CN102146434A

CN102146434A - 用于指导易瑞沙、特罗凯类药物个体化治疗的基因组合

Info

Publication number: CN102146434A
Application number: CN2010101073868A
Authority: CN
Inventors: 楼敬伟; 黄慧; 徐玲丽
Original assignee: SHANGHAI BIOTECAN PHARMACEUTICALS CO Ltd
Current assignee: SHANGHAI BIOTECAN PHARMACEUTICALS CO Ltd
Priority date: 2010-02-09
Filing date: 2010-02-09
Publication date: 2011-08-10

Abstract

本发明属于基因技术领域，提供一组用于指导易瑞沙、特罗凯类药物个体化治疗的基因组合，包括EGFR-Exon19，EGFR-Exon21，Kras-codon12/13，Kras-codon61。本发明通过检测病人肿瘤组织中的EGFR-Exon19，EGFR-Exon21，Kras-codon12/13，Kras-codon61基因位点的突变情况，对拟采用易瑞沙、特罗凯等EGFR-TKI治疗的病人进行药物敏感指导，以使疗效达到最大，副作用降到最低。

Description

用于指导易瑞沙、特罗凯类药物个体化治疗的基因组合

技术领域

本发明属于基因技术领域，涉及一组用于指导易瑞沙、特罗凯类药物个体化治疗的基因组合。

背景技术

表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶介导的细胞生长信号通路在癌症的形成和发展中起重要作用。EGFR在许多不同的实体瘤患者中过表达，包括非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌。卵巢癌、头颈癌、胃癌、前列腺癌、膀胱癌、结肠癌和胶质细胞瘤等，常与预后不良。放化疗抗性、肿瘤血管形成和肿瘤的转移有关，已成为肿瘤治疗的理想靶点。近年来，许多以此为靶点的新抗肿瘤药物陆续被开发，在多种肿瘤治疗中取得了令人鼓舞的疗效。

易瑞沙(Iressa/吉非替尼/Gefitinib，阿斯利康)和特罗凯(Tarceva/厄罗替尼/Erlotinib，罗氏制药)作为表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，是美国FDA批准用于NSCLC靶向治疗的主要药物。但是，临床试验表明易瑞沙和特罗凯仅对10-30％的NSCLC病人有显著疗效。进一步的研究发现EGFR酪氨酸激酶区基因突变是NSCLC靶向治疗药物奏效的一个必要前提条件，而且绝大多数携带EGFR基因突变的病人疗效显著。因此，检测EGFR基因突变成为NSCLC病人是否接受靶向治疗的重要依据。

EGFR：EGFR与配体结合后激活酪氨酸激酶区，结合1个ATP分子，自身发生磷酸化和转磷酸化作用，使受体酪氨酸残基磷酸化，然后将信号传入细胞内。EGFR不但能调节正常细胞的增殖分化，而且在调节肿瘤细胞的生长、修复和转移中也具有重要的作用。EGFR的突变主要发生在外显子18-21，其中19和21两外显子突变率可达到90％。19外显子碱基缺失主要发生在746-750位的氨基酸，这个位子是ATP结合的关键部位，突变改变了受体ATP结合位点(ATP-binding pocket)的角度，明显的增加了癌细胞对EGFR抑制剂如特罗凯和易瑞沙的敏感性。21外显子点突变表现为858位密码子的亮氨酸转变为精氨酸(L858R)，此突变位点紧邻激酶活化环中高度保守的DFG序列附近，使活化环的稳定性提高，也明显增强癌细胞对EGFR抑制剂的敏感性。美国FDA批准对拟采用易瑞沙、特罗凯等EGFR-TKI治疗的病人，进行EGFR基因突变检测。

Kras：ras基因家族与人类肿瘤相关的基因有三种：H-ras、K-ras和N-ras，分别定位在11、12和1号染色体上。其中，K-ras对人类癌症影响最大，它好像分子开关，当正常时能控制调控细胞生长的路径；发生异常时，则导致细胞持续生长，并阻止细胞自我毁灭。

Kras突变基因检测能确定是否适合进行表皮生长因子受体抑制剂这类药物的个体化治疗，通常情况下，60％左右的结直肠癌病人的K-ras基因都是野生型的，这样在化疗基础上加上表皮生长因子受体抑制剂，如爱必妥，有效率可以达到60％左右，延长病人生命。而突变型的病人则不适合进行单抗药物的治疗。K-ras基因突变的最常见的方式是点突变，多发生在N端第12、13和61密码子，其中又以第12密码子突变最常见，而且多为GGT突变成GTT。

Kras基因突变检测已被美国癌症综合网络(NCCN)列为《结肠癌临床治疗指南》与《直肠癌临床治疗指南》临床用药必检项目。

药物代谢和效应的个体化差异：临床上，同样药物的剂量对病人甲有效，对病人乙可能不起作用，对病人丙则可能有副作用。在药物疗效与副作用方面，病人的反应差异很大。因此，在对肿瘤病人进行化疗时，如果先对其相关基因位点进行检测，再根据其基因突变情况进行治疗，就可以对病人实施个体优化治疗。

因此，通过检测病人肿瘤组织中的EGFR-Exon19，EGFR-Exon21，Kras-codon12/13，Kras-codon61基因位点的突变情况，对拟采用易瑞沙、特罗凯等EGFR-TKI治疗的病人进行药物敏感指导，可以使疗效达到最大，副作用降到最低。

现有临床用药方法的缺陷：在很多疾病的治疗过程中，常发生用药不当而导致副作用或因剂量不足无法达到治疗目的。因此针对这些病患的基因型进行个体化用药具有特别重要的意义。以前，医生如果需要调整病人的用药，需要长时间观察，病人也需要做大量的检测。这种调整用药的过程程序复杂，费时，延误治病时机。

本发明的有益之处是：(1)本发明的筛选方法是一种对人体无害的检测方法；(2)本发明通过检测病人肿瘤组织中的EGFR-Exon19，EGFR-Exon21，Kras-codon12/13，Kras-codon61基因位点的突变情况，对拟采用易瑞沙、特罗凯等EGFR-TKI治疗的病人进行药物敏感指导，可以使疗效达到最大，副作用降到最低。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对目前肿瘤的治疗过程中，易瑞沙、特罗凯类药物的疗效在不同病人间的明显差异，提供一种方便、快捷的辅助临床医生制定个体化用药方案的基因组合及其应用方法。

本发明的目的是提供一组用于指导易瑞沙、特罗凯类药物个体化治疗的基因组合，包括：EGFR-Exon19，EGFR-Exon21，Kras-codon12/13，Kras-codon61基因。

本发明的另一个目的是提供该基因组合在指导易瑞沙、特罗凯类药物个体化治疗中的应用。

基于上述目的，本发明采用以下技术方案：

针对上述基因的特异性位点设计引物，各基因引物序列如表1所示。

表1

No.	基因名称	正向引物(5’-3’)	序列号	反向引物(5’-3’)	序列号
						1	EGFR-Exon19	TAACGTCTTCCTTCTCTCTCTG	SEQIDNo.1	GTGGAGATGAGCAGGGTCTA	SEQIDNo.2
2	EGFR-Exon21	TCTTCTCTGTTTCAGGGCA	SEQIDNo.3	ACAATACAGCTAGTGGGAAGG	SEQIDNo.4
						3	Kras-codon12/13	ACTGGTGGAGTATTTGA	SEQIDNo.5	AAGATTTACCTCTATTGTTG	SEQIDNo.6
4	Kras-codon61	TTCTCCCTTCTCAGGATTC	SEQIDNo.7	TTACTCCTTAATGTCAGCTTAT	SEQIDNo.8

使用上述引物鉴定其相应基因的突变情况，包括如下步骤：

(1)提取病人肿瘤组织基因组DNA；

(2)进行PCR扩增，20μl PCR反应体系如下：待测肿瘤组织基因组DNA 50～100ng，Taq酶0.125μl，上下游引物(10μM)各1μl，dNTP(2.5mM)2μl，10×PCR缓冲液(含Mg2+)2μl，余下为无菌蒸馏水；PCR反应条件为：95℃变性2min，随后95℃变性30sec，55℃(EGFR-Exon19)、60℃(EGFR-Exon21)、50℃(Kras-codon12/13)、50℃(Kras-codon61)退火30sec，72℃延伸1min，进行45个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存；

(3)PCR扩增产物的凝胶电泳分析；

(4)PCR扩增产物测序。

附图说明

图1是各基因突变区域的PCR扩增产物的电泳图，图中M为核酸分子量标准marker条带，1为Kras-codon12/13条带，2为Kras-codon61条带，3为EGFR-Exon19条带，4为EGFR-Exon21基因；

图2是EGFR-Exon19突变区域的PCR扩增产物的直接测序图；

图3是EGFR-Exon21突变区域的PCR扩增产物的直接测序图；

图4是Kras-codon12/13突变区域的PCR扩增产物的直接测序图；

图5是Kras-codon61突变区域的PCR扩增产物的直接测序图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1一种鉴定EGFR-Exon19突变情况的方法

1.提取病人肿瘤组织基因组DNA；

2.进行PCR扩增，20μl PCR反应体系如下：待测肿瘤组织基因组DNA 50～100ng，Taq酶0.125μl，上下游引物(10μM)各1μl，dNTP(2.5mM)2μl，10×PCR缓冲液(含Mg²⁺)2μl，余下为无菌蒸馏水；PCR反应条件为：95℃变性2min，随后95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，进行45个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存；

3.PCR扩增产物的凝胶电泳分析：

a.用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净。放在水平桌面上，并架好梳子。可配制1.5％浓度的琼脂糖用于电泳。

b.将50ml1×TAE电泳缓冲液100ml于三角烧瓶中，称取0.75g的琼脂糖粉放入后微波炉内加热溶解。冷却至60℃左右，加入5μl

混匀，倒入电泳槽中，避免气泡，待凝固。

c.向电泳槽中倒入1×TAE，其量以没过胶面2mm为宜，小心移去梳子。如样品孔内有气泡，应设法除去。

d.在3-5μl PCR产物中加入12μl的加样缓冲液，混匀后，加入样品孔内。并设一孔核酸分子量标准marker(6μl)。

e.接通电源，红色为正极黑色为负极，DNA样品由负极往正极泳动(靠近加样孔的一端为负)，电压为120V。根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳。一般200～400bp的PCR产物电泳20min即可。

f.紫外仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准比较被扩增产物的大小。拍照，电脑存档。

结果如图1所示，条带3代表EGFR-Exon19，其PCR产物为230bp。

4.PCR扩增产物测序：确认电泳跑出目标条带后进行测序。

a.在每个孔中加入2μl PCR产物，1μl混和酶(0.5U虾碱酶和5U外切酶)，PCR仪上，85℃灭活15min。

b.在上述孔中加入1μl BDT溶液，2μl引物(1pmol/μl)(正向和反向引物分别装于两个孔中)，每加完一次样都在96孔板于离心机中离心，当离心速度达到1500转/min时即停，最后当所有试剂全部加完离心后盖上热垫盖。

c.在PCR仪上进行扩增。反应条件为：95℃预变性4min，随后95℃变性30sec，50℃退火15sec，进行35个循环，最后60℃延伸4min，4℃保存；

d.反应结束后，将96孔板放入离心机离心，当转速达2000转/min即停止离心。

e.打开热垫盖，在各孔内分别加入2.μl 125mM EDTA，在离心机中离心，至转速达2000转/min停止离心，再加17μl无水乙醇(AR)，盖上盖子，在漩涡混悬器上振荡后放入于低温离心机中离心，在转速3500转/min下离心30分钟。

f.打开热垫盖盖，在板口放置足够的吸水纸，在离心机中倒置离心，当转速达1300转/min停止离心。

g.分别向上步得到沉淀中加入50μl 70％乙醇，封上塑料封口膜，在冷冻离心机中离心(3500转/min)6分钟。

h.揭开塑料封口膜，在板口放置足够的吸水纸，在冷冻离心机中倒置离心，当转速达到1300转/min时停止离心。

i.将洗涤好的沉淀在抽屉中避光，室温下放置15-30分钟左右，让残留乙醇全部挥发。

j.每孔加入10ul Hi-Di，在PCR仪上进行变性反应，条件为：95℃4min→4℃forever。

k.3730xl测序仪进行测序。

应用DNAstar程序，将样本测序所得序列与同一区域的野生型序列比较，确定EGFR-Exon19的突变情况及突变位点。野生型为19外显子中GGAATTAAGAGAAGC序列正常，突变型为此段序列缺失。本次样本测序结果为野生型，见图2。

实施例2一种鉴定EGFR-Exon21突变情况的方法

1.提取病人肿瘤组织基因组DNA；

2.进行PCR扩增，20μl PCR反应体系如下：待测肿瘤组织基因组DNA 50～100ng，Taq酶0.125μl，上下游引物(10μM)各1μl，dNTP(2.5mM)2μl，10×PCR缓冲液(含Mg²⁺)2μl，余下为无菌蒸馏水；PCR反应条件为：95℃变性2min，随后95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸1min，进行45个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存；

3.PCR扩增产物的凝胶电泳分析：具体步骤同实施例1。

结果如图1所示，条带4代表EGFR-Exon21，其PCR产物为247bp。

4.PCR扩增产物测序：具体步骤同实施例1。

应用DNAstar程序，将样本测序所得序列与同一区域的野生型序列比较，确定EGFR-Exon21的突变情况及突变位点。野生型序列为TTGGGCTGGCCAAA，突变型序列为TTGGGC(T→G)GGCCAAA。本次样本测序结果为野生型，见图3。

实施例3一种鉴定Kras-codon12/13突变情况的方法

1.提取病人肿瘤组织基因组DNA；

2.进行PCR扩增，20μl PCR反应体系如下：待测肿瘤组织基因组DNA 50～100ng，Taq酶0.125μl，上下游引物(10μM)各1μl，dNTP(2.5mM)2μl，10×PCR缓冲液(含Mg²⁺)2μl，余下为无菌蒸馏水；PCR反应条件为：95℃变性2min，随后95℃变性30sec，50℃退火30sec，72℃延伸1min，进行45个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存；

3.PCR扩增产物的凝胶电泳分析：具体步骤同实施例1。

结果如图1所示，条带1代表Kras-codon12/13，其PCR产物为235bp。

4.PCR扩增产物测序：具体步骤同实施例1。

应用DNAstar程序，将样本测序所得序列与同一区域的野生型序列比较，确定Kras-codon12/13的突变情况及突变位点，野生型密码子12和13序列分别为GGT和GGC，突变型密码子12序列为(G→(A，T，C))(G→A)T，突变型密码子13序列为G(G→(A，T，C))C。本次样本测序结果为突变型，见图4。

实施例4一种鉴定Kras-codon61突变情况的方法

1.提取病人肿瘤组织基因组DNA；

3.PCR扩增产物的凝胶电泳分析：具体步骤同实施例1。

结果如图1所示，条带2代表Kras-codon61，其PCR产物为213bp。

4.PCR扩增产物测序：具体步骤同实施例1。

应用DNAstar程序，将样本测序所得序列与同一区域的野生型序列比较，确定Kras-codon61的突变情况及突变位点。野生型序列为GGTCAAGAGGAGT，突变型序列为GGTC(A→T)AGAGGAGT。本次样本测序结果为野生型，见图5。

序列表

<110>上海宝藤生物医药科技有限公司

<120>用于指导易瑞沙、特罗凯类药物个体化治疗的基因组合

<130>20100102

<160>8

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

taacgtcttc cttctctctc tg 22

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

gtggagatga gcagggtcta 20

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

tcttctctgt ttcagggca 19

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

acaatacagc tagtgggaag g 21

<210>5

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

actggtggag tatttga 17

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

aagatttacc tctattgttg 20

<210>7

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

ttctcccttc tcaggattc 19

<210>8

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

ttactcctta atgtcagctt at 22

Claims

1.一组用于指导易瑞沙、特罗凯类药物个体化治疗的基因组合，其特征在于该基因组合包含EGFR-Exon19，EGFR-Exon21，Kras-codon12/13，Kras-codon61基因。

2.根据权利要求1所述的基因组合，其特征在于针对EGFR-Exon19位点设计的正向引物序列为TAACGTCTTCCTTCTCTCTCTG(SEQ ID No.1)，反向引物序列为GTGGAGATGAGCAGGGTCTA(SEQ ID No.2)；针对EGFR-Exon21位点设计的正向引物序列为TCTTCTCTGTTTCAGGGCA(SEQ ID No.3)，反向引物序列为ACAATACAGCTAGTGGGAAGG(SEQ ID No.4)；针对Kras-codon12/13位点设计的正向引物序列为ACTGGTGGAGTATTTGA(SEQ ID No.5)，反向引物序列为AAGATTTACCTCTATTGTTG(SEQ ID No.6)；针对Kras-codon61位点设计的正向引物序列为TTCTCCCTTCTCAGGATTC(SEQ ID No.7)，反向引物序列为TTACTCCTTAATGTCAGCTTAT(SEQ ID No.8)。

3.如权利要求2所述的引物序列在检测其相应的基因突变中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于检测方法如下：

(1)提取病人肿瘤组织基因组DNA；

(2)以待测肿瘤组织基因组DNA为模板，用权利要求2所述的扩增引物进行PCR扩增；

(3)PCR扩增产物凝胶电泳分析；

(4)PCR扩增产物测序。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述步骤(2)中PCR反应体系每20μl组成如下：待测病人肿瘤组织基因组DNA 50～100ng，Taq酶0.125μl，上下游引物(10μM)各1μl，dNTP(2.5mM)2μl，10×PCR缓冲液(含Mg²⁺)2μl，余下为无菌蒸馏水。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述步骤(2)中用于检测EGFR-Exon19的PCR扩增反应条件是：95℃变性2min，随后95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，进行45个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存。

7.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述步骤(2)中用于检测EGFR-Exon21的PCR扩增反应条件是：95℃变性2min，随后95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸1min，进行45个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存。

8.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述步骤(2)中用于检测Kras-codon12/13的PCR扩增反应条件是：95℃变性2min，随后95℃变性30sec，50℃退火30sec，72℃延伸1min，进行45个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存。

9.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述步骤(2)中用于检测Kras-codon61的PCR扩增反应条件是：95℃变性2min，随后95℃变性30sec，50℃退火30sec，72℃延伸1min，进行45个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存。

10.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述步骤(4)中测序PCR扩增的反应条件为：95℃预变4min，随后95℃变性30sec，50℃退火15sec，进行35个循环，最后60℃延伸4min，4℃保存。