CN102329863A - 用于指导氟脲嘧啶类药物个体化治疗的基因组合 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因技术领域，提供一组用于指导氟脲嘧啶类药物个体化治疗的基因组合，包括DPYD*2A，DPYD*5A，DPYD*9A，MTHFR，TS，GSTP1。本发明通过检测病人肿瘤组织中的DPYD*2A，DPYD*5A，DPYD*9A，MTHFR，TS，GSTP1基因位点的突变情况，对拟采用氟脲嘧啶类药物治疗的病人进行药物敏感指导，以使疗效达到最大，副作用降到最低。

Description

用于指导氟脲嘧啶类药物个体化治疗的基因组合

技术领域

本发明属于基因技术领域，涉及一组用于指导氟脲嘧啶类药物个体化治疗的基因组合。

背景技术

氟脲嘧啶类药物(5-FU)是目前治疗肠癌的主要化疗药物，亦用于乳腺癌、消化道肿瘤(包括原发性和转移性肝癌和胰腺癌)、卵巢癌和原发性支气管肺癌的辅助化疗和姑息治疗。其作用机理为：在体内先转变为5-氟-2-脱氧尿嘧啶核苷酸，后者抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，阻断脱氧尿嘧啶核苷酸转变为脱氧胸腺嘧啶核苷酸，从而抑制DNA的生物合成。此外，还能掺入RNA，通过阻止尿嘧啶和乳清酸掺入RNA而达到抑制RNA合成的作用。氟脲嘧啶类药物为细胞周期特异性药，主要抑制S期瘤细胞。此类药物在杀死肿瘤细胞的同时，也不可避免地杀伤了正常组织细胞，引起较为严重的毒副作用。主要表现为：恶心、食欲减退或呕吐；口腔粘膜炎或溃疡；腹部不适或腹泻；周围血白细胞减少，长期应用可导致神经系统毒性。

DPYD(二氢吡啶脱氢酶)：DPD酶(Dihydropyrimidinedehydrogenase)广泛分布于各种组织，是氟脲嘧啶类药物在肝脏和其他细胞中代谢失活的限速酶，约80％-90％的5-FU在肝脏中被分解代谢为无活性代谢物(二氢氟尿嘧啶，FHU)。DPD酶是由DPYD基因所编码，DPYD基因的突变会引起DPD酶活性的下降并减少氟脲嘧啶类药物合成代谢生成核苷类似物的分解代谢排出体外的量。DPYD至少有20种与酶活性下降有关的突变，其中约50％的已知无功能等位基因与IVS14+1G/A点突变有关，称为DPYD*2A；在中国人群中，DPYD*5A和DPYD*9A的变异较高，DPYD*5A I543V和A1627G位点的突变率较多，其中A1627G位点的突变率为30％左右；DPYD*9A的C29R和T85C的突变率较多。这些位点的突变会使人体内DPD酶活性下降或缺失，无法代谢氟脲嘧啶类药物，造成毒副作用增加。因此，DPYD突变型肿瘤患者在接受化疗时，应避免或减量使用氟脲嘧啶类药物，并严密监视药物的毒副作用。

MTHFR(亚甲基四氢叶酸还原酶)：MTHFR(Methylenetetrahydrofolate reductase)是叶酸代谢的限速酶，它会不可逆的催化5，10-亚甲基四氢叶酸(5，10-MTHF)转变为5，10-甲基四氢叶酸，其中5，10-MTHF作为胸苷酸合成的重要原料，与DNA合成和修复有密切关系。5-FU进入人体后，在胸苷激酶的催化下转化为5-氟-2-脱氧尿甘酸，后者可通过两种作用机制发挥抗癌作用。其一是直接掺入RNA或DNA；其二是以TS为作用靶点，5-氟-2-脱氧尿苷酸与5，10-MTHF和TS形成一种稳定的共价络合物，是胸苷酸合成反应受阻，从而干扰DNA的合成和修复。研究证实MTHFR的多态性位点C677T和A1298C会影响MTHFR酶活性。即MTHFR基因编码的酶活性随677位点C/C、C/T、T/T基因型的改变呈递减趋势，随着1298位点A/A、A/C、C/C呈递增趋势。MTHFR酶活性的降低会直接影响5，10-MTHF向5-甲基四氢叶酸的转化，导致体内5，10-MTHF浓度升高，高浓度的5，10-MTHF会进一步增加5-FU的生物利用度，从而提高5-FU的抗癌效果。

TS(胸苷酸合成酶)：在正常细胞代谢情况下，TS(thymidylate synthetase)催化脱氧尿苷酸(dUMP)转变成脱氧胸苷酸(dTMP)，当5-FU进入体内即被活化成氟脲嘧啶脱氧核苷酸(FdUMP)，FdUMP代替dUMP与TS结合，使TS失活，不能合成dTMP，从而影响DNA合成，该途径也是5-FU发挥抗癌作用的主要途径。TS的基因多态性使TS蛋白的功能和表达存在差异，造成不同患者用5-FU治疗的疗效差别很大。该基因5’非翻译区中增强子区存在1个28bp的核苷酸片段重复多态，其重复次数包括2次(2R)、3次(3R)或更多次数，根据这种多态性可将TS基因分为2R/2R(2R纯合子)、3R/3R(3R纯合子)和2R/3R(2R/3R杂合子)三类，3R/3R基因型患者对5-FU的化疗有效率低于2R/2R、2R/3R基因型。其机制认为TS基因5’-UTR多态性影响了正常组织和肿瘤组织的TS mRNA表达，3R/3R基因型患者的TS mRNA表达，3R/3R基因型患者的TS mRNA表达明显高于2R/2R、2R/3R组，导致前者有较高的TS蛋白表达，使FdUMP不能有效地抑制TS，从而影响肿瘤细胞DNA的合成，导致5-FU治疗疗效差、TS的表达水平与5-FU的敏感性及患者的预后呈负关系。

GSTP1催化谷胱甘肽与多种毒性复合物(包括氟脲嘧啶类药物)结合，形成低毒高水溶性物质排出细胞外。许多用于抗肿瘤的成神经细胞瘤高风险化学疗法的药物是GSTP1的潜在底物。变异的等位基因导致GSTP1活性的降低，GSTP1外显子5的第313位碱基存在AL/G单核苷酸多态，导致发生Ile-Val改变，能够显著降低GSTP1的活性，从而化疗药的清除率降低和药物对肿瘤作用时间的延长。

药物代谢和效应的个体化差异：临床上，同样药物的剂量对病人甲有效，对病人乙可能不起作用，对病人丙则可能有副作用。在药物疗效与副作用方面，病人的反应差异很大。因此，在对肿瘤病人进行化疗时，如果先对其相关基因位点进行检测，再根据其基因突变情况进行治疗，就可以对病人实施个体优化治疗。因此，通过检测病人肿瘤组织中的DPYD*2A、DPYD*5A、DPYD*9A、MTHFR、TS、GSTP1基因位点的突变情况，对拟采用氟脲嘧啶类药物治疗的病人进行药物敏感指导，可以使疗效达到最大，副作用降到最低。

现有临床用药方法的缺陷：在很多疾病的治疗过程中，常发生用药不当而导致副作用或因剂量不足无法达到治疗目的。因此针对这些病患的基因型进行个体化用药具有特别重要的意义。以前，医生如果需要调整病人的用药，需要长时间观察，病人也需要做大量的检测。这种调整用药的过程程序复杂，费时，延误治病时机。

本发明的有益之处是：(1)本发明的筛选方法是一种对人体无害的检测方法；(2)本发明通过检测病人肿瘤组织中的DPYD*2A、DPYD*5A、DPYD*9A、MTHFR、TS、GSTP1基因位点的突变情况，对拟采用氟脲嘧啶类药物治疗的病人进行药物敏感指导，可以使疗效达到最大，副作用降到最低。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对目前肿瘤的治疗过程中，氟脲嘧啶类药物的疗效及毒副作用在不同病人中的明显差异，提供一种方便、快捷的辅助临床医生制定个体化用药方案的基因组合及其应用方法。

本发明的目的是提供一组用于指导氟脲嘧啶类药物个体化治疗的基因组合，包括：DPYD*2A，DPYD*5A，DPYD*9A，MTHFR，TS，GSTP1基因。

本发明的另一个目的是提供该基因组合在指导氟脲嘧啶类药物个体化治疗中的应用。

基于上述目的，本发明采用以下技术方案：

针对上述基因的特异性位点设计引物，各基因引物序列如表1所示。

表1

使用上述引物鉴定其相应基因的突变情况，包括如下步骤：

(1)提取肿瘤病人血液基因组DNA；

(2)进行PCR扩增，20μl PCR反应体系如下：待测肿瘤病人血液基因组DNA50～100ng，Taq酶0.125μl，上下游引物(10μM)各1μl，dNTP(2.5mM)2μl，10×PCR缓冲液(含Mg²⁺)2μl，余下为无菌蒸馏水；PCR反应条件为：95℃变性2min，随后95℃变性30sec，57℃(DPYD*2A)、57℃(DPYD*5A)、57℃(DPYD*9A)、58℃(MTHFR)、58℃(TS)、55℃(GSTP1)退火30sec，72℃延伸30sec，进行40个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存；

(3)PCR扩增产物的凝胶电泳分析；

(4)PCR扩增产物测序。

附图说明

图1是各基因突变区域的PCR扩增产物的电泳图，图中M为核酸分子量标准marker条带，1为DPYD*2A基因条带，2为DPYD*5A基因条带，3为DPYD*9A基因条带，4为MTHFR基因条带，5为TS基因条带，6为GSTP1基因条带；

图2是DPYD*2A基因突变区域的PCR扩增产物的直接测序图；

图3是DPYD*5A基因突变区域的PCR扩增产物的直接测序图；

图4是DPYD*9A基因突变区域的PCR扩增产物的直接测序图；

图5是MTHFR基因突变区域的PCR扩增产物的直接测序图；

图6是TS基因突变区域的PCR扩增产物的直接测序图；

图7是GSTP1基因突变区域的PCR扩增产物的直接测序图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1一种鉴定DPYD*2A基因突变情况的方法

1.提取肿瘤病人血液基因组DNA；

2.进行PCR扩增，20μl PCR反应体系如下：待测肿瘤病人血液基因组DNA50～100ng，Taq酶0.125μl，上下游引物(10μM)各1μl，dNTP(2.5mM)2μl，10×PCR缓冲液(含Mg²⁺)2μl，余下为无菌蒸馏水；PCR反应条件为：95℃预变性2min，随后95℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸30scc，进行45个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存；

3.PCR扩增产物的凝胶电泳分析：

3.1用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净。放在水平桌面上，并架好梳子。可配制1.5％浓度的琼脂糖用于电泳。

3.2将50ml 1×TAE电泳缓冲液100ml于三角烧瓶中，称取0.75g的琼脂糖粉放入后微波炉内加热溶解。冷却至60℃左右，加入5μl

混匀，倒入电泳槽中，避免气泡，待凝固。

3.3向电泳槽中倒入1×TAE，其量以没过胶面2mm为宜，小心移去梳子。如样品孔内有气泡，应设法除去。

3.4在3-5μl PCR产物中加入12μl的加样缓冲液，混匀后，加入样品孔内。并设一孔核酸分子量标准marker(6μl)。

3.5接通电源，红色为正极黑色为负极，DNA样品由负极往正极泳动(靠近加样孔的一端为负)，电压为120V。根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳。一般200～400bp的PCR产物电泳20min即可。

3.6紫外仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准比较被扩增产物的大小。拍照，电脑存档。

结果如图1所示，条带1代表DPYD*2A基因，其PCR产物为296bp。

4.PCR扩增产物测序：确认电泳跑出目标条带后进行测序。

4.1在每个孔中加入2μl PCR产物，1μl混和酶(0.5U虾碱酶和5U外切酶)，PCR仪上，85℃灭活15min。

4.2在上述孔中加入1μl BDT溶液，2μl引物(1pmol/μl)(正向和反向引物分别装于两个孔中)，每加完一次样都在96孔板于离心机中离心，当离心速度达到1500转/min时即停，最后当所有试剂全部加完离心后盖上热垫盖。

4.3在PCR仪上进行扩增。反应条件为：95℃预变性4min，随后95℃变性30sec，50℃退火15sec，进行35个循环，最后60℃延伸4min，4℃保存；

4.4反应结束后，将96孔板放入离心机离心，当转速达2000转/min即停止离心。

4.5打开热垫盖，在各孔内分别加入2.μl 125mM EDTA，在离心机中离心，至转速达2000转/min停止离心，再加17μl无水乙醇(AR)，盖上盖子，在漩涡混悬器上振荡后放入于低温离心机中离心，在转速3500转/min下离心30分钟。

4.6打开热垫盖盖，在板口放置足够的吸水纸，在离心机中倒置离心，当转速达1300转/min停止离心。

4.7分别向上步得到沉淀中加入50μl 70％乙醇，封上塑料封口膜，在冷冻离心机中离心(3500转/min)6分钟。

4.8揭开塑料封口膜，在板口放置足够的吸水纸，在冷冻离心机中倒置离心，当转速达到1300转/min时停止离心。

4.9将洗涤好的沉淀在抽屉中避光，室温下放置15-30分钟左右，让残留乙醇全部挥发。

4.10每孔加入10μl Hi-Di，在PCR仪上进行变性反应，条件为：95℃4min→4℃保存。

4.113730xl测序仪进行测序。

应用DNAstar程序，将样本测序所得序列与同一区域的野生型序列比较，确定DPYD*2A的突变情况及突变位点，野生型第14内含子第一位碱基是G，突变型为A，本次样本测序结果为G/G型见图2

实施例2一种鉴定DPYD*5A基因突变情况的方法

1.提取肿瘤病人血液基因组DNA；

2.进行PCR扩增，20μl PCR反应体系如下：待测肿瘤病人血液基因组DNA50～100ng，Taq酶0.125μl，上下游引物(10μM)各1μl，dNTP(2.5mM)2μl，10×PCR缓冲液(含Mg²⁺)2μl，余下为无菌蒸馏水；PCR反应条件为：95℃预变性2min，随后95℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸30sec，进行40个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存；

3.PCR扩增产物的凝胶电泳分析：具体步骤同实施例1。

结果如图1所示，条带2代表DPYD*5A基因，其PCR产物为186bp。

4.PCR扩增产物测序：具体步骤同实施例1。

应用DNAstar程序，将样本测序所得序列与同一区域的野生型序列比较，确定DPYD*5A的突变情况及突变位点。野生型的第543密码子，即转录起始点第1627位为A，突变型的第1627位为G，本次样本测序结果为GG纯合型。见图3。

实施例3一种鉴定DPYD*9A基因突变情况的方法

1.提取肿瘤病人血液基因组DNA；

2.进行PCR扩增，20μl PCR反应体系如下：待测肿瘤病人血液基因组DNA50～100ng，Taq酶0.125μl，上下游引物(10μM)各1μl，dNTP(2.5mM)2μl，10×PCR缓冲液(含Mg²⁺)2μl，余下为无菌蒸馏水；PCR反应条件为：95℃预变性2min，随后95℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸30sec，进行40个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存；

3.PCR扩增产物的凝胶电泳分析：具体步骤同实施例1。

结果如图1所示，条带3代表DPYD*9A基因，其PCR产物为228bp。

4.PCR扩增产物测序：具体步骤同实施例1。

应用DNAstar程序，将样本测序所得序列与同一区域的野生型序列比较，确定DPYD*9A的突变情况及突变位点。本次样本测序结果为：转录起始点第85处为TT纯和型。见图4。

实施例4一种鉴定MTHFR基因突变情况的方法

1.提取肿瘤病人血液基因组DNA；

2.进行PCR扩增，20μl PCR反应体系如下：待测肿瘤病人血液基因组DNA50～100ng，Taq酶0.125μl，上下游引物(10μM)各1μl，dNTP(2.5mM)2μl，10×PCR缓冲液(含Mg²⁺)2μl，余下为无菌蒸馏水；PCR反应条件为：95℃预变性2min，随后95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，进行40个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存；

3.PCR扩增产物的凝胶电泳分析：具体步骤同实施例1。

结果如图1所示，条带3代表MTHFR基因，其PCR产物为375bp。

4.PCR扩增产物测序：具体步骤同实施例1。

应用DNAstar程序，将样本测序所得序列与同一区域的野生型序列比较，确定MTHFR的突变情况及突变位点。野生型为在转录起始点667位为C，突变型为在转录起始点667位为T，本次样本测序结果为TT纯合型。见图5。

实施例5一种鉴定TS基因突变情况的方法

1.提取肿瘤病人血液基因组DNA；

2.进行PCR扩增，20μl PCR反应体系如下：待测肿瘤病人血液基因组DNA50～100ng，Taq酶0.125μl，上下游引物(10μM)各1μl，dNTP(2.5mM)2μl，10×PCR缓冲液(含Mg²⁺)2μl，余下为无菌蒸馏水；PCR反应条件为：95℃预变性2min，随后95℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸30sec，进行40个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存；

3.PCR扩增产物的凝胶电泳分析：具体步骤同实施例1。

结果如图1所示，条带3代表TS基因，其PCR产物为243bp。

4.PCR扩增产物测序：具体步骤同实施例1。

应用DNAstar程序，将样本测序所得序列与同一区域的野生型序列比较，确定TS的突变情况及突变位点。野生型为在启动子区CCGCGCCACTTCGCCTGCCTCCGTCCCG这段序列为3个重复，突变型这段序列有两个重复，本次样本测序结果为3个重复。见图6。

实施例6一种鉴定GSTP1基因突变情况的方法

1.提取肿瘤病人血液基因组DNA；

2.进行PCR扩增，20μl PCR反应体系如下：待测肿瘤病人血液基因组DNA50～100ng，Taq酶0.125μl，上下游引物(10μM)各1μl，dNTP(2.5mM)2μl，10×PCR缓冲液(含Mg²⁺)2μl，余下为无菌蒸馏水；PCR反应条件为：95℃预变性2min，随后95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，进行40个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存；

3.PCR扩增产物的凝胶电泳分析：具体步骤同实施例1。

结果如图1所示，条带3代表GSTP1基因，其PCR产物为472bp。

4.PCR扩增产物测序：具体步骤同实施例1。

应用DNAstar程序，将样本测序所得序列与同一区域的野生型序列比较，确定TS的突变情况及突变位点。野生型为在转录起始点313位为A，突变型为在转录起始点313位为G，本次样本测序结果为A/A纯合型。见图7。

序列表

Claims (12)

1.一组用于指导氟脲嘧啶类药物个体化治疗的基因组合，其特征在于该基因组合包含：DPYD*2A，DPYD*5A，DPYD*9A，MTHFR，TS，GSTP1基因。

2.根据权利要求1所述的基因组合，其特征在于针对DPYD*2A位点设计的正向引物序列为：CATTGTGACAAATGTTTCCC(SEQ ID No.1)，反向引物序列为：ATCAGCAAAGCAACTGGCA(SEQ ID No.2)；针对DPYD*5A位点设计的正向引物序列为：TCTGCCAAGCCTGAACTAC(SEQ ID No.3)，反向引物序列为：AGAGAAAGTTTTGGTGAGGG(SEQ ID No.4)；针对DPYD*9A位点设计的正向引物序列为：CTGTCTTTAGAGTATCCTGGC(SEQ ID No.5)，反向引物序列为：CACGGCTGTACTTTAATACC(SEQ ID NO.6)；针对MTHFR位点设计的正向引物序列为：AGGACAGTGTGGGAGTTTGG(SEQ ID No.7)，反向引物序列为：GAAAAGCTGCGTGATGATGA(SEQ ID NO.8)；针对TS位点设计的正向引物序列为：GTGGCTCCTGCGTTTCCCCC  (SEQ ID No.9)，反向引物序列为：GGCTCCGAGCCGGCCACAGGCATGGCGCGG(SEQ ID NO.10)；针对GSTP1位点设计的正向引物序列为：CTGCTGTGTGGCAGTCTCTC(SEQ ID No.11)，反向引物序列为：CCGTTACTTGGCTGGTTGAT(SEQ ID NO.12)。

3.如权利要求2所述的引物序列在检测其相应的基因突变中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于检测方法如下：

4.1提取病人肿瘤组织基因组DNA；

4.2以待测肿瘤组织基因组DNA为模板，用权利要求2所述的扩增引物进行PCR扩增；

4.3PCR扩增产物凝胶电泳分析；

4.4PCR扩增产物测序。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述步骤(4.2)中PCR反应体系每20μl组成如下：待测病人肿瘤组织基因组DNA 50～100ng，Taq酶0.125μl，上下游引物(10μM)各1μl，dNTP(2.5mM)2μl，10×PCR缓冲液(含Mg²⁺)2μl，余下为无菌蒸馏水。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述步骤(4.2)中用于检测DPYD*2A的PCR扩增反应条件是：95℃预变性2min，随后95℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸30sec，进行40个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存。

7.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述步骤(4.2)中用于检测DPYD*5A的PCR扩增反应条件是：95℃预变性2min，随后95℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸30sec，进行40个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存。

8.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述步骤(4.2)中用于检测DPYD*9A的PCR扩增反应条件是：95℃预变性2min，随后95℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸30sec，进行40个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存。

9.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述步骤(4.2)中用于检测MTHFR的PCR扩增反应条件是：95℃预变性2min，随后95℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸30sec，进行40个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存。

10.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述步骤(4.2)中用于检测TS的PCR扩增反应条件是：95℃预变性2min，随后95℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸30sec，进行40个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存。

11.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述步骤(4.2)中用于检测GSTP1的PCR扩增反应条件是：95℃预变性2min，随后95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，进行40个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存。

12.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述步骤(4)中测序PCR扩增的反应条件为：95℃预变性4min，随后95℃变性30sec，50℃退火15sec，进行35个循环，最后60℃延伸4min，4℃保存。

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