CN103757118A - 一种检测人心脏微血管损伤标志物miRNA21的引物及其应用 - Google Patents

一种检测人心脏微血管损伤标志物miRNA21的引物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测人心脏微血管损伤标志物miRNA21的引物及其应用，具体提供了一种检测人心脏微血管损伤标志物miRNA21的引物、该引物的用途、包含该引物的试剂盒以及试剂盒的用途，所述引物的序列为：引物I：5’GCGGTAGCTTATCAGACTG3’；引物II：5’CAGTGCGTGTCGTGGAGT3’。本发明为心脏微血管损伤提供了一种特异性强、灵敏度高、快捷、易于被患者接受的临床诊断方法。

Description

一种检测人心脏微血管损伤标志物miRNA21的引物及其应用
技术领域
本发明涉及分子诊断技术领域，具体地说，是一种检测人心脏微血管损伤标志物miRNA21的引物及其应用。
背景技术
前期研究发现，柯萨奇B3病毒（CVB3）感染能损伤心脏微血管。以往对于心脏微血管的损伤缺乏灵敏、特异的诊断方法，传统的病理学方法存在着操作复杂、有创性等缺点，病人难以接受，临床上无法推广应用。因此，寻找一种高灵敏、特异性强、操作方便且病人能够接受的检测方法有着重要的临床意义。
近年来的研究表明miRNA可能参与心血管系统的发育、分化和病理过程，其在心血管疾病中的调控作用日益受到重视。首先，miRNA的表达具有组织特异性，作为一类重要的调节因子，miRNA通过降解、翻译抑制或激活目标RNA调节其目标基因的表达，而循环血中存在的特异性miRNA则有望作为心血管疾病的特异性标志物。
中国期刊《中华医学会第十五次全国心血管病学大会论文汇编》，2013年刊出的论文《miRNA21通过靶基因PDCD4在柯萨奇B3病毒(CVB3)诱导的心脏微血管内皮细胞凋亡中的作用和机制》，作者探讨了miRNA21通过靶基因程序性死亡蛋白4(PDCD4)在柯萨奇B3病毒(CVB3)诱导的心脏微血管内皮细胞凋亡中的作用和机制，通过在CVB3感染的CMECs模型上，采用miRNA芯片和qRT-PCR筛选并验证表达显著差异的miRNA21，发现CMECs感染CVB3后miRNA21的表达上调了3.65倍，提示miRNA21可作为检测CVB3诱导的心脏微血管损伤的标志物，为病毒性心肌炎和扩张性心肌病的临床诊断、疗效及预后判断提供了新的指标。但是目前关于可特异性检测miRNA21且灵敏度高，检测方法简单快捷，能充分满足临床需求的诊断试剂及方法还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种检测人心脏微血管损伤标志物miRNA21的引物。
本发明的再一的目的是，提供上述引物的用途。
本发明的另一的目的是，提供一种诊断人心脏微血管损伤的试剂盒。
本发明的第四个目的是，提供上述试剂盒的用途。
为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
一种检测人心脏微血管损伤标志物miRNA21的引物，所述的引物的序列为：
引物I：5’GCGGTAGCTTATCAGACTG3’；
引物II：5’ CAGTGCGTGTCGTGGAGT3’
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
如上所述的引物在制备检测或诊断人心脏微血管损伤药物中的应用。
其中，所述的人心脏微血管损伤可以是柯萨奇B3病毒感染所致的心脏微血管损伤，如病毒性心肌炎、扩张性心肌病等。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
一种诊断人心脏微血管损伤的试剂盒，所述的试剂盒包括如上所述的引物。
优选地，所述的试剂盒还包括以下引物：
引物III：5’GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT3’；
引物IV：5’CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT3’。
优选地，所述的试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶和PCR反应液。
为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：
如上任一所述的试剂盒在制备检测或诊断人心脏微血管损伤药物中的应用。
其中，所述的人心脏微血管损伤可以是柯萨奇B3病毒感染所致的人心脏微血管损伤。
本发明优点在于：本发明的引物能用于检测或诊断人心脏微血管损伤，尤其是柯萨奇B3病毒感染所致的人心脏微血管损伤，相比于其它引物特异性、灵敏度都显著较高，从而为该疾病的临床诊断提供了一种特异性强、灵敏度高、快捷的检测方法，且易于被患者接受，适于制备成试剂盒在临床上普遍推广。
附图说明
附图1是病毒性心肌炎组与对照组外周血中miRNA21表达差异比较。
附图2是miRNA21扩增曲线。
附图3是内参U6扩增曲线。
附图4是miRNA21溶解曲线。
附图5是内参U6溶解曲线。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例 1 qRT-PCR 检测人外周血中 miRNA21 表达
一、标本采集
临床收集确诊为病毒性心肌炎、CVB3中和抗体阳性的心肌炎患者50例以及正常对照20例，均签署知情同意书。静脉采血1ml，EDTA抗凝，尽快送到实验室。
二、样品的RNA抽提
TRI REAGENT BD试剂购于MRCGENE，氯仿、异丙醇、100%乙醇购于上海化学试剂有限公司，75%乙醇以DEPC处理的水配制，冰醋酸购于国药集团化学试剂有限公司，无RNA酶水和无RNA酶糖原购于Invitrogen life technologies。
1、匀浆
在1.5ml的离心管中分别加入250μl外周血液样品、750μl的TRI REAGENT BD试剂和20μl冰醋酸，手动剧烈振荡管体至混匀。
2、两相分离
匀浆后样品于室温孵育5分钟，以便核酸蛋白复合体完全解离。每750μl的TRI REAGENT BD试剂匀浆的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，室温孵育2-3分钟。4°C下12,000×g离心15分钟。离心后混合液体分为下层的红色酚氯仿相、中间层和上层无色水相。RNA全部被分配于上侧无色水相中。上层无色水相的体积大约是匀浆时加入的TRI REAGENT BD试剂体积的60%。
3、RNA沉淀
将上层无色水相转移到新离心管中，并加入500μl异丙醇，混匀以沉淀其中的RNA。混匀后室温孵育10分钟，于4°C、12,000 ×g离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀在管底部/侧壁上形成肉眼可见的沉淀块。
4、RNA清洗
移去上清液，750μl的TRI REAGENT BD试剂匀浆的样品中加入至少1ml的75%乙醇，清洗RNA沉淀。振荡后，4°C、7,500×g离心5分钟。
5、重新溶解RNA沉淀
去除乙醇溶液，空气中干燥RNA沉淀15分钟。注意RNA沉淀不要完全干燥，否则将大大降低RNA的可溶性，部分溶解的RNA样品A260 / 280比值将小于1.6。溶解RNA时，先加入无RNA酶水用枪反复吹打几次，然后55-60°C孵育10分钟。获得的RNA溶液保存于-70°C。
三、RNA质量检测
TE缓冲液：10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8（Tris-HCl、EDTA购于华美生物工程公司）；0.2M MOPS，pH7.0（MOPS购于华美生物工程公司）；0.02M乙酸钠（乙酸钠购于上海化学试剂有限公司）；0.01M EDTA（EDTA购于华美生物工程公司）；甲醛购于上海化学试剂有限公司；甲醛上样染液购于Ambion；Gold View染料购于上海赛百胜基因技术有限公司；琼脂糖购于生工生物工程有限公司。
1、紫外吸收测定法
使用NanoDrop® ND-1000测定RNA浓度和纯度，测量前先用溶解RNA用的DEPC水调零，操作方法如下：
（1）滴加1µl DEPC水或者RNA样品至测量基座的表面；
（2）液滴会自动在上下基座之间形成液柱并自动完成测定，RNA浓度及质量的各种参数将在电脑中自动生成文件；
（3）一次测定完成后，用柔软的擦镜纸擦去上下基座表面上的样本液，便可进行下一个样品的测量；
（4）测定结果
①浓度测定
260nm处读值为1表示40ng RNA/µl。样品RNA浓度计算公式为：A260×40ng/µl。具体计算如下：RNA溶于20µl DEPC水中，取1µl用于测定，测得A260=65.003，RNA浓度= 65.003×40ng/µl = 2600.12ng/µl；取1µl用来测量以后，剩余样品RNA为19µl，剩余RNA总量为：19µl×2600.12ng/µl =49.4µg。
②纯度检测
RNA溶液的A260/A280的比值是一种RNA纯度检测方法，比值范围1.8到2.1。
2、变性琼脂糖凝胶电泳
（1）制胶
按照下表配制10×MOPS电泳缓冲液：
Figure 360653DEST_PATH_IMAGE001
，
然后取1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60°C，加入10ml的10×MOPS电泳缓冲液和18ml的37%甲醛溶液（12.3M），灌制凝胶板，预留25µl加样孔。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。
（2）准备RNA样品
取1µg RNA，加1倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10µg/ml。加热至70°C孵育5分钟使样品变性。
（3）电泳
上样于胶孔中，5-6V/cm电压下电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3cm。
四、使用样品的RNA进行cDNA合成
试剂：RNA酶抑制剂、MMLV反转录酶、10 × RT缓冲液（250mM Tris-HCl，pH8.3，200mM KCl，40mM MgCl2，5mM DTT）购于Epicentre，2.5mM dNTP混合液（dATP、dGTP、dCTP和dTTP各2.5mM）购于HyTest Ltd。
RT primers由Invitrogen合成，序列如下表：
Figure 277794DEST_PATH_IMAGE002
仪器：生物安全柜（新加坡ESCO），Gene Amp PCR System 9700（Applied Biosystems）。
操作方法：
（1）制备RT混合反应液：
Figure 241552DEST_PATH_IMAGE003
；
（2）在PCR扩增仪进行RT反应：
Figure 636761DEST_PATH_IMAGE004
反应结束后，将其放在冰上待用或-20℃保存。
五、合成的cDNA用于实时定量PCR
试剂：2×PCR master mix购于Superarray，TaKaRa PCR Thermal Cycler购于宝生物工程有限公司。
仪器：生物安全柜购于新加坡ESCO，引物设计软件为Primer 5.0，ViiA 7 Real-time PCR System（Applied Biosystems）。
（1）进行Realtime PCR反应
使用Primer 5.0设计以下miRNA21和内参U6的特异性引物，如下表所示：
Figure 451133DEST_PATH_IMAGE006
注：GSP是对应miRNA21的特异引物，R是与RT引物相匹配的引物。
将所有cDNA样品分别配制Realtime PCR反应体系，轻弹管底将溶液混合，5000rpm短暂离心，反应体系如下：
Figure 211279DEST_PATH_IMAGE007
加样：a. 将8µl混合液加到384-PCR板对应的每个孔中。b. 再加入对应的2µl cDNA。c. 小心粘上Sealing Film 封口膜，并短暂离心混合。d. 在设置PCR程序前将准备好的PCR板放在冰上。将上述384-PCR板置于Realtime PCR仪上进行PCR反应。
内参U6及所有的样品均按以下程序进行扩增：95℃，10min；40个PCR循环（95℃，10秒；60℃，60秒(收集荧光)）。为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后，按（95℃，10秒；60℃，60秒；95℃，15秒）；并从60℃缓慢加热到99℃（仪器自动进行-Ramp Rate为0.05℃/秒）。
（2）结果与计算
Realtime PCR反应后，数据采用2 - △△ CT法进行分析。样品以U6为内参，CON-1为基准，校正如下：
Figure 478312DEST_PATH_IMAGE008
最终得到病毒性心肌炎组与对照组中miRNA21表达的差异如图1所示，两组miRNA21表达的差异极显著（P<0.001）。且病毒性心肌炎组2 - △△ CT值均分布在2.358-6.837范围内，而对照组2 - △△ CT值均分布在0.793-2.093围内。
附图2和3分别是miRNA21和内参U6的扩增曲线。附图4和5分别是miRNA21和内参U6的溶解曲线。溶解曲线图表说明，miRNA21和内参U6的Tm值均在80~90之间，且为单一峰，表明目的基因引物和内参基因引物特异性均非常好。
六、敏感性实验
分别将病毒性心肌炎组各样本cDNA浓度十倍梯级稀释数次，使cDNA含量分别为100ng、10ng、1ng、0.1ng、10pg、1pg、0.1pg、10fg、1fg、0.1fg、0.01fg。将上述不同浓度梯度的cDNA模板分别按照与上相同的PCR反应体系和条件进行反应，结束后观察扩增情况。设立不含cDNA组为阴性对照。PCR扩增结果表明，本发明的引物PCR检测的敏感程度可以达到0.1fg，灵敏度很高。
实施例 2 本发明的试剂盒一
试剂盒中含有下列试剂和材料：
引物溶液：引物I（5’GCGGTAGCTTATCAGACTG3’，5μmol/L）；引物II（5’ CAGTGCGTGTCGTGGAGT3’，5μmol/L）。
实施例 3 本发明的试剂盒二
试剂盒中含有下列试剂和材料：
引物溶液：引物I（5’GCGGTAGCTTATCAGACTG3’，5μmol/L）；引物II（5’ CAGTGCGTGTCGTGGAGT3’，5μmol/L）。；引物III（5’GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT3’，5μmol/L）；引物IV（5’CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT3’，5μmol/L）。
实施例 4 本发明的试剂盒三
试剂盒中含有下列试剂和材料：
1、引物溶液：引物I（5’GCGGTAGCTTATCAGACTG3’，5μmol/L）；引物II（5’ CAGTGCGTGTCGTGGAGT3’，5μmol/L）。；引物III（5’GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT3’，5μmol/L）；引物IV（5’CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT3’，5μmol/L）。
2、dNTPs（2.5mol/L）；
3、Taq聚合酶（8,000 units/ml）；
4、10×反应缓冲液，组成包括：200mM Tris-HCl，100mM (NH4)2SO4， 100mM KCl，20mM MgSO4，1% Triton X-100，pH8.8。
实施例 5 本发明引物的临床应用
按照实施例1的方法检测临床上疑似CVB3诱导的心脏微血管损伤患者40例。最终确诊为CVB3诱导的心脏微血管损伤患者31例，2 - △△ CT值均分布在3.057-5.982之间，落在2.358-6.837范围内，而另外9名患者2 - △△ CT值均分布在0.952-1.980之间，落在0.793-2.093范围内。同时使用传统病理学方法对以上40例患者进行诊断，诊断结果与使用本发明引物检测miRNA21标志物所诊断结果一致。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 复旦大学附属中山医院
<120> 一种检测人心脏微血管损伤标志物miRNA21的引物及其应用
<130> /
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cgcttcacga atttgcgtgt cat 23
<210> 2
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgactc aacat 55
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcttcggcag cacatatact aaaat 25
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cgcttcacga atttgcgtgt cat 23
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gcggtagctt atcagactg 19
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cagtgcgtgt cgtggagt 18

Claims (8)

1.一种检测人心脏微血管损伤标志物miRNA21的引物，其特征在于，所述的引物的序列为：
引物I：5’GCGGTAGCTTATCAGACTG3’；
引物II：5’ CAGTGCGTGTCGTGGAGT3’。
2.权利要求1所述的引物在制备检测或诊断人心脏微血管损伤药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的人心脏微血管损伤是柯萨奇B3病毒感染所致的人心脏微血管损伤。
4.一种诊断人心脏微血管损伤的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括权利要求1所述的引物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括以下引物：
引物III：5’GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT3’；
引物IV：5’CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT3’。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶和PCR反应液。
7.权利要求4-6任一所述的试剂盒在制备检测或诊断人心脏微血管损伤药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的人心脏微血管损伤是柯萨奇B3病毒感染所致的人心脏微血管损伤。
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