记述限定于此进行解释。

[第1实施方式]

如背景技术所述，在基准光谱与实际样品的荧光光谱之间产生偏离时，无法计算出正确的权重值，而记录错误的荧光强度。该偏离主要是由于光谱因荧光色素的变性发生变化而产生的。荧光色素的变性是由于不适当的pH、不适当的温度下的保管、色素的过度激发而产生的。另外，荧光色素的变性在光谱校准时和实际样品泳动时泳动电压不同的情况下也可能发生。在具备多个毛细管的电泳装置中，激发光强度按每个毛细管而不同，因此可能产生偏离。应注意的是，在上述列举的各个例子中，变性的程度根据荧光色素而不同。另外，在实际样品被与矩阵标准品不同的荧光色素标记的情况下，当然也会产生偏离。

因此，在第1实施方式中，对购买了多毛细管电泳装置的操作员在光谱校准时和实际样品泳动时泳动电压不同的情况下的运用(荧光光谱的校正)进行说明。另外，在本说明书中，有时将多毛细管电泳装置的制造商在该装置出厂前实施的光谱校准称为“第一光谱校准”，将购买了多毛细管电泳装置的操作员进行的光谱校准称为“第二光谱校准”。

＜多毛细管电泳装置的结构例＞

图5是表示第1实施方式的多毛细管电泳装置500的结构的概略图。如图5所示，多毛细管电泳装置500具备装置主体501和控制用计算机502。

装置主体501具备运算控制电路503、光检测器504、恒温槽505、毛细管阵列506、光源507、光照射部508、加载头509、阴极用缓冲液容器511、样品容器512、聚合物盒513、阳极用缓冲液容器514、阳极515、高压电源516、阵列头517、搬送机518、注射机构520、加热冷却机构523以及衍射光栅524。

装置主体501与控制用计算机502可通信地连接。操作员能够操作控制用计算机502来控制装置主体501所具有的各部。控制用计算机502接收由装置主体501取得的数据(光检测器504的检测信号等)。控制用计算机502具备显示接收到的数据的显示器。此外，控制用计算机502也可以内置于装置主体501内。

运算控制电路503基于光检测器504的检测信号执行测定值(荧光强度)的运算处理，并且对测定值(荧光强度)执行校正。另外，运算控制电路503按照来自控制用计算机502的输入、命令，控制装置主体501。

光检测器504是检测由作为从光源507向毛细管阵列506照射的激发光的激光产生的荧光的光传感器。作为光源507，可以适当使用液体激光器、气体激光器、半导体激光器等，也可以用LED代替。光源507可以从毛细管阵列506的排列的两侧照射激发光，另外，也可以构成为分时地照射激发光。

恒温槽505是用于对毛细管阵列506的温度进行控制的温度控制机构。恒温槽505为了在槽内保持温度固定而被绝热材料覆盖，通过加热冷却机构523控制温度。由此，能够将毛细管阵列506的大部分的温度维持为例如60℃左右的固定温度。

毛细管阵列506通过排列多根(在图5的例子中为4根)毛细管519(电泳路径)而构成。毛细管阵列506在确认到破损、品质的劣化的情况下，能够构成为可适当地更换为新品的更换部件。另外，毛细管阵列506能够根据测定而置换为具有不同根数、长度的毛细管的其他毛细管阵列。

构成毛细管阵列506的多个毛细管519分别能够由内径数十～数百μm、外径数百μm的玻璃管构成。另外，为了提高强度，玻璃管的表面也可以被聚酰亚胺被膜覆盖。但是，在照射激光的部位及其附近，毛细管519的表面的聚酰亚胺被膜被除去。毛细管519的内部填充有用于分离生物体试样(样品)中的DNA分子的分离介质。在此，使用作为电泳用而市售的聚丙烯酰胺基分离凝胶(以下，记作“聚合物”)。

光照射部508配置于毛细管阵列506的一部分。如后所述，光照射部508构成为能够使来自光源507的激光(激发光)共同入射到多个毛细管519，并将从多个毛细管519发出的荧光引导至光检测器504。具体而言，为了向设置于毛细管阵列506的光照射部位照射作为测定光的激光，光照射部508具有光纤、透镜等投光光学系统。衍射光栅524(分光元件)对来自毛细管519的光进行分光，使其入射到光检测器504。

在本公开中，说明了通过光检测器504检测基于激发光的照射的来自荧光色素的荧光的例子，但检测的光并不限定于荧光，也可以是吸光、发光等。

加载头509设置于毛细管阵列506的一端。加载头509作为被施加用于向毛细管519内导入生物体试样(样品)的负电压的阴极发挥功能。在毛细管阵列506的另一端设置有阵列头517，阵列头517将多根毛细管519捆扎成1束。另外，阵列头517在其下表面具备用于插入聚合物盒513的尖部521。

搬送机518构成为在其上表面载置阴极用缓冲液容器511、样品容器512、聚合物盒513以及阳极用缓冲液容器514，并对它们进行搬送。作为一例，搬送机518具备3个电动马达和线性致动器，能够在上下、左右、前后这3个轴方向上移动。

阴极用缓冲液容器511和阳极用缓冲液容器514是保持泳动用的缓冲液的容器，样品容器512是保持测定对象的试样(样品)的容器。

聚合物盒513是保持泳动用的聚合物的容器。聚合物盒513的上部522被橡胶或硅酮等可塑性高的材料密闭，与用于填充聚合物的注射机构520及搬送机518连结。

从聚合物盒513向毛细管519内填充聚合物时的顺序如以下的(1)～(3)所示。

(1)搬送机518进行动作，阵列头517移动到聚合物盒513的上侧。

(2)阵列头517的尖部521贯通聚合物盒513的上部522。此时，可塑性高的聚合物盒513的上部522将阵列头517的尖部521包入，由此两者紧贴，聚合物盒513与毛细管519以密闭状态连结。

(3)注射机构520将聚合物盒513内部的聚合物上推，将聚合物注入到毛细管519。

在阳极用缓冲液容器514中，以与缓冲液接触的方式配置有施加用于泳动的正电压的阳极515。高压电源516连接在阳极515与作为阴极的加载头509之间。

搬送机518将阴极用缓冲液容器511及样品容器512搬送到毛细管519的阴极端510。此时，阳极用缓冲液容器514联动地移动到相当于毛细管519的阳极端的尖部521。

样品容器512内含与毛细管519相同数量的样品管。操作员向样品管分注DNA。

运算控制电路503(运算部)具备测定值运算部5032、校正系数运算部5033、校正系数数据库5034以及校正部5035。

测定值运算部5032基于光检测器504的检测信号计算出测定值(荧光强度)。校正系数运算部5033计算用于校正由测定值运算部5032计算出的测定值的校正系数。校正系数数据库5034存储由校正系数运算部5033计算出的校正系数。另外，校正部5035对测定值运算部5032的测定值应用存储于校正系数数据库5034的校正系数，计算校正后的测定值。上述的运算控制电路503的各部的运算处理例如能够通过CPU、MPU等处理器执行程序来实现。

图6是表示恒温槽505内的光学系统的结构的概略图。如图6所示，作为一例，光照射部508具有多个(在图6中为2个)反射镜602以及聚光透镜603。反射镜602使来自光源507的激光601的行进方向变化。另外，聚光透镜603将激光聚光于毛细管阵列506的光照射部位。由此，激光601依次入射到多个毛细管519。各毛细管519内的荧光色素被激光601激发，发出信息光(具有取决于样品的波长的荧光)。该信息光被衍射光栅524在波长方向上分光。分光后的信息光被光检测器504检测。此时，光检测器504也能够连续地(实际上按每个像素离散地)测量光谱，但在本实施方式中，作为一例，仅取得20个波长λ(0)～λ(19)的信号强度。

这样，通过用光检测器504观测由激光601的入射而发出的荧光的荧光强度，能够进行电泳中的DNA的分析。电泳是指，通过在阴极、阳极缓冲液间产生的电场作用，对毛细管119中的样品赋予迁移率，通过取决于样品的性质的迁移率之差将样品分离。在此，以样品为DNA的情况为例进行说明。

DNA通过相当于双螺旋骨架的磷酸二酯键，在聚合物中具有负电荷。因此，在DNA电场中向阳极侧移动。此时，聚合物具有网眼状结构，因此DNA的迁移率取决于网眼的潜入容易度，换言之取决于DNA的尺寸。碱基长度短的DNA容易穿过网眼状结构，迁移率也变高，碱基长度长的DNA与其相反。由于在DNA上预先标记有荧光物质(荧光体)，因此从碱基长度短的DNA开始依次用光检测器504进行光学检测。通常，按照泳动时间最长的样品来设定测定时间和电压施加时间。

＜校正系数的计算方法＞

如上所述，本实施方式提出了在光谱校准时和实际样品泳动时泳动电压不同的情况下的荧光光谱的校正方法。多毛细管电泳装置500的制造商在装置出厂前求出用于校正实际样品泳动时取得的荧光光谱的校正系数，并登记在运算控制电路503的校正系数数据库5034中。

图7是表示校正系数的计算方法的流程图。对校正系数的计算方法进行概述，首先，在步骤S1中，制造商使用矩阵标准品进行光谱校准，通过运算控制电路503取得成为基准的矩阵M。接着，在步骤S2中，通过运算控制电路503取得用于校正的矩阵M’。最后，在步骤S3中，通过运算控制电路503取得校正系数矩阵K。

(步骤S1)

在步骤S1中，制造商使用包含用任意的荧光色素标记的DNA片段的矩阵标准品进行光谱校准(第一光谱校准)。在本实施方式中，作为一例，使用ROX、TMR、R110、R6G作为荧光色素。泳动电压应该与后述的实际样品泳动前的光谱校准(第二光谱校准)中的泳动电压相同。在本实施方式中，作为一例设为15kV，但泳动电压并不限定于此。

制造商通过控制用计算机502的输入装置的操作，将荧光色素的种类和泳动电压登记在运算控制电路503中。测定值运算部5032在该条件下求出矩阵M。

在此，本公开应解决的课题之一是，若在操作员进行的光谱校准时和实际样品泳动时泳动电压不同，则在基准光谱与实际样品的荧光光谱间产生偏离。泳动电压影响电泳所需的时间、作为分析时的重要的质量指标之一的分离能力。因此，在使用多毛细管电泳装置时，操作员根据需要频繁地变更实际样品的泳动电压。而且，每当变更实际样品的泳动电压时，操作员需要以与实际样品相同的泳动电压重新进行光谱校准。

为了解决该课题，在本实施方式中，提出了在多毛细管电泳装置出厂前以各种泳动电压进行第一光谱校准，将在此发现的光谱间的偏离定量化，从而将使偏离最小化的校正系数预先登记在运算控制电路503中。校正系数与所使用的荧光色素、泳动电压等信息一起登记。

购买了装置的操作员能够从登记在运算控制电路503中的信号中选择任意的泳动电压，在进行了第二光谱校准之后，以同样登记在运算控制电路503中的任意的泳动电压使实际样品泳动。即，在登记于运算控制电路503的范围内，即使将实际样品的泳动电压变更几次，操作员也不需要每次都重新进行光谱校准。

若设想以上的运用，则在步骤S1中，制造商不仅应该以15kV进行矩阵标准品的迁移，还应该以多个电压进行矩阵标准品的迁移。然后，应该将所取得的全部矩阵M与泳动电压和荧光色素的信息一起登记到运算控制电路503中。

对于矩阵M的计算方法，如上所述。

(步骤S2)

在步骤S2中，制造商以与实际样品相同的荧光色素和相同的泳动条件使矩阵标准品泳动。在此，假设用与在步骤S1中使用的矩阵标准品相同的荧光色素对实际样品进行标记，并以7.5kV进行泳动。此时，制造商通过控制用计算机502的输入装置的操作，将荧光色素的种类和泳动电压登记在运算控制电路503中。

如上所述，在矩阵标准品中包含分别用不同的荧光色素标记的长度不同的DNA片段，因此在各峰时刻(t0’、t1’、t2’、t3’)，各荧光色素单独发光。另外，由于与各个荧光色素对应的峰时刻的出现顺序是已知的，所以能够鉴定与各个峰时刻对应的荧光色素的种类。

图8A是表示通过进行矩阵标准品的电泳而得到的信号强度的波形的图，纵轴表示信号强度，横轴表示时刻。如图8A所示，ROX在时间t'0单独发光，TMR在时间t'1单独发光，R110在时间t'2单独发光，R6G在时间t'3单独发光。各个时刻的光谱相当于各个荧光色素的荧光光谱。因此，运算控制电路503通过取得各个峰时刻的光谱来取得各荧光色素的荧光光谱。

图8B是从图8A的信号强度波形取得的荧光光谱，纵轴表示荧光强度，横轴表示波长。

测定值运算部5032使用各荧光光谱计算出矩阵M’。以下的数式2表示取得了20个波长λ(0)～λ(19)下的信号强度的情况下的矩阵M’的一例。矩阵M’的要素相当于在各峰时刻(t’0、t’1、t’2、t’3)各个波长的各个荧光色素的强度比率。例如，数式2的要素W’X1是时刻t’0、波长λ(1)的荧光色素ROX的荧光强度的比率。

[数式2]

另外，在步骤S2中，由于在步骤S1中叙述的理由，在实际的运用中通过包含7.5kV的多个电压使矩阵标准品泳动，将所取得的全部矩阵M’与泳动电压、荧光色素等信息一起登记到运算控制电路503中。

(步骤S3)

返回到图7，在步骤S3中，测定值运算部5032将计算出的矩阵M和M’发送到校正系数运算部5033。校正系数运算部5033根据矩阵M和M’取得校正系数矩阵K。校正系数矩阵K的要素在荧光色素i、波长j中定义为校正系数矩阵K的要素k(ij)＝w’(ij)/w(ij)。如已经叙述的那样，将在步骤S1和步骤S2中使用的荧光色素以及泳动电压登记在运算控制电路503中。因此，k(ij)能够与计算中使用的泳动条件和荧光色素的信息一起蓄积在校正系数数据库5034中。此时，如步骤S1和S2所述，在通过多个泳动电压取得矩阵M和M’的情况下，校正系数运算部5033通过其全部的组合计算校正系数矩阵K，并与泳动电压和荧光色素的信息一起登记到校正系数数据库5034中。

＜基于实际样品的电泳的分析方法＞

图9是表示操作员进行的实际样品的电泳中的校正系数的应用方法的流程图。

(步骤S11)

上述的步骤S1～S3在操作员购买多毛细管电泳装置500的时间点已经结束。操作员仅进行步骤S11以后的操作即可。另外，在购买时(步骤S3之后)，为了搬运装置而装卸毛细管，光检测器504与毛细管519的位置关系发生变化。即，装置是需要再次进行光谱校准的状态。

在步骤S11中，操作员与步骤S1同样地使用矩阵标准品进行光谱校准。为了方便，将操作员进行的光谱校准称为“第二光谱校准”。第二光谱校准中的泳动电压只要是登记在校正系数数据库5034中的泳动电压，就能够任意地选择。在本实施方式中，作为一例，设为以15kV进行泳动。另外，关于荧光色素，矩阵标准品用ROX、TMR、R110、R6G标记。将通过步骤S11的第二光谱校准由测定值运算部5032取得的矩阵M设为矩阵M(r)。

(步骤S12)

在步骤S12中，操作员进行实际样品的泳动。假设实际样品是未知的样品，但荧光色素的种类和泳动电压是已知的。实际样品的泳动条件为步骤S2中的7.5kV。关于荧光色素，与矩阵标准品同样地，实际样品也用ROX、TMR、R110、R6G标记。

图10是步骤S12中的实际样品的电泳方法的流程图。如图10所示，电泳的基本顺序包括样品准备(步骤S121)、分析开始(步骤S122)、分离介质填充(步骤S123)、预备泳动(步骤S124)、样品导入(步骤S125)以及泳动分析(步骤S126)。

(步骤S121)

在步骤S121中，作为分析开始前的样品准备，操作员将样品以及试剂设置于多毛细管电泳装置500。更具体而言，首先，操作员在图5所示的阴极用缓冲液容器511和阳极用缓冲液容器514中充满形成通电路径的一部分的缓冲液。缓冲液例如可以使用市售的电泳用的电解质液。另外，操作员向样品容器512的孔内分注作为分析对象的实际样品。实际样品例如为DNA的PCR产物。另外，操作员向注射机构520内注入用于使样品电泳的分离介质。分离介质使用上述聚合物。而且，在预想毛细管519的劣化的情况下、变更毛细管519的长度的情况下，操作员更换毛细管阵列506。

(步骤S122)

在步骤S122中，操作员通过控制用计算机502的输入装置的操作，将实际样品中使用的荧光色素的种类和泳动电压登记到运算控制电路503中。然后，操作员向控制用计算机502输入分析开始的指示。控制用计算机502在被输入分析开始的指示时，将该指示发送到装置主体501。由此，装置主体501开始进行分析。

(步骤S123)

在步骤S123中，装置主体501开始向毛细管519内填充聚合物。聚合物填充是指，在毛细管519内填充新的聚合物，形成泳动路径的步骤。

在本实施方式的聚合物填充中，首先，利用图5所示的搬送机518将阴极用缓冲液容器511搬运至加载头509的正下方，以承接从毛细管519的阴极端510排出的使用完的聚合物。然后，驱动注射机构520，向毛细管519填充新的聚合物，将使用完的聚合物废弃。最后，为了防止分离介质的干燥，将阴极端510浸渍在阴极用缓冲液容器511内的缓冲液中。

(步骤S124)

在步骤S124中，装置主体501实施预备泳动。预备泳动是指，对聚合物施加预定的电压，使聚合物成为适于电泳的状态的步骤。

在本实施方式的预备泳动中，首先，利用搬送机518将阴极端510浸渍到阴极用缓冲液容器511内的缓冲液中，形成通电路径。然后，通过高压电源516对聚合物施加数～数十分钟的数～数十千伏左右的电压，使聚合物成为适于电泳的状态。最后，为了防止聚合物的干燥，将阴极端510浸渍在阴极用缓冲液容器511内的缓冲液中。

(步骤S125)

在步骤S125中，装置主体501向泳动路径导入样品成分。该步骤可以自动进行，也可以依次从控制用计算机502发送控制信号来进行。

在本实施方式的样品导入中，首先，利用搬送机518将阴极端510浸渍于保持在样品容器512的孔内的样品中。由此，形成通电路径，成为能够向泳动路径导入样品成分的状态。然后，通过高压电源516向通电路径施加脉冲电压，向泳动路径导入样品成分。最后，为了防止聚合物的干燥，将阴极端510浸渍在阴极用缓冲液容器511内的缓冲液中。

(步骤S126)

在步骤S126中，装置主体501实施泳动分析。在泳动分析中，通过电泳对样品中包含的各样品成分进行分离分析。

在本实施方式的泳动分析中，首先，利用搬送机518将阴极端510浸渍于阴极用缓冲液容器511内的缓冲液中，形成通电路径。接着，通过高压电源516对通电路径施加7.5kV的高电压，使泳动路径产生电场。通过产生的电场，泳动路径内的各样品成分以取决于各样品成分的性质的速度向光照射部508移动。即，样品成分通过其移动速度之差而被分离。然后，光检测器504从到达光照射部508的样品成分开始依次进行检测。

例如，在样品包含多个碱基长度不同的DNA的情况下，根据该碱基长度而在移动速度上产生差异，从碱基长度短的DNA开始依次到达光照射部508。各DNA与对应于解析对象的荧光色素结合。当从光源507向光照射部508照射激发光时，从样品产生信息光(具有取决于样品的波长的荧光)，并向外部释放。该信息光被衍射光栅524在波长方向上分光，由光检测器504检测。图1是由光检测器504检测出的图像的一例。在泳动分析中，在光检测器504中，以固定的时间间隔检测该信息光，将图像数据发送到运算控制电路503。或者，为了减少发送的信息量，光检测器504也可以不发送图像数据，而仅发送图像数据中的一部分区域的亮度(信号强度)。例如，也可以对每个毛细管仅发送固定间隔的波长位置的信号强度。

在本实施方式中，如在图1的说明中叙述的那样，上述的图像数据中，按每个毛细管仅将20的波长λ(0)～λ(19)的信号强度数据发送给运算控制电路503。该信号强度数据表示各毛细管中的各DNA样品的光谱，该光谱被存储到测定值运算部5032中。在测定值运算部5032中存储上述泳动分析中的全部检测时刻的全部毛细管519的光谱。此外，能够将全部的检测时刻的光谱存储于测定值运算部5032，但对于操作员来说仅特定的峰时刻重要的情况下，也可以仅存储特定时刻周边的光谱。

(步骤S127)

在步骤S127中，装置主体501在取得预定的图像数据结束后停止电压施加，结束泳动分析。

以上是图9中的电泳处理(步骤S12)的处理的一例。此外，步骤S123～S127既可以由装置主体501自动地进行，也可以依次从控制用计算机502发送控制信号来进行。

(步骤S13)

返回到图9，在步骤S13中，校正部5035从校正系数数据库5034调出具有矩阵M(r)的取得时间以及与步骤S12的实际样品相同的泳动电压、荧光色素的组合的校正系数矩阵K，对矩阵M(r)的各要素乘以矩阵K的各要素k(ij)来计算矩阵M(r)k。

(步骤S14)

在步骤S14中，校正部5035计算荧光强度。具体而言，校正部5035根据在上述电泳处理(步骤S12)中得到的图像数据，计算各荧光色素的强度。在本步骤S14中，对各个时刻的各个毛细管519的光谱乘以波长λ(0)～λ(19)中的各荧光色素的强度比率并相加即可。若将其用矩阵表现，则成为以下的数式3。

[数式3]

c＝M(r)k f

c＝[c_X c_T c_R c_G ]

f＝[f₀ f₁ f₂ ······ f₁₈ f₁₉]

在此，向量C表示所使用的各荧光色素的荧光强度。因此，向量C的要素CX、CT、CR、CG分别表示ROX、TMR、R110、R6G的荧光强度。向量f表示光检测器504观测到的信号强度。向量f的要素f0～f19分别表示波长λ(0)～λ(19)的信号强度。要素f0～f19分别可以是波长λ(0)～λ(19)附近的信号强度的加法平均等。

此外，在由光检测器504检测出的各个波长λ(0)～λ(19)的测量信号中，除了基于荧光色素的信号以外，还包含来自填充于毛细管519内的聚合物的拉曼散射光作为基线信号。因此，在计算向量f时，需要预先去除该基线信号。

作为基线信号的去除方法的一例，在装置出厂前预先求出拉曼散射光的光谱，将其作为基线信号存储在运算控制电路503中。然后，通过从各个时刻的测量信号中减去该基线信号，求出基于荧光色素的信号，将其作为向量f。或者，也可以将各时刻附近的最小值作为该时刻的基线信号值。

在将测量光谱f变换为荧光强度向量时，使用矩阵M(r)k。

校正部5035通过上述数式3根据测量光谱计算各荧光色素的荧光强度。对各时刻的各毛细管519的光谱进行该处理，从而能够得到各毛细管519的荧光强度的时间序列数据。以下，将该荧光强度的时间序列数据称为荧光强度波形。

(步骤S15)

在步骤S15中，校正部5035对上述荧光强度波形进行峰检测。在峰检测中，主要重要的是峰的中心位置(峰时刻)、峰的高度以及峰的宽度。峰的中心位置对应于DNA片段长度。峰的高度用于样品中的DNA浓度的大小等品质评价。峰的宽度在评价样品、电泳结果的品质方面也是重要的。作为推定这样的实际数据的峰参数的方法之一，能够使用作为已知技术的高斯拟合。

图11是表示高斯拟合的概念的图。如图11所示，高斯拟合是针对固定区间的实际数据，计算高斯函数g最佳地近似实际数据那样的参数(平均值μ、标准偏差σ以及最大振幅值A)的处理。作为表示实际数据的近似程度的指标，使用实际数据与高斯函数值的最小二乘误差的情况较多。作为使该最小二乘误差最小的数值计算方法，能够使用高斯牛顿法等方法使参数最佳化。此外，也可以应用2个以上的峰波形混合的情况、峰周边的数据非对称的情况等提高精度的方法。并且，如果高斯函数g的方差σ确定，则其半值全宽(FWHM：FullWidth at Half Maximum)由图11中所示的式子得到。可以将该值设为峰宽度。

这样，校正部5035对全部荧光色素的荧光强度波形求出峰参数。此时，在峰宽度、峰的高度不满足预先决定的阈值条件的情况下，也可以从峰中排除。

通过以上的操作，使用以15kV的泳动电压得到的矩阵M，正确地计算以7.5kV的泳动得到的实际样品的信号强度。在本实施方式中例示了特定的泳动电压的组合，但实际上，操作员能够在登记于校正系数数据库5034的范围内任意地选择第二光谱校准(步骤S11)和实际样品泳动(步骤S12)的泳动电压。

＜技术效果＞

如上所述，在第1实施方式中，在多毛细管电泳装置500出厂前，以多个泳动电压进行第一光谱校准以及与实际样品相同的条件下的泳动，针对泳动电压的每个组合，取得用于校正光谱的偏离的校正系数矩阵K，并与荧光色素的信息一起登记到校正系数数据库5034中。购买了装置的操作员能够通过登记在校正系数数据库5034中的任意的泳动电压的组合来实施第二光谱校准和实际样品的泳动，另外，即使操作员变更实际样品泳动时的电压，基准光谱与实际样品的荧光光谱也不会偏离，因此即使不重新进行第二光谱校准，也能够取得正确的荧光强度。

[第2实施方式]

在第1实施方式中，使用矩阵标准品来取得矩阵M’，但在第2实施方式中提出了使用已知的DNA样品取得矩阵M’的方法。已知的DNA样品是指DNA的PCR产物、市售的标准样品等。在本实施方式中，作为一例，矩阵标准品、已知的DNA样品、实际样品都用ROX、TMR、R110、R6G标记。另外，在已知的DNA样品的泳动中，各荧光色素单独发光的时刻(t0’、t1’、t2’、t3’)是已知的。

图12是表示第2实施方式的样品的分析方法的流程图。

在步骤S21中，制造商与步骤S1同样地使用矩阵标准品进行光谱校准，测定值运算部5032取得矩阵M。泳动电压为15kV。

在步骤S22中，制造商使已知的DNA样品泳动。

在步骤S23中，测定值运算部5032取得各荧光色素单独发光的时刻(t0’、t1’、t2’、t3’)的光谱，根据各个荧光色素的强度比率制作矩阵M’。泳动电压为7.5kV。

在步骤S24中，与步骤S3同样地，校正系数运算部5033基于矩阵M和M’计算校正系数矩阵K。校正系数矩阵K与泳动电压和荧光色素的信息一起登记在校正系数数据库5034中。如在第1实施方式的步骤S1中叙述的那样，在实际的运用中，以各种泳动电压进行步骤S21以及S22，取得多个矩阵M以及M’。在以多个电压进行了泳动的情况下，登记所有的校正系数矩阵K。

与第1实施方式同样地，步骤S21～S24在制造商侧在多毛细管电泳装置500出厂前实施，校正系数矩阵K已经登记在校正系数数据库5034中。购买了装置的操作员实际进行的作业为接下来的步骤S25以后。在此，在步骤S24之后，在搬运时进行毛细管519的装卸，光检测器504与毛细管519的位置关系变化。如果在步骤S24以后没有进行毛细管519的装卸，则能够从在步骤S21中得到的矩阵M中选择与实际样品泳动(步骤S26)相同的泳动电压的矩阵，并设为后述的矩阵M(r)k。

在步骤S25中，与步骤S11同样地，操作员进行第二光谱校准，测定值运算部5032取得矩阵M(r)。作为一例，步骤S25中的泳动电压设为15kV，但在实际的运用中能够从登记于校正系数数据库5034的泳动电压中选择任意的泳动电压。

在步骤S26中，与步骤S12同样地，操作员进行实际样品的泳动。作为一例，此处的泳动电压设为7.5kV，但在实际应用时能够从登记于校正系数数据库5034中的泳动电压中任意选择。

关于步骤S27～S29，与第1实施方式中说明的步骤S13～S15(图9)相同，因此省略说明。

通过以上的操作，即使在第一光谱校准时(步骤S21)和实际样品泳动时(步骤S25)泳动电压不同，基准光谱和实际样品的荧光光谱也不会偏离，能够正确地计算实际样品的荧光强度。在此例示了特定的泳动电压的组合，但实际上操作员能够在登记于校正系数数据库5034的范围内任意地选择第二光谱校准(步骤S25)和实际样品泳动(步骤S26)的泳动电压。

＜技术效果＞

如上所述，在第2实施方式中，与第1实施方式同样地，购买了装置的操作员能够通过登记在校正系数数据库5034中的任意的泳动电压的组合来实施第二光谱校准和实际样品的泳动，另外，即使操作员变更实际样品泳动时的电压，基准光谱与实际样品的荧光光谱也不会偏离，因此即使不重新进行第二光谱校准，也能够取得正确的荧光强度。

＜实验例1＞

按照以下的步骤确认了第2实施方式的效果。

(试样)

作为第一光谱校准(步骤S21)时的矩阵标准品，使用BigDye(注册商标)Terminator v3.1 Matrix Standards(Dye Set Z)(Applied Biosystems公司制)。已知的DNA样品(步骤S22)和实际样品(步骤S26)均使用3500/3500xL Sequencing Standards，BigDye(注册商标)Terminator v3.1(Applied Biosystems公司制)。以上的样品均使用ROX、TMR、R110、R6G作为荧光色素。

(分析步骤)

在实验例1中，作为第2实施方式的验证，步骤S21～S26分别按照步骤S1、S12、S2、S3、S11、S12所记载的要领进行。泳动时的毛细管长度为36cm，样品注入时的施加电压为1.6kV，泳动时的施加电压在第一光谱校准时(步骤S21)为15kV，已知样品泳动及实际样品泳动时的电压为7.5kV。

接着，以步骤S13～S15所记载的要领执行步骤S27～S29。

作为第2实施方式的对照，不应用校正系数矩阵K，而使用矩阵M进行实际样品的光强度计算和峰检测。在第2实施方式与其对照中比较了伪峰的信号强度。

(实验结果)

图13是表示实验例1的结果的图。图13示出了在步骤S21、S23和S24中获得的矩阵M、矩阵M’和校正系数矩阵K。

在图13中的图表中，横轴表示峰时刻，纵轴表示荧光强度。在对照中确认到伪峰，但显然在第2实施方式的方法中得到了减轻。

[第3实施方式]

在第1和第2实施方式中，说明了第二光谱校准时和实际样品泳动时泳动电压不同的情况，但在第3实施方式中，说明荧光色素不同的情况。在本实施方式中，作为一例，第一光谱校准中使用的矩阵标准品用FAM、JOE、TMR、CXR标记。另外，实际样品用R6G、R110、TMR、ROX标记。

图14是表示第3实施方式的样品的分析方法的流程图。

在步骤S31中，与步骤S1同样地，制造商使用矩阵标准品进行光谱校准，测定值运算部5032取得矩阵M。但是，样品使用由FAM、JOE、TMR、CXR标记的矩阵标准品。

在步骤S32中，与步骤S1同样地，制造商取得矩阵M’。但是，样品使用由R6G、R110、TMR、ROX标记的矩阵标准品。

在步骤S33中，与步骤S3同样地，校正系数运算部5033基于矩阵M和M’计算校正系数矩阵K。校正系数矩阵K与泳动电压和荧光色素的信息一起登记在校正系数数据库5034中。如在第1实施方式的步骤S1中叙述的那样，在实际的运用中，在步骤S31以及S32中，通过各种荧光色素的组合，取得多个矩阵M以及M’。在以多个荧光色素的组合进行了泳动的情况下，登记所有的校正系数矩阵K。

与第1实施方式同样地，步骤S31～S33在制造商侧在多毛细管电泳装置500出厂前实施，校正系数矩阵K已经登记在校正系数数据库5034中。购买了装置的操作员实际进行的作业为接下来的步骤S34以后。在此，在步骤S33之后，在搬运时进行毛细管519的装卸，光检测器504与毛细管519的位置关系变化。如果在步骤S33以后没有进行毛细管519的装卸，则能够从在步骤S31中得到的矩阵M中选择与实际样品泳动(步骤S35)相同的荧光色素的矩阵，并作为后述的矩阵M(r)k。

在步骤S34中，与步骤S11同样地，操作员进行第二光谱校准，测定值运算部5032取得矩阵M(r)。步骤S34中的荧光色素在本实施方式中使用FAM、JOE、TMR、CXR，但在实际应用时能够从登记在校正系数数据库5034中的荧光色素中选择任意的荧光色素。

在步骤S35中，与步骤S12同样地，操作员进行实际样品的泳动。作为一个例子，实际样品用R6G、R110、TMR、ROX标记。但是，在实际应用时，能够从登记在校正系数数据库5034中的荧光色素中选择任意的荧光色素。

关于步骤S36～S38，由于与在第1实施方式中说明的步骤S13～S15(图9)相同，所以省略说明。

通过以上的操作，即使在光谱校准时(步骤S31)和实际样品泳动时(步骤S35)荧光色素不同，基准光谱和实际样品的荧光光谱也不会背离，能够正确地计算实际样品的荧光强度。在此，例示了特定的荧光色素的组合，但实际上操作员能够在登记于校正系数数据库5034的范围内，任意地变更第二光谱校准(步骤S34)和实际样品泳动(步骤S35)的荧光色素。

＜技术效果＞

如上所述，在第3实施方式中，在多毛细管电泳装置500出厂前，使用由不同的荧光色素的组标记的样品，进行第一光谱校准以及与实际样品相同的条件下的泳动，针对荧光色素的每个组合，取得用于校正光谱的偏离的校正系数矩阵K，并登记到校正系数数据库5034中。购买了装置的操作员能够通过登记在校正系数数据库5034中的任意的荧光色素的组合来实施第二光谱校准和实际样品的泳动，另外，即使操作员变更实际样品泳动时的荧光色素，基准光谱与实际样品的荧光光谱也不会偏离，因此即使不重新进行第二光谱校准，也能够取得正确的荧光强度。

＜实验例2＞

按照以下的步骤确认了第3实施方式的效果。

(试样)

作为第一光谱校准(步骤S31)时的矩阵标准品，使用PowerPlex(注册商标)4CMatrix Standards(Promega公司制)。为了取得矩阵M’(步骤S32)，使用BigDye(注册商标)Terminator v3.1 Matrix Standards(Dye Set Z)(Applied Biosystems公司制)。实际样品(步骤S35)使用3500/3500xL Sequencing Standards，BigDye(注册商标)Terminatorv3.1(Applied Biosystems公司制)。

图15A是表示实验例2中使用的荧光色素的图。如图15A所示，在矩阵标准品(步骤S31)中，使用FAM、JOE、TMR、CXR作为荧光色素。另外，在步骤S32及S35的样品中，均使用ROX、TMR、R110、R6G作为荧光色素。

(分析步骤)

在实验例2中，作为第3实施方式的验证，步骤S31、S32、S33、S34分别以步骤S1、S1、S3、S11所记载的要领进行。泳动时的毛细管长度为36cm，样品注入时的施加电压为1.6kV，泳动时的施加电压在第一光谱校准时(步骤S31)在所有步骤中为15kV。

接着，以步骤S12～S15中记载的要领执行步骤S35～S38。

作为第3实施方式的对照，不应用校正系数矩阵K，而使用矩阵M进行实际样品的光强度计算和峰检测。在第3实施方式与其对照中比较了伪峰的信号强度。

(实验结果)

图15B是表示实验例2的结果的图。图15B示出了在步骤S31～S33中得到的矩阵M、矩阵M’和校正系数矩阵K。

在图15B的图表中，横轴表示峰时刻，纵轴表示荧光强度。在对照中确认到伪峰，但显然在第3实施方式的方法中得到了减轻。

[第4实施方式]

在第1实施方式中，将由特定的装置得到的校正系数矩阵K应用于由相同的装置得到的实际样品的数据。在第4实施方式中，提出了将由某特定的装置得到的校正系数矩阵K应用于由其他装置得到的实际样品的数据的方法。

在本实施方式中，作为一例，与第3实施方式同样地以荧光色素不同的情况(图14)为例进行说明。作为一例，第一光谱校准(步骤S31)中使用的矩阵标准品由FAM、JOE、TMR、CXR标记。而且，实际样品用R6G、R110、TMR、ROX标记。

第一光谱校准(步骤S31)、矩阵M’的取得(步骤S32)、校正系数矩阵K的计算(步骤S33)在制造商侧在特定的多毛细管电泳装置A中与第3实施方式同样地进行。装置A例如经由网络将校正系数矩阵K发送到不同的装置(多个装置)，并登记到各个校正系数数据库5034中。例如，也可以在出厂前的全部多毛细管电泳装置中登记校正系数矩阵K。

步骤S34以后能够在登记有与装置A相同的校正系数矩阵K的任意的装置中实施。

＜技术效果＞

如上所述，在第4实施方式中，将使用特定的多毛细管电泳装置取得的校正系数矩阵K也登记在其他装置中。由此，不需要在各装置中测量校正系数矩阵K，因此能够减轻制造商侧的费用和时间。

[第5实施方式]

在第1实施方式中，通过对由第二光谱校准得到的矩阵M(r)乘以校正系数矩阵K，防止了矩阵M(r)与实际样品的荧光光谱间的背离。在第5实施方式中，提出了通过变更光检测器检测的信号的波长宽度(信号取得宽度)来防止偏离的方法。对于与第1实施方式相同的处理，省略说明。

图16是表示第5实施方式的样品的分析方法的流程图。

在本实施方式中，多毛细管电泳装置500的光检测器504在对数据进行采样时，测量20个波长λ(0)～λ(19)的信号强度。在此，作为一例举出了20个波长，但实际上也可以取波长λ(0)～λ(19)各自的波长附近的信号强度的加法平均。另外，矩阵标准品用CXR标记，实际样品用ROX标记。这些荧光色素的荧光光谱是已知的，并且不一致。

本实施方式的光检测器504仅检测20个波长，因此CXR的荧光光谱用由20个要素构成的向量Vm表示，ROX的荧光光谱用由20个要素构成的向量Vs表示。

在步骤S51中，测定值运算部5032以向量Vm与向量Vs的相关系数最大的方式定义20个波长(信号取得宽度)。此时，也可以对光谱的极大或其附近赋予权重。另外，如果在实际应用时没有问题，则只要充分提高相关系数即可，不一定需要设为最大值。即，以相关系数成为预定值以上的方式定义信号取得宽度。

在步骤S52中，与步骤S1同样地，操作员进行光谱校准。此时，测定值运算部5032计算由20个要素构成的向量Vc。

在步骤S53中，与步骤S12同样地，操作员进行实际样品的泳动。在此，测定值运算部5032取得的向量f表示光检测器504观测到的信号强度。其要素f0～f19分别表示波长λ(0)～λ(19)中的信号强度。

在步骤S54中，校正部5035计算荧光强度。具体而言，对各个时刻的各个毛细管519的光谱乘以波长λ(0)～λ(19)的各个波长的各荧光色素的强度比率并相加即可。若将其用矩阵表现，则成为以下的数式4。

[数式4]

c＝Vmf

f＝[f₀ f₁ f₂ ······ f₁₈ f₁₉]

Vm＝[w₀ w₁ w₂ ······ w₁₈ w₁₉]

向量c是荧光强度向量。向量f表示光检测器504检测出的信号强度。其要素f0～f19分别表示波长λ(0)～λ(19)中的信号强度。

另外，如第1实施方式的步骤S14所述，在由光检测器504检测出的各个波长λ(0)～λ(19)的测量信号中，除了包含基于荧光色素的信号以外，还包含来自填充于毛细管内的聚合物的拉曼散射光作为基线信号。因此，在计算向量f时，需要预先去除该基线信号。基线去除也可以通过步骤S14中记载的方法进行。

在步骤S55中，校正部5035与步骤S15同样地进行峰检测。

通过以上的操作，即使在光谱校准时(步骤S1)和实际样品泳动时(步骤S12)荧光色素不同，基准光谱和实际样品的荧光光谱也不会偏离，能够正确地计算实际样品的荧光强度。

<技术效果>

如上所述，在第5实施方式中，光检测器504以多个荧光色素的荧光光谱的相关系数变大的波长宽度检测来自毛细管519的光。由此，在泳动时不需要矩阵M(r)k，因此能够缩短分析所需的时间，而且能够减轻对运算控制电路503的负担。

<实验例3>

按照以下的步骤确认了第5实施方式的效果。

(装置)

能够使用在第1实施方式中说明的多毛细管电泳装置500(图5)。但是，作为本实施方式中的一例，光检测器504检测520nm～690nm之间的20个波长的信号强度。在本实验例3中，用于充分提高两个光谱的互相关系数的信号取得宽度是已知的。将用向量表示该20个波长的值设为λtest。另外，作为对照，假定在相同区间以等间隔各8.9nm取得信号的情况，将该20个波长用向量表示为λctrl。以下的数式5表示λtest以及λctrl的要素。

[数式5]

λtest＝(520 529 538 547 556 565 574 583 602 627 634 640 646 653 659665 671 678 684 690)

λctrl＝(520 529 538 547 556 565 574 583 592 601 605 618 627 636 645654 663 672 680 690)

(试样)

光谱校准(步骤S52)时的矩阵标准品使用PowerPlex(注册商标)4C MatrixStandards(Promega公司制)所含的4个峰中的用CXR标记的1个。在实际样品的泳动(步骤S53)中，使用BigDye(注册商标)Terminator v3.1 Matrix Standards(Dye Set Z)(Applied Biosystems公司制)中所含的4个峰中的用ROX标记的1个。

(分析步骤)

在实验例3中，作为第5实施方式的验证，步骤S52和S53分别按照步骤S11和S12中记载的要领进行。泳动时的毛细管长度为36cm，样品注入时的施加电压为1.6kV，泳动时的施加电压在光谱校准时(步骤S52)和实际样品泳动时(步骤S53)均为15kV。

(实验结果)

图17A是实验例3中取得的荧光光谱。图17A示出了在λtest中获得的荧光光谱。以下的数式6表示λtest中的向量Vm和向量Vs的信号强度。如数式6所示，应用了λtest(第五)实施方式的情况下的向量Vm与向量Vs的相关系数(corr.)为0.998。

[数式6]

Vm＝(0.01 0.02 0.02 0.03 0.03 0.04 0.06 0.06 0.16 1.00 0.86 0.71 0.580.43 0.35 0.29 0.24 0.21 0.19 0.17)

Vs＝(0.01 0.01 0.02 0.02 0.02 0.02 0.04 0.04 0.09 1.00 0.89 0.75 0.620.46 0.36 0.29 0.24 0.21 0.19 0.17)

corr.＝0.998

图17B是在实验例3的对照实验中取得的荧光光谱。图17B示出了通过λctrl获得的荧光光谱。以下的数式7表示λctrl中的向量Vm和向量Vs的信号强度。如数式7所示，λctrl的情况下的向量Vm与向量Vs的相关系数(corr.)为0.986。

[数式7]

Vm＝(0.01 0.02 0.02 0.03 0.03 0.04 0.06 0.06 0.16 0.38 0.70 1.00 0.990.79 0.59 0.39 0.30 0.23 0.20 0.17)

Vs＝(0.01 0.01 0.02 0.02 0.02 0.02 0.04 0.04 0.09 0.24 0.54 0.87 1.000.83 0.62 0.420.30 0.23 0.20 0.17)

corr.＝0.986

从数式6和数式7可知，在应用了λtest即第5实施方式的情况下，与对照(λctrl)相比，互相关系数变高。

[第6实施方式]

在第一～第3实施方式中，说明了泳动电压或荧光色素在第二光谱校准时和实际样品泳动时不同的情况。在第6实施方式中，对泳动电压和荧光色素双方不同的情况进行说明。在本实施方式中，作为一例，第一光谱校准中使用的矩阵标准品用FAM、JOE、TMR、CXR标记。另外，实际样品用R6G、R110、TMR、ROX标记。光谱校准时的泳动电压为15kV，实际样品泳动时的泳动电压为7.5kV。

图18是表示第6实施方式的样品的分析方法的流程图。

在步骤S61中，与步骤S1同样地，制造商使用矩阵标准品进行光谱校准，测定值运算部5032取得矩阵M。泳动电压为15kV。

在步骤S62中，与步骤S2同样地，制造商取得矩阵M’。但是，样品使用由R6G、R110、TMR、ROX标记的矩阵标准品。此时的泳动电压为7.5kV。

在步骤S63中，与步骤S3同样地，校正系数运算部5033基于矩阵M和M’计算校正系数矩阵K。校正系数矩阵K与泳动电压和荧光色素的信息一起登记在校正系数数据库5034中。如在第1实施方式的步骤S1中叙述的那样，在实际的运用中，通过各种泳动电压和荧光色素的组合来进行步骤S61以及S62，取得多个矩阵M以及M’。在利用多个泳动电压、多个荧光色素进行泳动的情况下，登记所有的校正系数矩阵K。

与第1实施方式同样地，步骤S61～S63在制造商侧在多毛细管电泳装置500出厂前实施，校正系数矩阵K已经登记在校正系数数据库5034中。购买了装置的操作员实际进行的作业为接下来的步骤S64以后。在此，在步骤S63之后，在搬运时进行毛细管519的装卸，光检测器504与毛细管519的位置关系变化。如果在步骤S63以后没有进行毛细管519的装卸，则能够从在步骤S61中得到的矩阵M中选择与实际样品泳动(步骤S65)相同的荧光色素的矩阵，并作为后述的矩阵M(r)k。

在步骤S64中，与步骤S11同样地，操作员进行第二光谱校准，测定值运算部5032取得矩阵M(r)。作为一个例子，步骤S64中的泳动电压和荧光色素能够设为与第一光谱校准(步骤S61)相同，但实际上能够从登记在校正系数数据库5034中的泳动电压和荧光色素中选择任意的泳动电压和荧光色素。

在步骤S65中，操作员进行实际样品的泳动。这里使用的泳动电压和荧光色素作为一例与矩阵M’的取得时(步骤S62)相同，但实际上能够从登记在校正系数数据库5034中的泳动电压和荧光色素中选择任意的泳动电压和荧光色素。

关于步骤S66～S68，也与第1实施方式中说明的步骤S13～S15(图9)相同，因此省略说明。

通过以上的操作，即使在光谱校准时(步骤S61)和实际样品泳动时(步骤S65)使用的荧光色素和泳动电压双方不同，基准光谱和实际样品的荧光光谱也不会偏离，能够正确地计算实际样品的荧光强度。在此，例示了特定的荧光色素和泳动电压的组合，但实际上，操作员能够在登记于校正系数数据库5034的范围内，任意地变更第二光谱校准(步骤S64)和实际样品泳动(步骤S65)的泳动电压和荧光色素。

＜技术效果＞

如上所述，在第6实施方式中，在多毛细管电泳装置500出厂前，使用用不同的荧光色素的组标记的样品，以不同的泳动电压进行第一光谱校准和实际样品的泳动，针对荧光色素和泳动电压的每个组合，取得用于校正光谱的偏离的校正系数矩阵K，并登记到校正系数数据库5034中。购买了装置的操作员能够通过登记在校正系数数据库5034中的任意的荧光色素和泳动电压的组合来实施第二光谱校准和实际样品的泳动。由此，本实施方式与第1～第3实施方式相比，操作员使用的荧光色素、泳动电压的自由度提高。

[第7实施方式]

在第1～第3实施方式中，说明了泳动电压或荧光色素在第二光谱校准时和实际样品泳动时不同的情况，但在第7实施方式中，说明聚合物的化学特性或组成不同的情况。如上所述，聚合物只不过是分离介质的一个例子，因此当然能够将相同的运用应用于聚合物以外的分离介质。

第7实施方式的分析方法例如能够以与第1实施方式相同的流程实施，因此以下仅说明不同点。

在第7实施方式中，作为一例，在光谱校准(步骤S1和S11)中使用的聚合物含有4％的聚丙烯酰胺。而且，实际样品泳动时(步骤S2和S12)使用的聚合物含有7％的聚丙烯酰胺。矩阵标准品和实际样品都用R6G、R110、TMR、ROX标记，泳动电压均设为15kV。

如第1实施方式所述，在实际的运用中，以各种聚合物的组合进行步骤S1和S2，取得多个矩阵M和M’。在此所说的各种聚合物是指作为一例含有各种浓度的聚丙烯酰胺的聚合物。

在步骤S3中，校正系数运算部5033基于矩阵M和M’计算校正系数矩阵K。校正系数矩阵K与聚合物的种类等信息一起登记于校正系数数据库5034中。在使用多个聚合物进行了泳动的情况下，登记所有的校正系数矩阵K。

根据本实施方式的方法，即使在光谱校准时(步骤S1)和实际样品泳动时(步骤S12)聚合物的组成不同，基准光谱和实际样品的荧光光谱也不会偏离，能够正确地计算实际样品的荧光强度。在此，例示了特定的组成的组合，但实际上操作员能够在登记于校正系数数据库5034的范围内，任意地变更第二光谱校准(步骤S11)和实际样品泳动(步骤S12)的聚合物的化学特性。另外，本实施方式的方法也能够应用于聚合物的组成不同的情况。

[第8实施方式]

在第1～第3实施方式中，说明了泳动电压或荧光色素在光谱校准时和实际样品泳动时不同的情况，但在第8实施方式中说明毛细管519的长度不同的情况。

第8实施方式的分析方法例如能够以与第1实施方式相同的流程实施，因此以下说明不同点。

在第8实施方式中，作为一例，将光谱校准(步骤S1及S11)时的毛细管长度设为50cm，将实际样品泳动时(步骤S2及S12)的毛细管长度设为36cm。

如第1实施方式所述，在实际的运用中，以各种毛细管长度的组合进行步骤S1和S2，取得多个矩阵M和M’。

在步骤S3中，校正系数运算部5033基于矩阵M和M’计算校正系数矩阵K。校正系数矩阵K与毛细管长度的信息一起登记在校正系数数据库5034中。在以多个毛细管长度进行了泳动的情况下，登记所有的校正系数矩阵K。

根据本实施方式的方法，即使在光谱校准时(步骤S1)和实际样品泳动时(步骤S12)毛细管长度不同，基准光谱和实际样品的荧光光谱也不会偏离，能够正确地计算实际样品的荧光强度。在此，例示了特定的长度的组合，但实际上操作员能够在登记于校正系数数据库5034的范围内，任意地变更第二光谱校准(步骤S11)和实际样品泳动(步骤S12)的毛细管长度。

[第9实施方式]

在第1～第3实施方式中，说明了泳动电压或荧光色素在光谱校准时和实际样品泳动时不同的情况，但在第9实施方式中，说明阳极缓冲液的组成或化学特性不同的情况。

第9实施方式的分析方法例如能够以与第1实施方式相同的流程实施，因此以下说明不同点。

在第9实施方式中，作为一例，将在光谱校准(步骤S1和S11)中使用的阳极缓冲液的pH设为7.5。将实际样品泳动时(步骤S2和S12)的阳极缓冲液的pH设为8.0。

如第1实施方式所述，在实际的运用中，以各种pH的阳极缓冲液的组合进行步骤S1和S2，取得多个矩阵M和M’。

在步骤S3中，校正系数运算部5033基于矩阵M和M’计算校正系数矩阵K。校正系数矩阵K与阳极缓冲液的pH的信息一起登记在校正系数数据库5034中。在使用多个pH的阳极缓冲液进行泳动的情况下，登记所有的校正系数矩阵K。

根据本实施方式的方法，即使在光谱校准时(步骤S1)和实际样品泳动时(步骤S12)阳极缓冲液的pH不同，基准光谱和实际样品的荧光光谱也不会偏离，能够正确地计算实际样品的荧光强度。在此，例示了特定的pH的组合，但实际上操作员能够在登记于校正系数数据库5034的范围内，任意地变更第二光谱校准(步骤S11)和实际样品泳动(步骤S12)的阳极缓冲液的pH。另外，本实施方式的方法也能够应用于阳极缓冲液的组成不同的情况。

[第10实施方式]

在第9实施方式中，对阳极缓冲液的化学特性不同的情况进行了说明，但在第10实施方式中，对阴极缓冲液的组成或化学特性不同的情况进行说明。

在第10实施方式中，作为一例，在光谱校准(步骤S1和S11)中使用的阴极缓冲液的pH为7.5。将实际样品泳动时(步骤S2和S12)的阴极缓冲液的pH设为8.0。其他方面与第9实施方式相同，因此省略说明。

根据本实施方式的方法，即使在光谱校准时(步骤S1)和实际样品泳动时(步骤S12)阴极缓冲液的pH不同，基准光谱和实际样品的荧光光谱也不会偏离，能够正确地计算实际样品的荧光强度。在此，例示了特定的pH的组合，但实际上操作员能够在登记于校正系数数据库5034的范围内，任意地变更第二光谱校准(步骤S11)和实际样品泳动(步骤S12)的阳极缓冲液的pH。另外，本实施方式的方法也能够应用于阴极缓冲液的组成不同的情况。

[第11实施方式]

在第9实施方式中对阳极缓冲液的化学特性不同的情况进行了说明，在第10实施方式中对阴极缓冲液的化学特性不同的情况进行了说明，但在第11实施方式中对样品溶液的化学特性或组成不同的情况进行说明。

第11实施方式的分析方法例如能够以与第1实施方式同样的流程实施，因此以下说明不同点。

在第11实施方式中，作为一例，将光谱校准(步骤S1以及S11)中使用的矩阵标准品的溶液的pH设为7.5。将在步骤S2和S12中使用的实际样品的溶液的pH设为8.0。

如第1实施方式所述，在实际的运用中，以各种pH的样品的组合进行步骤S1和S2，取得多个矩阵M和M’。

在步骤S3中，校正系数运算部5033基于矩阵M和M’计算校正系数矩阵K。校正系数矩阵K与样品溶液的pH的信息一起登记在校正系数数据库5034中。在使用多个pH的样品进行泳动的情况下，登记所有的校正系数矩阵K。

根据本实施方式的方法，即使在光谱校准时(步骤S1)和实际样品泳动时(步骤S12)样品溶液的pH不同，基准光谱和实际样品的荧光光谱也不会偏离，能够正确地计算实际样品的荧光强度。在此，例示了特定的pH的样品溶液的组合，但实际上操作员能够在登记于校正系数数据库5034的范围内，任意地变更第二光谱校准(步骤S11)和实际样品泳动(步骤S12)的样品溶液的pH。另外，本实施方式的方法也能够应用于样品溶液的组成不同的情况。

[第12实施方式]

在第12实施方式中，对恒温槽505的温度不同的情况进行说明。

第12实施方式的分析方法例如能够以与第1实施方式相同的流程实施，因此以下说明不同点。

在第12实施方式中，作为一例，将光谱校准时(步骤S1和S11)的恒温槽505的温度设为42℃。而且，将实际样品泳动时(步骤S2和S12)的恒温槽505的温度设为60℃。

如在第1实施方式中叙述的那样，在实际的运用中，以各种温度的组合进行步骤S1以及S2，取得多个矩阵M以及M’。

在步骤S3中，校正系数运算部5033基于矩阵M和M’计算校正系数矩阵K。校正系数矩阵K与恒温槽505的温度的信息一起登记在校正系数数据库5034中。在将恒温槽505设为多个温度而进行了泳动的情况下，登记所有的校正系数矩阵K。

根据本实施方式的方法，即使在光谱校准时(步骤S1)和实际样品泳动时(步骤S12)恒温槽505的温度不同，基准光谱和实际样品的荧光光谱也不会偏离，能够正确地计算实际样品的荧光强度。在此，例示了恒温槽505的温度的特定的组合，但实际上操作员能够在登记于校正系数数据库5034的范围内，任意地变更第二光谱校准(步骤S11)和实际样品泳动(步骤S12)的恒温槽505的温度。

[关于显现性]

作为本公开的确认侵害的方法的一例，可举出以下的验证。基于图9进行说明。

在对象的装置中，进行步骤S11(光谱校准)。此时，虽然泳动电压为15kV，但实际上以相当于7.5kV的泳动速度进行分析。泳动速度可以通过在样品中加入适当量的盐来调整。或者，也可以在装置上登记为15kV，同时实际上以7.5kV进行泳动。然后，按照第1实施方式的方法，分析实际样品(步骤S13～S15)。此时，如果伪峰比第1实施方式时增大，则对象装置将针对每个泳动电压确定的校正系数应用于矩阵标准品的荧光光谱的可能性较高。

另外，也能够进行以下那样的验证。基于图14进行说明。在该情况下，在步骤S31中登记与实际不同的荧光色素。如果在实际样品分析后(步骤S34～S36)上拉比第3实施方式增大，则将针对每个荧光色素确定的校正系数应用于矩阵标准品的荧光光谱的可能性较高。

[变形例]

本公开并不限定于上述的实施方式，包括各种变形例。例如，上述的实施方式是为了易于理解地说明本公开而详细地进行了说明的实施方式，不一定需要具备所说明的全部结构。另外，能够将某实施方式的一部分置换为其他实施方式的结构。另外，也可以在某实施方式的结构中添加其他实施方式的结构。另外，对于各实施方式的结构的一部分，也能够追加、删除或置换其他实施方式的结构的一部分。

符号说明

101…装置主体、102…控制用计算机、103…运算控制电路、104…光检测器、105…恒温槽、106…毛细管阵列、107…光源、108…光照射部、109…加载头、110…阴极端、111…阴极用缓冲液容器、112…样品容器、113…聚合物盒、114…阳极用缓冲液容器、115…阳极、116…直流电源、117…阵列头、118…搬送机、119…毛细管、120…注射机构、121…尖部、122…聚合物盒上部、123…加热冷却机构、201…激光、202…反射镜、203…聚光透镜。

Claims (12)

1.一种电泳装置，其特征在于，

所述电泳装置具备：

样品的电泳路径；

分光元件，其对来自所述电泳路径内的所述样品的光进行分光；

光检测器，其对由所述分光元件分光后的光进行检测；以及

运算部，其基于来自所述光检测器的信号，求出所述光的光谱，

所述运算部使用针对每个泳动条件或荧光色素确定的校正系数来校正所述光谱。

2.根据权利要求1所述的电泳装置，其特征在于，

所述校正系数是针对所述样品电泳时的每个电压来确定的。

3.根据权利要求1所述的电泳装置，其特征在于，

所述校正系数是按照所述样品电泳时的缓冲液的pH或所述样品的溶液的pH来确定的。

4.根据权利要求1所述的电泳装置，其特征在于，

所述校正系数是按照所述电泳路径的每个长度来确定的。

5.根据权利要求1所述的电泳装置，其特征在于，

所述电泳装置还具备容纳所述电泳路径的恒温槽，

所述校正系数是按照所述恒温槽的每个设定温度来确定的。

6.根据权利要求1所述的电泳装置，其特征在于，

所述校正系数是使用特定的所述电泳装置取得的。

7.根据权利要求1所述的电泳装置，其特征在于，

所述校正系数是按照所述电泳路径内的分离介质的每个组成或化学特性来确定的。

8.根据权利要求1所述的电泳装置，其特征在于，

所述电泳装置还具备多个所述电泳路径，

所述运算部对于所述多个所述电泳路径的每一个设定所述校正系数。

9.根据权利要求1所述的电泳装置，其特征在于，

所述运算部计算表示第一荧光色素的第一光谱与第二荧光色素的第二光谱之间的相对关系的数值来作为所述校正系数，

所述运算部对与所述第一荧光色素相同的第三荧光色素的第三光谱应用所述校正系数，从而按照所述相对关系校正所述第三光谱。

10.根据权利要求1所述的电泳装置，其特征在于，

所述运算部计算表示在第一泳动条件下取得的第一光谱与在第二泳动条件下取得的第二光谱之间的相对关系的数值来作为所述校正系数，

所述运算部对在与所述第一泳动条件相同的第三泳动条件下取得的第三光谱应用所述校正系数，从而按照所述相对关系校正所述第三光谱。

11.一种电泳装置，其特征在于，

所述电泳装置具备：

样品的电泳路径；

分光元件，其对来自所述电泳路径内的所述样品的光进行分光；

光检测器，其对由所述分光元件分光后的光进行检测；以及

运算部，其基于所述光检测器的信号，计算所述光的信号强度，

所述光检测器以信号取得宽度取得所述信号，所述信号取得宽度被设定成多个荧光色素的光谱间的相关系数为预定值以上。

12.一种分析方法，其特征在于，

所述分析方法包括如下步骤：

在电泳路径中使样品电泳；

通过分光元件对来自所述电泳路径内的所述样品的光进行分光；

通过光检测器检测由所述分光元件分光后的光；以及

通过运算部，基于来自所述光检测器的信号，求出所述光的光谱，

求出所述光的光谱的步骤包括：通过所述运算部，使用针对每个泳动条件或荧光色素确定的校正系数来校正所述光谱。

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