CN102649978A - Ccdc158基因在制备肝癌治疗或诊断药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了CCDC158基因在制备肝癌治疗或诊断药物中的应用。CCDC158在肝癌组织中发生杂合性缺失和表达降低，而且与肝癌的预后显著相关；在肝癌细胞中，上调其表达，可降低癌细胞生长和克隆形成能力并诱导了癌细胞凋亡，这些表明该基因不仅在肝癌发生发展中起着重要作用并具有抑制癌细胞的生物学功能。因此，CCDC158可用于制作抗肿瘤新药和肿瘤诊断及预后评估的试剂盒。

Description

CCDC158基因在制备肝癌治疗或诊断药物中的应用

技术领域

本发明涉及CCDC158基因的新用途。

背景技术

肝细胞癌(简称肝癌)是我国最常见的恶性肿瘤之一，研究显示，近二十年来肝癌的发病率在我国呈上升趋势，其在九大恶性肿瘤死亡率的排名中已从第三位上升到第二位。肝癌的临床研究在近十多年中已取得了较大的进展，但肝癌五年生存率仍非常低而且复发率高。由此可见，单靠临床研究来提高肝癌病人的生存率和降低复发率是不够的。由于分子生物技术的迅猛发展，科学界对肿瘤发生发展过程中的生物大分子的变化及其作用有了较深入的了解，这为开发肿瘤包括肝癌等的基因诊断、基因治疗和预后评估提供了崭新的方法和手段，同时也将最终阐明肿瘤的发病机理。如果能够找出在肝癌发生发展中起关键作用的相关基因特别是肿瘤抑制基因，根据其在肝癌中的作用和变化可设计出新的基因治疗和药物治疗等方法以及开发出新的分子诊断、预后评估、复发预测等手段，从而可望提高肝癌病人的生存率。

CCDC158基因，全名叫coiled-coil domain containing 158，在美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information）基因库的登录号为NM_001042784.1。该基因位于人类染色体4q21，是CCDC家族成员之一。该基因家族都含有卷曲螺旋蛋白质超二级结构，这是由2个或以上的α螺旋组成的超螺旋结构。在自然界中，卷曲螺旋是一个介导蛋白质相互作用或形成蛋白质骨架的通用结构域。卷曲螺旋专一性的相互作用在病毒感染、膜融合、分子识别、信号转导和基因转录等生理途径中发挥重要作用。原癌基因c-fos和c-jun编码的蛋白都是卷曲螺旋的代表，它们形成异二聚体后与DNA结合，参与了对有丝分裂刺激产生反应的一系列基因的转录调节。在乳腺癌中，CCDC98与BRCA-1相互作用，在放射敏感性及损伤诱导的G2/M期阻滞中起着重要作用。而CCDC50则认为是慢性淋巴细胞白血病及套细胞淋巴瘤的癌基因，能促进慢性淋巴细胞白血病和套细胞淋巴瘤细胞的生长。

发明内容

本发明的目的在于根据发明人对CCDC158基因在人肝癌中的变化及其对肝癌细胞生物学功能的调节作用的研究，提供基于CCDC158基因DNA变异（包括突变和缺失）、mRNA和蛋白表达变化以在制备抗肿瘤的基因药物和化学药物、生产诊断和/或预后评估试剂盒中的应用。

本发明是通过以下技术方案予以实现：

本申请发明人在肿瘤研究中发现，CCDC158基因在肝癌中发生了高频率的遗传变异 -- 杂合性缺失，基因转录的mRNA明显下降，结合临床资料分析发现，其表达高低与病人预后密切相关。接着，我们对CCDC158基因进行了体外细胞功能学的研究，将CCDC158基因转染到SK-Hep1肝癌细胞系，以建立该基因稳定表达的细胞株。转染了CCDC158基因的肝癌细胞与转染空载体的对照肝癌细胞相比，其生长速度、克隆形成能力及细胞迁移率等均显著下降，并且该基因能诱导肝癌细胞凋亡。由此可见，CCDC158基因在肝癌中起着抑癌基因的作用。因此，可以合成或制作此基因或其模拟以用作基因治疗，也可根据该基因所抑制的下游基因功能，制作出其下游基因的抑制物（靶向治疗药物）；由于该基因在肝癌中有丢失和表达降低，故可制作检测该基因DNA变异和表达变化的试剂盒以用于诊断肝癌；由于该基因表达的降低与病人预后密切相关，故检测其表达水平变化的试剂盒也可用于其预后的评估。

作为一种优选方案，上述应用中，可特别针对肝癌进行制备用于肝癌治疗的药物和方法、也可制作用于肝癌的诊断和预后评价的试剂。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明通过检测肝癌病人中CCDC158基因的杂合性丢失和基因表达情况，发现CCDC158基因发生了高频率的杂合性缺失，而且其表达也明显降低，因此，二者均可作为肝癌的诊断标志；该基因mRNA和蛋白的表达水平与肝癌的预后明显相关，即可作为诊断之用也可作为其预后的评价指标。同时，对CCDC158基因进行细胞功能学的研究，发现转染CCDC158基因的肝癌细胞生长速度减慢、克隆形成能力和细胞迁移率等均显著下降，并且转染细胞同时也发生了明显的细胞凋亡。因此，该基因的细胞生物学功能研究为制备基因药物和靶向药物提供了依据。本发明不仅在基因遗传、转录（mRNA)和翻译（蛋白）三个水平上也在细胞生物学功能方面为制备治疗肿瘤的新药物和诊断及预后评估试剂盒的开发提供了基础。

附图说明

图1是CCDC158基因在112例肝癌病人中的杂合性缺失情况。白色为无信息病例，灰色和黑色为有信息病例，其中灰色为未发生杂合性缺失病例，黑色为杂合性缺失病例；

图2是定量PCR检测CCDC158基因在112例病例中肝癌组织及癌旁组织的表达情况；

图3是按照CCDC158基因表达情况分组，两组病人的生存曲线；

图4是转染CCDC158基因的肝癌细胞中，CCDC158基因的表达情况；

图5是MTT检测转染CCDC158基因的肝癌细胞的增殖能力；

图6是平板克隆实验检测转染CCDC158基因的肝癌细胞的克隆形成能力；

图7是流式细胞术检测细胞凋亡，转染CCDC158基因诱导肝癌细胞凋亡。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步阐述，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

实施例

1 材料和方法

1.1 试验材料

本实验所需的探针，引物由广州英俊公司合成。实验过程中采用的逆转录酶购自美国Promega公司，qPCR试剂盒购自美国Invitrogen公司，CCDC158质粒购自广州复能公司，凋亡检测试剂盒购自美国BD公司。

1.2 SNP芯片检测基因型及杂合性缺失

应用SNP芯片检测CCDC158基因在112例肝癌病人肿瘤组织及癌旁组织的基因型。根据基因型癌旁和肿瘤组织的基因型判断病人的杂合性缺失情况。在正常组织为杂合子的SNP位点，即为有信息病例，如果同时该位点在肿瘤组织为纯合子时，定义为该位点发生杂合性分析。如果CCDC158基因上有任何一个位点为有信息位点，则该个体为有信息个体；如果任何一个位点发生杂合性缺失，则定义该基因发生LOH。112例肝癌病人CCDC158基因的杂合性缺失率为45.4%，具体结果如图1。

1.3 定量PCR检测CCDC158基因的表达及其对病人的预后评价

用Trizol提取组织RNA后，取2ug RNA按照Promega说明书将RNA逆转录成cDNA。 将cDNA稀释40倍加入到含1×qPCR Mix，50nM上下游引物的混合液中。95℃预变性10min之后进入循环，包括95℃ 30s，60℃ 1min共40个循环。按照ΔΔCt法将Ct值转换为相对表达值，比较癌旁跟肿瘤组织之间的表达，发现肿瘤组织的表达比癌旁组织的表达显著降低，结果如图2。然后根据病人的相对表达值划分为高低表达两组，用Kaplan-Meier进行生存分析。CCDC158基因低表达组与高表达组预后较差，结果如图3。

1.4 CCDC158稳定表达细胞的筛选与建立

将CCDC158真核表达载体（CCDC158-pM10，带myc标签）转染肝癌细胞SK-Hep1，空载体pM10转染SK-Hep1作为对照。转让后24小时，用新霉素G418（500 μg/ml）进行筛选。筛选维持两周，含有抗性基因表达的细胞存活， G418浓度降至400 μg/ml维持细胞增殖。提取细胞蛋白，用myc特异性抗体进行Western-Blot检测，验证CCDC158的表达。结果见图4。

1.5 转染CCDC158基因肝癌细胞的增殖能力测定

将CCDC158稳定表达细胞，空载体阴性对照细胞，接种于96孔细胞培养板，接种密度为每孔1000个细胞，培养7天。每天取细胞进行细胞生长活力（MTT）测定，每天测3个复孔，连续测定7天后，根据MTT吸光度值画出生长曲线。转染CCDC158肝癌细胞生长显著减慢，结果见图5。

1.6转染CCDC158基因肝癌细胞的克隆形成能力测定

将CCDC158稳定表达细胞，空载体阴性对照细胞，接种于6孔细胞培养板，接种密度为每孔500个细胞，一个细胞做3个复孔，培养约10天，直至细胞克隆直径大于1 mm。PBS洗两次后，75%乙醇固定细胞，用0.5 %结晶紫染色。用水洗掉多余的结晶紫后，晾干，直接对每孔细胞计数。转染CCDC158肝癌细胞克隆形成能力显著减弱，结果见图6。

1.7 转染CCDC158基因肝癌细胞的凋亡测定

将CCDC158稳定表达细胞，空载体阴性对照细胞，接种于12孔细胞培养板，每孔细胞接种密度不等，按照第二天细胞密度约为80%进行铺板。24小时后，收集细胞，800rpm离心5min。然后按照BD凋亡试剂盒进行Annexin V和PI的染色，染色后一个小时内，流式细胞仪上机。根据流式细胞术的结果，得出凋亡细胞的比例。转染CCDC158肝癌细胞凋亡比例显著增多，CCDC158基因可诱导细胞凋亡，结果见图7。

Claims (4)

1.CCDC158基因或及其编码的蛋白在制备肿瘤预后评价的试剂中的应用。

2.权利要求1所述的CCDC158基因或其编码的蛋白在制备肿瘤诊断试剂中的应用。

3.权利要求1所述的CCDC158基因或其编码的蛋白在制备肿瘤治疗的药物中的应用。

4.根据权利要求1~3中任意一条权利要求所述的应用，其特征在于所述肿瘤为肝癌。