JP7261877B2 - マルチキャピラリ電気泳動装置、及びサンプル分析方法 - Google Patents
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Description
まず、図1の概略図を参照して、第1の実施の形態に係るマルチキャピラリ電気泳動装置の構成を説明する。このマルチキャピラリ電気泳動装置1は、装置本体101と、制御用コンピュータ102とを備える。
(1)搬送機118が動作し、アレイヘッダ117がポリマカートリッジ113の上側に移動する。
(2)アレイヘッダ117の尖部121がポリマカートリッジ113の上部122を貫通する。この時、可塑性の高いポリマカートリッジ113の上部122がアレイヘッダ117の尖部121を包み込むことで両者が密着し、ポリマカートリッジ113とキャピラリ119が密閉状態で連結される。
(3)シリンジ機構120がポリマカートリッジ113内部のポリマを押し上げて、ポリマをキャピラリ119に注入する。
は簡略化のため図示は省略する。
本発明の実施の形態の効果を、下記に示すサンプルを用いて実際に確認した。
(サンプル)
波長校正時の標準品には、PowerPlex(登録商標)4C Matrix Standard(プロメガ社製)を用いた。実サンプルには、プロメガ社から提供されたヒトゲノムDNAを鋳型に、PowerPlex(商標)16HS System(プロメガ社製)で増幅した産物を用いた。サンプルは共にプロメガ社の推奨する標準プロトコルに従い調製された。なお、本実験では、標準品と実サンプルの双方が4種類の蛍光体(5-FAM、JOE、TMR、CXR)で標識されている。
キャピラリ型電気泳動においては、一般的に各キャピラリで異なる実サンプルを泳動することが多い。しかし本実験では、本発明の効果を明確にするため、全てのキャピラリに対して同じ実サンプルを等量ずつ分析した。より具体的には、図1に示す構成を有するキャピラリ型電気泳動装置のサンプル容器112に、波長校正時の標準品又は実サンプルを等量ずつ配置した。泳動時のキャピラリ長は36cm、サンプル注入時の印加電圧は1.6kV、泳動時の印加電圧は15kVであった。
波長校正300で得られたデータに色変換311を施し、上記の方法で補正係数を算出した。次に実サンプルの泳動を行い、前記補正係数の適用前後で、キャピラリ間の蛍光強度差がどのように変化するかを比較した。
実験の結果を図5に示す。図5は縦軸が蛍光強度、横軸がキャピラリの末尾番号を示す。図中それぞれのドットが、各増幅産物で観測された蛍光強度を示す。本実験では上記の通り、サンプル容器に等量の実サンプルを配置している。そのため、理想状態にあってはキャピラリ間で蛍光強度は一致する。
次に、第1の実施の形態の変形例1を説明する。第1の実施の形態では、波長校正時(ステップS300)のデータを用いて補正係数k(nX)を算出したが、この変形例1では、任意の濃度既知のサンプルに蛍光体Xを標識して電気泳動させ、その結果得られた蛍光強度のデータを用いて補正係数k(nX)を算出する。
次に、第1の実施の形態の変形例2を説明する。第1の実施の形態では、波長校正時(ステップS300)のデータを用いて補正係数k(nX)を算出したが、この変形例2では、任意の濃度比既知のサンプルに蛍光体Xを標識して電気泳動させ、その結果得られた蛍光強度のデータを用いて補正係数を算出する。
次に、第1の実施の形態の変形例3を説明する。第1の実施の形態では、特定の波長校正時(ステップS300)のデータを用いて補正係数k(nX)を算出したが、この変形例2では、この変形例3では、複数の波長校正データから補正係数を算出する。
次に、図6を参照して、第2の実施の形態に係るマルチキャピラリ電気泳動装置を説明する。第2の実施の形態のマルチキャピラリ電気泳動装置の構成自体は、第1の実施の形態(図1)と同一で良いので、重複する説明は省略する。また、全体の動作も略同一である(図3)。
次に、図7を参照して、第3の実施の形態に係るマルチキャピラリ電気泳動装置を説明する。第3の実施の形態のマルチキャピラリ電気泳動装置の構成自体は、第1の実施の形態(図1)と同一で良いので、重複する説明は省略する。また、全体の動作も略同一である(図3)。ただし、この第3の実施の形態では、蛍光強度Int(nX)の実測値を用いて補正係数k(nX)を算出するのに代えて、蛍光強度Int(nX)の分布に従ったフィッティングカーブに基づいた近似値を求め、この近似値から補正係数k(nX)を算出する。
次に、図8を参照して、第4の実施の形態に係るマルチキャピラリ電気泳動装置を説明する。第4の実施の形態のマルチキャピラリ電気泳動装置の構成自体は、第1の実施の形態(図1)と同一で良いので、重複する説明は省略する。また、全体の動作も略同一である(図3)。ただし、この第4の実施の形態では、光検出器104での光の検出の手法、及び補正係数の算出方法が前述の実施の形態とは異なっている。
次に、図9を参照して、第5の実施の形態に係るマルチキャピラリ電気泳動装置を説明する。この第5の実施の形態は、第4の実施の形態と同様に、ラマン光強度に基づいて補正係数を算出するよう構成されている。第5の実施の形態のマルチキャピラリ電気泳動装置の構成自体は、第1の実施の形態(図1)と同一で良いので、重複する説明は省略する。また、全体の動作も略同一である(図3)。第4の実施の形態では、バッファのラマン光の信号強度分布のピークの位置における信号強度を用いて補正係数を算出したが、第5の実施の形態では、バッファのラマン光の信号強度分布に含まれる複数の波長における信号強度を用いて補正係数を算出する。これを図9を参照して説明する。
この最低ラマン光強度Int(yA)、Int(yB)を基準として、補正係数k(nA)、k(nB)が、k(nA)=Int(yA)/Int(nA)、k(nB)=Int(yB)/Int(nB)として計算される。このようにして得られた補正係数k(nA)、k(nB)が、蛍光体Xで標識された実サンプルの蛍光強度f(nX)に乗算されることで、蛍光体A、Bの蛍光強度が適切に補正される。
次に、図10を参照して、第6の実施の形態に係るマルチキャピラリ電気泳動装置を説明する。第1の実施の形態では、実サンプルの電気泳動とは別個の電気泳動で得られた蛍光強度に基づいて補正係数を算出したが(例えば、図2のステップS300)、この第6の実施の形態の装置は、実サンプルの電気泳動で得られた蛍光強度から補正係数を算出するように構成されている。以下、この点を図10を参照して説明する。
Claims (14)
- 複数のキャピラリを配列してなるキャピラリアレイと、
前記複数のキャピラリに励起光を照射する光源と、
前記キャピラリ内のサンプルからの蛍光を検出する光検出器と、
前記光検出器の信号に従い前記蛍光の信号強度を算出する演算制御部と
を備え、
前記演算制御部は、
前記複数のキャピラリのいずれかと前記サンプルを標識する蛍光体との組み合わせ毎に定められた補正指数に従い、前記信号強度を補正するよう構成された、マルチキャピラリ電気泳動装置。 - 前記演算制御部は、実サンプルを計測して得られた信号強度に前記補正指数を適用した場合に、前記補正指数の適用後の前記信号強度の前記複数のキャピラリの間でのばらつきが、前記補正指数の適用前の前記信号強度の前記複数のキャピラリの間でのばらつきに比べて低減するよう前記補正指数を設定する、請求項1に記載のマルチキャピラリ電気泳動装置。
- 前記演算制御部は、
前記複数のキャピラリのいずれかと、複数種類の蛍光体のいずれかの組み合わせ毎に定められた補正指数に基づいて、前記信号強度を補正する、請求項1に記載のマルチキャピラリ電気泳動装置。 - 前記補正指数を演算する補正指数演算部を更に備え、
前記補正指数演算部は、前記複数のキャピラリに同一の条件を与えて前記複数のキャピラリ内のサンプルからの蛍光を測定して得られた信号強度に基づき、前記補正指数を演算する、請求項1に記載のマルチキャピラリ電気泳動装置。 - 前記補正指数演算部は、前記複数のキャピラリのうちの1つで得られた信号強度を基準値とし、前記複数のキャピラリの各々で得られた信号強度の値を、前記基準値で除算した値を前記補正指数として算出する、請求項4に記載のマルチキャピラリ電気泳動装置。
- 前記補正指数演算部は、前記信号強度の近似値を、前記信号強度の分布のフィッティングカーブに基づいて算出し、前記近似値に基づいて前記補正指数を演算する、請求項4に記載のマルチキャピラリ電気泳動装置。
- 前記補正指数演算部は、実サンプルを標識する蛍光体と同一の蛍光体で標識された既知のサンプルを前記複数のキャピラリにおいて電気泳動させて得られた蛍光の信号強度に基づいて前記補正指数を演算する、請求項4に記載のマルチキャピラリ電気泳動装置。
- 複数のキャピラリを備えたマルチキャピラリ電気泳動装置を用いてサンプルを分析するサンプル分析方法において、
複数のキャピラリを介して前記サンプルを電気泳動させるステップと、
前記複数のキャピラリに励起光を照射することで発生する蛍光を光検出器を用いて検出するステップと、
前記光検出器の信号に従い前記蛍光の信号強度を算出するステップと
前記複数のキャピラリのいずれかと前記サンプルを標識する蛍光体の組み合わせごとに定められた補正指数に従い、前記蛍光の信号強度を補正するステップと
を備えることを特徴とするサンプル分析方法。 - 実サンプルを計測して得られた信号強度に前記補正指数を適用した場合に、前記補正指数の適用後の前記信号強度の前記複数のキャピラリの間でのばらつきが、前記補正指数の適用前の前記信号強度の前記複数のキャピラリの間でのばらつきに比べて低減するよう前記補正指数が設定される、請求項8に記載のサンプル分析方法。
- 前記複数のキャピラリのいずれかと、複数種類の蛍光体のいずれかの組み合わせ毎に前記補正指数が定められる、請求項8に記載のサンプル分析方法。
- 前記補正指数を演算するステップを更に備え、
前記補正指数を演算するステップは、前記複数のキャピラリに同一の条件を与えて前記複数のキャピラリ内のサンプルからの蛍光を測定して得られた信号強度に基づき、前記補正指数を演算する、請求項8に記載のサンプル分析方法。 - 前記補正指数を演算するステップは、前記複数のキャピラリのうちの1つで得られた信号強度を基準値とし、前記複数のキャピラリの各々で得られた信号強度の値を、前記基準値で除算した値を前記補正指数として算出する、請求項11に記載のサンプル分析方法。
- 前記補正指数を演算するステップは、前記信号強度の近似値を、前記信号強度の分布のフィッティングカーブに基づいて算出し、前記近似値に基づいて前記補正指数を演算する、請求項11に記載のサンプル分析方法。
- 前記補正指数を演算するステップは、実サンプルを標識する蛍光体と同一の蛍光体で標識された既知のサンプルを前記複数のキャピラリにおいて電気泳動させて得られた蛍光の信号強度に基づいて前記補正指数を演算する、請求項11に記載のサンプル分析方法。
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