CN116606962A - 一种基于crispr技术的荧光可视化病毒核酸检测试剂盒及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于CRISPR技术的荧光可视化病毒核酸检测试剂盒及其制备方法和应用，该试剂盒包括识别模块和信号模块；所述识别模块为利用CRISPR技术构建的基因编辑探针，包括针对病毒核酸靶标的介导crRNA和Cas蛋白，其中介导crRNA具有靶向病毒核酸的序列，可以预先与Cas蛋白孵育获得Cas‑crRNA复合物，用于识别病毒核酸靶标；所述信号模块为利用荧光标记的单链核酸修饰的磁珠构建的磁性探针，由磁珠及在磁珠表面修饰的利用荧光标记的单链核酸组成，切割后会释放荧光，用于荧光信号的输出。本发明的试剂盒可实现对病毒核酸的即时、快速、准确、经济检测。
Description
技术领域
本发明属于荧光生物传感及核酸检测技术领域，具体涉及一种基于CRISPR技术的荧光可视化病毒核酸检测试剂盒及其制备方法和应用。
背景技术
CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)是原核生物基因组内的一段重复序列，是生命进化历史上，细菌和病毒进行斗争产生的免疫武器，简单说就是病毒能把自己的基因整合到细菌，利用细菌的细胞工具为自己的基因复制服务，细菌为了将病毒的外来入侵基因清除，进化出CRISPR系统，利用这个系统，细菌可以把病毒基因从自己的基因组上切除，这是细菌特有的免疫系统，是古菌和细菌抵抗病毒等外源遗传物质入侵的一种获得性免疫系统。作为一种适应性免疫系统，CRISPR/Cas系统使用crRNA引导的核酸酶切割外源基因元件。
在crRNA引导的DNA/RNA结合后，Cas蛋白表现出对靶标DNA/RNA特异性切割和对邻近DNA/RNA非特异性切割能力，Cas蛋白的侧式切割活性已适用于检测用于疾病诊断的序列特异性DNA/RNA。相比于PCR技术，利用CRISPR技术检测病毒核酸在反应时间和操作成本方面具有显著优势。
对于CRISPR技术而言，实现复杂实际样本中信号的放大存在难点。单链DNA/RNA修饰信号分子数量有限且稳定性和抗干扰能力差，在复杂基质中难以被识别且易于降解，导致低信噪比。因此现有技术中检测病毒核酸的检测方案普遍存在耗时长、受大型仪器限制、有条件限制、操作复杂、信噪比低等缺点。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种基于CRISPR技术的荧光可视化病毒核酸检测试剂盒及其制备方法和应用，可用于病毒核酸检测，实现对病毒核酸的即时、快速、准确、经济检测。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种基于CRISPR技术的荧光可视化病毒核酸检测试剂盒，包括识别模块和信号模块；所述识别模块为利用CRISPR技术构建的基因编辑探针，用于识别病毒核酸靶标；所述信号模块为利用荧光标记的单链核酸修饰的磁珠构建的磁性探针，用于荧光信号的输出；
所述基因编辑探针包括针对病毒核酸靶标的介导crRNA和Cas蛋白，所述介导crRNA预先与所述Cas蛋白孵育获得Cas-crRNA复合物，作为识别模块；
所述介导crRNA具有靶向病毒核酸的序列；所述Cas蛋白为Cas12a、Cas13、Cas14；
所述磁性探针是由磁珠及在磁珠表面修饰的利用荧光标记的单链核酸组成，切割后会释放荧光，作为信号模块。
优选地，所述病毒核酸为非洲猪瘟病毒ASFV，具有如SEQ ID No.1-2所示的序列；所述介导crRNA具有如SEQ ID No.3所示的序列。
优选地，所述病毒核酸为新型布尼亚病毒SFTSV，具有如SEQ ID No.5-6所示的序列；所述介导crRNA具有如SEQ ID No.7所示的序列。
优选地，所述磁珠是由链霉亲和素或羧基包覆的，其粒径为10nm～2μm；所述荧光标记的单链核酸长度为5nt以上。
优选地，所述Cas-crRNA复合物浓度为10nM～1μM；当所述Cas蛋白为Cas12a或Cas14时，所述荧光标记的单链核酸为荧光标记的单链DNA；当所述Cas蛋白为Cas13时，所述荧光标记的单链核酸为荧光标记的单链RNA；所述荧光标记的单链核酸的浓度为10～3000nM。
优选地，所述荧光标记的单链核酸，其一端连有生物素或氨基，能够使荧光标记的单链核酸连接到链霉亲和素或羧基修饰的磁珠上，其另一端修饰有荧光基团；所述荧光基团为近红外二区荧光分子、上转换粒子、量子点、罗丹明、花菁染料、金纳米簇、含芳香烃/杂环结构的荧光团中的一种。
一种基于CRISPR技术的荧光可视化病毒核酸检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
步骤1)利用CRISPR/Cas技术构建识别模块Cas-crRNA复合物：首先针对病毒核酸靶标的基因序列设计与之互补的crRNA，再将Cas蛋白与crRNA以浓度比1:1混合于1×NEBuffer 2.1中，在室温下孵育10min，获得Cas-crRNA复合物作为识别模块；
步骤2)将荧光标记的单链核酸通过生物素-链霉亲和素作用或氨羧缩合作用组装到磁珠的表面，通过磁分离去除多余的荧光标记的单链核酸，并对组装后的磁珠进行清洗和重新分散，构建信号模块，实现对荧光分子的富集；
步骤3)将步骤1)所得识别模块与步骤2)所得信号模块组成试剂盒，即得。
优选地，步骤2)所述将荧光标记的单链核酸通过生物素-链霉亲和素作用或氨羧缩合作用组装到磁珠的表面，具体步骤包括以下两种方案：
方案(A)：将生物素化的荧光标记的单链核酸和链霉亲和素修饰的磁珠在连接缓冲液中混合，并对组装后的磁珠进行清洗，去除多余的荧光标记的单链核酸，将得到的磁珠分散在DEPC水中储存，即得；
所述连接缓冲液为：10mM Tris-HCl，2M NaCl，1mM EDTA，pH＝7.4；
或方案(B)：将羧基修饰的磁珠稀释在MES缓冲液中，继续加入体积比例为2:1的EDC缓冲液和NHS缓冲液，并在45℃下反应6h，随后用PBS缓冲液洗涤三次，加入氨基修饰的荧光标记的单链核酸，并在37℃下孵育1h，反应完之后得到的磁珠分散在DEPC水中，即得；
所述MES缓冲液为：100mM MES，pH＝6.0；
所述EDC缓冲液为：100mM MES，200mM EDC，pH＝6.0；
所述NHS缓冲液为：100mM MES，100mM NHS，pH＝6.0；
所述PBS缓冲液为：10mM PBS，pH＝7.2。
上述的荧光可视化病毒核酸检测试剂盒，或上述制备方法制得的荧光可视化病毒核酸检测试剂盒在非疾病诊断目的的病毒核酸检测中的应用。
优选地，非疾病诊断目的的病毒核酸检测包括以下步骤：
将识别模块与信号模块混合，向其中加入待测样本进行反应，在25～43℃下反应5～30min后，通过磁分离，收集上清液，检测荧光信号，产生荧光信号则为阳性。
本发明的有益效果如下：
(1)本发明采用荧光标记的单链核酸修饰的磁珠构建的磁性探针作为识别模块，磁珠具有优异的高比表面积、良好的分子富集特性及快速分离特性，在即时传感器的构建中独具优势。
(2)基于荧光检测装置测量荧光标记物是生物传感器中最灵敏的策略之一，本发明通过荧光修饰技术设计核酸探针，通过蓝光灯激发即可实现对病原体核酸的现场即时检测。
(3)本发明利用Cas蛋白正式切割和侧式切割作用，切割磁性探针，背景信号低，可以有效提高检测灵敏度和信噪比。
(4)本发明操作简单，检测时间短，反应条件温和，可以检测包括非洲猪瘟病毒核酸在内的多种核酸靶标，通用性好，在病毒检测和即时检测中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为基于CRISPR技术的荧光可视化病毒核酸检测试剂盒的工作原理示意图；
图2为实施例2中试剂盒对目标病毒核酸(ASFV)检测荧光信号强度；
图3为实施例3中试剂盒对目标病毒核酸(SFTSV)检测荧光信号强度；
图4为实施例4中试剂盒在不同反应时间里检测能力的测试结果；
图5为实施例5中试剂盒在不同目标核酸浓度下检测能力的测试结果；
图6为实施例6中试剂盒在不同温度下检测能力的测试结果；
图7为实施例7中试剂盒针对不同种类的病毒核酸特异性检测效果。
具体实施方式
下面结合附图与实施例对本发明做进一步详细说明，以下实施例中所涉及的原料和试剂如无特殊说明，均为市售可得。
实施例1
一种基于CRISPR技术的荧光可视化病毒核酸检测试剂盒，包括识别模块和信号模块；所述识别模块为利用CRISPR技术构建的基因编辑探针，用于识别病毒核酸靶标；所述信号模块为利用荧光标记的单链核酸修饰的磁珠构建的磁性探针，用于荧光信号的输出。
所述基因编辑探针包括针对病毒核酸靶标的介导crRNA和Cas蛋白，介导crRNA预先与Cas蛋白孵育获得Cas-crRNA复合物，作为识别模块。介导crRNA具有靶向病毒核酸的序列；Cas蛋白为Cas12a、Cas13、Cas14。当Cas蛋白为Cas12a或Cas14时，荧光标记的单链核酸为荧光标记的单链DNA；当Cas蛋白为Cas13时，所述荧光标记的单链核酸为荧光标记的单链RNA。
所述磁性探针是由磁珠及在磁珠表面修饰的利用荧光标记的单链核酸组成，切割后会释放荧光，作为信号模块。所述磁珠是由链霉亲和素或羧基包覆的，其粒径为10nm～2μm，优选为1μm；所述荧光标记的单链核酸长度为5nt以上，优选为10nt以上。
所述荧光标记的单链核酸，其一端连有生物素或氨基，能够使荧光标记的单链核酸连接到链霉亲和素或羧基修饰的磁珠上，其另一端修饰有荧光基团；所述荧光基团为近红外二区荧光分子、上转换粒子、量子点、罗丹明、花菁染料、金纳米簇、含芳香烃/杂环结构的荧光团中的一种。
本发明试剂盒的原理如图1所示。对于目标病毒核酸，靶标与Cas-crRNA复合物反应，形成Cas-crRNA-target三元复合物，激活Cas蛋白侧式切割活性，对磁珠上修饰的荧光标记的单链核酸进行快速切割，磁分离后上清液产生荧光信号。当没有目标核酸时，Cas-crRNA复合物与其不发生界面切割反应，则磁分离时荧光标记的单链核酸随磁珠一同被分离，磁分离后上清液不产生荧光信号。
本实施例以非洲猪瘟病毒ASFV核酸为靶标进行研究，制备上述的基于CRISPR技术的荧光可视化病毒核酸检测试剂盒，具体制备过程如下：
(1)针对非洲猪瘟病毒ASFV特征性目标核酸序列，设计crRNA-ASFV。该crRNA可以与Cas12a室温下孵育形成Cas12a-crRNA复合物。
目标核酸是由互补配对的TS和NTS组成的DNA双链，分别具有如SEQ ID NO.1-2所示的序列，具体为：
TS(SEQ ID NO.1)：5’-TTCATGATTTGCACAAGCCGCACCAAAGCAA-3’；
NTS(SEQ ID NO.2)：5’-TTGCTTTGGTGCGGCTTGTGCAAATCATGAA-3’。
所述crRNA-ASFV具有如SEQ ID NO.3所示的序列，具体为：
5’-UAAUU UCUAC UAAGU GUAGA UGUGC GGCUU GUGCA AAUCA UGAA-3’。
(2)将1μL 1μM Cas12a，1μL 1μM crRNA-ASFV，2μL 10×NEBuffer 2.1加入到13.2μL DEPC水中(终浓度1×NEBuffer 2.1)，孵育形成Cas12a-crRNA复合物，构建识别模块。
所述10×NEBuffer 2.1由50mM NaCl，10mM Tris-HCl，10mM MgCl2，100μg/mLRecombinant Albumin组成。
(3)然后将5μL的链霉亲和素修饰的磁珠稀释并用连接缓冲液(10mM Tris-HCl，2MNaCl，1mM EDTA，pH＝7.4)反复洗涤三次，以去除表面保护剂。再用磁力架将磁珠吸附，吸出洗涤液，加入9.5μL的连接缓冲液和0.5μL 10μMDNA荧光链，并在37℃恒温摇匀仪中孵育30min。磁分离后，将DNA荧光链修饰的磁珠用DEPC水洗涤3次，用磁力架将磁珠吸附，吸出洗涤液。将所得到的磁珠分散在10μL DEPC水中，构建信号模块。
所述DNA荧光链是由生物素或氨基修饰的，其序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：
5’-biotin-TTTTTTGGTTGATTGTGCCGATATCATATGTC-6-FAM-3’。
DNA荧光链是通过生物素-链霉亲和素或氨羧缩合作用组装到磁珠表面的。具体步骤为以下两种方案择一：
(A)将生物素化的DNA荧光链和链霉亲和素修饰的磁珠在连接缓冲液(10mM Tris-HCl，2M NaCl，1mM EDTA，pH＝7.4)中混合，并对组装后的磁珠进行清洗，去除多余的DNA荧光链，将得到的磁珠分散在DEPC水中储存，即得。
(B)将羧基修饰的磁珠稀释在MES缓冲液(100mM MES，pH＝6.0)中，继续加入体积比例为2:1的EDC缓冲液(100mM MES，200mM EDC，pH＝6.0)和NHS缓冲液(100mM MES，100mMNHS，pH＝6.0)，并在45℃下反应6h，随后用PBS缓冲液(10mM PBS，pH＝7.2)洗涤三次，加入氨基修饰的DNA荧光链，并在37℃下孵育1h，反应完之后得到的磁珠分散在DEPC水中，即得。
本实施例采用的是方案(A)。
(4)将步骤(2)中制作好的识别模块与步骤(3)中制作好的信号模块组成试剂盒，即得。
其中，识别模块中的Cas12a-crRNA复合物浓度为10nM～1μM，优选为50nM；信号模块中的DNA荧光链浓度为10～3000nM，优选为500nM。
实施例2
本实施例将实施例1制得的荧光可视化病毒核酸检测试剂盒用于非洲猪瘟病毒核酸检测，具体步骤如下：
将试剂盒中的识别模块与信号模块混合，向其中加入终浓度为100nM的靶标(非洲猪瘟病毒核酸)，在37℃下反应15min，反应完后通过磁珠分离收集上清液，通过荧光仪检测反应前后的荧光强度变化，如图2所示。
由图2可知，在含有非洲猪瘟病毒核酸的样品中，磁性探针上的DNA荧光链被切割，磁分离后上清液在产生较高荧光信号，而不含非洲猪瘟病毒核酸的样品中，磁分离后上清液产生较低荧光信号。
实施例3
采用实施例1的方案制备荧光可视化病毒核酸检测试剂盒，并将其用于新型布尼亚病毒SFTSV核酸检测，具体步骤如下：
(1)针对新型布尼亚病毒SFTSV特征性目标核酸序列，设计crRNA-SFTSV。将实施例1中的识别模块中的crRNA-ASFV替换为crRNA-SFTSV，其余不变。
新型布尼亚病毒SFTSV目标核酸序列如SEQ ID NO.5-6所示，具体为：
SEQ ID NO.5：5’-GTGGAATTTGGCTGGCATGAACCAACAAAGAACT-3’；
SEQ ID NO.6：5’-AGTTCTTTGTTGGTTCATGCCAGCCAAATTCCAC-3’。
所述crRNA-SFTSV具有如SEQ ID NO.7所示的序列，具体为：
5’-UAAUU UCUAC UAAGU GUAGAUUUGG UUCAU GCCAG CCAAA UUCCAC-3’。
(2)将上述制得试剂盒中的识别模块与信号模块混合，向其中加入终浓度为100nM的目标核酸(新型布尼亚病毒核酸)，在37℃下反应15min，反应完后通过磁珠分离收集上清液，通过荧光仪检测反应前后的荧光强度变化，如图3所示。
由图3可知，在含有新型布尼亚病毒核酸的样品中，磁性探针上的DNA荧光链被切割，磁分离后上清液产生较高荧光信号，而在不含新型布尼亚病毒核酸的样品中，磁分离后上清液产生较低荧光信号。
实施例4
本实施例测试Cas12a切割反应时间对荧光检测信号的影响，具体过程如下：
将实施例1制得的荧光可视化病毒核酸检测试剂盒中的识别模块与信号模块混合，向其中加入终浓度为100nM的目标核酸(非洲猪瘟病毒核酸)，在37℃条件下分别切割反应0、5、10、15、20、25、30min，反应完后通过磁珠分离收集上清液，通过荧光仪检测反应前后的荧光强度变化。
测试结果如图4所示，在0～15min内，随着时间推移，荧光强度不断升高；当切割时间达到15min时，Cas12a对磁性探针上的DNA荧光链的切割反应达到平衡状态。因此，将Cas12a的切割反应时间优选为15min。
实施例5
本实施例将实施例1制备的荧光可视化病毒核酸检测试剂盒加入不同浓度的目标核酸后，测试切割反应产生的荧光强度随目标核酸浓度的变化实验，具体过程如下：
将实施例1制得的荧光可视化病毒核酸检测试剂盒中的识别模块与信号模块混合，向其中分别加入终浓度为0、1、2、5、10、50、100、200nM的靶标(非洲猪瘟病毒核酸)，在37℃条件下反应15min，反应完后通过磁珠分离收集上清液，通过荧光仪进行荧光检测记录上清液荧光强度变化。
测试结果如图5所示，随着加入目标核酸浓度的增大，反应溶液中的荧光强度逐渐增加，说明本发明的试剂盒可以实现对不同浓度目标核酸的检测。
实施例6
本实施例针对Cas12a切割反应温度进行优化，具体过程如下：
分别将实施例1制得的荧光可视化病毒核酸检测试剂盒中的识别模块与信号模块混合，向其中加入终浓度为100nM目标核酸(非洲猪瘟病毒核酸)，然后在25℃、30℃、33℃、37℃、40℃、43℃下分别反应15min，反应完成后通过磁珠分离收集上清液，通过荧光仪进行荧光检测记录上清液荧光强度变化。
测试结果如图6所示，当Cas12a切割反应温度在37℃时，可得到最高的荧光强度。因此，等温核酸扩增反应的温度优选为37℃。
实施例7
本实施例测试实施例1制得的荧光可视化病毒核酸检测试剂盒对于目标核酸检测的特异性，具体过程如下：
将实施例1制得的荧光可视化病毒核酸检测试剂盒中的识别模块与信号模块混合，向其中分别加入终浓度为100nM的目标核酸(非洲猪瘟病毒核酸)，以及与目标核酸ASFV同类型的病毒核酸：猪圆环病毒2型(PCV2)核酸靶标、猪伪狂犬病毒(PRV)核酸靶标，在37℃条件下反应15min并测量荧光强度。与目标核酸同类型的病毒核酸序列具体如下：
猪圆环病毒2型(PCV2)核酸序列如SEQ ID NO.8-9所示，具体为：
SEQ ID NO.8：5’-TCTCGATGTGGCAGCGGGCACCCAAATACCA-3’；
SEQ ID NO.9：5’-TGGTATTTGGGTGCCCGCTGCCACATCGAGA-3’。
猪伪狂犬病毒(PRV)核酸序列如SEQ ID NO.10-11所示，具体为：
SEQ ID NO.10：5’-TGTACTTTATCGAGTACGCCGACTGCGACCC-3’；
SEQ ID NO.11：5’-GGGTCGCAGTCGGCGTACTCGATAAAGTACA-3’。
测试结果如图7所示，只有加入非洲猪瘟病毒靶标时，才会出现强荧光信号，证明该检测试剂盒对于非洲猪瘟病毒具有高特异性。
综上所述，本发明利用CRISPR/Cas对目标核酸的高度灵敏度、高特异性识别以及对荧光标记的单链核酸的快速非特异性切割，结合磁珠对荧光标记的单链核酸的富集，可以实现病毒核酸的高灵敏快速可视化检测，极大节省检测时间，适用于现场即时核酸检测，能够实现资源匮乏地区的病毒预检筛查。
以上所述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部的实施例，其他的任何未背离本发明原理下所作的改变、替代、组合、简化均应是等效的置换方式，均落在本发明的保护和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种基于CRISPR技术的荧光可视化病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，包括识别模块和信号模块；所述识别模块为利用CRISPR技术构建的基因编辑探针，用于识别病毒核酸靶标；所述信号模块为利用荧光标记的单链核酸修饰的磁珠构建的磁性探针，用于荧光信号的输出；
所述基因编辑探针包括针对病毒核酸靶标的介导crRNA和Cas蛋白，所述介导crRNA预先与所述Cas蛋白孵育获得Cas-crRNA复合物，作为识别模块；
所述介导crRNA具有靶向病毒核酸的序列；所述Cas蛋白为Cas12a、Cas13、Cas14；
所述磁性探针是由磁珠及在磁珠表面修饰的利用荧光标记的单链核酸组成，切割后会释放荧光，作为信号模块。
2.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR技术的荧光可视化病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述病毒核酸为非洲猪瘟病毒ASFV，具有如SEQ ID No.1-2所示的序列；所述介导crRNA具有如SEQ ID No.3所示的序列。
3.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR技术的荧光可视化病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述病毒核酸为新型布尼亚病毒SFTSV，具有如SEQ IDNo.5-6所示的序列；所述介导crRNA具有如SEQ ID No.7所示的序列。
4.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR技术的荧光可视化病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述磁珠是由链霉亲和素或羧基包覆的，其粒径为10nm～2μm；所述荧光标记的单链核酸长度为5nt以上。
5.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR技术的荧光可视化病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述Cas-crRNA复合物浓度为10nM～1μM；当所述Cas蛋白为Cas12a或Cas14时，所述荧光标记的单链核酸为荧光标记的单链DNA；当所述Cas蛋白为Cas13时，所述荧光标记的单链核酸为荧光标记的单链RNA；所述荧光标记的单链核酸的浓度为10～3000nM。
6.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR技术的荧光可视化病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述荧光标记的单链核酸，其一端连有生物素或氨基，能够使荧光标记的单链核酸连接到链霉亲和素或羧基修饰的磁珠上，其另一端修饰有荧光基团；所述荧光基团为近红外二区荧光分子、上转换粒子、量子点、罗丹明、花菁染料、金纳米簇、含芳香烃/杂环结构的荧光团中的一种。
7.权利要求1-6任一项所述的一种基于CRISPR技术的荧光可视化病毒核酸检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1)利用CRISPR/Cas技术构建识别模块Cas-crRNA复合物：首先针对病毒核酸靶标的基因序列设计与之互补的crRNA，再将Cas蛋白与crRNA以浓度比1:1混合于1×NEBuffer2.1中，在室温下孵育10min，获得Cas-crRNA复合物作为识别模块；
步骤2)将荧光标记的单链核酸通过生物素-链霉亲和素作用或氨羧缩合作用组装到磁珠的表面，通过磁分离去除多余的荧光标记的单链核酸，并对组装后的磁珠进行清洗和重新分散，构建信号模块，实现对荧光分子的富集；
步骤3)将步骤1)所得识别模块与步骤2)所得信号模块组成试剂盒，即得。
8.根据权利要求7所述的一种基于CRISPR技术的荧光可视化病毒核酸检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤2)所述将荧光标记的单链核酸通过生物素-链霉亲和素作用或氨羧缩合作用组装到磁珠的表面，具体步骤包括以下两种方案：
方案(A)：将生物素化的荧光标记的单链核酸和链霉亲和素修饰的磁珠在连接缓冲液中混合，并对组装后的磁珠进行清洗，去除多余的荧光标记的单链核酸，将得到的磁珠分散在DEPC水中储存，即得；
所述连接缓冲液为：10mM Tris-HCl，2M NaCl，1mM EDTA，pH＝7.4；
或方案(B)：将羧基修饰的磁珠稀释在MES缓冲液中，继续加入体积比例为2:1的EDC缓冲液和NHS缓冲液，并在45℃下反应6h，随后用PBS缓冲液洗涤三次，加入氨基修饰的荧光标记的单链核酸，并在37℃下孵育1h，反应完之后得到的磁珠分散在DEPC水中，即得；
所述MES缓冲液为：100mM MES，pH＝6.0；
所述EDC缓冲液为：100mM MES，200mM EDC，pH＝6.0；
所述NHS缓冲液为：100mM MES，100mM NHS，pH＝6.0；
所述PBS缓冲液为：10mM PBS，pH＝7.2。
9.权利要求1-6任一项所述的荧光可视化病毒核酸检测试剂盒，或权利要求7或8所述制备方法制得的荧光可视化病毒核酸检测试剂盒在非疾病诊断目的的病毒核酸检测中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
将识别模块与信号模块混合，向其中加入待测样本进行反应，在25～43℃下反应5～30min后，通过磁分离，收集上清液，检测荧光信号，产生荧光信号则为阳性。
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|---|---|---|---|---|
| CN118374641A (zh) * | 2024-06-24 | 2024-07-23 | 江苏省中国科学院植物研究所 | 一种球形核酸底物增强的CRISPR-Cas12a系统检测非洲猪瘟的方法 |
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| CN118374641B (zh) * | 2024-06-24 | 2024-09-20 | 江苏省中国科学院植物研究所 | 一种球形核酸底物增强的CRISPR-Cas12a系统检测非洲猪瘟的方法 |
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