CN103361432A - 用于检测人类乙醛脱氢酶2(aldh2)基因分型的引物组及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测人类ALDH2基因分型的引物组及试剂盒。用于检测人类ALDH2基因分型的引物组包括ALDH2*1引物对、ALDH2*2引物对和内参引物对，本发明的试剂盒的应用实现了对ALDH2基因的良好分型，对饮酒行为、酒精性肝硬化，肝癌，鼻咽癌，口腔癌等遗传危险因素，硝酸甘油指导用药具有参考价值。

Description

用于检测人类乙醛脱氢酶2(ALDH2)基因分型的引物组及试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种用于检测ALDH2基因分型的试剂盒。

背景技术

人类乙醛脱氢酶2(ALDH2)基因位于12号染色体(12q24.2)，它的主要多态性是rs671，即位于外显子12的G1510A。正常的等位基因记为ALDH2*1，单碱基突变的等位基因记为ALDH2*2。ALDH2*2在人类各族群中的分布是不同的，它基本全部出现在亚洲人上。研究显示中国人ALDH2*2的等位基因频率为18％，其中广东汉族最高(31％)，武汉汉族12％，洛阳人15％，上海人25％，台湾人30％。朝鲜人16％，日本人27％，泰国人4％，白人0％，黑人0％。

乙醛脱氢酶是随机组合的四聚体，一个突变型的亚基影响了四聚体的稳定性，进而影响酶的正常表达。ALDH2*2是显性遗传，研究发现携带ALDH2*2的是纯合子(AA)，ALDH2酶无活性，若是杂合子(GA)，ALDH2酶活性只有6％。ALDH2基因多态性对饮酒行为有影响，是酒精性肝硬化，肝癌，鼻咽癌，口腔癌等遗传危险因素，对硝酸甘油指导用药具有参考价值。下面分别加以介绍。

ALDH2与饮酒行为的关系：ALDH2*2突变表达出的亚基的酶无法正常代谢乙醇的氧化产物乙醛，血液乙醛浓度增高，造成一系列饮酒后的不良反应，如脸红、头晕、心跳加快等。而纯合子ALDH2*2/*2酶活性近乎为零，最好是滴酒不沾。有ALDH2*2者更易产生饮酒的不良反应，酗酒的可能性也较小。ALDH2*2/*2纯合子，由于完全不能代谢酒精，不胜酒力，很快就醉倒了，所以反而不会去喝酒，对健康也就不会有什么大的影响。ALDH2*1/*2杂合子，由于还是具有弱的ALDH2活性，经过不断的磨练，会逐渐对乙醛、脸红现象产生耐受，成为习惯性的重度饮酒者。ALDH2检测评估个体酒精代谢能力，指导检测者正确饮酒，避免不当饮酒对身体造成的伤害。ALDH2*2/*2纯合子，由于完全不能代谢酒精，尽量不要饮酒。ALDH2*1/*2杂合子，由于还是具有弱的ALDH2活性，最易形成习惯性的重度饮酒者，尽量不要饮酒。

ALDH2与酒精性肝硬化的关系：流行病理学表明，酗酒是慢性肝病的重要诱因，然而长期酗酒者中，仅10％～20％发展为酒精性肝硬化(alcoholic liver cirrhosis，ALC)。单卵双胞胎与双卵双胞胎相比有较高发生率，提示个体间遗传差异是酗酒者ALC易感性的基础，说明遗传因素对汉族男性ALC易感性有影响。ALDH2*2突变表达出的亚基的酶无法正常代谢乙醇的氧化产物乙醛，血液与肝脏中乙醛浓度增高，长期刺激引起酒精性肝硬化。ALDH2*2等位基因在酗酒组中的频率显著低于它在ALC组中的频率，提示ALDH2*2等位基因会提高其携带者ALC的患病风险。

ALDH2与癌症的关系：酒精在体内的代谢过程主要为乙醇→乙醛→乙酸。乙醛已被证实有明显的致癌作用，而存在于肝细胞中的乙醛脱氢酶2(ALDH2)，它的功能是将乙醛氧化为无致癌作用的乙酸。有研究表明，饮酒后携带ALDH2*2/*2者血液中乙醛的浓度是携带谷氨酸纯合型ALDH2*2/*2的19倍，是谷氨酸赖氨酸杂合型ALDH2*1/*2的19(ALJ))的3倍。ALDH2基因多态性与癌症易感性关系的研究集中在日本进行，结果显示其主要是与胃癌和食管癌的发生有关。研究发现的在携带ALDH2变异基因型饮酒人中，每月饮酒量＞3kg与≤3kg者相比，患肝癌危险性高达7.2倍，乙肝阳性肝癌危险性高达52倍，食道癌危险性高达13倍，口腔癌危险性高达6倍。

ALDH2基因多态性与硝酸甘油代谢：硝酸甘油(GTN，glyceryl trinitrate，nitroglycerin)用于治疗心绞痛和心力衰竭已有130年的历史，舌下含服硝酸甘油片是抗冠心病心绞痛急性发作的常规首选药方。临床有效性常因人而异。有的人因它而及时挽救了生命，而有的人服用之后，效果却不甚明显。研究表明ALDH2基因突变是影响硝酸甘油药物疗效的决定性因素。临床医师在使用硝酸甘油时，需考虑患者的ALDH2基因型遗传因素。通过DNA检测，评估硝酸甘油治疗方案，ALDH2基因型突变可作为硝酸甘油治疗的简单指示标志。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种用于检测ALDH2基因分型的引物组。

本发明的第二个目的是：提供一种用于灵敏、特异、经济、简便、快速的特点的用于检测ALDH2基因分型的试剂盒。

一种用于检测人类乙醛脱氢酶2(ALDH2)基因分型的引物组，其特征包括ALDH2*1引物对、ALDH2*2引物对及内参引物对。

所述ALDH2*1引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；

所述ALDH2*2引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

一种用于检测人类乙醛脱氢酶2(ALDH2*1、ALDH2*2)基因分型的试剂盒，其特征是包被有ALDH2*1引物对、ALDH2*2引物对及内参引物对的引物板和浓缩dNTP-Buffer。

所述ALDH2*1引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；

所述ALDH2*2引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

附图说明

图1为ALDH2基因特异引物孔位图

图2为实验结果阴阳性判读图

图3为ALDH2实验结果阳性基因分型读板纸

图4为ALDH2电泳结果胶图

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1

依据美国国立生物技术信息中心基因库(NCBI Gene Bank)公开的ALDH2等位基因序列，设计出用于检测ALDH2基因分型的引物组，该引物组包括ALDH2*1引物对、ALDH2*2引物对及内参引物对。

实施例2

用于检测ALDH2基因分型的试剂盒的制备方法是：

(1)依据ALDH2基因特异引物孔位图(见图1)，分别将ALDH2*1引物对、ALDH2*2引物对和内参引物对包被至引物板的相应位置上，干燥处理；

(2)依据配200mM dNTP、3.5mM Mg2+、500mM KCL、100mM Tris-HCL、1％TritonX-100制备出440μl浓缩dNTP-Buffer；

(3)将包被有引物对的引物板每人份检测包括2孔特异性引物孔，浓缩dNTP-Buffer组成一种用于人类ALDH2基因分型检测的试剂盒。

实施例3

使用操作流程

一、2.5％琼脂糖凝胶的准备：

1.将加入2.5g琼脂糖加入100ml1×TBE溶液(Tris-硼酸盐-EDTA溶液)，加热直到形成均匀的凝胶溶液。再加入适量电泳染色剂，混合均匀。

2.将凝胶槽置于水平位置，向凝胶槽中加入适量凝胶溶液，插入电泳梳。前后水平移动凝胶槽，确保凝胶溶液覆盖均匀。

3.待凝胶完全凝固后，竖直拔出电泳梳。

二、PCR循环参数见表1：

1	96℃/2min	1cycle
			2	96℃/20sec，68℃/60sec	5cycles
3	96℃/20sec，65℃/50sec，72℃/45sec	10cycles
			4	96℃/20sec，63℃/50sec，72℃/45sec	15cycles
5	72℃/3min	1cycle
			6	4℃保存

表1扩增参数特征表

三、必须满足的试验条件：

1.从冷冻室取出Taq聚合酶，放置冰上备用。

2.根据实验所需数量，将包被引物的干燥冷冻保存的引物板取出，放置室温解冻，备用。

3.根据实验所需数量，将冷冻的DNA样本、浓缩dNTP-Buffer取出，彻底融化，混匀离心。

四、实验过程中的注意事项：

1.PCR扩增前后使用的加样器具要分开，不得混用。

2.对电泳染色剂操作时请带手套。

3.所有血液制品均应按照潜在的传染物处理。

4.当观察和拍摄胶凝体时，要戴防紫外光的保护镜，不要直视紫外光源。

5.试剂和样本应加样到微孔板的底部。

6.为避免交叉污染，在不同样本和试剂之间要更换加样枪头。

7.在检测前应准备好所有试剂和样本，一旦开始试验，为确保得到可靠结果不可中断操作。

8.Taq聚合酶粘性很大，在分装过程中必须小心操作确保准确。

9.严格按照指定的顺序操作。

五、操作步骤：选用实施例2制备的一种人类ALDH2基因分型检测试剂盒

1.配制dNTP-Buffer工作液：

440μl浓缩dNTP-Buffer+560μl无菌水＝1000μl dNTP-Buffer工作液

2.配制Buffer-Taq酶混合液：每5人份用量：100μl dNTP-Buffer工作液+0.8μl Taq酶(5units/μl)＝100.8μl

3.配制Buffer-Taq酶-DNA混合液：20μl配制Buffer-Taq酶混合液+2μlDNA＝22μl

4.漩涡混匀Buffer-酶混合液，并瞬时离心，，使液体位于管底。

5.分别向每个引物孔(每人份2孔)加入10μl上述混合液。

6.每孔再分别加入15-20μl石蜡油，用密封膜封好PCR反应板(引物板)。

7.将引物板放入设置好循环参数的PCR仪内，配合使用适当的板架适配器。PCR循环参数见上文。

8.反应板顶部置PCR密封压力垫，以防止液体蒸发，关上PCR仪，启动程序直至循环结束。

9.启动PCR程序，直到循环结束。

10.取出引物板，轻轻地撕掉密封膜，防止样品溅出。或者如果不立即电泳，置于4℃可保存48小时。

11.按照照引物孔位图的顺序，将每个PCR反应产物(5-10μl)转移到2.5％琼脂糖凝胶孔中。

12.140-150V电泳15-20分钟，内参带和阳性带清晰分开即可停止电泳。

13.紫外光下观察结果并拍摄成像。

14.根据提供的读板纸解释分型结果。

六、质量控制程序：

内参质控带(缓慢迁移的)作为成功扩增的质控手段，在阴性孔应该总是可见的；阳性孔的内参质控带可能会很弱或者不存在，这是因为特异性引物扩增过程中与内参引物竞争Taq酶等反应原料的结果。

七、实验结果的判读：

检测ALDH2电泳结果胶图(见图4)，实验结果阴阳性判读图(见图2)，实验结果阳性基因分型读板纸(见图3)。

预期结果：

阳性孔：有两条带，一条是内参带，另一条是特异性扩增带

阴性孔：只有一条带，是内参带，无特异性扩增带

产物大小和孔位：见ALDH2基因特异引物孔位图(见图1)

根据ALDH2基因特异引物孔位图(见图1)或该试剂配套软件进行分型结果的判定。

该实验为定性试验，特异性扩增带强弱将不影响结果判读；扩增产物大小请参见ALDH2基因特异引物孔位图(见图1)；并符合人类基因座位规则。

Claims (2)

1.一种用于检测人类乙醛脱氢酶2(ALDH2)基因分型的引物组，其特征包括ALDH2*1引物对、ALDH2*2引物对及内参引物对。(下述引物的位置来源于美国GENBANK网站的ALDH2的参考序列，Homo sapiens aldehyde dehydrogenase 2 family(mitochondrial)(ALDH2)，RefSeqGene on chromosome 12 NCBI Reference Sequence：NG_012250.1)

所述ALDH2*1的上、下游引物位于ALDH2的DNA参考序列的42403-42421与42739-42757位置，上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；

所述ALDH2*2的上、下游引物位于ALDH2的DNA参考序列的42403-42421与42739-42757位置，上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；

2.根据权利1所述的一种用于检测人类乙醛脱氢酶2(ALDH2*1及ALDH2*2)基因分型的试剂盒，其特征是所述引物板上包被有ALDH2*1引物对、ALDH2*2引物对和内参引物对的引物板和浓缩dNTP-Buffer。

所述ALDH2*1引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；

所述ALDH2*2引物对的上、下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；

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