CN102344970B

CN102344970B - 同时检测人cmv和bk病毒dna的引物序列及定量检测试剂盒

Info

Publication number: CN102344970B
Application number: CN 201010244873
Authority: CN
Inventors: 陈必成; 白永恒; 杨亦荣
Original assignee: First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University
Priority date: 2010-07-27
Filing date: 2010-07-27
Publication date: 2013-01-23
Anticipated expiration: 2030-07-27
Also published as: CN102344970A

Abstract

同时检测人CMV和BK病毒DNA的引物序列及定量检测试剂盒本发明公开了可同时用于对巨细胞病毒(CMV)和BK病毒(BKV)脱氧核糖核酸片段(DNA)进行定量检测的引物、荧光探针和实时定量多聚酶链反应(real-time PCR)试剂盒。试剂盒包括试剂A、B、C、D、E和G。试剂A由一组引物和探针混合组成，引物和探针均针对CMV DNA、BKV DNA的保守序列；试剂B为含dNTP的缓冲液；试剂C为Taq DNA聚合酶；试剂D由不同浓度标准品组成；试剂E和G分别为阴性、阳性对照。本发明所提供的整套试剂盒可对尿液、血液、其他体液等临床标本中CMV和BKV两种病毒DNA同时进行定量检测。

Description

同时检测人CMV和BK病毒DNA的引物序列及定量检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术，是一种基于定量核酸扩增的分子生物学方法，特别是涉及用实时荧光定量多聚酶链反应(real-time PCR)，通过使用特异性的引物扩增巨细胞病毒(CMV)和多瘤病毒(BKV)保守性片段，并通过特异性探针释放荧光信号对其进行定量。优化实验条件后，构建可在单个反应管内同时完成对CMV DNA和BKV DNA检测的试剂盒。

背景技术

CMV和BKV是肾移植受者体内的潜伏病毒。当免疫抑制治疗过度时，两种病毒会有不同程度的再激活而损伤移植肾脏。这些病毒可以在肾移植受者尿液、血浆和外周血细胞中被发现，对肾移植受者的长期存活、移植肾的长期存活和医疗费用产生巨大的负面影响。

目前，还未开发出可同时检测CMV DNA和BKV DNA的诊断试剂，作为早期指标诊断CMV和BKV感染。而且对肾移植受者免疫过度抑制的评价和危害也未有具体的方法。CMV和BKV作为潜伏病毒，可以作为肾移植受者体内的“探针”，检测两种病毒DNA的拷贝数变化可间接反应机体免疫抑制程度。

本发明基于实时荧光定量PCR技术，利用此技术的敏感性和特异性，针对CMV DNA和BKVDNA的保守序列设计了荧光定量PCR的引物和标记荧光的探针。通过不同荧光标记探针，可以在同一反应管和同次实验内完成对CMV DNA和BKV DNA的检测。并通过制备含CMV和BKV靶DNA的标准品，使荧光定量PCR可以同时定量检测CMV DNA和BKV DNA拷贝数。目前，尚无其他方法可同时对CMV、BKV两种病毒的DNA进行定量检测。

发明内容

本发明的目的是克服现有分子诊断技术中对CMV和BKV DNA序列多态性考虑不足，提供了一种用于对CMV和BKV DNA保守性序列进行定量检测的引物和探针，包括SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQID NO.5和SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6。

本发明第二个目的是提供CMV DNA和BKV DNA的保守序列作为检测的靶DNA片段SEQ IDNO.7和SEQ ID NO.8。

本发明第三个目的是提供一种配套此引物和探针检测CMV DNA和BKV DNA的标准品，其为含CMV、BKV两种测定目的DNA片段SEQ ID NO.9的纯化质粒，并提供了制备标准品的引物SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12到SEQ ID NO.13。

本发明第四个目的是提供一种简便的对临床标本的CMV DNA和BKV DNA同时进行定量检测的试剂盒。

本发明的技术方案概述如下：

一组用于扩增CMV和BKV的特异性引物和探针，分别针对CMV保守序列和BKV的保守序列。针对CMV有上游引物SEQ ID NO.1和下游引物SEQ ID NO.2，及一条探针SEQ ID NO.3；针对BKV有上游引物SEQ ID NO.4和下游引物SEQ ID NO.5，及一条探针SEQ ID NO.6。

提供CMV DNA和BKV DNA的保守序列SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8作为检测的靶DNA片段，其具有高度的保守性。

一种配套此引物和探针检测CMV DNA和BKV DNA的标准品，其为含CMV、BKV两种测定目的DNA片段SEQ ID NO.9的纯化质粒。CMV DNA片段经引物对SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11扩增而获得，其BKV DNA片段经引物对SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13扩增而获得。标准品通过基因工程技术将包含检测CMV和BKV的目的DNA片段连接到质粒上，并通过鉴定、扩增、提取、纯化获得，并通过260nM的进行吸光度值读取，进行浓度分析而获得目的DNA准确的拷贝数目，并通过稀释制备成不同浓度的标准品。

一种同时检测CMV和BKV两种病毒DNA的试剂盒：

试剂A：由针对CMV、BKV的引物和探针混合组成250μL溶液。溶液包含5μM SEQ ID NO.1、5μM SEQ ID NO.2、5μM SEQ ID NO.4、5μM SEQ ID NO.5和2μM探针SEQ ID NO.3、2μM探针SEQ ID NO.6；

试剂B：由250μL缓冲液组成，包含1mM dNTPs(包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、200mMTris-HCl、200mM KCl、100mM(NH₄)₂SO₄，45mM MgSO₄；

试剂C：5U/μL Taq DNA聚合酶；

试剂D：制备的标准品经过梯度稀释达到5E7(5×10⁷拷贝/mL)、5E6、5E5、5E4、5E3，用于标准曲线的制定；

试剂E：阴性对照(无CMV、BKV感染的正常人DNA)；

试剂G：阳性对照(采用5E4的标准品)。

本发明优点：

利用CMV DNA和BKV DNA上保守序列的稳定性，设计高特异性的引物和探针，提高CMV DNA和BKV DNA的检出。通过优化实验反应体系和反应条件，组成简单、快速、灵敏、特异的检测试剂盒，可用于对临床标本CMV DNA和BKV DNA拷贝数的跟踪和动态检测。有利于CMV DNA和BKV DNA拷贝数的检测和对两种病毒感染的诊断。同时在单一反应管内检测可减少人力和物力，提供更多的实验信息。

附图说明

图1为CMV和BKV DNA标准品同时检测的测定结果。

图2为CMV和BKV DNA同时检测后，单独显示CMV DNA检测结果。

图3为CMV和BKV DNA同时检测后，单独显示CMV DNA检测结果。

图4为CMV和BKV DNA梯度浓度标准品测定值的两条标准曲线。

图5为CMV和BKV DNA同时检测后，单独显示CMV DNA检测标准曲线。

图6为CMV和BKV DNA同时检测后，单独显示BKV DNA检测标准曲线。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1

一种用于对CMV和BKV DNA进行定量检测的一组引物和探针。包括一对针对CMV的引物包括上游引物SEQ ID NO.1和下游引物SEQ ID NO.2及一条探针SEQ ID NO.3；和一对针对BKV的引物包括上游引物SEQ ID NO.4和下游引物SEQ ID NO.5，及一条探针SEQ ID NO.6。SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.6可标记不同的荧光染料用于定量检测。

实施例2

一种配套此方法检测CMV和BKV DNA的标准品，同时含CMV、BKV两种测定目的DNA片段SEQ ID NO.9的纯化质粒。制备过程通过对CMV和BKV DNA扩增后获得目的片段并连接于T载体。用SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11引物对CMV DNA进行次扩增，程序为95℃2min；94℃20sec，60℃30sec，72℃30sec共35个循环，条件为200nM引物、Taq酶50U/mL、100μM dNTPs、20mM Tris-HCl、20mM KCl、10mM(NH₄)₂SO₄、2mM MgSO₄。通过以上方法获得CMV目的DNA片段。对BKV DNA进行PCR扩增，采用SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13引物进行扩增，程序为95℃2min；94℃20sec，60℃30sec，72℃30sec共35个循环，条件为200nM引物、Taq酶50U/mL、100μM dNTPs、20mM Tris-HCl、20mM KCl、10mM(NH₄)₂SO₄、2mM MgSO₄。通过以上方法获得BKV的目的DNA片段。经BamH I内切酶在37℃，酶切CMV和BKV的PCR产物2.5小时(CMV和BKV PCR产物各10μL、10×Tango缓冲液4μL、BamH I内切酶2μL、水14μL)，酶切产物经过PCR产物纯化柱纯化获得20μL酶切产物。酶切产物再经T4连接酶22℃反应12小时(酶切产物5μL、T4连接酶1μL、10×缓冲液1μL、水3μL)连接CMV和BKV靶DNA片段，再经PCR产物纯化柱纯化获得10μL的连接产物。此产物再经 SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.13引物进行扩增，程序为95℃2min；94℃20sec，60℃30sec，72℃30sec共30个循环，再72℃延伸5min；反应条件为引物浓度为200nM、Taq酶50U/mL、100μM dNTPs、20mM Tris-HCl、20mM KCl、10mM(NH₄)₂SO₄、2mM MgSO₄。将最后一次PCR产物经纯化后连接到T载体上(纯化的PCR产物5μL、T4连接酶1μL、T载体1μL、10×缓冲液1μL、水2μL)，随后通过标准的基因工程技术，进行筛选、扩增和纯化。并通过对质粒进行DNA测序证实CMV和BKV目的DNA片段已经共同被连接于质粒载体。对纯化质粒进行260nM的吸光度检测，计算质粒的拷贝数。

实施例3

一种对CMV和BKV的DNA进行定量检测的试剂盒，由下列试剂组成：

试剂A：由针对CMV、BKV的引物和探针混合组成250μL溶液。溶液包含5μM SEQ ID N0.1、5μM SEQ ID NO.2、5μM SEQ ID NO.4、5μM SEQ ID NO.5和2μM探针SEQ ID NO.3、2μM探针SEQ ID NO.6；

试剂C：5U/μL Taq DNA聚合酶；

试剂E：阴性对照(无CMV、BKV感染的正常人DNA)；

试剂G：阳性对照(采用5E4的标准品)。

实施例4

用本发明试剂盒进行实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测。首先，按实验的标本个数计算各试剂的需要量，实验步骤如下：

1.需要进行5个标准品和标本的复孔检测外，还需检测阴性对照和阳性对照。

2.按如顺序和数量配置反应液：

加入水790μL、试剂A 100μL、试剂B 100μL、试剂C 10μL共900μL，可进行20个反应孔的实验。

3.混匀上述反应液后，每次吸取45μL分别加入20孔的PCR反应管。

4.各管按顺序加入5μL的5E3、5E4、5E5、5E6、5E7标准品、标本、阴性对照、阳性对照(如下)。

5.盖好盖子后放入荧光定量PCR仪进行检测。程序设计为：95℃2min；94℃10sec，60℃1min共45个循环；荧光信号值在60℃度检测。

6.结果计算：通过荧光定量PCR仪的分析软件，记录不同标准品的Ct值并绘制标准曲线，通过标准曲线计算各样本的CMV和BKV的DNA拷贝数。通过阴性对照和阳性对照进行实验的控制。

Claims

1.用于对巨细胞病毒和BK病毒脱氧核糖核酸片段同时进行定量检测的一组核酸，其为引物和探针，其特征是，

一对针对巨细胞病毒的引物，其包括上游引物SEQ ID NO.1和下游引物SEQ ID NO.2；

及一条探针SEQ ID NO.3；

和一对针对BK病毒的引物，其包括上游引物SEQ ID NO.4和下游引物SEQ ID NO.5；

及一条探针SEQ IDNO.6。

2.一种用于对巨细胞病毒和BK病毒的DNA同时进行定量检测的试剂盒，其特征包括，其由下述试剂组成：

试剂A：由针对巨细胞病毒、BK病毒的引物和探针混合组成的250μL溶液，所述溶液包含5μM SEQ ID NO.1、5μM SEQ ID NO.2、5μM SEQ ID NO.4、5μM SEQ ID NO.5和2μM探针SEQ ID NO.3以及2μM探针SEQ ID NO.6；

试剂B：由250μL缓冲液组成，所述缓冲液包含包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP的1mM dNTPs、200mMTris-HCl、200mM KCl、100mM(NH₄)₂SO₄和45mM MgSO₄；

试剂C：5U/μL Taq DNA聚合酶；

试剂D：制备的经过梯度稀释达到5×10⁷拷贝/mL、5×10⁶拷贝/mL、5×10⁵拷贝/mL、5×10⁴拷贝/mL、5×10³拷贝/mL的标准品，其用于标准曲线的制定；

试剂E：阴性对照，其为无巨细胞病毒、BK病毒感染的正常人DNA；和

试剂G：阳性对照，其为采用经过梯度稀释达到5×10⁴拷贝/mL的标准品。