JP2014117222A - 遺伝子型解析装置及び遺伝子型解析方法 - Google Patents
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Abstract
手間と費用が掛る特別なマトリクススタンダードを用いて電気泳動を行うことなく、実際の解析対象サンプルの電気泳動と同時にスペクトラルキャリブレーションを実現する技術を提供する。
【解決手段】遺伝子型解析装置において、実際のサンプルの電気泳動の際に使用される既知のDNA断片情報である、サイズスタンダードとアレリックラダーとを用いて基準蛍光スペクトルを得ることを特徴とし、アレリックラダーを用いないキャピラリに対しては、サイズスタンダードの蛍光スペクトルのシフト量を検出し、このシフト量を用いて基準蛍光スペクトルをシフトさせることで蛍光スペクトルを計算することで、スペクトルキャリブレーションを行うことを特徴とする。
【選択図】図1
Description
図2は、キャピラリ終端部に設置された上記の光学検出器に結像される画像の例を示す図である。キャピラリ終端部に特定の波長のレーザ光を照射して得られる各蛍光色素の励起光を、回折格子によって波長方向に分離された画像をCCD等の撮像素子にて検出する。同図はキャピラリ(1)〜(8)が8本並べられたキャピラリアレイに対してレーザ光を照射したときの回折格子像である(図中の下段)。同図(下段)は、縦軸がキャピラリの配列方向、横軸が波長方向を示し、同図(上段)は、下段に示すキャピラリ(4)のA−A’方向に対応する信号強度を示す図である。同図(上段)は、縦軸に信号強度を表わす輝度値を取り、横軸に波長を取った時の信号強度分布を示している。同図(上段)で示されるように、特定のキャピラリにおけるスペクトルは、そのキャピラリにおける信号強度を縦軸、波長を横軸とするような波形として得ることができる。
中央制御部102は、サンプル情報設定部106と、電気泳動装置制御部108と、蛍光強度計算部110と、ピーク検出部107と、マトリクス計算部109と、STR解析部111とから構成される。各々の機能については後述する。
キャピラリは、内径数十〜数百ミクロン、外形数百ミクロンのガラス管で構成され、強度を向上させるために表面をポリイミドでコーティングしている。ただし、レーザ光が照射される光照射部は、内部の発光が外部に漏れやすいように、ポリイミド被膜が除去された構造になっている。キャピラリ502の内部は、電気泳動時に泳動速度差を与えるための分離媒体が充填される。分離媒体は流動性と、非流動性の双方が存在するが、本実施例では流動性のポリマーを用いる。
まず、ステップ601において解析対象の実サンプルの電気泳動処理を行う。
次に、ステップ602において、電気泳動で得られたスペクトル波形データから各蛍光色素の蛍光強度を計算する。
そしてステップ603において、蛍光強度の波形からピークを検出する。
次に、ステップ604において、得られたピーク時刻とサイズスタンダードの既知のDNA断片長の情報とのマッピングをとることで、時刻とDNA断片長との対応関係を得る。この処理をSize Callingと呼ぶ。
その後、ステップ605において、基準キャピラリにおける蛍光スペクトルを取得する。ここで、基準キャピラリとは後述するアレリックラダーへ電気泳動が行われるキャピラリを意味する。
次に、ステップ606において、その他のキャピラリの蛍光スペクトルを計算する。
その後、ステップ607において、得られた蛍光スペクトルを用いてマトリクスを計算する。
そしてステップ608において、得られたマトリクスを用いて各蛍光色素の蛍光強度を計算する。
その後ステップ609にて、得られた蛍光強度データを用いてSTR解析を行う。
<ステップ601の説明>
図7は、ステップ601における、実サンプルの電気泳動処理のフローを示している。
以下に、各ステップにおける処理について詳述する。
以上が、図6における電気泳動処理(ステップ601)の処理の一例である。
<ステップ602の説明>
次に、図6における蛍光色素強度計算の処理の一例を説明する。
もしくは前回のスペクトラルキャリブレーションで得られたマトリクスが記憶部104に格納され、かつその際の蛍光試薬の種類が今回の蛍光試薬の種類と同じである場合には、この前回のマトリクスを初期値としてもよい。
<ステップ603の説明>
次に、図6におけるピーク検出の処理の一例を説明する。
<ステップ604の説明>
次に、図6におけるSize Callingの処理の一例を説明する。
<ステップ605の説明>
次に、図6における基準蛍光スペクトル取得の処理の一例を説明する。
同図で示すように、本実施例では、基準キャピラリの上記5つの蛍光強度波形のうち、単一の蛍光色素のみでピークが観測される時刻(以降、単色ピーク時刻)を抽出する(ステップ1401)。そしてこの単色ピーク時刻におけるスペクトルを取得する(ステップ1402)ことで、その色の蛍光スペクトルとみなす。
図13では、T(V)、T(N)、T(F)、T(P)、及びT(L)が、それぞれ、蛍光色素VIC、NED、6FAM、PET、及びLIZの単色ピーク時刻であり、それぞれの時刻では互いに他の蛍光色素による蛍光強度への寄与が無いとみなされる。
もしも上記のような単色ピーク時刻が得られなかった場合には、パス610により、初期のマトリクスが適用された蛍光強度波形を用いてSTR解析を行ってもよい。
既に図8の説明で述べたように、本実施例では、全てのキャピラリの全ての検出時刻におけるスペクトルは記憶部104に格納される。よって上述のステップ1401において、アレリックラダーとサイズスタンダードの既知DNA断片長情報を元に、基準キャピラリにおける単一色ピーク時刻を抽出し、その時刻におけるスペクトルを記憶部104から取得する。これを基準蛍光スペクトルとする。以上のようにして、図6における基準蛍光スペクトル取得処理(ステップ605)が行われる。
<ステップ606の説明>
次に、図6における蛍光スペクトル計算の処理の一例を説明する。
<ステップ607の説明>
次に、図6におけるマトリクス計算の処理の一例を説明する。
<ステップ608の説明>
次に、図6における蛍光強度計算の処理の一例を説明する。
<ステップ609の説明>
次に、図6におけるSTR解析の処理の一例を説明する。
実施例1による遺伝子型解析装置では、アレリックラダーに対して電気泳動が行われるキャピラリを基準キャピラリとし、基準キャピラリにおける、アレリックラダーとサイズスタンダードの単色ピーク時刻を抽出し、この時刻におけるスペクトルを、基準蛍光スペクトルとした。そして基準蛍光スペクトルをシフトさせることで、基準キャピラリ以外の全てのキャピラリにおける蛍光スペクトルを求めることで、全キャピラリのマトリクスMを計算した。
しかし前述のように、各々の蛍光色素の蛍光スペクトルは、理想的には装置に係りなく蛍光色素の種類と、これに対する励起光の波長、キャピラリの泳動媒体の特性によって一意に決められるものである。
同図中の単色ピーク時刻検出(ステップ2101)、及び蛍光スペクトル取得(ステップ2102)の処理は図14で述べた、基準蛍光スペクトル取得処理(ステップ605)における、単色ピーク時刻検出(ステップ1401)と基準蛍光スペクトル取得処理(ステップ1402)と同様であるので、説明は省略する。
図22を参照して、修正処理(ステップ2104)の一例を説明する。
同図中、基準蛍光スペクトル2106と理想蛍光スペクトル2107は、上で述べたように、記憶部104に格納されたスペクトルからそれぞれ取得されたデータである。まず、これらの波長方向での位置あわせを行う(2201)。この処理は実施例1における蛍光スペクトル計算(図6中のステップ606)中の、基準キャピラリからのシフト量計算(図17中のステップ1703)の処理と同様な方法を用いることができる。すなわち、両スペクトルの相互相関関数を計算し、その値が最大値となるようなシフト量を求めることで、双方のスペクトルのずれを補正する、すなわち位置あわせすることができる。もしくは前に述べた、ガウシアンフィッティングを両スペクトルに適用し、そのピークの中心位置の差分を、上記のシフト量としてもよい。
なお、上で述べた、理想蛍光スペクトルによる基準蛍光スペクトルの置き換え(ステップ2302)は、アレリックラダーを用いない遺伝子型解析に対しても適用できる。すなわちSTR解析において高い塩基分解能が要求されないような用途の遺伝子型解析(例えば食品検査等)であれば、アレリックラダーを用いなくとも、アレルの識別が可能である。このような場合には実施例1で述べたように、アレリックラダーの情報を用いて基準蛍光スペクトルを取得することができない。このような場合には、ステップ2302のように、理想蛍光スペクトルを基準蛍光スペクトルとして置き換え、各々のキャピラリに対してのシフト量を求めることで、蛍光スペクトルを得ることができる。
実施例1、及び実施例2による遺伝子型解析装置では、アレリックラダーに対して電気泳動が行われるキャピラリを基準キャピラリとし、基準キャピラリにおける基準蛍光スペクトルを求めた。そして基準蛍光スペクトルと、基準キャピラリ以外のスペクトル間のシフト量を求め、この量だけ基準蛍光スペクトルをシフトさせることで、基準キャピラリ以外の全てのキャピラリにおける蛍光スペクトルを求め、全キャピラリのマトリクスMを計算した。
そこで、本発明の実施例3では、上記のような基準蛍光スペクトルからのシフトではなく、各キャピラリにおいて、実サンプルに対して行われる電気泳動のスペクトルを用いて、蛍光スペクトルを求めることを特徴とする。
以下、図面を参照して実施例3による遺伝子型解析装置の詳細を説明する。実施例3による遺伝子型解析装置の構成は、図1に示される構成と同様である。
実施例1においては、図13及び図16で示したように、アレリックラダーの蛍光強度の波形から、各蛍光色素の単色ピーク時刻を検出し、その単色ピーク時刻におけるスペクトルを、各々の蛍光色素の蛍光スペクトルとした。
(C1):主ピークのピーク時刻(T1)と、疑似ピークのピーク時刻(T2)との差が予め定められた時刻差内に収まっている(すなわち、T1≒T2)こと(図32(a))。
(C2):主ピークのピーク高さ(H1)と、疑似ピークのピーク高さ(H2)、及びこれらの比(H1/H2)がそれぞれ予め定められた値域に収まっていること(図32(b))。
(C3):上記を満たす主ピークと疑似ピークのパターンが予め定められた個数以上存在すること(図32(c))。
(C4):主ピーク単独のピークが存在しないこと(図32(c))。
などが挙げられる。
ステップ2501にて、アレリックラダー、コントロールサンプルを含めた、全てのサンプルのキャピラリに対して電気泳動を行う。この電気泳動処理は、実施例1における電気泳動処理(図6中、ステップ601)と同様である。
実施例1と実施例2では、基準キャピラリにおいて基準蛍光スペクトルを取得し、他キャピラリに対しては、基準蛍光スペクトルをシフトすることで、各キャピラリにおける蛍光スペクトルを計算した。実施例3では、各キャピラリにおける実サンプルの電気泳動によるスペクトルを用いて、単色ピーク時刻を検出し、蛍光スペクトルをそれぞれ取得した。ただし実施例3においても、望ましい単色ピーク時刻を検出できなかった場合には、実施例1もしくは実施例2のように基準蛍光スペクトルをシフトさせることで蛍光スペクトルを計算した。
以下に、図26に示すステップ2601〜2611の処理を説明する。
もしくは個々のラマンスペクトルに対して、前述のガウシアンフィッティングを行ってもよい。すなわち、ラマンスペクトルでは、光源の波長と泳動媒体とはいずれも既知であるため、ラマンスペクトルのピークの数やそのピーク波長、個々の信号強度比などは予め計測することで求められる。そこで閾値処理などによって個々のピークの大まかな位置を検出し、そのピークの周辺のデータに対して前述のガウシアンフィッティング(図11参照)を適用することで、個々のピーク波長を得ることができる。全てのキャピラリにおけるラマンスペクトルに対して、このような複数のピーク波長を求め、キャピラリ間で各々のピーク波長のシフト量を計算してもよい。
実施例3による遺伝子解析装置では、各キャピラリにおいて、実サンプルに対して行われる電気泳動のスペクトルを用いて、蛍光スペクトルを求めた。その際、実サンプルから得られる蛍光強度波形から、単一蛍光色における疑似ピークが観測できるような時刻を探索し、この時刻を単色ピーク時刻として、蛍光スペクトルを求めた。
以下に、図31に示すステップ3101〜3107の処理に関して説明する。
もしもステップ3102が2回目以降の蛍光強度計算である場合、すなわち既に本実施例によるマトリクス計算が行われている場合には、前回で算出されたマトリクス(後述するステップ3106)を用いて、(式1)により各蛍光色の蛍光強度波形を計算してもよい。
ある蛍光色の主ピークに対して疑似ピークが検出されなかった場合には、ステップ3102で用いられたマトリクスに対応する蛍光スペクトルを採用する。すなわち、この処理は、初期マトリクスに対応する(式2)の蛍光スペクトル行列Sのある列ベクトルを、疑似ピーク時刻におけるスペクトルで置き換えることに相当する。
もしもある蛍光色に対する疑似ピークが存在しない場合はその蛍光スペクトルが適切であると見なし、その蛍光色のスペクトルは変更しない。そして全ての蛍光色において疑似ピークが検出されなかった場合に、ステップ3102で用いられたマトリクスを最終的なマトリクスとして採用し、ステップ3107のSTR解析に進む。このステップ3107のSTR解析の処理内容は、実施例1と同様である。
このような場合に備え、実際には上記の繰り返し回数に上限を設けておき、上記の繰り返し数が上限に達した場合には、例えば、最も疑似ピークのレベルが低いマトリクスを採用する、初期マトリクスを採用する、などの処理を行うことが望ましい。
以上に述べたように、本発明の実施例5による遺伝型解析装置では、基準蛍光スペクトルからのシフトではなく、各キャピラリにおいて、実サンプルに対して行われる電気泳動のスペクトルを用いて、単色ピークを検出し、これを基に蛍光スペクトルを求めることでスペクトラルキャリブレーションを行うことを特徴とする。この際、実サンプルにおける疑似ピークを探索し、この疑似ピークが検出されなくなるようなマトリクスを繰り返し算出することで、より適切なマトリクスを得ることが可能となる。
(1)複数の流路からなる流路アレイに励起光を照射し、流路アレイにおける発光を分光して光検出器上にスペクトルを結像する電気泳動手段により得られるスペクトルを基に、複数の蛍光色素で標識されたDNAサンプルにおける各々の蛍光強度を計算する遺伝子型解析方法において、そのDNAサンプルに対する電気泳動で得られるスペクトルを基に、複数の蛍光色素の基準蛍光スペクトルを求め、該基準蛍光スペクトルを波長方向にシフトさせることで、各流路の蛍光スペクトルを求める、ことを特徴とする遺伝子型解析方法。
(2)上記(1)において、基準蛍光スペクトルを、既知の長さのDNA断片を含むサンプルのスペクトルのうち、単一の蛍光色素の発光によるスペクトルを抽出する、ことを特徴とする遺伝子型解析方法。
(3)上記(1)において、基準蛍光スペクトルとして、予め計測された理想蛍光スペクトルとする、ことを特徴とする遺伝子型解析方法。
(4)上記(2)において、基準蛍光スペクトルを、予め計測された理想蛍光スペクトルを参照して修正する、ことを特徴とする遺伝子型解析方法。
(5)上記(1)において、基準蛍光スペクトルを、遺伝子型解析の対象である実サンプルのスペクトルのうち、単一の蛍光色素の発光によるスペクトルを抽出することにより求める、ことを特徴とする遺伝子型解析方法。
(6)上記(1)乃至(5)のいずれかにおいて、各流路における、サイズスタンダードを標識する蛍光色素の単一の蛍光スペクトルを抽出することで、流路間の蛍光スペクトルの波長方向のシフト量を求め、該シフト量の分だけ、前記基準蛍光スペクトルをシフトする、ことを特徴とする遺伝子型解析方法。
(7)上記(1)乃至(5)のいずれかにおいて、各流路における、ラマンスペクトルを計測することで、流路間の蛍光スペクトルの波長方向のシフト量を求め、該シフト量の分だけ、基準蛍光スペクトルをシフトする、ことを特徴とする遺伝子型解析方法。
(8)上記(1)において、蛍光スペクトルを、遺伝子型解析の対象である実サンプルのスペクトルのうち、単一の蛍光色素の発光によるスペクトルを抽出できるか否かを判定し、該判定が否である場合には、基準蛍光スペクトルをシフトさせることで前記の蛍光スペクトルを求める、ことを特徴とする遺伝子型解析方法。
(9)励起光を照射する光源と、複数の流路からなる流路アレイと流路アレイの両端部に電圧を印加する電圧源と流路アレイから発光する光を検出する光検出器とを具備してなる電気泳動装置と、電気泳動装置と情報の授受を行うデータ解析装置とを有し、
前記流路アレイに複数の蛍光色素で標識されたDNA断片を有するDNAサンプルを投入し、電圧源を用いて流路アレイ中のDNA断片を移動させながら、流路アレイに対して光源から励起光を照射し、照射により前記流路アレイから放出される発光を分光して光検出器上にスペクトルを結像させ、データ解析装置において、結像したスペクトルを基に複数の蛍光色素の基準蛍光スペクトルを求め、該基準蛍光スペクトルを波長方向にシフトさせることで、各流路の蛍光スペクトルを求めることを特徴とする遺伝子型解析装置。
(10)上記(9)において、基準蛍光スペクトルを求め、該基準蛍光スペクトルを波長方向にシフトさせることで、各流路の蛍光スペクトルを求める、ことを特徴とする遺伝子型解析装置。
(11)上記(9)において、基準蛍光スペクトルを、既知の長さのDNA断片を含むサンプルのスペクトルのうち、単一の蛍光色素の発光によるスペクトルを抽出する、ことを特徴とする遺伝子型解析装置。
(12)上記(9)において、基準蛍光スペクトルとして、予め計測された理想蛍光スペクトルとする、ことを特徴とする遺伝子型解析装置。
(13)上記(10)において、基準蛍光スペクトルを、予め計測された理想蛍光スペクトルを参照して修正する、ことを特徴とする遺伝子型解析装置。
(14)上記(9)において、基準蛍光スペクトルを、遺伝子型解析の対象である実サンプルのスペクトルのうち、単一の蛍光色素の発光によるスペクトルを抽出することにより求める、ことを特徴とする遺伝子型解析装置。
(15)上記(9)乃至(14)のいずれかにおいて、各流路における、サイズスタンダードを標識する蛍光色素の単一の蛍光スペクトルを抽出することで、流路間の蛍光スペクトルの波長方向のシフト量を求め、該シフト量の分だけ、前記基準蛍光スペクトルをシフトする、ことを特徴とする遺伝子型解析装置。
(16)上記(9)乃至(14)のいずれかにおいて、各流路における、ラマンスペクトルを計測することで、流路間の蛍光スペクトルの波長方向のシフト量を求め、該シフト量の分だけ、前記基準蛍光スペクトルをシフトする、ことを特徴とする遺伝子型解析装置。
102…中央制御部、
103…ユーザインタフェース部、
104…記憶部、
105…電気泳動装置、
106…サンプル情報設定部、
107…ピーク検出部、
108…電気泳動装置制御部、
109…マトリクス計算部、
110…蛍光強度計算部、
111…STR解析部、
112…データ解析装置。
Claims (12)
- 複数の流路からなる流路アレイのそれぞれに、複数の蛍光色素で標識されたDNA断片を有するDNAサンプルを投入し、
電気泳動手段を用いて前記流路アレイ中を移動させながら前記DNA断片に対して励起光を照射し、
照射により前記流路アレイから放出される発光を分光して得られたスペクトルを基に、前記DNA断片の各々に対する蛍光強度波形を算出し、
算出した前記各々の蛍光強度波形を基に、前記複数の蛍光色素の蛍光スペクトルを求める、
ことを特徴とする遺伝子型解析方法。 - 前記DNAサンプルとして遺伝子型解析の対象である実サンプルを準備し、
分光して得られた前記実サンプルのスペクトルの中から、単一の蛍光色素の発光によるスペクトルを抽出し、抽出した前記スペクトルに基づき前記蛍光スペクトルを求める、
ことを特徴とする請求項1に記載の遺伝子型解析方法。 - 前記単一の蛍光色素の発光によるスペクトルを、前記蛍光強度波形の疑似ピークを探索することにより抽出する、
ことを特徴とする請求項2に記載の遺伝子型解析方法。 - 前記疑似ピークが検出されないか、もしくは繰り返し回数が設定上限値に到達するか、のいずれかを満たすまで、前記疑似ピークの探索と前記蛍光強度波形の算出とを繰り返し実行する、
ことを特徴とする請求項3に記載の遺伝子型解析方法。 - 前記蛍光スペクトルを、以前に求められた蛍光スペクトルとする、
ことを特徴とする請求項2乃至4のいずれか一つに記載の遺伝子型解析方法。 - 前記疑似ピークの探索において、前記疑似ピークの検出条件、もしくは前記疑似ピークの検出結果を表示し、該表示を参照しながら前記検出条件もしくは前記検出結果をユーザによる変更ができる、
ことを特徴とする請求項5に記載の遺伝子型解析方法。 - 励起光を照射する光源と、
複数の流路からなる流路アレイと、前記流路アレイの両端部に電圧を印加する電圧源と、前記流路アレイから発光する光を検出する光検出器と、を具備してなる電気泳動装置と、
前記電気泳動装置と情報の授受を行うデータ解析装置と、を有し、
前記流路アレイに複数の蛍光色素で標識されたDNA断片を有するDNAサンプルを投入し、
前記電圧源を用いて前記流路アレイ中の前記DNA断片を移動させながら、前記流路アレイに対して前記光源から励起光を照射し、
照射により前記流路アレイから放出される発光を分光して前記光検出器上にスペクトルを結像させ、
前記データ解析装置において、結像したスペクトルを基に前記DNA断片の各々に対する蛍光強度波形を算出し、算出した前記各々の蛍光強度波形を基に、前記複数の蛍光色素の蛍光スペクトルを求める、
ことを特徴とする遺伝子型解析装置。 - 前記DNAサンプルとして遺伝子型解析の対象である実サンプルを用いる場合であって、
前記データ解析装置において、分光して得られた前記実サンプルのスペクトルの中から、単一の蛍光色素の発光によるスペクトルを抽出し、抽出した前記スペクトルに基づき前記蛍光スペクトルを求める、
ことを特徴とする請求項7に記載の遺伝子型解析装置。 - 前記データ解析装置において、前記単一の蛍光色素の発光によるスペクトルを、前記蛍光強度波形の疑似ピークを探索することにより抽出する、
ことを特徴とする請求項8に記載の遺伝子型解析装置。 - 前記データ解析装置において、前記疑似ピークが検出されないか、もしくは繰り返し回数が設定上限値に到達するか、のいずれかを満たすまで、前記疑似ピークの探索と前記蛍光強度波形の算出とを繰り返し実行する、
ことを特徴とする請求項9に記載の遺伝子型解析装置。 - 前記蛍光スペクトルを、以前に求められた蛍光スペクトルとする、
ことを特徴とする請求項8乃至10のいずれか一つに記載の遺伝子型解析装置。 - 前記データ解析装置における前記疑似ピークの探索において、前記疑似ピークの検出条件、もしくは前記疑似ピークの検出結果を表示し、該表示を参照しながら前記検出条件もしくは前記検出結果をユーザが変更できる、
ことを特徴とする請求項11に記載の遺伝子型解析装置。
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