CN110669827A - 一种核酸等温扩增产物的微悬臂生物传感检测方法 - Google Patents

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CN110669827A CN201911004143.9A CN201911004143A CN110669827A CN 110669827 A CN110669827 A CN 110669827A CN 201911004143 A CN201911004143 A CN 201911004143A CN 110669827 A CN110669827 A CN 110669827A
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雷荣
陈乃中
吴品珊
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Abstract

本发明公开了一种核酸等温扩增产物的微悬臂生物传感检测方法。本发明的检测方法包括如下步骤：(1)采用等温扩增目标核酸的引物对对目标样品的基因组DNA进行RPA扩增，得到RPA产物；(2)将捕获探针修饰的金纳米粒子与RPA产物反应，得到连接金纳米粒子的RPA产物；(3)将连接金纳米粒子的RPA产物加入链霉亲和素修饰的微悬臂芯片中，使其特异性的吸附在所述微悬臂芯片的微悬臂梁上，根据微悬臂梁的共振频率变化判断待测样品中是否含有目标核酸。本发明的检测方法具有快速、准确、灵敏的优点，在植物、动物组织、农产品、食品等中的目标核酸检测方面具有良好的应用前景。

Description

一种核酸等温扩增产物的微悬臂生物传感检测方法
技术领域
本发明涉及植物、动物、农产品、食品质量安全分子检测技术领域，具体涉及一种核酸等温扩增产物的微悬臂生物传感检测方法。
背景技术
分子检测技术是一种以植物、动物、微生物中核酸为分析目标的检测技术，克服了传统组织切片、形态鉴定、微生物菌落培养等灵敏度低、特异性差、成本高、耗时长等缺点。目前主要的分子检测技术有聚合酶链式反应(PCR)、实时荧光定量PCR、数字PCR、环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、重组酶介导等温扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)、链置换扩增(Strand DisplacementAmplification，SDA)、滚环扩增技术(Rolling Circle Amplification，RCA)、转录介导扩增技术(Transcription Mediated Amplification，TMA)、交叉引物扩增(Cross PrimingAmplification，CPA)、基因芯片技术等，具有快速、精准、灵敏度高、特异性强、高通量等优点，已经广泛应用于生物鉴定、转基因成分、物种鉴定等检测领域。
尽管以上分子检测技术的扩增原理有所不同，但都需要在引物的引导和脱氧核糖核苷酸(dNTP)的参与下进行百万倍扩增；扩增反应在1-2小时内选择性地放大特定的DNA片段，扩增产物可通过多种方式进行检测。普通PCR的产物可用凝胶电泳进行检测；实时荧光定量PCR则在反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析，具有定量分析、通量高、自动化程度高的特点，已成为分子检测的金标准，但这类仪器检测灵敏度通常在1000个核酸分子拷贝数以上，仪器价格也比较昂贵。等温扩增技术如LAMP针对靶基因的6个区域设计4条特异的引物，利用链置换DNA聚合酶在63℃左右恒温反应90min左右，反应产生大量的焦磷酸根可与镁离子反应产生焦磷酸镁沉淀，该沉淀与DNA模板的量成正比，因此可根据反应溶液的浊度来计算DNA模板量。也可采用SYBR Green等可与双链DNA结合的染料变色法来判断结果，但浊度法和荧光染料颜色法的灵敏度低，且假阳性率高。重组酶介导等温扩增(RPA)所需的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶在常温下有活性，在常温37℃-42℃就可对目标核酸进行扩增。而且通过修饰引物和特定探针，得到的产物可用凝胶电泳或荧光法或侧向流试纸条法检测。尽管RPA扩增效率高，但是现存的检测方法有其固有的局限性，使得总体检测灵敏度还有待提高。
微悬臂传感器(Microcantilever sensor)是在原子力显微镜(Atomic forcemicroscope，AFM)的基础上发展起来的一种技术。在实验中，探针分子被修饰在微悬臂梁的表面。当目标分子与探针分子在微悬臂表面发生生化反应时，其表面应力会发生变化，从而导致微悬臂发生弯曲变形，可通过光学或者电学方法来检测这种弯曲变形。相比于传统的传感技术，微悬臂生物传感器(Microcantilever biosensor)具有灵敏度高、响应速度快、重现性好、无须标记和实时监测等优点，已成为当前传感器领域检测分子、细菌、病毒和蛋白质等的研究新热点，具有非常好的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种核酸等温扩增产物的微悬臂生物传感检测方法及其在检测待测样品中是否含有目标核酸中的应用。
为了实现上述目的，本发明首先提供了用于检测目标核酸的成套试剂。
本发明提供的成套试剂由P1、P2和P3组成：
P1：用于等温扩增目标核酸的引物对；
P2：捕获探针修饰的金纳米粒子；
P3：链霉亲和素修饰的微悬臂芯片；
所述用于等温扩增目标核酸的引物对由正向引物和反向引物组成；
所述正向引物、所述反向引物和所述捕获探针均为单链DNA分子；
所述正向引物自5’至3’依次包括DNA片段甲和DNA片段乙；所述DNA片段甲与所述捕获探针或其部分片段互补；
所述反向引物的5'末端修饰生物素；
所述捕获探针的3'末端修饰巯基(修饰巯基的目的是与金纳米粒子结合)。
上述成套试剂中，所述DNA片段乙与所述反向引物用于扩增目标核酸(靶序列)，得到RPA产物。所述RPA产物的一端连接所述DNA片段甲，另一端修饰生物素。由于金纳米粒子表面修饰捕获探针，而所述捕获探针可与所述RPA产物一端连接的DNA片段甲互补，因此金纳米粒子可通过捕获探针与DNA片段甲的互补配对连接在RPA产物上，得到连接金纳米粒子的RPA产物。又由于微悬臂芯片表面修饰链霉亲和素，而RPA产物一端修饰生物素，可通过链霉亲和素与生物素的相互作用，使连接金纳米粒子的RPA产物特异性的被微悬臂芯片上的微悬臂捕获。所述成套试剂的功能为检测待测样品中的目标核酸。
上述成套试剂中，所述DNA片段甲的大小可为10-20bp；进一步的，所述DNA片段甲的大小可为10-15bp；更进一步的，所述DNA片段甲的大小为10bp。
所述DNA片段乙的大小可为30-35bp；进一步的，所述DNA片段乙的大小可为30-33bp；更进一步的，所述DNA片段乙的大小为32bp。
所述反向引物的大小可为30-35bp；进一步的，所述反向引物的大小可为30-33bp；更进一步的，所述反向引物的大小为32bp。
所述捕获探针的大小可为10-16bp；进一步的，所述捕获探针的大小可为13-16bp；更进一步的，所述捕获探针的大小为16bp。
所述目标核酸的大小可为100-400bp；进一步的，所述目标核酸的大小可为100-200bp；更进一步的，所述目标核酸的大小为131bp。
在本发明的一个具体实施例中，所述正向引物如SEQ ID NO.1所示。所述反向引物如SEQ ID NO.2所示。所述捕获探针如SEQ ID NO.3所示。
为了实现上述目的，本发明还提供了上述成套试剂的制备方法。
本发明提供的上述成套试剂的制备方法包括如下步骤：
1)合成上述引物对和捕获探针；
2)用所述捕获探针修饰金纳米粒子，制备上述捕获探针修饰的金纳米粒子；
3)用链霉亲和素修饰微悬臂芯片，制备上述链霉亲和素修饰的微悬臂芯片。
上述成套试剂的制备方法中，所述捕获探针修饰的金纳米粒子的制备方法包括如下步骤：
2-1)将步骤1)合成的捕获探针与二硫键还原剂混合，得到混合液；
2-2)将所述混合液与金纳米粒子溶液混合，反应，离心，收集沉淀，得到所述捕获探针修饰的金纳米粒子；
所述步骤2-1)中，所述二硫键还原剂可为三(2-羧乙基)膦盐酸盐。进一步的，将所述捕获探针与含有三(2-羧乙基)膦盐酸盐的Tris-HCl溶液混合，得到所述混合液。更进一步的，将20μL 100μM的捕获探针溶液与5μL含有100mM三(2-羧乙基)膦盐酸盐的Tris-HCl混合，震摇1h，得到所述混合液。
所述步骤2-2)中，所述金纳米粒子溶液中的金纳米粒子的粒径可为20nm。进一步的，将所述混合液与1mL的金纳米溶液混合，反应12h，离心，得到所述沉淀。
所述步骤2-2)后还包括将所述沉淀洗涤，分散在水溶液中的步骤。进一步的，所述洗涤的方法可为用水洗涤2次。
上述成套试剂的制备方法中，所述链霉亲和素修饰的微悬臂芯片的制备方法包括如下步骤：
3-1)将微悬臂芯片阵列表面修饰羧基，得到表面修饰羧基的微悬臂芯片阵列；
3-2)活化所述表面修饰羧基的微悬臂芯片阵列上的羧基，得到羧基活化的微悬臂芯片阵列；
3-3)将链霉亲和素溶液滴加至所述羧基活化的微悬臂芯片阵列表面，得到链霉亲和素修饰的微悬臂芯片。
所述步骤3-1)前还包括清洗微悬臂芯片阵列的步骤。进一步的，所述清洗的方法可包括如下步骤：向微悬臂芯片阵列中加入Piranha溶液(过氧化氢/硫酸＝1/3，v/v)，浸泡8分钟，然后用去离子水冲洗，氮气吹干，得到洁净的微悬臂芯片阵列。
所述步骤3-1)中，所述将微悬臂芯片阵列表面修饰羧基的方法包括如下步骤：将微悬臂芯片阵列在含有11-巯基十一烷酸的乙醇溶液中反应，得到表面修饰羧基的微悬臂芯片阵列。进一步的，将微悬臂芯片阵列在含有1mM 11-巯基十一烷酸的乙醇溶液中浸泡过夜，清洗，干燥，得到表面修饰羧基的微悬臂芯片阵列。
所述步骤3-2)中，所述活化所述表面修饰羧基的微悬臂芯片阵列上的羧基的方法可包括如下步骤：用EDC和NHS活化所述表面修饰羧基的微悬臂芯片阵列上的羧基。进一步的，将所述表面修饰羧基的微悬臂芯片阵列在含有100mM EDC和50mM NHS的MES溶液中活化羧基3h，清洗，干燥，得到羧基活化的微悬臂芯片阵列。
所述步骤3-3)的方法可包括如下步骤：将20μL 0.1mg/mL链霉亲和素溶液滴加至所述羧基活化的微悬臂芯片阵列表面，37℃温育1h或者4℃过夜。
所述步骤3-3)后还包括用BSA溶液封闭微悬臂芯片阵列表面上的非特异性吸附位点的步骤。进一步的，所述封闭的方法可包括如下步骤：将20μL 10％BSA溶液滴加至微悬臂芯片阵列表面，37℃温育0.5h。
为了实现上述目的，本发明还提供了一种用于检测目标核酸的试剂盒。
本发明提供的用于检测目标核酸的试剂盒包括上述成套试剂或按照上述成套试剂制备方法制备的成套试剂。
进一步的，所述试剂盒还可包括用于RPA扩增的试剂和/或仪器、用于检测RPA产物的试剂和/或仪器。
更进一步的，所述用于RPA扩增的试剂和/或仪器可包括再水化缓冲液(
Figure BDA0002242241000000041
Basic试剂盒)、冻干酶粉(
Figure BDA0002242241000000042
Basic试剂盒)、醋酸镁溶液(280mmol/L)。
所述用于检测RPA产物的试剂和/或仪器可包括SCALA纳米机械生物传感检测系统(该系统包括反应池、激光器、位置检测器)、注射泵。
上述成套试剂或按照上述成套试剂制备方法制备的成套试剂或上述试剂盒在检测或辅助检测待测样品中是否含有目标核酸中的应用也属于本发明的保护范围。
上述成套试剂或按照上述成套试剂制备方法制备的成套试剂或上述试剂盒在制备检测或辅助检测待测样品中是否含有目标核酸的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
为了实现上述目的，本发明最后提供了利用上述成套试剂或按照上述成套试剂制备方法制备的成套试剂检测或辅助检测待测样品中是否含有目标核酸的方法。
本发明提供的利用上述成套试剂或按照上述成套试剂制备方法制备的成套试剂检测或辅助检测待测样品中是否含有目标核酸的方法包括如下步骤：
(1)以待测样品的基因组DNA为模板，采用上述引物对进行RPA扩增，得到RPA产物；所述RPA产物一端连接有所述DNA片段甲，另一端修饰生物素；
(2)将上述捕获探针修饰的金纳米粒子与所述RPA产物反应，得到连接金纳米粒子的RPA产物；
(3)将所述连接金纳米粒子的RPA产物加入上述链霉亲和素修饰的微悬臂芯片中，使其特异性的吸附在所述微悬臂芯片的微悬臂梁上，根据微悬臂梁的共振频率变化判断待测样品中是否含有目标核酸：如果在加入待测样品前后微悬臂梁的共振频率变化值大于20Hz，则待测样品中含有或候选含有目标核酸；如果在加入待测样品前后微悬臂梁的共振频率变化值小于或等于20Hz，则待测样品中不含有或候选不含有目标核酸(此处也包括目标核酸含量极低的情况)；所述共振频率变化值＝加入待测样品后各微悬臂梁的共振频率平均值-加入待测样品前各微悬臂梁的共振频率平均值。
上述方法中，所述各微悬臂梁的共振频率可通过Mecwins公司生产的SCALA纳米机械生物传感检测系统检测获得。
上述方法中，所述RPA扩增反应体系的具体配置方法如下：将再水化缓冲液(
Figure BDA0002242241000000051
Basic试剂盒)29.5μL，正向引物(10μmol/L)2.4μL，反向引物(10μmol/L)2.4μL，DNA模板2μL，去离子水11.2μL混匀后加至含有冻干酶粉(
Figure BDA0002242241000000052
Basic试剂盒)的TwistAmp Basic反应管(
Figure BDA0002242241000000053
Basic试剂盒)中，充分溶解，再加入醋酸镁溶液(280mmol/L)2.5μL，得到RPA扩增反应体系。
所述RPA扩增反应条件具体如下：39℃条件下温育20min。
上述成套试剂或方法或试剂盒或应用或方法中，所述待测样品可为植物组织、动物组织、农产品或食品；所述目标核酸可为来源于植物、动物、微生物中的目标核酸。在本发明的具体实施例中，所述待测样品为感染茎基溃疡病菌的油菜组织；所述目标核酸来源于植物病原物油菜茎基溃疡病菌18S rRNA基因。
本发明提供了一种核酸等温扩增产物的微悬臂生物传感检测方法。通过实验证明，本发明提供的微悬臂生物传感检测方法具有快速、准确、灵敏的优点，在植物组织、动物组织、农产品、食品等中的目标核酸检测方面具有良好的应用前景。
附图说明
图1为微悬臂“光杠杆法”检测原理图。
图2为链霉亲和素修饰微悬臂芯片检测等温扩增产物的原理图。
图3为微悬臂芯片检测等温扩增产物的悬臂偏转结果。图A所进样品为不含目标核酸的RPA产物。图B所进样品为含有目标核酸的RPA产物。其中，横坐标为开始读取悬臂项端位置的时间(min)，纵坐标为悬臂反射的激光在位置检测器(PSD)上的y轴坐标(mm)。黑色代表悬臂1，红色代表悬臂2，蓝色代表悬臂3，粉色代表悬臂4，绿色代表悬臂5。
图4为微悬臂芯片检测等温扩增产物的共振频率变化图。图A所进样品为不含目标核酸的RPA产物；图B所进样品为含有目标核酸的RPA产物。其中，横坐标为动态模式下的振动频率(Hz)，纵坐标为悬臂振幅(au)。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的三(2-羧乙基)膦盐酸盐[Tris(2-carboxyethyl)phosphinehydrochloride，TCEP]是Sigma-Aldrich的产品，货号为C4706；11-巯基十一烷酸(11-Mercaptoundecanoic acid，11-MUA)是Sigma-Aldrich的产品，货号为674427；金纳米溶液(粒径20nm)是沃卡威(北京)生物技术有限公司的产品，货号为MAUCN20-25M；链霉亲和素溶液是索莱宝科技有限公司的产品，货号为S9170；N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)是Sigma-Aldrich的产品，货号为E6383；N-羟基丁二酰亚胺(NHS)是Sigma-Aldrich的产品，货号为56480；微悬臂芯片阵列是德国Micromotive公司的产品，货号为Octosensis，具体参数如下：长500μm，宽90μm，厚1.0μm；TwistAmpTM basic试剂盒是TwistDx公司的产品，货号为TABAS03KIT。
实施例1、核酸等温扩增产物的微悬臂生物传感检测试剂盒及其检测方法
一、核酸等温扩增产物的微悬臂生物传感检测试剂盒
本发明的核酸等温扩增产物的微悬臂生物传感检测试剂盒包括引物、捕获探针、金纳米粒子及微悬臂芯片。设计原则具体如下：
1、引物的设计
针对目标核酸，结合核酸等温扩增方法，设计用于等温扩增目标核酸(靶序列)的引物对，该引物对由正向引物和反向引物组成；该引物对的目标核酸(靶序列)大小可为100-400bp。
正向引物自5’至3’依次包括大小为10-20bp的DNA片段甲和大小为30-35bp的DNA片段乙。
反向引物5'末端修饰生物素。
所述DNA片段甲与捕获探针或其部分片段互补，所述DNA片段乙与大小为30-35bp的反向引物用于扩增目标核酸(靶序列)，得到RPA产物，所述RPA产物的一端连接DNA片段甲，另一端修饰生物素。
2、捕获探针的设计
捕获探针或其部分片段与所述RPA产物一端连接的DNA片段甲互补，捕获探针大小可为10-16bp。
捕获探针的3'末端修饰巯基，使其可与金纳米粒子结合。
3、金纳米粒子的设计
金纳米粒子表面修饰所述捕获探针，由于所述捕获探针可与所述RPA产物一端连接的DNA片段甲互补，因此金纳米粒子可通过捕获探针与DNA片段甲的互补配对连接在RPA产物上。
4、微悬臂芯片的设计
微悬臂芯片表面修饰链霉亲和素，使其可通过链霉亲和素-生物素相互作用，捕获带有生物素的RPA产物。
二、核酸等温扩增产物的微悬臂生物传感检测试剂盒的检测原理与检测方法
本发明试剂盒的用途是检测待测样品中是否含有目标核酸。
本发明试剂盒的检测原理是基于光杠杆法的微悬臂生物传感检测方法。微悬臂表面的分子吸附和生物分子识别能引起悬臂的弯曲或共振频率的改变，当悬臂从初始位置弯曲，反射光在检测器上移动，移动距离由“光杠杆”来增强，激光点在检测器上的位置移动可反映悬臂的弯曲情况(图1)。同时，由于微悬臂表面的分子吸附以及由此可能引起的悬臂刚性变化，悬臂在动态模式下的共振频率也会发生改变。
本发明试剂盒的检测方法包括如下步骤：以待测样品DNA为模板，采用设计的引物对进行RPA扩增，得到特定形式的RPA产物，然后将金纳米粒子与特定形式的RPA产物反应，得到连接金纳米粒子的RPA产物，将连接金纳米粒子的RPA产物加入到链霉亲和素修饰的微悬臂芯片上，使其特异性的被微悬臂捕获，通过检测动态模式下悬臂共振频率的变化，实现待测样品中目标核酸的检测。
实施例2、核酸等温扩增产物的微悬臂生物传感检测试剂盒在检测植物病原物油菜茎基溃疡病菌中的应用
一、检测植物病原物油菜茎基溃疡病菌的试剂盒的制备
1、引物的设计与合成
根据植物病原物油菜茎基溃疡病菌18S rRNA基因，设计用于扩增18S rRNA基因的引物对，该引物对由正向引物Lm-F和反向引物Lm-R组成。扩增产物大小为131bp。
正向引物Lm-F：
5’-TACACAGCAGCCCATTTTCAAAGCACTGCCGCCTCGATCAGTGGC-3’(SEQ ID NO.1)；
反向引物Lm-R：
5’-biotin-AATTGCAAGTGGTTTTAGGGGATCCAATTGGTGGG-3’(SEQ ID NO.2)。
扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
上述正向引物Lm-F自5’至3’依次包括大小为10bp的DNA片段甲(下划线所示的序列)、大小为34bp的DNA片段乙(斜体序列)。上述反向引物Lm-R的5’末端修饰生物素。
上述DNA片段乙与上述反向引物Lm-R用于扩增靶序列，得到RPA产物。RPA产物的一端连接有大小为10bp的DNA片段甲(下划线所示的序列)，另一端修饰生物素。
人工合成上述正向引物和反向引物。
2、捕获探针的设计与合成
捕获探针Lm-GNP：5’-GCTGCTGTGTATTTTT-SH-3’(SEQ ID NO.3)；
上述捕获探针Lm-GNP中，双下划线所示的大小为10bp的片段与步骤1中正向引物Lm-F中的DNA片段甲互补配对，捕获探针Lm-GNP的3’末端修饰巯基。
人工合成上述捕获探针。
3、捕获探针修饰的金纳米粒子的制备
1)将步骤2中合成的12μL 100μM捕获探针Lm-GNP与5μL含100mM三(2-羧乙基)膦盐酸盐[Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride，TCEP]的50mM Tris-HCl(pH 7.4)混合，在室温条件下震摇1h，得到混合液。
2)将步骤1)获得的混合液加入至1mL的金纳米粒子溶液(金纳米粒子的粒径为20nm)中，在室温条件下反应16h，12000rpm离心15min，弃上清，收集沉淀。
3)将步骤2)获得的沉淀用水洗涤2次，然后将洗涤后的金纳米粒子分散在1mL水溶液中，得到捕获探针修饰的金纳米粒子，置于4℃待用。
4、链霉亲和素修饰的微悬臂芯片传感器的制备
1)将未使用的微悬臂芯片阵列置于玻璃培养皿中，加入Piranha溶液(过氧化氢/硫酸＝1/3，v/v)，浸泡8分钟，然后用去离子水冲洗，氮气吹干，得到洁净的微悬臂芯片阵列。
2)将步骤1)获得的洁净的微悬臂芯片阵列放入含1mM 11-巯基十一烷酸(11-Mercaptoundecanoic acid，11-MUA)的乙醇溶液中浸泡过夜，取出后依次用乙醇溶液和水清洗，用氮气干燥，得到表面修饰羧基的微悬臂芯片阵列。
3)将步骤2)获得的表面修饰羧基的微悬臂芯片阵列置于含100mM EDC和50mM NHS的50mM MES(pH 5.5)溶液中活化羧基3h，然后用50mM MES(pH 5.5)洗3次，再用水洗后氮气干燥，得到羧基活化的微悬臂芯片阵列。
4)将20μL 0.1mg/mL链霉亲和素溶液滴加至步骤3)获得的羧基活化的微悬臂芯片阵列表面，在37℃恒温下温育1h(或者在4℃条件下过夜)，取出用PBS冲洗，然后将20μL10％BSA溶液滴加至微悬臂芯片阵列表面，在37℃恒温下温育0.5h，以封闭微悬臂芯片阵列表面上非特异性吸附位点，取出后用蒸馏水洗净，制成链霉亲和素修饰的微悬臂芯片传感器。
二、植物病原物油菜茎基溃疡病菌的检测方法
1、油菜茎基溃疡病菌的RPA扩增
提取感染茎基溃疡病菌的油菜组织的基因组DNA，准确测量其浓度后，逐级稀释至1.06×10-4ng/μL，得到模板浓度为1.06ng/μL和1.06×10-4ng/μL的溶液，并以此为扩增模板，采用步骤一中的引物Lm-F和引物Lm-R进行RPA扩增，得到RPA产物(含有目标核酸)。同时以水作为模板进行RPA扩增，得到RPA产物(不含目标核酸)。
RPA扩增反应体系的配置方法如下：将再水化缓冲液(
Figure BDA0002242241000000091
Basic试剂盒自带)29.5μL，引物Lm-F(10μmol/L)2.4μL，引物Lm-R(10μmol/L)2.4μL，DNA模板2μL，去离子水11.2μL混匀后加至含有冻干酶粉(
Figure BDA0002242241000000092
Basic试剂盒自带)的TwistAmp Basic反应管(Basic试剂盒自带)中，充分溶解，再加入醋酸镁溶液(280mmol/L)2.5μL，得到RPA扩增反应体系。
RPA扩增反应条件如下：39℃条件下温育20min。
2、连有金纳米粒子的RPA产物的制备
取10μL步骤1获得的RPA产物与5μL捕获探针修饰的金纳米粒子溶液混合，再加入20μL PBS缓冲溶液(pH 7.5)在37℃条件下温育30min，得到连有金纳米粒子的RPA产物。
3、RPA产物检测
RPA产物检测所使用的仪器包括Mecwins公司生产的SCALA纳米机械生物传感检测系统(该系统包括反应池、激光器、位置检测器)，harvard公司生产的注射泵(70-3007)。具体检测步骤如下：
1)将链霉亲和素修饰的微悬臂芯片固定在控温37℃的反应池中，加入PBS缓冲液，排除反应池中的气泡。
2)调节激光器、反应池与位置检测器(PSD)的位置，使激光照射在微悬臂芯片阵列位置。
3)设置注射泵的流速为30μL/min，推动PBS缓冲液，测量各微悬臂梁的偏转数据和共振频率。当检测到的各微悬臂梁实时曲线趋于稳定后，通过六通阀在流路中加入20μL连有金纳米粒子的RPA产物，以30μL/min的流速注入，实时采集和记录各微悬臂梁的偏转数据及共振频率。
4)提取出各微悬臂梁的偏转信息和共振频率变化，分析实验数据。各微悬臂梁的偏转结果如图3所示，共振频率变化图如图4所示。如果在加入待测样品前后的共振频率变化值大于20Hz，则待测样品中含有目标核酸；如果在加入待测样品前后的振频率变化值小于或等于20Hz，则待测样品中不含有目标核酸。
共振频率变化值＝加入待测样品后各微悬臂梁的共振频率平均值-加入待测样品前各微悬臂梁的共振频率平均值。
结果表明：加入不含目标核酸的RPA产物前，各微悬臂梁的共振频率平均值为5.198kHz，加入不含目标核酸的RPA产物后，各微悬臂梁的共振频率平均值为5.218kHz，故阴性对照(水)的RPA产物引起的各微悬臂梁共振频率变化值为20Hz。加入含0.212pg目标核酸的RPA产物前，各微悬臂梁的共振频率平均值为7.87kHz，加入含0.212pg目标核酸的RPA产物后，各微悬臂梁的共振频率平均值为7.94kHz，故0.212pg目标核酸的RPA产物引起的各微悬臂梁共振频率变化值为70Hz。加入含2.12ng目标核酸的RPA产物前，各微悬臂梁的共振频率平均值为7.5kHz，加入含2.12ng目标核酸的RPA产物后，各微悬臂梁的共振频率平均值为7.7kHz，故2.12ng目标核酸的RPA产物引起的各微悬臂梁共振频率变化值为200Hz。
根据此共振频率的变化，本发明方法可以检测到0.212pg油菜茎基溃疡病菌基因组DNA。比发明CN 101805793A“油菜茎基溃疡病菌的实时荧光PCR检测方法及检测用引物和探针”提供的检测灵敏度为4pg油菜茎基溃疡病菌基因组DNA，低了近19倍。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110>中国检验检疫科学研究院
<120>一种核酸等温扩增产物的微悬臂生物传感检测方法
<160>4
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>1
tacacagcag cccattttca aagcactgcc gcctcgatca gtggc 45
<210>2
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>2
aattgcaagt ggttttaggg gatccaattg gtggg 35
<210>3
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>3
gctgctgtgt attttt 16
<210>4
<211>131
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>4
cccattttca aagcactgcc gcctcgatca gtggcggcag tctactttga ttctgcccat 60
gttttttgcg tactatttgt ttccttggtg ggcttgccca ccaattggat cccctaaaac 120
cacttgcaat t 131

Claims (10)

1.成套试剂，由P1、P2和P3组成：
P1：用于等温扩增目标核酸的引物对；
P2：捕获探针修饰的金纳米粒子；
P3：链霉亲和素修饰的微悬臂芯片；
所述用于等温扩增目标核酸的引物对由正向引物和反向引物组成；
所述正向引物、所述反向引物和所述捕获探针均为单链DNA分子；
所述正向引物自5’至3’依次包括DNA片段甲和DNA片段乙；所述DNA片段甲与所述捕获探针或其部分片段互补；
所述反向引物的5'末端修饰生物素；
所述捕获探针的3'末端修饰巯基。
2.根据权利要求1所述的成套试剂，其特征在于：
所述DNA片段甲的大小为10-20bp；
所述DNA片段乙的大小为30-35bp；
所述反向引物的大小为30-35bp；
所述捕获探针的大小为10-16bp；
所述目标核酸的大小为100-400bp。
3.根据权利要求1或2所述的成套试剂，其特征在于：
所述正向引物如SEQ ID NO.1所示；
所述反向引物如SEQ ID NO.2所示；
所述捕获探针如SEQ ID NO.3所示；
所述目标核酸的大小为131bp。
4.权利要求1-3任一所述的成套试剂的制备方法，包括如下步骤：
1)合成权利要求1-3中任一所述的引物对和捕获探针；
2)用所述捕获探针修饰金纳米粒子，制备得到权利要求1-3中任一所述的捕获探针修饰的金纳米粒子；
3)用链霉亲和素修饰微悬臂芯片，制备得到权利要求1-3中任一所述的链霉亲和素修饰的微悬臂芯片。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述捕获探针修饰的金纳米粒子的制备方法包括如下步骤：
2-1)将步骤1)合成的捕获探针与二硫键还原剂混合，得到混合液；
2-2)将所述混合液与金纳米粒子溶液混合，反应，离心，收集沉淀，得到所述捕获探针修饰的金纳米粒子；
所述链霉亲和素修饰的微悬臂芯片的制备方法包括如下步骤：
3-1)将微悬臂芯片阵列表面修饰羧基，得到表面修饰羧基的微悬臂芯片阵列；
3-2)活化所述表面修饰羧基的微悬臂芯片阵列上的羧基，得到羧基活化的微悬臂芯片阵列；
3-3)将链霉亲和素溶液滴加至所述羧基活化的微悬臂芯片阵列表面，得到链霉亲和素修饰的微悬臂芯片。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：
所述步骤2-1)中，将所述捕获探针与含有三(2-羧乙基)膦盐酸盐的Tris-HCl溶液混合，得到混合液；
所述步骤2-2)中，所述金纳米粒子溶液中的金纳米粒子的粒径为20nm；
所述步骤2-2)后还包括将所述沉淀洗涤，分散在水溶液中的步骤。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：
所述步骤3-1)前还包括清洗微悬臂芯片阵列的步骤；
所述步骤3-1)中，将微悬臂芯片阵列在含有11-巯基十一烷酸的乙醇溶液中反应，得到表面修饰羧基的微悬臂芯片阵列；
所述步骤3-2)中，用EDC和NHS活化所述表面修饰羧基的微悬臂芯片阵列上的羧基；
所述步骤3-3)后还包括用BSA溶液封闭微悬臂芯片阵列表面上的非特异性吸附位点的步骤。
8.一种用于检测目标核酸的试剂盒，其包括权利要求1-3任一所述的成套试剂或按照权利要求4-7任一所述的方法制备的成套试剂。
9.权利要求1-3任一所述的成套试剂或按照权利要求4-7任一所述的方法制备的成套试剂或权利要求8所述的试剂盒在检测或辅助检测待测样品中是否含有目标核酸中的应用；
或，权利要求1-3任一所述的成套试剂或按照权利要求4-7任一所述的方法制备的成套试剂或权利要求8所述的试剂盒在制备检测或辅助检测待测样品中是否含有目标核酸的产品中的应用。
10.利用权利要求1-3任一所述的成套试剂或按照权利要求4-7任一所述的方法制备的成套试剂检测或辅助检测待测样品中是否含有目标核酸的方法，包括如下步骤：
(1)以待测样品的基因组DNA为模板，采用权利要求1-3中任一所述的引物对进行RPA扩增，得到RPA产物；所述RPA产物一端连接有所述DNA片段甲，另一端修饰生物素；
(2)将权利要求1-3中任一所述的捕获探针修饰的金纳米粒子与所述RPA产物反应，得到连接金纳米粒子的RPA产物；
(3)将所述连接金纳米粒子的RPA产物加入权利要求1-3中任一所述的链霉亲和素修饰的微悬臂芯片中，使其特异性的吸附在所述微悬臂芯片的微悬臂梁上，根据微悬臂梁的共振频率变化判断待测样品中是否含有目标核酸：如果在加入待测样品前后微悬臂梁的共振频率变化值大于20Hz，则待测样品中含有或候选含有目标核酸；如果在加入待测样品前后微悬臂梁的共振频率变化值小于或等于20Hz，则待测样品中不含有或候选不含有目标核酸；所述共振频率变化值＝加入待测样品后各微悬臂梁的共振频率平均值-加入待测样品前各微悬臂梁的共振频率平均值。
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