DE3606231A1

DE3606231A1 - Verfahren zum messen des gesamtproteingehaltes einer probe mit hilfe eines elektrophoretischen bildes

Info

Publication number: DE3606231A1
Application number: DE19863606231
Authority: DE
Inventors: Hidehiko Hachioji Tokio/Tokyo Yamamoto
Original assignee: Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1985-02-27
Filing date: 1986-02-26
Publication date: 1986-09-11
Also published as: JPS61196154A; JPH065227B2; DE3606231C2; US4666578A

Description

Verfahren zum Messen des Gesamtproteingehaltes einer Probe mit Hilfe eines elektrophoretisehen Bildes

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Messung der Gesamtproteinmenge, die in einer Serumprobe enthalten ist, mit Hilfe eines elektrophoretischen Bildes, das durch eine Elektrophorese-Apparatur erzeugt wird.

\jj Bei bekannten Elektrophorese-Apparaturen werden Teil- oder Fraktions-Bildmuster, die Bilder der (Protein)-Fraktionen Albumin (Alb), c^-Globulin (a.-G), ^-Globulin (Cx₂-G) , ß-Globulin (ß-G) und γ-Globulin (γ-G) wiedergeben, die auf die Fraktionen dieser Proteinkomponenten entfallenden prozentualen Anteile und der A/G-Wert (Verhältnis von Albumin zu Globulin) allgemein in einem Versuchsbericht aufgezeichnet. Heutzutage wird Wert darauf gelegt, Schwankungen der Absolutmenge der jeweiligen Proteinkomponenten zusätzlich zu Schwankungen der prozentualen Anteile der Fraktionen, die die relativen Mengen der betreffenden Proteinkomponenten darstellen, zu überwachen. Es wird daher in der Praxis die Gesamtproteinmenge einer Probe mit Hilfe eines getrennten biochemischen Analysegerätes gemessen und die gemessene Gesamtproteinmenge in den Elektrophorese-Apparat eingegeben; die Absolutmengen der betreffenden Substanzen der Probe werden durch Multiplizieren der prozentualen Anteile der Fraktionen mit der Gesamtproteinmenge berechnet. Die so berechneten Absolutmengen werden ebenfalls in dem Versuchsbericht ausgedruckt.

³⁶⁰⁶^l,

- sr - 60

.G-

Das Messen der Gesamtproteinmengen der jeweiligen Proben mit Hilfe des getrennten biochemischen Analysegerätes und das Eingeben der so gemessenen Gesamtproteinmengen in die Elektrophorese-Apparatur ist jedoch sehr umständlich und es können Fehler bei der Identifizierung von Proben auftreten. Außerdem wird auf diese Weise die Anzahl Proben, die mit Hilfe des biochemischen Analysegerätes analysiert werden können, um Eins vermindert.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein neues und nützliches Verfahren zum Messen der Gesamtproteinmenge mit Hilfe einer Elektrophorese-Apparatur bereitzustellen.

Diese Aufgabe wird mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens gelöst. Dieses umfaßt folgende Stufen:

Erzeugen elektrophoretischer Bilder einer Standardprobe mit einer bekannten Gesamtproteinmenge sowie der zu untersuchenden Probe mit unbekannter Gesamtproteinmenge, Ermitteln des integrierten Konzentrationswertes aus dem elektrophoretischen Bild der Standardprobe, Ermitteln des integrierten Konzentrationswertes (Menge) aus dem elektrophoretischen Bild der zu untersuchenden Probe und Ermitteln der unbekannten Proteinmenge der zu untersuchenden Probe in Übereinstimmung mit der bekannten Gesamtproteinmenge der Standardprobe und den integrierten Werten für die Konzentrationen in der Standardprobe und der zu untersuchenden Probe aus den elektrophoretischen Bildern.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der integrierte Konzentrationswert aus dem elektrophoretischen Bild erhalten durch zweidimensionales optisches Abtasten des elektrophoretischen Bildes, um ein Bildsignal zu gewinnen, Eingeben des Bildsignales in einen logarithmischen Verstärker um einen Absorptionswert zu erhalten bzw. abzuleiten, der proportional ist der Konzentration des Proteins in der Probe und Integrieren des Absorptionswertes über das gesamte elektrophoretische Bild.

b Die Erfindung wird nachfolgend mit Bezug auf die beigefügten Zeichnungen näher erläutert. Es zeigt bzw. zeigen:

Fig. 1 eine schematische Seitenansicht einer Ausführungsform einer für das erfindungsgemäße Verfahren geeigneten Elektrophorese-Apparatur;

Fig. 2 eine schematische Draufsicht der räumlichen Anordnung eines linearen Bildsensors (einer linearen Bildsensor-Reihe) relativ zum in Fig. 1 gezeigten Träger;

Fig. 3 ein Blockdiagramm einer Ausführungsform einer datenverarbeitenden Schaltung und

Fig. 4,5,6 und 7 Diagramme zur Erläuterung der in Fig. 3 gezeigten Schaltung.

Gemäß einer Ausführungsform der Elektrophorese-Apparatur, die bevorzugt für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet wird, wird eine Anzahl von Testproben (zu untersuchenden Proben), beispielsweise dreißig Testproben, auf einen Träger aus Celluloseacetat mit Hilfe einer Auftragevorrichtung (Applikator) mit dreißig Auftragsspitzen aufgebracht. Dann wird der Träger, nach dem Anfärben, Entfärben und Trocknen, in ein Densitometer eingegeben, um nacheinander die Absorption der elektrophoretisehen Bilder der Testproben zu messen.

Fig. 1 zeigt schematisch den prinzipiellen Aufbau des Densitometer s der für das erfindungsgemäße Verfahren brauchbaren Elektrophorese-Apparatur. Der Träger (1), der zuvor angefärbt, entfärbt und getrocknet worden ist, wird mit Hilfe der Aufgabewalzen (2a und 2b) in den Licht messenden Bereich (4) eingebracht, der Decalin (3) enthält, um den Träger (1) transparent zu machen. Der Träger (1) wird dann mit Hilfe der Photometervorrichtung (5) photometrisch ausgewertet und darauf mit Hilfe der

- 4 - 60

- 8-

Austragswalzen (6a, 6b) ausgetragen. Die Photometervorrichtung (5) umfaßt eine Lichtquelle (5a), die unter dem Träger (1) angeordnet ist und Licht abgibt sowie einen linearen (Festkörper-) Bildsensor (5b), der über dem Träger (1) angeordnet ist. Der lineare Bildsensor (die lineare Bildsensor- Reihe) (5b) kann eine lineare CCD (ladungsgekoppelte Schaltung) oder Photodioden-Reihe sein und ist senkrecht zur Durchlaufrichtung (a) des Trägers angeordnet, wie in Fig. 2 gezeigt.

Bei der vorliegenden Ausführungsform wird angenommen, daß die dreißig Proben gleichzeitig auf den Träger (1) aufgetragen werden. Unter diesen Proben ist die in der Aufgabenrichtung erste Probe die Probe mit bekannter Gesamtproteinmenge; die verbleibenden neunundzwanzig Proben sind die zu untersuchenden Testproben mit unbekannten Gesamtproteinmengen. In Fig. 2 ist das elektrophoretisch^ Bild der Standardprobe mit (7a) bezeichnet und die elektrophoretischen Bilder der Testproben sind mit (7b) bezeichnet. Erfindungsgemäß wird der integrierte Konzentrationswert eines elektrophoretischen Bildes abgeleitet bzw. ermittelt, indem der Träger (1) stufenweise in Richtung (a) bewegt wird.

Fig. 3 ist ein Blockdiagramm, das eine Ausführungsform einer datenverarbeitenden Schaltung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zeigt. Bei der vorliegenden Ausführungsform sollen verschiedene Arten von Proteinkomponenten, die in Serumproben von Personen enthalten sind, analysiert werden. Der Träger (1), der elektrophoretische Bilder von Standard- und Testserumproben trägt, wird durch den in Fig. 1 gezeigten Densitometer mit der Photometer-Vorrichtung (5) umfassend die Lichtquelle (5a) und den linearen Bildsensor (5b) mit konstanter Geschwindigkeit, beispielsweise 8 mm/s geführt. Ein photoelektrisch umgewandeltes Ausgabe-Bildsignal aus dem linearen Bildsensor (5b) wird synchron mit der stufen- bzw. .schrittweisen Bewegung des Trägers (1) von einem Abtast- und Haltekreis (11) übernommen. Das so abgetastete und festgehaltene Signal wird

BAD ORIGINAL

- β - 60 168

• J·

durch einen Log-Verstärker (12) verstärkt und in ein Signal umgewandelt, das die optische Absorption bzw. die Extinktion eines elektrophoretischen Bildes wiedergibt, wobei die Extinktion ihrerseits der Proteinkonzentration der Probe proportional ist. Darauf wird das Extinktionssignal mit Hilfe eines A/D-Wandlers 13 in digitale Abtastsignale umgewandelt. Die so erhaltenen digitalen Signale werden unter der Steuerung eines zentralen Prozessors (CPU) (14) in einen Speicher (15) eingegeben und dort gespeichert, nachdem die erforderliche Signalverarbeitung wie Glätten und Null-Abgleichung zur Korrektur der Schwankungen der Grundlinie aufgrund der Fluktuation der Lichtintensität vorgenommen worden ist. Die Apparatur umfaßt weiterhin eine Tastatur (16) und einen Bildschirm (CRT) (17) zum Eingeben und Überwachen verschiedener Befehle, Daten und Bilder.

Bei der vorliegenden Ausführungsform wird eine bekannte Gesamtproteinmenge (TP-), die in der Standardprobe enthalten ist, mit Hilfe der Tastatur (16) und des Bildschirms (CRT) (17) in den Speicher (15) eingegeben.

Während der Träger (1) stufenweise eingebracht wird, werden durch photometrische Auswertung des elektrophoretischen Bildes, im Speicher (15) dreidimensionale Daten der Extinktion des elektrophoretischen Bildes gespeichert, wie in Fig. 4 erläutert ist. Darauf werden die im Speicher (15) gespeicherten Proben in die jeweiligen (Einzel-)Proben getrennt, wie in Fig. 5 gezeigt ist und integrierte Konzentrationen (D₁, D_ ... D_n) der elektrophoretischen Bilder der Standardprobe und der Testproben werden berechnet. Allgemein kann der integrierte Wert (D) der Konzentration wiedergegeben werden durch

D = Σ τ D. . ... (1)

i j ^J

wobei D.. die Daten sind, die beim i-ten Schritt aus einem das j-te Licht empfangenden Element des linearen Bildsensors (5b)

-/Τ - 60 168

erhalten werden. Allgemein ist der Extinktionswert, der durch optisches Abtasten des auf dem Träger erzeugten elektrophoretischen Bildes erhalten wird, proportional der Proteinkonzentration. Infolgedessen ist der integrierte Wert D des gesamten elektrophoretischen Bildes einer Probe proportional der Konzen tration des in der Probe enthaltenen Gesamtproteins. Dann werden die bekannte Menge Gesamtprotein der Standardprobe und die unbekannte Menge Gesamtprotein der Testprobe mit TP- bzw. TP. bezeichnet und die integrierten Werte der Konzentration der elektrophoretischen Bilder der Standardprobe und der Testprobe (n) mit D- und D. angegeben. Daraus ergibt sich folgende Gleichung (2).

TP. D.
ι _ ι

TP = —— · TP

ι D₁ ^iFl ... (2)

Dies bedeutet, daß die unbekannte Menge Gesamtprotein TP. gemäß der obigen Gleichung (2) berechnet werden kann, wenn die integrierten Konzentrationswerte D. und D. der elektrophoretischen Bilder der Standardprobe und der Testprobe ermittelt sind und die bekannte Menge Gesamtprotein TP- gegeben ist.

Wie allgemein bekannt setzt sich das elektrophoretische Bild einer Probe zusammen aus Teil- oder Fraktionsbildern der verschiedenen Proteinkomponenten, d.h. Albumin, α -Globulin, α Globulin, ß-Globulin und γ-Globulin. Es hat sich gezeigt, daß diese Substanzen mit einer Färbeflüssigkeit unterschiedlich stark angefärbt werden. Wird beispielsweise Ponceau-3R als Färbeflüssigkeit verwendet, so ist die Konzentration des Fraktionsbildes von Albumin höher als diejenige von γ-Globulin. Bei der vorliegenden Ausführungsform werden, um den Unterschied im Anfärbegrad der jeweiligen Proteinkomponenten auszugleichen, Farbkorrektur-Koeffizienten k , k _G , k „ , k und k _ einge-

-X- 60 168

• AA-

führt, die entsprechend dem Farbstoff und der bei der photometrischen Auswertung angewandten Wellenlänge bestimmt werden können. Diese Koeffizienten werden vorab mit Hilfe der Tastatur (16) in den Speicher (15) eingegeben. Weiterhin wird das elektrophoretische Bild in Fraktionsbilder aufgeteilt und es werden integrierte Konzentrationswerte der jeweiligen Fraktionsbilder ^dAlb' ^dal -G ' ^da2-G ' ^dß-G ^Und Vg ' ^{Wie in Fi}^ ⁶ ^läutert, abgeleitet bzw. ermittelt. Dann wird der korrigierte Integrationswert der Konzentration D¹ des elektrophoretischen Bildes berechnet gemäß der folgenden Gleichung unter Anwendung der Korrekturkoeffiz ienten.

■' -

⁽³⁾

Daraus wird die Gesamtproteinmenge der Testprobe TP. mit Hilfe der folgenden Gleichung

TP₁

ermittelt bzw. berechnet.

In der folgenden Tabelle 1 werden beispielhaft Farbkorrekturkoeffizienten angegeben.

Tabelle 1

^kAlb	*K₁-G*	*K r*	^kß-G	0,420
0,430	0,428	0,426	0,423

Das elektrophoretische Bild kann in Übereinstimmung mit verschiedenen Verfahren in die jeweiligen Teil- oder Fraktionsbilder aufgeteilt werden. Gemäß einer Ausführungsform der Teilungsmethode werden folgende Schritte durchgeführt, um die integrierten Werte der Konzentration für die jeweiligen Teil-Bilder zu erhalten:

(a) es wird eine Mitten-Abtastlinie aus allen Abtastlinien ausgewählt;

(b) Fraktionspunkte werden auf der Mitten-Abtastlinie ermittelt;

(c) Fraktionslinien, die durch die Fraktionspunkte gehen, werden senkrecht zur Abtastlinie gezogen; und

(d) Konzentrationswerte innerhalb der durch die Fraktionslinien geteilten Bereiche werden integriert, um die integrierten Konzentrationswerte für die jeweiligen Proteinkomponenten zu erhalten.

Gemäß einer anderen Methode der Aufteilung des elektrophoretischen Bildes werden folgende Schritte ausgeführt:

(a) eine elektrophoretische Expansionslänge (Linie) (L) wird für jede Abtastlinie ermittelt durch Vergleich der Absorptions- bzw. Extinktionswerte mit einem Schwellenwert (S), wie in Fig. 7 gezeigt;

(b) die elektrophoretische Expansionslänge (L) wird in Längen für die einzelnen Fraktionen geteilt, und zwar im Verhältnis bzw. proportional zu Standard-Fraktionsbildlängen;

(c) Konzentrationswerte innerhalb der jeweiligen Fraktionslängen werden integriert, um integrierte Werte der Bereiche der Fraktionen entlang den jeweiligen Abtastlinien zu erhalten; und

(d) die integrierten Werte der jeweiligen Proteinkomponenten für die jeweiligen Abtastlinien werden akkumuliert, um die integrierten Werte der jeweiligen Fraktions- oder Teilbilder zu erhalten.

Wenn Proben auf den Träger mit Hilfe der Aufbringevorrichtung aufgebracht werden, die eine Anzahl von Aufbringespitzen aufweist, unterscheiden sich die einzelnen Probenmengen auf dem Substrat etwas voneinander. Weiterhin schwankt der Grad der Anfärbung je nach der Lage der Proben im Färbegefäß. Bei der vorliegenden Ausführungsform werden, um die erwähnten Schwan-

-ff - 60 168

kungen auszuschalten, zweite oder sekundäre Korrekturkoeffizienten (K,, K„ ... K_n) eingeführt, um die Schwankungen in den aufgebrachten Mengen der Proben auf dem Träger zu kompensieren. Die zweiten Korrekturkoeffizienten können in folgender Weise abgeleitet bzw. erhalten werden: Zunächst wird die Standardprobe mit bekannter Menge an Gesamtprotein mit Hilfe von allen dreißig Aufbringespitzen des Applikators auf den Träger aufgebracht, und der Träger wird der Elektrophorese unterworfen, wobei dreißig elektrophoretische Bilder derselben Standardprobe erzeugt werden. Dann werden diese elektrophoretischen Bilder photoelektrisch abgetastet, um integrierte Konzentraticnsverte der elektrophoretischen Bilder (cL, d_ ... d^) zu erhalten. Dieser Arbeitsgang wird einmal oder mehrere Male durchgeführt. Im letzteren Falle werden die mehrfachen integrierten Konzentrationswerte für jeweilige elektrophoretische Bilder gemittelt, um einen integrierten Konzentrations-Mittelwert für die jeweiligen Aufbringespitzen zu erhalten. Dann werden die auf diese Weise für alle elektrophoretischen Bilder erhaltenen integrierten Konzentrationswerte (d., d_ ... cL·) gemittelt, um einen integrierten Bezugs-Konzentrationswert (d_.) zu erhalten.

Darauf werden die Korrekturkoeffizienten (K.., K₂ ... K^) berechnet, indem jeweils der integrierte Bezugs-Konzentrationswert (d_R) durch den jeweiligen integrierten Konzentrationswert (d-, d₂ ... djj) geteilt wird.

d_R ^di

^dR

μΤ-

In der folgenden Tabelle 2 sind die tatsächlichen Werte für die Korrekturkoeffizienten (Κ_χ, K₂ ... K_n) angegeben, die in der oben erläuterten Weise erhalten worden sind.

Tabelle 2

Kx	K₂	^Ks I	K₃₀
1,02	1,05	0,98 ü)	0,87

Zu beachten ist, daß wenn ein Korrekturkoeffizient (K.) für eine Aufbringspitze des Applikators größer ist als 1,00, die von dieser Aufbringspitze aufgebrachte Menge einer Probe größer ist als die durchschnittliche Menge. Infolgedessen kann ein integrierter Konzentrationswert (O^) kompensiert werden, indem D. durch K₁ geteilt wird.

Die Korrekturkoeffizienten (Κ_χ, K₂ ... K_n) können im Speicher (15) mit Hilfe der Tastatur (16) und des Bildschirms (CRP) (17) gespeichert werden oder sie können berechnet und im Speicher (15) mit Hilfe des Prozessors (14) automatisch gespeichert werden. In diesem letzteren Falle genügt es, daß die Bedienungsperson in den Prozessor (14) einen Befehl für den Vorgang der Berechnung und Speicherung der Korrekturkoeffizienten eingibt.

Nachdem die Korrekturkoeffizienten (K₁, K_ ... KJ in der oben erläuterten Weise im Speicher (15) gespeichert worden sind, werden Testproben mit unbekannten Mengen an Gesamtprotein auf den Träger aufgebracht zusammen mit der Standardprobe mit der bekannten Gesamtproteinmenge; darauf wird der Träger der Elektrophorese unterworfen und es werden elektrophoretische Bilder auf dem Träger erzeugt. Dann werden die elektrophoretischen Bilder der Testproben und der Standardprobe optisch abgetastet und die integrierten Konzentrationswerte der jeweiligen elektrophoretischen Bilder (D₁, D₂ ... D_n) berechnet. Darauf wird

- 60 168

• AB-

die Gesamtproteinmenge einer Testprobe (TP.) entsprechend der folgenden Gleichung berechnet.

V^K1
^i " D^lT * ^l . . . ( 6 )

Die so berechneten Gesamtprotexnmengen der Testproben werden in der Diskette bzw. dem Floppy-Disk (18) gespeichert.

Bei der vorliegenden Ausführungsfcrm werden aus allen im Speicher (15) gespeicherten Absorptions bzw. Extinktionswerten der Testproben Absorptionswerte auf Abtastlinien ermittelt, die durch Mittellinien der jeweiligen elektrophoretischen Bilder der Testproben laufen. Dann werden die prozentualen Anteile der Fraktionen und die Verhältnisse A/G aus diesen herausgenommenen Absorptionswerten berechnet und in der Diskette (18) gespeichert. Gleichzeitig werden die Mengen der jeweiligen Proteinkomponenten berechnet, indem die prozentualen Anteile der Fraktionen mit der gemäß Gleichung 6 berechneten Gesamtproteinmenge multipliziert werden, und anschließend in der Diskette (18) gespeichert. Schließlich werden die herausgenommenen Absorptionswerte normalisiert. Die obigen Arbeitsgänge werden für die aufeinanderfolgenden, auf dem Träger erzeugten elektrophoretischen Bilder der Testproben durchgeführt und die Gesamtproteinmengen, prozentualen Anteile der Fraktionen, A/G-Verhältnisse, Mengen der jeweiligen Proteinkomponenten und normalisierten Absorptionswerte für alle neunundzwanzig Testproben in der Diskette (18) gespeichert. Darauf werden die Gesamtproteinmenge, die prozentualen Anteile der Fraktionen, das A/G-Verhältnis, die Mengen der jeweiligen Proteinkomponenten und die elektrophoretischen Bildmuster mit Hilfe des Druckers (19) unter Steuerung des Prozessors (14) in einem Versuchsbericht ausgedruckt .

- 60 168

■ -Ab-

Wie oben erläutert, wird bei der vorliegenden Ausführungsform die Standardprobe mit bekannter Gesamtproteinmenge zusammen mit den Testproben auf den Träger aufgebracht und die unbekannten Gesamt proteinmengen der Testproben werden aus der bekannten Gesamtproteinmenge der Standardprobe, dem integrierten Konzentrationswert des elektrophoretischen Bildes der Standardprobe, den integrierten Konzentrationswerten der elektrophoretischen Bilder der Testproben und den ersten und zweiten Korrekturkoeffizienten für die Korrektur von Unterschieden bzw. Schwankungen in den den Anfärbebedingungen und den auf den Träger aufgebrachten Mengen der Proben erhalten. Infolgedessen können die Gesamtproteinmengen der Testproben immer genau quantitativ ermittelt werden.

Die beschriebenen Ausführungsformen lassen sich modifizieren:

Beispielsweise umfaßt bei der obigen Ausführungsform das Densitometer den linearen Bildsensor, aber es kann (auch) ein einzelnes lichtempfangendes Element in der Hauptabtastrichtung zusammen mit der Lichtquelle synchron mit der schrittweisen Bewegung des Trägers bewegt werden, um das Raster-Abtasten zu bewirken. Weiterhin kann Gebrauch gemacht werden von einem zweidimensionalen Bildsensor und einer Objektivlinse um ein Bild eines elektrophoretischen Bildes einer Probe auf dem Bildsensor zu erzeugen. In diesem Falle kann der Abstand der stufen- oder schrittweisen Bewegung des Trägers länger und somit die Steuerung für die Bewegung einfacher sein.

Weiterhin kann eine Bedingung eines elektrophoretischen Bildes, die von verschiedenen Faktoren abhängt, beispielsweise ungleichmäßiges Aufbringen der Probe, aufgrund der Absorptions-(Extinktions-)Werte beurteilt werden und, wenn die Bedingungen des elektrophoretischen Bildes als schlecht beurteilt werden,

- 60 168

-Λ-

kann auf die Berechnung der Gesamtproteinmenge verzichtet werden. Die Bedingung bzw. der Zustand des elektrophoretischen Bildes kann mit Hilfe verschiedener Methoden beurteilt werden. Beispielsweise werden Maximalwerte, Mittelwerte oder integrierte Werte von Absorptionswerten aller Abtastlinien ermittelt und ein Muster aus den so erhaltenen Werten erstellt. Dann wird eine Länge des Musters, gesehen in der Eingaberichtung des Trägers, nachgewiesen bzw. ermittelt und mit einer Standardlänge verglichen, oder es wird eine Anzahl von Beugungs- bzw. Biegungspunkten des Musters nachgewiesen und mit einem Standardwert verglichen.

Ergibt die Berechnung eine außerordentlich hohe oder niedrige Gesamtproteinmenge, so braucht diese Menge nicht ausgedruckt zu werden oder sie wird mit einem Hinweis ausgedruckt, daß es sich um einen abnormalen Wert handelt.

Bei der obigen Ausführungsform wird ein integrierter Konzentrationswert weiterhin abgeleitet bzw. erhalten durch Integrieren der Absorptionswerte des gesamten elektrophoretischen Bildes. Es ist jedoch auch möglich, einen integrierten Konzentrationswert durch Integrieren von Absorptionswerten einer einzelnen Abtastlinie, die durch das Zentrum des elektrophoretischen Bildes geht, zu berechnen.

Darüberhinaus werden bei der obigen Ausführungsform einer Standardprobe mit bekannter Gesamtproteinmenge und Testproben mit unbekannten Gesamtproteinmengen auf ein und denselben Träger aufgebracht und die nicht bekannten Gesamtproteinmengen der Testproben werden aus der bekannten Gesamtproteinmenge der Standardprobe, dem integrierten Konzentrationswert des elektrophoretischen Bildes der Standardprobe und den integrierten Konzentrationswerten der elektrophoretischen Bilder der Testproben berechnet. Jedoch braucht die Standardprobe nicht immer auf den Träger aufgebracht zu werden. In einem solchen Falle

- L4" - 60

'/it'

werden Teilmengen von mehreren Standardproben mit unterschiedlichen bekannten Gesamtproteinmengen auf mehrere Träger aufgebracht und es wird eine Eichkurve oder ein Umwandlungs-(Konversions-) Koeffizient ermittelt, der eine Beziehung zwischen einer Gesamtproteinmenge und einem integrierten Konzentrationswert des elektrophoretischen Bildes wiedergibt. Dann werden lediglich Testproben auf einen Träger aufgebracht und die Gesamtproteinmengen der Testproben aus der Eichkurve oder dem Umwandlungskoeffizienten ermittelt bzw. bestimmt. In diesem Falle werden vorzugsweise Eichkurven oder ümwandlungskoeffizienten für jeweilige Aufbringespitzen der gleichen Proben-Aufbringevorrichtung aufgestellt.

Wie oben im einzelnen erläutert wird erfindungsgemäß die Gesamtproteinmenge einer Probe aus einem elektrophoretischen Bild ermittelt, das durch die Elektrophorese-Apparatur erzeugt worden ist. Es kann daher au zeitraubende Arbeitsgänge, wie das Analysieren der Gesamtproteinmengen von Testproben mit Hilfe des biochemischen Analysegerätes und Eingeben der durch die Analyse erhaltenen Gesamtproteinmengen in die Elektrophorese-Apparatur, verzichtet werden. Infolgedessen kann das biochemische Analysegerät sehr viel wirksamer ausgenutzt werden.

7264/28

Claims

PATENTANWÄLTE pp-.-ing. franz vuesthoff j WUESTHOFF-v.PECHMANN-BEHRENS-GOETZ κ··»«!-««* ^uestho» (.927-195«) \ JVPL.-ING. GERHARD PULS (i9J2-197l) 4*1 EUROPEAN PATENT ΛΤ7Ο$φ0 623 1 «μρ.-οηεμ.οκ.,ρκε,ηε* voh pechmann j DR.-ING. DIETER BEHRENS j D1PL.-1NG. DIPL.-VIIITSCH.-ING. KUPEIlT GOETZ j DIPL.-PMYS. DK. AXEL VON HELLFELD OLYMPUS OPTICAL COMPANY LIMITED D_8Q00 MÜNCHEN 90 j lA-60 168 SCHWEIGERSTRASSE 2 telefon: (089) 66 20 ji TELEGRAMM: PROTECTPATENT I TELEX: J 24 070 j TELEFAX: (089) 663936 (ill) i Patentansprüche :

1. Verfahren zum Messen der in einer Probe enthaltenen Gesamtproteinmenge umfassend folgende Stufen: Erzeugen elektrophoretischer Bilder einer Standardprobe mit bekannter Gesamtproteinmenge und einer zu untersuchenden Probe mit unbekannter Gesamtproteinmenge;

Ermitteln eines integrierten Konzentrationswertes des e^lektrophoretischen Bildes der Standardprobe;

Ermitteln eines integrierten Konzentrationswertes des elektro- / phoretischen Bildes der zu untersuchenden Probe; und i

Ermitteln der unbekannten Proteinmenge der zu untersuchenden Probe entsprechend der bekannten Menge Gesamtprotein der Standardprobe und den integrierten Konzentrationswerten der elektrophoretischen Bilder der Standardprobe und der zu untersuchenden Probe.

2. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennz e ichnet,

daß die elektrophoretischen Bilder der Standardprobe und der zu untersuchenden Probe (n) erzeugt werden, indem die Standardprobe und die zu untersuchende(n) Probe(n) auf einen einzigen Träger aufgebracht und der Träger der Elektrophorese unterworfen wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennze ichnet,

daß ein integrierter Konzentrationswert eines elektrophoretischen Bildes einer Probe ermittelt wird durch photoelektri-

- 2 - 60 168

sches Abtasten des elektrophoretischen Bildes um ein erstes elektrisches Signal zu erzeugen, das die Durchlässigkeit des elektrophoretischen Bildes wiedergibt, Eingeben des ersten elektrischen Signals in einen logarithmischen Verstärker, um ein zweites elektrisches Signal zu erzeugen, das die Absorption (Extinktion) des elektrophoretischen Bildes wiedergibt und Integrieren des zweiten elektrischen Signals um den integrierten Konzentrationswert des elektrophoretischen Bildes zu erhalten.

4. Verfahren nach Anspruch 3,
dadurch gekennzeichnet,

daß das elektrophoretische Bild zweidimensional abgetastet und das zweite elektrische Signal über das gesamte elektrophoretische Bild integriert wird.

5. Verfahren nach Anspruch 3,
dadurch gekennze ichnet,

daß das elektrophoretische Bild linear entlang einer Mittellinie des elektrophoretischen Bildes abgetastet und das zweite elektrische Signal entlang der Mittellinie des elektrophoretischen Bildes integriert wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,

daß der integrierte Konzentrationswert des elektrophoretischen Bildes einer Probe zusätzlich korrigiert wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6,
dadurch gekennzeichnet,

daß die Korrekturstufe das Ermitteln von Korrekturkoeffizienten

^kAlb ' ^ka1-G ' ^ka2-G ' ^kß-G ^{und 1}S-G ^{zum Korri}9^{ieren des} Unterschiedes im Anfärbungsgrad der jeweiligen Proteinkomponenten, Ermitteln integrierter Konzentrationswerte d,-»_b , d _ , d _ , d_o „ und d _ für den jeweiligen Proteinkomponenten entsprechende Teilbilder und Ermitteln eines integrierten Konzentrationswertes D des elektrophoretischen Bildes als Summe der Pro-

- 3 - 60 168

dukte aus den integrierten Konzentrationswerten von Teilbildern und den entsprechenden Korrekturkoeffizienten:

umfaßt.

8. Verfahren nach Anspruch 7,
dadurch gekennzeichnet,

daß die Korrekturkoeffizienten entsprechend der Lichtwellenlänge, mit der das elektrophoretische Bild optisch abgetastet wird, bestimmt werden.

9. Verfahren nach Anspruch 2,
dadurch gekennze ichnet,

daß ein elektrophoretisches Bild der Standardprobe und mehrere elektrophoretische Bilder von mehreren zu untersuchenden Proben auf dem gleichen Träger erzeugt und die Schwankungen innerhalb der auf den Träger aufgebrachten Probenmengen korrigiert werden.

10. Verfahren nach Anspruch 9,
dadurch gekennzeichnet,

daß die Korrekturstufe folgende Schritte umfaßt: Erzeugen von mehreren elektrophoretischen Bildern der Standardprobe auf einem Träger;

Ermitteln integrierter Konzentrationswerte d-, d_ ... d_N der elektrophoretischen Bilder der Standardprobe; Ermitteln eines Mittelwertes d_ der integrierten Konzentrationswerte d-, d_ ... d„;

Ermitteln von Korrekturkoeffizienten K₁ , K„ ... K„ in Uberein-Stimmung mit den integrierten Konzentrationswerten und dem Mittelwert und
Ermitteln korrigierter integrierter Konzentrationswerte durch

- 4 - 60 168

Dividieren der integrierten Werte D-, D_ ... D_n der elektrophoretischen Bilder der zu untersuchenden Proben durch die entsprechenden Korrekturkoeffizienten K,, K„ ... K .

11. Verfahren nach Anspruch 10,
dadurch gekennzeichnet,

daß die Erzeugung der elektrophoretischen Bilder der Standardprobe und die Ermittlung der integrierten Konzentrationswerte der elektrophoretischen Bilder der Standardprobe unter Verwendung von mehreren Trägern mehrfach vorgenommen und der Mittelwert des integrierten Wertes aus den Mittelwerten von mehreren integrierten Konzentrationswerten berechnet wird.

12. Verfahren nach Anspruch 3,
dadurch gekennze ichnet,

daß die elektrophoretischen Bilder von Proben schrittweise in einer Richtung senkrecht zur elektrophoretischen Richtung bewegt und mit Hilfe eines linearen Bildsensors abgetastet werden, der in der elektrophoretischen Richtung angeordnet ist.

13. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,

daß zusätzlich Mengen der jeweiligen Proteinkomponenten einer Probe berechnet werden durch Multiplizieren der prozentualen Anteile der Fraktionen der jeweiligen Proteinkomponenten mit der Gesamtproteinmenge der betreffenden Probe.

14. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,

daß zusätzlich die Beschaffenheit der elektrophoretischen Bilder von Proben nachgewiesen und eine Maßnahme zur Herleitung der Gesamtproteinmenge einer Probe unterlassen wird, wenn die Beschaffenheit des elektrophoretischen Bildes der betreffenden Probe als abnormal nachgewiesen wird.

7264/28