CN102230017A - 人类血小板抗原基因分型液相芯片及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种人类血小板抗原基因分型液相芯片及其检测方法。人类血小板抗原基因分型技术是为患者提供相配合的血小板、促进临床血小板输注的安全性和有效性的重要技术手段，但现有的人类血小板抗原基因分型技术存在通量低、准确度和灵敏度等指标均有待提高等问题。本发明所述的液相芯片包含有引物1-24、连接探针25-46和包被有检测探针47-68的荧光编码微球，经过扩增、连接和杂交反应完成人类血小板抗原基因分型检测。本发明所采用的液相芯片和检测方法具有通量大、敏感性高、特异性强、重复性好、线性范围宽、操作简单、灵活性强、应用范围广的优点，是临床上准确、高效而实用的人类血小板抗原基因分型检测方法。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种人类血小板抗原基因分型液相芯片及其检测方法。
背景技术
血小板输注是预防和治疗因血小板减少或功能异常而引发的出血性疾病的重要手段。由于目前人类血小板抗原（human platelet antigen，HPA）分型技术的局限性，临床输注血小板时多考虑ABO血型，而忽视了血小板血型相配合的问题。血小板血型不配合可引发一系列临床同种免疫症状的出现，如新生儿同种免疫血小板减少症（NAIT）、输血后紫癜（PTP）及血小板输注无效（PTR）等。建立一种新型、高效且实用的HPA分型技术，为患者提供相配合的血小板，对于促进临床血小板输注的安全性和有效性无疑具有重要意义。
HPA是由血小板糖蛋白携带的一类特异性抗原，其基因具有单核苷酸多态性（SNP）。目前已发现有24个血型抗原，被国际血小板命名委员会（PNC）正式命名的HPA有22个，其相应基因遗传多态性的分子基础也被阐明。这些HPA系统的共同特点是：常染色体显性遗传，多数已证实由共显性双等位基因控制，在cDNA序列中仅有1～2个碱基的差别而导致翻译时1个氨基酸的不同。随着HPA分子生物学特性的不断阐明，HPA基因分型成为可能。
长久以来，HPA分型一直采用血清学方法，如混合被动血凝试验（MPHA）、血小板抗原单克隆特异性抗体固定试验（MAIPA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）及简易致敏红细胞血小板血清学试验（SEPSA）等。由于这些方法所需的一些抗血清，如抗2a和抗3b等，都难以获得，加之在一些NAIT、PTP或PTR患者中较难得到足够的血小板用于血清学试验，人们一直考虑用一种更有效、实用的方法来取代血清学试验。进入上世纪90年代后，随着分子生物学技术的不断发展和对HPA基因结构研究的突破性进展，使得HPA基因分型成为可能。到目前为止，主要有以下几种HPA基因分型方法：聚合酶链反应-序列特异性引物技术（PCR-SSP）、DNA序列分析、聚合酶链反应-等位基因特异性寡核苷酸探针杂交（PCR-ASO）、聚合酶链反应-限制性片断长度多态性分析（PCR-RFLP）、固相基因芯片，其检测的准确性、敏感性、简便性及线性范围等方面均有待进一步提高。
发明内容
本发明的目的是提供一种准确性、敏感性和灵活性更高的人类血小板抗原基因分型液相芯片及其检测方法，可对目前正式命名的22种人类血小板抗原型别一次性检测，以克服目前的人类血小板抗原基因分型技术中存在的通量低、准确度和灵敏度较差的问题。
本发明所采用的技术方案是：
人类血小板抗原基因分型液相芯片，其特征在于：
所述的液相芯片包含有：
（1）扩增出包含有人类血小板抗原22种基因型SNP位点的目标序列的引物1-24：
引物1-12的序列分别为SEQ ID NO.1-12，扩增包括1a、1b、10w、2a、2b、3a、3b、9w、5a、5b、15a、15b、11w和8w在内的六个目标片段；
引物13-24的序列分别为SEQ ID NO.13-24，扩增包括4a、4b、16w、6w、7w、12w、13w和14w在内的六个目标片段；
（2）用于区分22种SNP位点的特异性连接探针25-46，序列分别为SEQ ID NO.25-46，每个探针是针对每一个SNP位点的前后相邻的两个寡核苷酸片段，即前端连接探针和后端连接探针；
（3）分别包被有对应人类血小板抗原22种SNP位点的特异性检测探针47-68的荧光编码微球。
所述的前端连接探针的末位碱基为区别SNP突变的碱基，前端连接探针的首位碱基标记有生物素，后端连接探针的首位碱基有磷酸化修饰，在碱基完全匹配的情况下有耐热连接酶将前端后端连接探针进行共价连接，形成首位碱基有标记有生物素的多碱基核苷酸链。
所述的对应人类血小板抗原22种SNP位点的特异性检测探针47-68，分别选自HPA1 HPA2 HPA3 HPA4 HPA5 HPA15 HPA6 HPA7 HPA8 HPA9 HPA10 HPA11 HPA12 HPA13 HPA14 HPA16抗原决定基因碱基突变位点两侧序列，包括特异序列、连续10个T碱基间隔序列及修饰合成的氨基。
如所述的人类血小板抗原基因分型液相芯片的检测方法，其特征在于：
由以下步骤实现：
步骤一：采用两组扩增引物1-24在两个扩增管中对检测DNA样本进行多重PCR扩增，并将两管中的产物进行等量混合，获得包含有22种SNP位点所在的目的片段；
步骤二：以上述获得的扩增产物为模板，用连接探针25-46在同一管中进行多重连接反应，获得样品中存在的代表各基因型的单链连接产物；
步骤三：连接产物同包被有特异性探针47-68的荧光微球进行杂交反应，随后通过连接产物前端碱基上标记的生物素和链亲和素-藻红蛋白荧光标记分子反应，从而形成荧光微球-特异性探针-单链连接产物-生物素-链亲和素-藻红蛋白复合物；
步骤四：通过流式荧光检测仪进行信号阅读。
所述的步骤一中的扩增温度为95℃，变性3分钟，95℃－30s 52℃－30s 72℃－30s 5 个循环，95℃－30s 55℃－30s 72℃－30s 30个循环，72℃延伸1分钟；
PCR扩增使用的酶为taq聚合酶。
所述的步骤二中的连接反应，其反应体系包括1X thermo stable ligase reaction buffer，两管多重扩增产物各1μl, 连接探针各0.2μM, thermo stable ligase 4U,总体积为20μl；连接温度为95℃，变性3分钟，95℃－30s 60℃－30s 30个循环；
连接反应使用的连接酶为90N耐热连接酶。
所述的步骤三中的杂交反应为，将液相芯片放置于室温下静置30分钟平衡温度；微球于振荡器上震荡30秒，充分悬浮微球；取微球20μl置于杂交反应室内；每个反应加入连接产物1.5μl；贴上合适的封板纸，并于振荡器上震荡10秒钟充分混匀；置于控温器上，设置并运行如下温度程序：94℃ 3 min 50℃ 30 min，此运行时按照80μl/反应的体积准备荧光素，并孵育至温度为50℃，同时请将Luminex加热装置设定为52℃，运行结束后每孔加入荧光素80μl,并继续在50℃下孵育10分钟。
本发明具有以下优点：
①通量大：液相芯片体系中的微球采用荧光编码技术，可产生100种有颜色差别的荧光微球。这样便可对同一标本中多达100种不同的待检分子同时进行定性、定量分析。与传统检测方法相比，这可谓是一个质的飞跃。
②敏感性高：微球表面积大，每个微球表面可包被多达1~2×106个捕获分子。因此结合的待检分子多，产生的信号强。加之采用荧光检测，其敏感性大大高于现有的其它检测手段。
③特异性强：液相芯片检测的特异性主要是由反应系统内生物分子间结合的特异性所决定的。另外，用两束激光分别检测微球的荧光信号和分子间的杂交信号，其中荧光信号决定特异性，杂交信号决定敏感性，而且激光只分析微球一定半径内的信息，因此可进一步增强检测的特异性，降低背景信号。
④重复性好：液相芯片的杂交反应发生在准均相液态环境中，其结果稳定，重复性好。另外，每一指标在一个反应体系中有相对应的1000~5000个相同的微球。检测时，抽取其中100~500个进行读数，取其均值作为最终结果，从而使得定量结果更为精确可靠。
⑤线性范围宽：其检测的线性范围可以达到4~6个数量级。
⑥操作简便、省时、经济：液相芯片检测可无需洗涤，整个过程只涉及加样和孵育，最后上机读取结果，因此操作省时、省力。加之整个反应过程在液态悬浮状态下进行，可保持生物分子的天然构象，更有利于生物分子间的特异性结合反应，使得反应速度大大提高。可同时检测同一标本中多个待检分子的液相芯片方法，不仅经济，而且更节约标本用量。
⑦灵活性大、应用范围广：包被有不同捕获分子的微球可分开保存，以便根据需要及时调整检测体系的设计，包括调整包被于微球上捕获分子的种类，这样便可灵活地对检测体系进行调整与完善。包被于微球表面的捕获分子可以是蛋白质，也可以是核酸，因此可满足不同的研究和诊断需求。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。
一、液相芯片（liquichip），又称悬浮点阵技术（suspension array technology, SAT），是新一代的生物芯片技术。液相芯片体系主要由4种要素构成：微球、捕获分子即抗原、抗体或核酸探针、待检分子和报告分子。微球由聚苯乙烯制作而来，主要用来固定和区分不同的捕获分子；利用荧光编码技术，即在微球制备过程中精确掺入两种不同比例的红色分类荧光染料，就可获得100种有颜色差别的荧光编码微球，这样便可对100种不同的探针分子进行标记，也就能完成对一个标本中多达100种不同的待检分子同时进行检测。包被于微球上的捕获分子若为抗原或抗体，便可检测蛋白质，即所谓液相蛋白芯片；若为核酸探针，便可检测核酸，即所谓液相基因芯片；将每种包被有相应捕获分子的荧光编码微球混悬于一个液相体系中，依次加入待检标本及报告分子。不同微球上的捕获分子与标本中的相应待检分子便特异性结合，报告分子与相应待检分子也特异性结合，即构成了一个液相芯片的反应系统。反应结束后，让单个的微球依次通过检测通道进行检测。液相芯片的检测系统内置有双色激光发射器，产生的红色激光用来激发微球上的红色分类荧光，可将微球分类，从而将各种不同的分析反应区分开来，即定性。产生的绿色激光用来激发报告分子上的绿色报告荧光，从而确定与微球结合的相应待检分子的数量，即定量。利用这种液相芯片系统，可以对同一微量标本中的多个不同待检分子同时进行快速的定性、定量分析。
二、本发明所述的人类血小板抗原基因分型液相芯片包含有：
（1）扩增出包含有人类血小板抗原22种基因型SNP位点的目标序列的引物1-24。如表1所示，人类血小板抗原22种基因型的SNP位点分布在7个基因的16个不同位置，本发明根据各SNP位点的分布，设计了A、B两组多重引物。其中，引物1-12为A组，序列分别为SEQ ID NO.1-12，扩增包括1a、1b、10w、2a、2b、3a、3b、9w、5a、5b、15a、15b、11w和8w在内的六个目标片段；引物13-24为B组，序列分别为SEQ ID NO.13-24，扩增包括4a、4b、16w、6w、7w、12w、13w和14w在内的六个目标片段。通过优选确定了每组引物中各引物对之间的浓度配比，通过这两组引物可将12个目的片段在A、B两管中进行有效扩增，同时避免扩增出非特异性产物。A、B两组引物的序列及其对应扩增片段包含的基因型及浓度配比见表2。
表1 22种人类血小板抗原基因型所在的基因名称、基因登录号、氨基酸变化及CD分类信息
表2 引物的序列、对应扩增目的片段包含基因型、引物配比
以上所有扩增引物均由IDT合成，采用纯化水配制成100μM的储备液于-20℃保存。
（2）用于区分22种SNP位点的特异性连接探针25-46，序列分别为SEQ ID NO.25-46，每个探针是针对每一个SNP位点的前后相邻的两个寡核苷酸片段，即前端连接探针和后端连接探针；前端连接探针的末位碱基为区别SNP突变的碱基，前端连接探针的首位碱基标记有生物素，后端连接探针的首位碱基有磷酸化修饰，在碱基完全匹配的情况下有耐热连接酶将前端后端连接探针进行共价连接，形成首位碱基有标记有生物素的多碱基核苷酸链。22对连接探针的序列及对应的基因型见表3。
表3 22对连接探针序列及对应的基因型
以上所有连接探针序列、生物素修饰及磷酸化修饰均由IDT完成，采用纯化水配制成100μM的储备液于-20℃保存。
（3）包被有对应人类血小板抗原22种SNP位点的特异性检测探针47-68的荧光编码微球：针对每一个人类血小板抗原22种SNP位点设计一条特异性检测探针，特异性检测探针序列和对应位点的一对连接探针通过连接反应生成的单链核苷酸序列部分互补；将突变碱基位置选择在特异性检测探针的中间，特异性探针的长度在14-21碱基；特异性检测探针包括特异序列、连续10个T碱基间隔序列及修饰合成的氨基；每种特异性检测探针通过末端氨基和某一种选择的荧光编码微球进行共价连接，将连接有特异性检测探针的不同微球按照等比例一定浓度混合后即成为液相芯片；22中特异性检测探针序列、对应基因型及连接的荧光编码微球见表4。
表4 22特异性检测探针序列、对应的基因型及连接的荧光编码微球
以上所有氨基修饰特异性检测探针均由IDT完成，采用纯化水配制成100μM的储备液于-20℃保存。
以上选择的22中荧光编码微球购资美国Luminex公司。
特异性检测探针通过末端氨基与荧光编码微球的共价连接方法如下：
取浓度为107/ml微球0.5ml，8000rpm离心3分钟，加入50μl的100mM MES(pH=4.5),超声振荡20秒钟，充分悬浮微球；加入1 nmol/μl 氨基修饰探针2μl, 振荡均匀；加入新鲜配制的EDC (25mg/ml) 2μl，并立即振荡均匀；室温下避光反应30分钟，并重复加入新鲜配制的EDC (25mg/ml) 2μl，并立即振荡均匀，室温下继续避光反应30分钟；加入1ml 0.02℅ Tween20 振荡均匀，8000rpm 离心3分钟，小心弃去上清；加入1ml 0.1℅ SDS 振荡均匀，8000rpm 离心3分钟，小心弃去上清；加入250μl TE缓冲液（10m Tris-HCl 1mM EDTA pH 8.0）,振荡均匀即可，避光保存于4-8℃。
将上述包被有探针的22种微球按照各自不同的浓度，采用1X TMAC溶液进行配制，使得每种微球的使用量为2000个/20μl，微球浓度的检测采用血球计数板进行。
上述溶液配制方法如下：
0.1 M MES, pH 4.5：
准确称取MES 4.88g, 加入220ml 水充分溶解，加入5 N NaOH 约5滴，调整至pH = 4.5，用水加至体积为250ml, 过滤除菌后保存于4℃备用。
0.02% TWEEN-20：
准确量取250ml水，加入50ul TWEEN-20，充分混合均匀，过滤除菌后室温保存备用。
0.1% SDS：
准确量取247.5ml水，加入2.5ml SDS 10% solution，充分混合均匀，过滤除菌后室温保存备用。
TE, pH 8.0：
准确量取247.5ml水，加入2.5ml Tris-EDTA Buffer, pH 8.0, 100X，充分混合均匀，过滤除菌后室温保存备用。
1 X TMAC：
准确量取150ml5 M TMAC，依次加入1.25ml 20% Sarkosyl solution，12.5ml 1 M Tris-HCl pH 8.0，2ml 0.5 M EDTA pH 8.0，84.25ml水，充分混合均匀，室温保存备用。
三、本发明所述的人类血小板抗原基因分型液相芯片的检测方法为：
步骤一：采用两组扩增引物1-24在两个扩增管中对检测DNA样本进行多重PCR扩增，并将两管中的产物进行等量混合，获得包含有22种SNP位点所在的目的片段。
两个扩增管分别为A管和B管。反应体系, A管包括1X polymerase buffer，dNTP 125uM each, genomicDNA 100ng,Taq polymerase 1U, 引物按照0.2uM为基准比例为（276:221:180:153:131:100 = 4:3:2:3:3:3），总体积为20ul；B管包括1X polymerase buffer，dNTP 125uM each, genomicDNA 100ng,Taq polymerase 1U, 引物按照0.2uM为基准比例为（262:233:170:150:134:103 = 3:2:1:2:5:8），总体积为20ul;扩增温度为95℃变性3分钟，95℃－30s 52℃－30s 72℃－30s 5 个循环，95℃－30s 55℃－30s 72℃－30s 30个循环，72℃延伸1分钟。
以上PCR扩增使用的taq聚合酶购自Qiagen公司，HotStarTaq Plus DNA Polymerase货号：Cat: 203605。
步骤二：以上述获得的扩增产物为模板，用连接探针25-46在同一管中进行多重连接反应，获得样品中存在的代表各基因型的单链连接产物。
反应体系, 包括1X thermo stable ligase reaction buffer，A管、B管多重扩增产物各1ul, 连接探针各0.2uM, thermo stable ligase 4U,总体积为20ul； 连接温度为95℃变性3分钟，95℃－30s 60℃－30s 30个循环。
以上链接反应使用的连接酶为90N耐热连接酶购自NEB 货号M0238L。
步骤三：连接产物同包被有特异性探针47-68的荧光微球进行杂交反应，随后通过连接产物前端碱基上标记的生物素和链亲和素-藻红蛋白荧光标记分子反应，从而形成荧光微球-特异性探针-单链连接产物-生物素-链亲和素-藻红蛋白复合物。
将液相芯片放置于室温下静置30分钟平衡温度；微球于振荡器上震荡30秒，充分悬浮微球；取微球20μl置于杂交反应室内；每个反应加入连接产物1.5μl；贴上合适的封板纸，并于振荡器上震荡10秒钟充分混匀；置于控温器上，设置并运行如下温度程序：94℃ 3 min 50℃ 30 min，此运行时按照80μl/反应的体积准备荧光素，并孵育至温度为50℃，同时请将Luminex加热装置设定为52℃，运行结束后每孔加入荧光素80μl,并继续在50℃下孵育10分钟。
步骤四：通过流式荧光检测仪进行信号阅读。
四、结果判定：
参照Qiagen人全血基因组小量提取试剂盒说明，得到检测DNA样品。每次检测时都将三个参考品作为对照样品进行检测，每条探针检测相应的参考品时产生的信号作为阳性参照，检测非对应参考品时的信号为阴性对照，并按照如下方法判定结果：
除了3a 3b外，每个探针的信号值于相应阴性参比品信号值相比，比值大于5以上的判定为阳性。
除了3a 3b外，如果HPA1、2、4、5、15中a、b两个探针都为阴性的，建议重新测定，或进行特殊的分析，如PCR扩增后进行电泳条带分析或进行单对引物扩增测序分析。
3a 3b的位点由于GC含量高，结构特殊，造成检测室信噪比不明显，判定需要谨慎。可按照如下方法判定：a. 两条探针信号相比，比值相差4倍以上的判定高值探针阳性同时判定低值探针阴性，b. 两条探针信号比值低于4的，看低值的信号与阴性样品的信号比值是否大于1.5，大于1.5判定此样品为杂合子，低于1.5的判定为高值探针阳性。
五、临床样品的检测：
参考品CW、CM及CH配制说明：
如表5所示合成了代表不同HPA基因型的质粒，各个质粒的浓度调整为30ng/ml。并按照表五配制了CW、CM及CH三种参考品，CW代表野生型，CM代表突变型，CH代表杂合型,由于突变位点位置关系对于10w 9w 16w 11w 8w 7w 6w没有纯合型参考品。
表5 参考品CW、CM和CH配制
六、216例临床样品检测结果：
按照上述检测方法对216例人基因组样品进行了检测，共检出HPA1a/b杂合子5例，HPA1b纯合子0例，HPA1a及HPA1b基因频率分别为0.99和0.01；HPA2a/b杂合子21例，HPA2b纯合子2例，HPA2a及HPA2b基因频率分别为0.94和0.06；HPA3a/b杂合子110例，HPA3b纯合子40例，HPA3a及HPA3b基因频率分别为0.56和0.44；HPA4a/b杂合子3例，HPA3b纯合子0例，HPA4a及HPA4b基因频率分别为0.99和0.01；HPA5a/b杂合子7例，HPA5b纯合子0例，HPA5a及HPA5b基因频率分别为0.98和0.02；HPA15a/b杂合子102例，HPA15b纯合子49例，HPA15a及HPA15b基因频率分别为0.54和0.46；检出HPA6w型5例。挑取50例样品进行测序验证，测序结果和检测结果对比情况为100%一致。
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<400> 20
caaaggtgac ctggacgat 19
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
cctatgggga cacctgtga 19
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
gagagctggg gattctagtc a 21
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
gttgcccggc gccctgta 18
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
tcggttgtgt cgacagggaa 20
<210> 25
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
acagcgaggt gagcccagag gcagggcctg taagaca 37
<210> 26
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
acagcgaggt gagcccggag gcagggcctg taagaca 37
<210> 27
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
agcttgggtg tgggcgtcag gagccctggg gg 32
<210> 28
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
agcttgggtg tgggcatcag gagccctggg gg 32
<210> 29
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
ggggaggggc tggggatggg cagcccccag tcca 34
<210> 30
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
ggggaggggc tggggctggg cagcccccag tcca 34
<210> 31
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
tggccatcca gatgcgaaag ctcaccagta acctgcg 37
<210> 32
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
tggccatcca gatgcaaaag ctcaccagta acctgcg 37
<210> 33
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
gtttattttt ttttttttac ctctttgata gtaaacaggt agactcttc 49
<210> 34
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
gtttattttt ttttttttac ctttttgata gtaaacaggt agactcttc 49
<210> 35
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
caaattcttg gtaaatcctg gaactgaagt caagataata aatataaaca 50
<210> 36
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
caaattcttg gtaaatcctg taactgaagt caagataata aatataaaca 50
<210> 37
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
acgaatgcag cccccaggag ggtcagcccg tctg 34
<210> 38
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
acttctcctt ctcctgggca cagcctcgca ccttggc 37
<210> 39
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
tcactgactc aatctcgtca cacagtaacg gttgcaggta tttt 44
<210> 40
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
ggcagccccc agtccatctg ggggggcaaa ggag 34
<210> 41
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
ggggcctgtc ctctagtact tgggcctcac tcactgggaa 40
<210> 42
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
caatctcgtc acggcagtaa tggttgcagg tattttcgtc atgt 44
<210> 43
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
cgctcgtgga ctgcgagcgc cgcgggctga ct 32
<210> 44
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
acaaaaggtt aacattttca gtaatgctga aaaataaaag ggaaagtgc 49
<210> 45
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
ctctccagac tccacactca cttaaaggtg caggcatctg gg 42
<210> 46
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
gggtaccaag ctggccatcc agatgcgaaa gctcacca 38
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
cctgcctctg ggctcacttt ttttttm 27
<210> 48
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
cctgcctccg ggctcacttt ttttttm 27
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
gctcctgacg cccacacttt ttttttm 27
<210> 50
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
gctcctgatg cccacacttt ttttttm 27
<210> 51
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
gctgcccatc cccagctttt tttttm 26
<210> 52
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
ggatgcccag ccccagccct ttttttttm 29
<210> 53
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
gagctttcgc atctgttttt ttttm 25
<210> 54
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
gagcttttgc atctgttttt ttttm 25
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<212> DNA
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tactatcaaa gaggtaaaaa attttttttt m 31
<210> 56
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 56
tactatcaaa aaggtaaaaa attttttttt m 31
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 57
cttcagttcc aggatttttt ttttttm 27
<210> 58
<211> 25
<212> DNA
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ttcagttaca ggattttttt ttttm 25
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 59
gctgaacctc ctgggggctg gttttttttt m 31
<210> 60
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 60
cgaggctgtg cccaggagat ttttttttm 29
<210> 61
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 61
gttactgctg tgacgagttt ttttttm 27
<210> 62
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 62
gttactgctg tgacgagttt ttttttm 27
<210> 63
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 63
tgaggcccaa gtactagagt ttttttttm 29
<210> 64
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 64
ctgcaaccat tactgccttt ttttttm 27
<210> 65
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 65
cgcggcgctc gcagtccatt tttttttm 28
<210> 66
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<212> DNA
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atttttgagc attactgaaa tttttttttm 30
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<211> 29
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<213> 人工序列
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ctgcaccttt aagtgagtgt ttttttttm 29
<210> 68
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 68
catctggatg gccggttttt ttttm 25
Claims (7)
1.人类血小板抗原基因分型液相芯片，其特征在于：
所述的液相芯片包含有：
（1）扩增出包含有人类血小板抗原22种基因型SNP位点的目标序列的引物1-24：
引物1-12的序列分别为SEQ ID NO.1-12，扩增包括1a、1b、10w、2a、2b、3a、3b、9w、5a、5b、15a、15b、11w和8w在内的六个目标片段；
引物13-24的序列分别为SEQ ID NO.13-24，扩增包括4a、4b、16w、6w、7w、12w、13w和14w在内的六个目标片段；
（2）用于区分22种SNP位点的特异性连接探针25-46，序列分别为SEQ ID NO.25-46，每个探针是针对每一个SNP位点的前后相邻的两个寡核苷酸片段，即前端连接探针和后端连接探针；
（3）分别包被有对应人类血小板抗原22种SNP位点的特异性检测探针47-68的荧光编码微球。
2.根据权利要求1所述的人类血小板抗原基因分型液相芯片，其特征在于：
所述的前端连接探针的末位碱基为区别SNP突变的碱基，前端连接探针的首位碱基标记有生物素，后端连接探针的首位碱基有磷酸化修饰，在碱基完全匹配的情况下有耐热连接酶将前端后端连接探针进行共价连接，形成首位碱基有标记有生物素的多碱基核苷酸链。
3.根据权利要求1所述的人类血小板抗原基因分型液相芯片，其特征在于：
所述的对应人类血小板抗原22种SNP位点的特异性检测探针47-68，分别选自HPA1 HPA2 HPA3 HPA4 HPA5 HPA15 HPA6 HPA7 HPA8 HPA9 HPA10 HPA11 HPA12 HPA13 HPA14 HPA16抗原决定基因碱基突变位点两侧序列，包括特异序列、连续10个T碱基间隔序列及修饰合成的氨基。
4.如权利要求1-3中任一权利要求所述的人类血小板抗原基因分型液相芯片的检测方法，其特征在于：
由以下步骤实现：
步骤一：采用两组扩增引物1-24在两个扩增管中对检测DNA样本进行多重PCR扩增，并将两管中的产物进行等量混合，获得包含有22种SNP位点所在的目的片段；
步骤二：以上述获得的扩增产物为模板，用连接探针25-46在同一管中进行多重连接反应，获得样品中存在的代表各基因型的单链连接产物；
步骤三：连接产物同包被有特异性探针47-68的荧光微球进行杂交反应，随后通过连接产物前端碱基上标记的生物素和链亲和素-藻红蛋白荧光标记分子反应，从而形成荧光微球-特异性探针-单链连接产物-生物素-链亲和素-藻红蛋白复合物；
步骤四：通过流式荧光检测仪进行信号阅读。
5.根据权利要求4所述的人类血小板抗原基因分型液相芯片的检测方法，其特征在于：
所述的步骤一中的扩增温度为95℃，变性3分钟，95℃－30s 52℃－30s 72℃－30s 5 个循环，95℃－30s 55℃－30s 72℃－30s 30个循环，72℃延伸1分钟；
PCR扩增使用的酶为taq聚合酶。
6.根据权利要求4所述的人类血小板抗原基因分型液相芯片的检测方法，其特征在于：
所述的步骤二中的连接反应，其反应体系包括1X thermo stable ligase reaction buffer，两管多重扩增产物各1μl, 连接探针各0.2μM, thermo stable ligase 4U,总体积为20μl；连接温度为95℃，变性3分钟，95℃－30s 60℃－30s 30个循环；
连接反应使用的连接酶为90N耐热连接酶。
7.根据权利要求4所述的人类血小板抗原基因分型液相芯片的检测方法，其特征在于：
所述的步骤三中的杂交反应为，将液相芯片放置于室温下静置30分钟平衡温度；微球于振荡器上震荡30秒，充分悬浮微球；取微球20μl置于杂交反应室内；每个反应加入连接产物1.5μl；贴上合适的封板纸，并于振荡器上震荡10秒钟充分混匀；置于控温器上，设置并运行如下温度程序：94℃ 3 min 50℃ 30 min，此运行时按照80μl/反应的体积准备荧光素，并孵育至温度为50℃，同时请将Luminex加热装置设定为52℃，运行结束后每孔加入荧光素80μl,并继续在50℃下孵育10分钟。
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