CN102367438A

CN102367438A - 用于指导铂类药物个体化治疗的基因组合

Info

Publication number: CN102367438A
Application number: CN2011102615878A
Authority: CN
Inventors: 楼敬伟
Original assignee: SHANGHAI BIOTECAN PHARMACEUTICALS CO Ltd
Current assignee: SHANGHAI BIOTECAN PHARMACEUTICALS CO Ltd
Priority date: 2011-09-06
Filing date: 2011-09-06
Publication date: 2012-03-07

Abstract

本发明属于基因技术领域，提供一组用于指导铂类药物个体化治疗的基因组合，包括GSTP1，MRP2，XRCC1-Exon6，XRCC1-Exon10，ERCC1，ERCC2。本发明通过检测病人肿瘤组织中的GSTP1，MRP2，XRCC1-Exon6，XRCC1-Exon10，ERCC1，ERCC2基因位点的突变情况，对拟采用铂类药物治疗的病人进行药物敏感指导，以使疗效达到最大，副作用降到最低。

Description

用于指导铂类药物个体化治疗的基因组合

技术领域

本发明属于基因技术领域，涉及一组用于指导铂类药物个体化治疗的基因组合。

背景技术

铂类化疗药物(顺铂、卡铂、奥沙利铂等)是肿瘤化疗领域的最常用药物之一，其抗癌活性是通过在DNA双链上形成共价交联，并与DNA绑定形成铂-DNA加合物，从而引起一系列细胞内事件的发生，最终导致肿瘤细胞死亡。然而部分肿瘤细胞对铂类药物的敏感性差是导致化疗失败，病情进展的主要原因。因此，临床医生在使用铂类药物前，迫切需要一份对疗效、耐药性及预后具有前瞻性指导意义的信息。

GSTP1属于多功能II相代谢酶家族，能催化谷胱甘肽与多种毒性复合物(包括铂类制剂)结合，形成低毒高水溶性物质排出细胞外，达到促进药物排泄而降低抗癌效果的作用。GSTP1外显子5的第313位碱基存在A/G单核苷酸多态，导致其编码的氨基酸发生Ile-Val改变，显著降低GSTP1的活性，从而使化疗药的清除率降低和药物对肿瘤作用的时间延长。

MRP2：MRP2(ABCC2)属于多药耐药相关蛋白(multidrug resistance associatedproteins，MRPs)家族，MRPs定位于细胞膜，是一类能量依赖性转运蛋白，主要转运疏水性、不带电荷分子或水溶性阴离子化合物。已经证实MRP2与铂类药物的耐药有关。MRP2表达增强时，顺铂-DNA复合物的形成减少，C2阻滞减少，细胞对铂类的耐药性增强；而当SNP导致MRP2发生氨基酸替换时，这一作用减弱，细胞对铂类敏感性增强。另有研究表明，MRP2可能通过促进GSH结合的铂离子排出细胞外，来增强肿瘤细胞对铂类的耐药性。MRP第10外显子(G1249A)的突变使MRP2的功能降低，从而增加肿瘤患者对铂类药物的敏感性。XRCC1：XRCC1(X-ray repair cross-complementing gene 1)是碱基切除修复系统(BER)和单链断裂修复系统(ssBR)中的重要成分，参与顺铂或卡铂引起的DNA损伤修复过程，其进化保守区有SNP，导致其编码区密码子194和399的取代改变，从而影响XRCC1蛋白的正常功能，改变DNA的修复能力。多项研究表明，在XRCC1 Arg194Trp基因表达中，携带至少1个194Trp等位基因患者化疗有效率是携带野生基因型Arg/Arg患者的3倍；携带XRCC1 399Arg/Arg基因型患者治疗的有效率是Arg/Gln或Gln/Gln基因型者的2.7倍；在联合基因型中，既携带194 Arg/Trp又携带399 Arg/Arg基因型患者化疗有效率进一步提高。

ERCC1：ERCC1(excision repair cross-complementation group 1)是核苷酸切除修复途径的限速酶，在核酸损伤修复过程和凋亡过程中起着重要作用。ERCC1基因的表达产物与DNA修复酶缺乏互补基因F(XPF)形成紧密的异二聚体(ERCC1-XPF)，该二聚体具有识别损伤和5’端切除的双重作用，在核苷酸切除修复中起到限速或调节的重要作用。ERCC1的表达量直接影响DNA修复的生理过程。所有肿瘤细胞中都有ERCC1表达，而且表达水平差异很大。核苷酸切除修复(nucleotide excision repair，NER)是铂类药物耐药的重要机制之一。临床研究已证实ERCC1参与铂类化疗耐药发生，其表达水平与多种癌症铂类化疗疗效和生存期呈负相关，既表达水平低的患者对铂类药物敏感，表达水平高的患者表现耐药。ERCC1基因中118位密码子CC野生型对铂类药物化疗反应性较好，有较好的预后。ERCC1TT突变型会导致ERCC1蛋白表达水平增高，增强修复顺铂对DNA的损伤的能力，因此突变患者对铂类药物耐药。

ERCC2：着色性干皮病基因D(XPD)/切除修复交叉互补基因2(ERCC2)是参与受损DNA核苷酸切除修复(NER)过程的一种重要的酶，其活性直接影响铂类药物的化疗效果。ERCC2存在多个单核苷酸多态性(SNP)，312Asp/Asn和751Lys/Gln多态性比较常见。最常见的为第751位密码子由赖氨酸(Lys)变为谷氨酰胺(Gln)，此多态性影响奥沙利铂(L-OHP)的治疗效果。研究显示，C/C基因型病人缓解率明显比C/A和A/A基因型病人高，C/C基因型病人对铂类药物敏感性更好。

药物代谢和效应的个体化差异：临床上，由于个体基因型差异，患者对药物敏感性的差异显著。因此，在对肿瘤患者进行治疗时，如果先对其相关基因位点进行检测，再根据其基因突变情况用药，以达到在正确的时间，给正确的患者，实施正确的个体优化治疗。通过检测病人肿瘤组织中的GSTP1，MRP2，XRCC1-Exon6，XRCC1-Exon10，ERCC1，ERCC2基因位点的突变情况，对拟采用铂类药物治疗的病人进行药物敏感性指导，可以使疗效达到最大，副作用降到最低。

现有临床用药方法的缺陷：大量研究表明，由于个体基因型差异，患者对药物敏感性的差异显著。如医生在用药时未做药物的靶标检测，则可能导致用药无(微)效、延误最佳治疗时机、毒副作用等现象发生。

本发明的有益之处是：(1)本发明的筛选方法是一种对人体无害的检测方法；(2)本发明通过检测病人肿瘤组织中的GSTP1，MRP2，XRCC1-Exon6，XRCC1-Exon10，ERCC1，ERCC2基因位点的突变情况，对拟采用铂类药物治疗的病人进行药物敏感指导，可以使疗效达到最大，副作用降到最低。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对目前肿瘤的治疗过程中，铂类药物的疗效在不同病人间的明显差异，提供一种方便、快捷的辅助临床医生制定个体化用药方案的基因组合及其应用方法。

本发明的目的是提供一组用于指导铂类药物个体化治疗的基因组合，包括：GSTP1，MRP2，XRCC1-Exon6，XRCC1-Exon10，ERCC1，ERCC2基因。

本发明的另一个目的是提供该基因组合在指导铂类药物个体化治疗中的应用。

基于上述目的，本发明采用以下技术方案：

针对上述基因的特异性位点设计引物，各基因引物序列如表1所示。

表1

使用上述引物鉴定其相应基因的突变情况，包括如下步骤：

(1)提取病人肿瘤组织基因组DNA；

(2)进行PCR扩增，20μl PCR反应体系如下：待测肿瘤组织基因组DNA50～100ng，Taq酶0.125μl，上下游引物(10μM)各1μl，dNTP(2.5mM)2μl，10×PCR缓冲液(含Mg²⁺)2μl，余下为无菌蒸馏水；PCR反应条件为：95℃变性2min，随后95℃变性30sec，55℃(GSTP1)、64℃(MRP2)、58℃(XRCC1-Exon6)、58℃(XRCC1-Exon10)、58℃(ERCC1)、60℃(ERCC2)退火30sec，72℃延伸30sec，进行40个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存；

(3)PCR扩增产物的凝胶电泳分析；

(4)PCR扩增产物测序。

附图说明

图1是各基因突变区域的PCR扩增产物的电泳图，图中M为核酸分子量标准marker条带，1为GSTP1条带，2为MRP2条带，3为XRCC1-Exon6条带，4为XRCC1-Exon10条带，5为ERCC1条带，6为ERCC2条带；

图2是GSTP1突变区域的PCR扩增产物的直接测序图；

图3是MRP2突变区域的PCR扩增产物的直接测序图；

图4是XRCC1-Exon6突变区域的PCR扩增产物的直接测序图；

图5是XRCC1-Exon10突变区域的PCR扩增产物的直接测序图；

图6是ERCC1突变区域的PCR扩增产物的直接测序图。

图7是ERCC2突变区域的PCR扩增产物的直接测序图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1一种鉴定GSTP1突变情况的方法

1.提取病人肿瘤组织基因组DNA；

2.进行PCR扩增，20μlPCR反应体系如下：待测肿瘤组织基因组DNA50～100ng，Taq酶0.125μl，上下游引物(10μM)各1μl，dNTP(2.5mM)2μl，10×PCR缓冲液(含Mg²⁺)2μl，余下为无菌蒸馏水；PCR反应条件为：95℃预变性2min，随后95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，进行40个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存；

3.PCR扩增产物的凝胶电泳分析：

a.用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净。放在水平桌面上，并架好梳子。可配制1.5％浓度的琼脂糖用于电泳。

b.将50ml 1×TAE电泳缓冲液100ml于三角烧瓶中，称取0.75g的琼脂糖粉放入后微波炉内加热溶解。冷却至60℃左右，加入5μl

混匀，倒入电泳槽中，避免气泡，待凝固。

c.向电泳槽中倒入1×TAE，其量以没过胶面2mm为宜，小心移去梳子。如样品孔内有气泡，应设法除去。

d.在3-5μlPCR产物中加入12μl的加样缓冲液，混匀后，加入样品孔内。并设一孔核酸分子量标准marker(6μl)。

e.接通电源，红色为正极黑色为负极，DNA样品由负极往正极泳动(靠近加样孔的一端为负)，电压为120V。根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳。一般200～400bp的PCR产物电泳20min即可。

f.紫外仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准比较被扩增产物的大小。拍照，电脑存档。

结果如图1所示，条带2代表GSTP1，其PCR产物为472bp。

4.PCR扩增产物测序：确认电泳跑出目标条带后进行测序。

a.在每个孔中加入2μl PCR产物，1μl混和酶(0.5U虾碱酶和5U外切酶)，PCR仪上，85℃灭活15min。

b.在上述孔中加入1μl BDT溶液，2μl引物(1pmol/μl)(正向和反向引物分别装于两个孔中)，每加完一次样都在96孔板于离心机中离心，当离心速度达到1500转/min时即停，最后当所有试剂全部加完离心后盖上热垫盖。

c.在PCR仪上进行扩增。反应条件为：95℃预变性4min，随后95℃变性30sec，50℃退火15sec，进行35个循环，最后60℃延伸4min，4℃保存；

d.反应结束后，将96孔板放入离心机离心，当转速达2000转/min即停止离心。

e.打开热垫盖，在各孔内分别加入2.μl 125mM EDTA，在离心机中离心，至转速达2000转/min停止离心，再加17μl无水乙醇(AR)，盖上盖子，在漩涡混悬器上振荡后放入于低温离心机中离心，在转速3500转/min下离心30分钟。

f.打开热垫盖盖，在板口放置足够的吸水纸，在离心机中倒置离心，当转速达1300转/min停止离心。

g.分别向上步得到沉淀中加入50μl 70％乙醇，封上塑料封口膜，在冷冻离心机中离心(3500转/min)6分钟。

h.揭开塑料封口膜，在板口放置足够的吸水纸，在冷冻离心机中倒置离心，当转速达到1300转/min时停止离心。

i.将洗涤好的沉淀在抽屉中避光，室温下放置15-30分钟左右，让残留乙醇全部挥发。

j.每孔加入10ul Hi-Di，在PCR仪上进行变性反应，条件为：95℃4min→4℃保存。

k.3730xl测序仪进行测序。

应用DNAstar程序，将样本测序所得序列与同一区域的野生型序列比较，确定GSTP1的突变情况及突变位点。野生型为5外显子中313位碱基正常为A，突变型为G。本次样本测序结果为野生型，见图2。

实施例2一种鉴定MRP2突变情况的方法

1.提取病人肿瘤组织基因组DNA；

2.进行PCR扩增，20μl PCR反应体系如下：待测肿瘤组织基因组DNA50～100ng，Taq酶0.125μl，上下游引物(10μM)各1μl，dNTP(2.5mM)2μl，10×PCR缓冲液(含Mg²⁺)2μl，余下为无菌蒸馏水；PCR反应条件为：95℃预变性2min，随后95℃变性30sec，64℃退火30sec，72℃延伸30sec，进行40个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存；

3.PCR扩增产物的凝胶电泳分析：具体步骤同实施例1。

结果如图1所示，条带3代表MRP2，其PCR产物为414bp。

4.PCR扩增产物测序：具体步骤同实施例1。

应用DNAstar程序，将样本测序所得序列与同一区域的野生型序列比较，确定MRP2的突变情况及突变位点。第1249位碱基野生型序列为G，突变型序列为A。本次样本测序结果为野生型，见图3。

实施例3一种鉴定XRCC1-Exon6突变情况的方法

1.提取病人肿瘤组织基因组DNA；

2.进行PCR扩增，20μl PCR反应体系如下：待测肿瘤组织基因组DNA50～100ng，Taq酶0.125μl，上下游引物(10μM)各1μl，dNTP(2.5mM)2μl，10×PCR缓冲液(含Mg²⁺)2μl，余下为无菌蒸馏水；PCR反应条件为：95℃预变性2min，随后95℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸30sec，进行40个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存；

3.PCR扩增产物的凝胶电泳分析：具体步骤同实施例1。

结果如图1所示，条带4代表XRCC1-Exon6，其PCR产物为330bp。

4.PCR扩增产物测序：具体步骤同实施例1。

应用DNAstar程序，将样本测序所得序列与同一区域的野生型序列比较，确定XRCC1-Exon6的突变情况及突变位点，野生型密码子194序列分别为AGG，突变型密码子序列为TGG。本次样本测序结果为突变型，见图4。

实施例4一种鉴定XRCC1-Exon10基因突变情况的方法

1.提取肿瘤病人血液基因组DNA；

2.进行PCR扩增，20μl PCR反应体系如下：待测肿瘤病人血液基因组DNA50～100ng，Taq酶0.125μl，上下游引物(10μM)各1μl，dNTP(2.5mM)2μl，10×PCR缓冲液(含Mg²⁺)2μl，余下为无菌蒸馏水；PCR反应条件为：95℃预变性2min，随后95℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸30sec，进行40个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存；

3.PCR扩增产物的凝胶电泳分析：具体步骤同实施例1。

结果如图1所示，条带5代表XRCC1-Exon10基因，其PCR产物为411bp。

4.PCR扩增产物测序：具体步骤同实施例1。

应用DNAstar程序，将样本测序所得序列与同一区域的野生型序列比较，确定XRCC1-Exon10的突变情况及突变位点。野生型为密码子399序列为CGG，突变型序列为CAG，本次样本测序结果为野生型。见图5。

实施例5一种鉴定ERCC1基因突变情况的方法

1.提取肿瘤病人血液基因组DNA；

3.PCR扩增产物的凝胶电泳分析：具体步骤同实施例1。

结果如图1所示，条带6代表ERCC1基因，其PCR产物为439bp。

4.PCR扩增产物测序：具体步骤同实施例1。

应用DNAstar程序，将样本测序所得序列与同一区域的野生型序列比较，确定ERCC1的突变情况及突变位点。野生型密码子118序列为AAT，突变型密码子序列为AAC，本次样本测序结果为野生型。见图6。

实施例6一种鉴定ERCC2基因突变情况的方法

1.提取肿瘤病人血液基因组DNA；

2.进行PCR扩增，20ml PCR反应体系如下：待测肿瘤病人血液基因组DNA50～100ng，Taq酶0.125ml，上下游引物(10μM)各1μl，dNTP(2.5mM)2ml，10×PCR缓冲液(含Mg2+)2ml，余下为无菌蒸馏水；PCR反应条件为：95℃预变性2min，随后95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，进行40个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存；

3.PCR扩增产物的凝胶电泳分析：具体步骤同实施例1。

结果如图1所示，条带7代表ERCC2基因，其PCR产物为385bp。

4.PCR扩增产物测序：具体步骤同实施例1。

应用DNAstar程序，将样本测序所得序列与同一区域的野生型序列比较，确定ERCC2的突变情况及突变位点。野生型密码子751序列为AAA，突变型密码子序列为CAA，本次样本测序结果为野生型。见图7。

序列表

<110>上海宝藤生物医药科技有限公司

<120>用于指导铂类药物个体化治疗的基因组合

<130>20110830

<160>12

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

ctgctgtgtg gcagtctctc 20

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

ccgttacttg gctggttgat 20

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

gggcaaagaa gtgtgtggat 20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

agggtcccaa ctctctccat 20

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

atactgacct tgcgggacct 20

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

序列表

<400>6

cagcctccag acctctcaac 20

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

tccactatgc tgcatgcttt 20

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

attgcccagc acaggataag 20

<210>9

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

tgagccaattcagccact 18

<210>10

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

tagttcctca gtttcccg 18

<210>11

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

gatggcccgc tctggatt 18

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

cctgcgatta aaggctgtgg 20

Claims

1.一组用于指导铂类药物个体化治疗的基因组合，其特征在于该基因组合包含：GSTP1，MRP2，XRCC1-Exon6，XRCC1-Exon10，ERCC1，ERCC2基因。

2.根据权利要求1所述的基因组合，其特征在于针对GSTP1位点设计的正向引物序列为：CTGCTGTGTGGCAGTCTCTC(SEQ ID No.1)，反向引物序列为：CCGTTACTTGGCTGGTTGAT(SEQ ID No.2)；针对MRP2位点设计的正向引物序列为：GGGCAAAGAAGTGTGTGGAT(SEQ ID No.3)，反向引物序列为：AGGGTCCCAACTCTCTCCAT(SEQ ID No.4)；针对XRCC1-Exon6位点设计的正向引物序列为：ATACTGACCTTGCGGGACCT(SEQ ID No.5)，反向引物序列为：CAGCCTCCAGACCTCTCAAC(SEQ ID NO.6)；针对XRCC1-Exon10位点设计的正向引物序列为：TCCACTATGCTGCATGCTTT(SEQ ID No.7)，反向引物序列为：ATTGCCCAGCACAGGATAAG(SEQ ID NO.8)；针对ERCC1位点设计的正向引物序列为：TGAGCCAATTCAGCCACT(SEQ ID No.9)，反向引物序列为：TAGTTCCTCAGTTTCCCG(SEQ ID NO.10)；针对ERCC2位点设计的正向引物序列为：GATGGCCCGCTCTGGATT(SEQ ID No.11)，反向引物序列为：CCTGCGATTAAAGGCTGTGG(SEQ ID NO.12)。

3.如权利要求2所述的引物序列在检测其相应的基因突变中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于检测方法如下：

4.1提取病人待测肿瘤组织基因组DNA；

4.2以待测肿瘤组织基因组DNA为模板，用权利要求2所述的扩增引物进行PCR扩增；

4.3PCR扩增产物凝胶电泳分析；

4.4PCR扩增产物测序。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述步骤4.2中PCR反应体系每20μl组成如下：待测病人肿瘤组织基因组DNA 50～100ng，Taq酶0.125μl，上下游引物(10μM)各1μl，dNTP(2.5mM)2μl，10×PCR缓冲液(含Mg²⁺)2μl，余下为无菌蒸馏水。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述步骤4.2中用于检测GSTP1的PCR扩增反应条件是：95℃预变性2min，随后95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，进行40个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存。

7.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述步骤4.2中用于检测MRP2的PCR扩增反应条件是：95℃预变性2min，随后95℃变性30sec，64℃退火30sec，72℃延伸30sec，进行40个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存。

8.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述步骤4.2中用于检测XRCC1-Exon6的PCR扩增反应条件是：95℃预变性2min，随后95℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸30sec，进行40个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存。

9.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述步骤4.2中用于检测XRCC1-Exon10的PCR扩增。反应条件是：95℃预变性2min，随后95℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸30sec，进行40个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存。

10.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述步骤4.2中用于检测ERCC1的PCR扩增反应条件是：95℃预变性2min，随后95℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸1min，进行40个循环，最后72℃延伸30sec，4℃保存。

11.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述步骤4.2中用于检测ERCC2的PCR扩增反应条件是：95℃预变性2min，随后95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸1min，进行40个循环，最后72℃延伸30sec，4℃保存。

12.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述步骤4.4中测序PCR扩增的反应条件为：95℃预变性4min，随后95℃变性30sec，50℃退火15sec，进行35个循环，最后60℃延伸4min，4℃保存。