CN112513289A - 使用新型crispr酶介导的检测策略特异性检测脱氧核糖核酸序列 - Google Patents

使用新型crispr酶介导的检测策略特异性检测脱氧核糖核酸序列 Download PDF

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Abstract

本文公开的实施方案包括使用编程Cast 2蛋白直接、选择性和灵敏地检测来自各种来源的单链和双链靶DNA序列的装置、方法和系统。当通过结合靶DNA序列而活化时，Cas12a裂解系链，从而释放随后可被检测到的报道分子。在一些实施方案中，所述系统、方法和装置可包括可有助于分离该系链和未系链报道分子的过滤器或膜。这些装置、系统和技术允许使用者快速处理可包含靶DNA的样品，而不需要扩增靶序列。这些装置和方法可用于测定各种各样的样品和靶DNA来源，以测定是否存在特定靶DNA序列。还描述了可用于实践这些方法，例如检测生物样品中的靶DNA的组合物和试剂盒。

Description

使用新型CRISPR酶介导的检测策略特异性检测脱氧核糖核酸 序列
优先权申请的所有主题均以引用方法并入本文，只要此类主体不与此矛盾。
背景领域
CRISPR(成簇调节性间隔短回文重复序列)系统是用于鉴定和修饰外源遗传因子(例如质粒、病毒、噬菌体)的原核系统。Cas(CRISPR缔合的)蛋白借助于RNA序列鉴定并裂解DNA(脱氧核糖核酸)和/或外源RNA。Cas 12或Cas 12a是由指导RNA指导的可编程DNA内切核酸酶，其具有特异性和非特异性内切核酸酶(DNase)活性两者。Cas 12a的DNase活性的激活需要结合“指导RNA序列”，这然后使Cas 12a结合互补的双链DNA(dsDNA)序列。这可能是在细胞死亡时可最终导致限制外源核酸扩散的第一步。
本文描述了一种用于鉴定特定靶(或活化剂)序列的灵敏的、低成本的、快速的且易于使用的系统，其无需核酸序列扩增即可执行。
发明内容
一般来讲，本公开的实施方案涉及用于直接、选择性和灵敏地检测来自各种来源的靶DNA序列的装置，方法和系统。这些装置、系统和技术允许使用者快速处理可包含靶核酸序列的样品，而不需要扩增靶序列。实际上，在各种实施方式中，本发明所公开的装置、方法和系统可用于通过两种或更多种酶(诸如RNA核酸酶、蛋白酶、肽酶、脂肪酶、麦芽糖糊精酶和核酸内切酶等)的相互作用来放大信号。这些装置和方法可以用于测定各种各样的样品和靶核酸源，以确定是否存在特定的靶核酸序列。还描述了可用于实践这些方法，例如检测生物样品中的靶核酸序列的组合物和试剂盒。
在一个实施方案中，装置可有助于确定dsDNA(双链DNA)或ssDNA(单链DNA)的靶核酸序列的存在。该装置包括测定区域，该测定区域包括至少一个报道分子、系链分子和固体载体。该系链分子包括第一末端、第二末端和至少一个指示核酸序列，以用于检测活化的Cas 12和/或Casl2a核酸内切酶(DNase)的存在，其中至少一个报道分子附接在第一末端，并且固体载体附接在第二末端。本发明所公开的装置还包括检测区域和定位于该检测区域与该测定区域之间的过滤器。
在一个实施方案中，构建装置的方法包括合成系链分子，所述系链分子具有第一末端、第二末端和定位于第一末端和第二末端之间的至少一个指示核酸(DNA)序列，至少一个指示核酸序列。在一个实施方案中，指示序列可包括至少两个核碱基，所述至少两个核碱基包括两个胸腺嘧啶碱基或腺苷碱基。该方法还包括将报道分子附接在系链分子的第一末端，以及将系链分子的第二末端附接到固体载体，其中该固体载体是纳米颗粒。在一个实施方案中，固体载体具有至少约1.0nm的至少一个可测量尺寸。
在一个实施方案中，用于确定靶核酸序列存在的系统可包括经修饰的Cas 12a分子，其包括与靶核酸序列互补的指导RNA序列，用于确定核酸酶的存在的装置，该装置包括至少一个报道分子，固体载体和系链分子，该系链分子具有第一末端、第二末端和定位于所述第一末端与所述第二末端之间的至少一个指示核酸序列，其中至少一个报道分子附接在所述第一末端，并且固体载体附接在所述系链分子的第二末端。所述装置还包括测定隔室、检测隔室和定位于所述测定隔室和所述检测隔室之间的过滤器，其中未系链报道分子可透过该过滤器。
在一个实施方案中，检测生物样品中的靶核酸序列的方法可包括将生物样品与组合物混合以形成样品混合物，该组合物包含至少一个经修饰的Cas分子，该经修饰的Cas分子包含具有与靶核酸序列互补的序列的指导RNA。该方法还包括将样品混合物与指示剂装置一起温育以形成测定混合物，该指示剂装置包括固体载体、至少一个报道分子和具有第一末端和第二末端的系链分子，其中该系链分子在第一末端处附接到固体载体并且在第二末端处附接到至少一个报道分子，该系链分子包括定位于所述第一末端和所述第二末端之间的至少一个指示核酸序列。该方法还包括将测定混合物温育测定时间段，将分离力施加于测定混合物的步骤以及检测来自未系链报道分子的信号的步骤，其中如果检测到的信号大于背景值，则靶核酸序列存在于生物样品中，其中背景值得自缺乏靶核酸序列的生物样品。在一个实施方案中，可将生物样品与包含用指导RNA序列修饰的至少一个Cas分子的组合物组合，其中所述指导RNA序列与靶核酸序列互补，固体载体可以为聚丙烯酰胺葡聚糖小珠，报道分子可以为萤光素酶，并且离心可用于将系链萤光素酶与未系链萤光素酶分离，所述未系链萤光素酶可通过过滤器进入含有萤光素的检测区域。
本发明所公开的方法的实施方案可用于从人类或非人类患者，从环境样品、农业样品或食品样品获得的样品中鉴定病原体。本发明所公开的方法的实施方案可用于鉴定外源DNA或RNA，例如微小RNA(mRNA)物种。
来自本发明所公开的实施方案中任一个的特征可以彼此组合使用而没有限制。此外，通过考虑以下具体实施方式和附图，本公开的其他特征和优点对于本领域普通技术人员而言也将变得显而易见。
前述发明内容仅是说明性的，而绝不旨在进行限制。除了上述说明性方面、实施方案和特征之外，通过参考附图和以下具体实施方式，其他方面、实施方案和特征也将变得显而易见。
附图说明
图1为当前公开的装置的实施方案的示意图。上图示出的是系链报道分子，其通过未系链报道分子可透过的过滤器或膜与检测隔室分离。下图是示出系链报道分子的一个实施方案的构造的详细示意图。
图2示出了与本发明所公开的方法和系统中的任一者一起使用的检测装置的各种实施方案。图A和图B示出了侧向流实施方案，其中箭头示出流动方向。图C和图D示出了微量离心管实施方案。
图3A和图3B是示出本发明所公开的装置和方法的实施方案的图。图3A示出具有用于检测活化的Cas蛋白存在的第一装置的实施方案，其中报道分子系链到第一装置。图3B示出了具有用于检测活化的Cas蛋白存在的第一装置的实施方案，其中报道分子是靶向第二装置上的指示序列的酶，在此为核酸酶，其中第二装置具有第二报道分子。
图4A和4B是本发明所公开的方法的实施方案的流程图(图4A)，以及本发明所公开的系统的实施方案的框图(图4B)。
图5以柱状图的形式示出以A488作为报道分子的测定的实施例1的结果。
图6示出了来自A488测定的结果，其中活化剂序列/靶序列的浓度增加。
图7是来自实施例2A488测定的结果的柱状图。
图8是来自实施例2A488测定的结果的柱状图。
定义
“寡核苷酸”、“多核苷酸”和“核酸”在本文可互换使用。这些术语可指任何长度、链型(双链或单链)的核酸、和核糖核苷酸(RNA)或脱氧核糖核苷酸(DNA)以及混合分子(包含DNA和RNA)的聚合物形式。本发明所公开的核酸还可包括天然存在的和合成的或非天然的核碱基。天然核碱基包括腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)和尿嘧啶(U)。
“互补性”是指第一核酸具有第一序列，所述第一序列允许其与第二核酸“碱基配对”“结合”、“退火”或“杂交”。在一个实施方案中，第一核酸可以为RNA序列，而第二核酸可以是单链或双链DNA或RNA序列。结合可受互补性的量和某些外部条件(诸如环境的离子强度、温度等)的影响。碱基配对规则在本领域中是众所周知的(A与DNA中的T配对，与RNA中的U配对；以及G与C配对)。在一些情况下，RNA可包含配对，其中G可与U配对。在所有情况下，互补性并不表示完全或100％的互补性。例如，互补性可小于100％且大于约60％，例如两个序列在给定序列长度的范围内(例如，大于10nt.且小于220nt.)的互补性可大于60％或小于100％。
“蛋白质”、“肽”、“多肽”可互换使用。该术语是指任何长度的氨基酸的聚合形式，其可包括天然和非天然残基。该残基也可在掺入多肽之前或之后被修饰。在一些实施方案中，多肽可以为支链的以及直链的。
提及Cas蛋白，“编程的”是指包括指导RNA的Cas蛋白，该指导RNA包含与活化剂(或靶)序列互补的序列。通常，编程的Cas蛋白包括工程化指导RNA。
“Cas蛋白”为CRISPR缔合的蛋白。当前所公开的Cas蛋白具有核酸酶活性，其可在靶序列与由Cas蛋白结合指导RNA结合后被活化。如下文更详细地公开的，指导RNA可包含crRNA与其他序列，在一些实施方案中，其可加工自pre-crRNA序列。在一个实施方案中，指导RNA序列可包括天然或合成的核酸，例如经修饰的核酸，诸如但不限于锁核酸(LNA)、2’-o～甲基化碱基，甚至ssDNA(单链DNA)。在许多实施方案中，本发明所公开的Cas蛋白选自Cas12组，其可来源于本领域技术人员已知的各种来源。
“编码序列”是编码多肽序列或RNA序列的DNA序列，例如指导RNA。首先将编码多肽的编码序列转录成RNA，其继而可编码该多肽的氨基酸序列。一些RNA序列(诸如指导RNA)可不编码氨基酸序列。
除此之外，“天然的”、“天然存在的”、“未修饰的”或“野生型”描述了天然存在的蛋白质、氨基酸、细胞、核碱基、核酸、多核苷酸和生物体。例如，与存在于自然界中相同但未被人类修饰的核酸序列是天然序列。如本文所用，“重组的”、“工程化”和“经修饰的”意指特定的核酸(DNA或RNA)是人为干预的产物，并且通常不存在于“自然界”中。具体地讲，特定序列已通过体外合成、突变、缺失、取代、克隆、裂解、连接和扩增中的一者或多者进行分离和/或修饰。
“标签”或“标记”是指具有使得该组分可通过一种或多种技术鉴定的分子的组分。
以下公开内容应理解为不限于下文所述的具体实施方案。而且，所提供的术语并不意味着是限制性的。
具体实施方式
本文所公开的实施方案包括用于检测样品中是否存在特定靶核酸序列(例如双链DNA序列)的装置、组合物、方法和系统。在一个实施方案中，所述装置、组合物、方法和系统可用于快速、灵敏且成本有效地诊断患有病毒、细菌、寄生虫或真菌感染的患者或样品，或可通过存在一个或多种特异性核酸序列来鉴定的疾病、病症或障碍。在一个实施方案中，本发明所公开的装置、组合物、方法和系统可用于基因筛选、癌症筛选、突变分析、单核苷酸多态性分析等。
在以下具体实施方式中，参考形成其一部分的附图。在附图中，除非上下文另外指出，否则相同的符号通常标识相同的组件。在具体实施方式、附图和权利要求中所述的示例性实施方案并不意味着是限制性的。在不背离此处呈现的主题的精神或范围的情况下，可以利用其他实施方案，并可进行其他改变。
在80年代后期发现了成簇调节性间隔短回文重复序列(CRISPR)。尽管在后续几十年中提出了这些序列参与细菌防御系统的观念，但其直到00年代中期到后期才被广泛接受。在此期间，若干论文阐明了这种获得性免疫系统的基础：将侧接有回文重复序列的外源DNA序列(例如来自质粒和病毒)掺入宿主基因组中，并且其RNA产物指导Cas复合物裂解含有互补序列的核酸。CRISPR缔合的(Cas)蛋白与工程化指导RNA的简化复合物被示出能够定位和裂解特异性DNA序列。这导致新技术，尤其是基因组编辑的爆炸式增长。进一步的研究显示，这些蛋白质可用于体内编辑基因组。CRISPR系统存在于古细菌和许多细菌中。除了它们更广泛地公认的靶向DNA的能力之外，一些类型的Cas蛋白还具有不明确的核酸酶活性。例如，Cas 12a蛋白具有单链和双链核酸内切酶活性。
核酸内切酶(DNase)裂解聚合的脱氧核糖核酸(DNA)以产生核苷酸或更短的多核苷酸。已知大多数DNase靶向双链DNA，然而一些DNase靶向单链DNA。Cas12a属于V型CRISPR系统，并具有单链和双链DNase活性。具体地讲，当Cas 12a使用其指导RNA与靶DNA(或活化剂-DNA)结合时，该Cas 12a被活化。在一个实施方案中，靶或活化剂DNA可以是互补的单链序列或双链序列。
因此，Cas12a(Cpf1)是具有序列特异性和非特异性核酸酶活性的CRISPR DNase。如同其他Cas蛋白，Cas12a在结合指导RNA序列后被“编程”。Cas12a通过结合单链或双链DNA而被活化，并具有在靶序列和非靶序列处裂解双链DNA的能力。Cas12还具有无差别的单链DNase活性。与非特异性(无差别)DNase活性相关联的酶促活性看起来远高于靶活性。
如同其他几种CRISPR蛋白，Cas12a的指导RNA序列可以进行修饰或“编程”以识别并结合特异性靶核酸序列。这种类型的“编程”使蛋白质的侧支裂解功能对给定的靶DNA序列具有特异性。实际上，这可以为外源序列或病毒序列，但是在体外工程化时，靶序列可选自与指导RNA的工程化部分互补的任何单链序列或双链序列。
本文公开的实施方案包括用于检测特定单链或双链靶DNA序列是否存在的装置、组合物、方法和系统。在一些实施方案中，诸如在图1中所示的，本发明所公开的装置100包括指示装置210，其还包括经由具有至少一个指示序列245的系链分子240连接到固体载体220的报道分子230。在一些实施方案中，装置100还可包括未系链报道分子可透过的过滤器400或膜。检测隔室300或区域可允许独立区域，该独立区域用于检测远离测定隔室200中的系链报道分子的未系链报道分子。检测区域300还可包括与未系链报道分子相互作用的一个或多个分子310，诸如底物或结合蛋白。图1的下部示出了指示装置210的实施方案，该指示装置包括报道分子230、系链分子240和固体载体220。在该实施方案中，报道分子230为萤光素酶(此处为
Figure BDA0002923447490000071
(Promega)，命名为“NL”)，其与
Figure BDA0002923447490000072
(Promega，HT)融合。HaloTag蛋白与氯化标签配体共价结合，其继而经由硫和琥珀酰亚胺基团与近端处的指示序列245共价连接。在指示序列的远端，为共价连接的生物素分子，其继而与共价连接至小珠的链霉亲和素蛋白结合。在一个实施方案中，HT、氯化标签、生物素和链霉亲和素可被称为锚分子241。
本发明还公开了用于检测样品中的靶DNA的试剂盒，其中所述试剂盒包括至少一种Cas12a蛋白(也在图1中示出)，其也可包括指导RNA序列，并且在另一个实施方案中，指导RNA序列+活化剂DNA序列。至少一个Cas12a可以呈编码序列的形式，并且试剂盒还可包括用于编程Cas12a蛋白的一个或多个指导RNA(或编码所述指导RNA的序列)，即Cas12a蛋白包括指导RNA序列。在一些实施方案中，试剂盒可包括系链报道分子、固体载体和用于与报道分子相互作用的底物或捕获分子。
所公开的系统提供了对包括单链DNA或双链DNA在内的各种来源的核酸靶序列的廉价且快速检测，所述来源包括但不限于哺乳动物、病毒、细菌、真菌等。本发明所公开的装置、系统和方法提供了最少的样品准备，并且在一个实施方案中，不需要从样品中扩增核酸。样品可以为来自人类或非人类患者的生物样品，或者来自水、食品等的环境样品。在一些实施方案中，本发明所公开的组合物、装置和系统可包括报道分子，诸如荧光团或酶，例如磷酸酶或荧光素酶(如上所述)。在一些实施方案中，萤光素酶可以是为
Figure BDA0002923447490000081
(Promega)，并且磷酸酶可以为碱性磷酸酶。这可以允许使用荧光测定法、发光测定法和/或比色测定法来检测靶核酸序列的方法。在其他实施方案中，报道分子可以为纳米颗粒，例如金属纳米颗粒，诸如金纳米颗粒。
如图2所示，用于鉴定靶DNA的存在的检测装置可以包括侧向流1110(图A和图B)或带隔室的微量离心管2100(图C和图D)。在一些实施方案中，带隔室的微量离心管2100可具有包括过滤器2400的可移动测定区域2200。基于横向流的装置1100可包括样品板1500、测定区域1200、检测区域1300和芯板1600以有助于从样品板1500抽出流体。在这些实施方案中，报道分子1230可系链到固体载体1220以在测定区域1200处形成指示装置1210，所述指示装置还可包括过滤器1400。在一些实施方案中，诸如图2的上图所示，过滤器1400也可为固体载体1221(图B)，并且报道分子1230可系链到过滤器1400或1221。检测区域可包括分子1310，其具有用于捕获报道分子的捕获表面1311(图A)，或与报道分子相互作用的基底1312(面板B)。图2的下部(图C和图D)所示的基于微量离心的实施方案可与使用离心以将系链报道分子与未系链报道分子分离的方法一起使用。在此，过滤器2400再次防止指示装置2210上的系链报道分子2310进入检测区域2300，并允许未系链报道分子2230进入检测区域2300(图C)。同样，图D示出直接附接到过滤器2400(图D)的报道分子2230和系链分子2210，从而允许未系链分子与基底2310相互作用。
其他实施方案可包括微流体装置，和/或可组合图2所示的装置的各方面。例如，图3所示的是具有测定区域3200和包含捕获分子3310的检测区域3300的装置3000，其中指示装置3210上的报道分子3230是酶(在此为荧光素酶)，其(经由系链分子3245，在此为ssDNA3240)系链到过滤器3400，所述过滤器也是固相载体3220。在一些实施方案中，具有酶活性的报道分子的组合捕获可有助于增强和集中信号传导。当与视觉检查、拉曼检测、等离子共振或其他检测方法组合时，本发明所公开的装置可灵敏且准确地鉴定样品中靶DNA序列的存在。在一些实施方案中，该装置和方法可用于同时且快速地处理多个样品。此外，本发明所公开的方法和装置可提供对相同或不同样品中的不同靶序列的快速和同时检测。
图3B示出了当前公开的装置的两个实施方案，所述装置具有第一指示装置和第二指示装置。在上图中，第一指示装置包括可被Cas蛋白裂解的第一指示序列，以及作为限制性核酸内切酶(此处为EcoRI)的第一报道分子。可以在第一指示装置的近端或远端(例如下游)的第二指示装置包括可被第一报道分子裂解的第二指示序列。在这些实施方案中，第二指示序列是具有限制性内切核酸酶的靶序列的双链DNA序列，该靶序列可不同于Cas蛋白识别的序列。第二报道分子装置可以为纳米颗粒或可产生可检测信号的酶(例如萤光素酶)。
图3B所示的实施方案可提供信号放大和/或背景减小。在一个实施方案中，如下所述，第一报道分子可以为酶，诸如肽酶、蛋白酶、麦芽糖糊精酶、脂肪酶、核酸内切酶等。在一些实施方案中，第一报道分子可以为可裂解第二指示序列但不裂解第一指示序列的不同的Cas蛋白质。在一些实施方案中，第二指示装置的数量可大于第一指示装置的数量。在一些实施方案中，第一指示装置与第二指示装置的比率为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:20、1:50或1:100。
用于检测单链靶DNA序列和双链靶DNA序列的装置
本文所公开的实施方案包括用于检测靶核酸序列的指示装置。在一些实施方案中，所公开的装置将包括报道分子、固体载体和定位于报道分子与固体载体之间的系链分子。该系链分子将报道分子直接或间接地连接到固体载体。在一些实施方案中，该装置还可包括过滤器，其可有助于将固体载体与未系链报道分子分离。在一些实施方案中，未系链报道分子可透过该过滤器，但系链报道分子不可透过该过滤器。
系链或桥接分子包括至少一个“指示”序列。该指示序列可易于被核酸酶裂解。在一个实施方案中，该核酸酶为Cas蛋白，例如活化的Cas12a DNase。在其中指示序列为单链DNA的实施方案中，指示序列可包括至少两个胸腺嘧啶残基。指示序列的长度可以在2个核苷酸至50个核苷酸之间或更长。该系链分子可包括相同或不同序列的两个或更多个指示序列。在一些实施方案中，指示序列可在其5'和/或3'末端处连接至非核酸分子，或定位于两个或更多个指示序列之间。在一些实施方案中，指示序列可包括在5'和/或3'末端处的硫醇或生物素。在一些优选的实施方案中，指示序列的序列为5'-TTATT-3'或TTATTTTATT(SEQID NO：1)。
在一个实施方案中，指示序列可以不是核酸。例如，指示剂可以为脂质、碳水化合物、蛋白质、肽或可被酶裂解的其他序列。在一个实施方案中，指示序列可易于被SUMO、TEV蛋白酶、脂肪酶、麦芽糖糊精酶等中的一种或多种裂解。
本发明所公开的装置可包括具有一种或多种指示序列类型的指示装置。例如，该装置可包括第一指示装置，其具有可被活化的Cas蛋白裂解的核酸指示序列，以及可以被蛋白酶裂解的第二指示序列。在该实施方案中，第一指示装置可包括为蛋白酶的报道分子，第二指示装置可包括可通过一种或多种检测方法检测的报道分子(例如，第二指示装置上的报道分子可为萤光素酶)。
在系链分子包括单链DNA指示序列和一个或多个非DNA分子的情况下，除了指示序列之外，非DNA序列还可以为下列中的一种或多种：双链RNA、双链DNA和/或单链RNA。在一个实施方案中，系链分子可包括下列中的一种或多种：单链RNA、单链DNA、双链DNA、核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、脂质，肽、碳水化合物、聚乙二醇(PEG)、“点击”化学标签、生物素、链霉亲和素、DNA、马来酰亚胺、硫、硫醇、氨基酸、蛋白质、肽、琥珀酰亚胺、细菌蛋白质、合成蛋白质、烷基卤脱卤酶(HaloTag)、氯烷烃、三唑、砜、杂环或碳环小分子、脂族或杂脂族小分子、无机物质、有机金属物质、放射性分子以及它们的组合。
系链分子可在第一末端和/或第二末端包括至少一个锚结构域、序列、残基或结构。锚结构域可有助于系链分子接触并连接到报道分子(报道分子锚)或固体载体(载体锚)。在一些实施方案中，锚可共价或非共价键合至系链分子、报道分子和/或固体载体。那些实施方案具有非共价键，该键可足够牢固以减少大多数生理环境中的解离。在其他实施方案中，系链分子可直接共价附接到报道分子和/或固体载体。图1示出了锚结构，例如卤代标签配体和生物素。
报道分子
报道分子可通过指示序列系链到固体载体上。在一个实施方案中，当与固相载体分离时，报道分子可被容易地检测到，或者可裂解系链到第二报道分子的指示序列。在一些实施方案中，报道分子选自下列中的一种或多种：蛋白酶、肽酶、麦芽糖糊精酶、核酸酶、核酸内切酶、限制性核酸内切酶、Cas蛋白、荧光团、荧光分子、发光分子、蛋白质、融合蛋白、酶、SERS(表面增强拉曼光谱)颗粒、杂环或碳环小分子、脂族或杂脂族小分子、无机物质、有机金属物质、放射性分子、纳米颗粒以及它们的组合。在一些实施方案中，相同或不同类型的两个或多个报道分子连接到系链分子或固体载体。例如，系链分子可连接到萤光素酶和纳米颗粒，或者系链分子可连接到两个或更多个萤光素酶分子。在一些优选的实施方案中，报道分子可以为下列中的一种或多种：荧光团、NanoLuc、萤火虫荧光素酶、海洋腔肠荧光素酶、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、α-或β-淀粉酶、荧光蛋白、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、β-葡萄糖醛酸酶、荧光素染料、Alexa fluor、量子点、量子纳米点、金属和金。
报道分子可通过各种方法直接或间接地检测。例如，在报道分子为荧光团，例如A488的情况下，可通过在给定的光波长下激发未系链荧光团并检测发射波长来检测未系链荧光团。在一个实施方案中，可将未系链荧光团信号与由保持系链的荧光团所产生的信号进行比较，或者可将未系链的信号与标准进行比较。当报道分子为酶，例如荧光素酶时，可通过与底物，诸如荧光素相互作用来检测未系链酶的存在。在一个实施方案中，报道分子可以为裂解酶，其可通过裂解第二指示序列使第二指示装置上的第二报道分子未系链。在这些实施方案中，第二指示装置可以位于具有裂解酶的第一指示装置中、在其附近或远离所述第一指示装置。在一些实施方案中，在报道分子为可检测的分子或酶的情况下，底物可远离固体载体定位或位于固体载体的远侧，使得酶直到不与固体载体系链才与底物接触。在其他实施方案中，可直接检测报道分子，例如在报道分子为纳米颗粒(诸如SERS颗粒)的情况下。在这些实施方案中，颗粒可与分子相互作用，所述分子对报道分子具有亲和力、捕获、识别和/或结合到报道分子。例如，报道分子可以为纳米颗粒，当其未与固相载体系链时，可以转移到远离固体载体的位点并被例如抗体、结合蛋白或被设计用于与报道分子相互作用的磁性结构捕获。
在一个实施方案中，未与固体载体系链的报道分子可被另一分子吸引或捕获。在一些实施方案中，可将未系链报道分子集中以帮助增强检测。
系链报道分子与系链分子连接，其中所有指示序列均完整、未裂解并附接到固体载体上。报道分子可产生信号，所述信号可以以各种方式被检测到，或者可在第二指示装置处裂解第二指示序列。在一些实施方案中，其中报道分子直接或间接地产生信号，该信号为下列中的一种或多种：发光、荧光、等离子体共振、浊度、吸光度或电化学。
固体载体
固体载体可以为各种结构或物质，例如下列中的至少一种：表面、纤维、小珠或颗粒。固体载体可包括下列中的一种或多种：玻璃、金属、聚合物、纤维素、聚丙烯酰胺葡聚糖、琼脂糖、丙烯酰胺或葡聚糖。在一些实施方案中，多个系链分子可附接至固体载体。在其他实施方案中，单个固体载体分子可附接到单个系链分子。在一些实施方案中，固体载体为或包括过滤器、网、织物或其他材料，未系链报道分子可透过所述固体载体，但系链报道分子不可透过所述固体载体。即，在这些实施方案中，当未系链时，报道分子可流过、离开、排出或以其他方式经过或通过固体载体以重新定位至检测区域，并被检测或产生被检测的信号。在一些优选的实施方案中，固体载体可以为磁珠或纤维素结合蛋白。
在一个实施方案中，固体载体可以为侧向流装置的板或过滤器。在这些实施方案中，报道分子可附接到系链分子，所述系链分子继而附接到侧向流装置的板或过滤器。当系链分子的指示序列裂解时，未系链报道分子可通过或在板或过滤器上朝向检测区域流动。在这些实施方方案中，未系链报道分子可通过毛细作用远离裂解的系链分子和固体载体易位。
Cas蛋白
本发明所公开的Cas蛋白可来源于包括古细菌和细菌的各种源。在一些实施方案中，天然Cas蛋白可来源于拟杆菌属、肉食杆菌属、李斯特菌属、Herbinix属、红细菌属、纤毛菌属、毛螺菌科、真杆菌属或梭菌属。在一些实施方案中，天然Cas蛋白可来源于丙酸杆菌(Paludibacter propionicigenes)、鸡肉杆菌、斯氏利斯特菌、纽约李斯特氏菌、Herbinixhemicellulosilytica、荚膜红细菌、Leptotrichia wadei、口腔纤毛菌、Leptotrichiashahii、毛螺科菌NK4A179、毛螺科菌MA2020、直肠真杆菌、毛螺科菌NK4A144、和Clostridium aminophilum。
目前公开的Cas蛋白与天然Cas蛋白同源。在一些实施方案中，本发明所公开的Cas蛋白与天然Cas蛋白序列具有大于75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％且小于约100％、99％、98％、97％、95％、90％、85％、80％或75％同一性。本发明所公开的Cas蛋白可具有一个或多个HEPN结构域，并且可在活化后能够裂解单链RNA，包括前体指导RNA和指示RNA。
Cas蛋白的活化可包括使一个或多个靶序列与指导RNA序列接触，所述指导RNA序列与Cas蛋白相关联。在一些实施方案中，Cas蛋白的指导RNA可通过与互补的单链或双链靶序列杂交来帮助活化Cas蛋白的核酸酶活性。
本发明所公开的Cas蛋白可以为Cas12蛋白。在一个实施方案中，Cas蛋白是经修饰的Cas12蛋白，将其修饰、工程化或突变以改变其与指导或靶序列的相互作用和/或改变其核酸酶活性，例如特异性、周转率、核苷酸偏好性等。在其他实施方案中，Cas蛋白可与另一种蛋白、肽或标记融合，以有助于离析、鉴定、分离、核酸酶活性、靶序列结合等。
指导RNA序列
指导RNA包括与靶序列互补的至少一个序列。在一些实施方案中，该靶互补序列可称为间隔区序列，附加的序列可被称为支架序列。在一些实施方案中，间隔区序列来源于人(例如基因组DNA或转录RNA)或非人来源(例如病原体)。在一些实施方案中，所选择的病原体可选自细菌、病毒、真菌和寄生虫。在一些实施方案中，病原体可以为选自分枝杆菌属、链球菌属、假单胞菌属、志贺氏菌属、弯曲杆菌属、沙门氏菌属、梭状芽孢杆菌属、棒状杆菌属和密螺旋体细菌。一些实施方案中，病毒可选自DNA或RNA病毒，其包括腺病毒科、微小核糖核酸病毒科、疱疹病毒科、肝脱氧核糖核酸病毒科、黄病毒科、逆转录病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、乳多空病毒科、多瘤病毒科、弹状病毒科和披膜病毒科。在一些实施方案中，致病真菌包括念珠菌、曲霉菌、隐球菌、组织胞浆菌、肺孢子虫和葡萄穗霉属。
在其他实施方案中，间隔区RNA序列与非病原体互补。例如，间隔区RNA序列可工程化以与任何感兴趣的核酸序列杂交。在一些实施方案中，指导RNA序列可工程化为与感兴趣的哺乳动物序列，例如基因组序列或转录序列(mRNA，microRNA等)互补。在各种实施方案中，指导RNA可包括与哺乳动物病症、疾病或障碍(诸如癌症、病毒感染、细菌感染、真菌感染)相关联的序列互补的序列。在一些实施方案中，指导RNA可与mRNA或微小RNA(例如微小RNA标记中的微小RNA序列)互补。在一些实施方案中，指导RNA序列可在前体RNA内，其继而可以为具有多个指导RNA序列的阵列的一部分。在一些实施方案中，前体RNA序列可以由Cas蛋白加工以提供指导RNA序列。
指导RNA序列包括与靶序列互补的间隔区序列，以及为间隔区序列的5'的更恒定序列。该恒定序列可被称为支架序列、重复序列、操纵序列或恒定区，并有助于将指导RNA与Cas蛋白结合。在一些实施方案中，恒定序列可用进化相关的恒定序列的序列代替。如本领域已知的，Cas蛋白可分组成不同的家族，其包含识别crRNA的正交集合并具有不同的核苷酸裂解特异性的官能团。在一些实施方案中，可通过包括天然存在的和合成的或非天然的核碱基或骨架修饰来修饰恒定序列以改善亲和力和稳定性。在一些实施方案中，恒定序列可包括前体序列。在一个实施方案中，可对前-crRNA序列进行加工以形成crRNA序列，其包括指导序列。
包含指导RNA的Cas蛋白可被称为“编程的”Cas蛋白。指导RNA序列可引入到Cas蛋白并与其结合。例如，指导RNA可在细胞内或细胞外接触Cas蛋白。可使用多种方法使指导RNA与Cas蛋白接触以产生编程的Cas蛋白。在一些实施方案中，接触需要少于约2小时，例如少于约90分钟、60分钟、40分钟、30分钟、20分钟、10分钟、5分钟、4分钟、3分钟、2分钟或1分钟。
靶/活化剂序列
靶核酸序列可从各种来源中鉴定，所述来源包括但不限于植物、哺乳动物、寄生虫、变形虫、病毒、细菌和真菌。在一些实施方案中，靶或活化剂序列是微生物或病毒序列，在其他实施方案中，靶序列是哺乳动物基因组或转录序列。在一些实施方案中，来源可以为人类、非人类或动物。在一些实施方案中，动物来源可以为驯养或非家养动物，例如野生动物。在一些实施方案中，驯养的动物为服务型或陪伴型动物(例如狗、猫、鸟、鱼或爬行动物)或驯养的家畜。
对于来自病原体的靶序列，病原体可具有显著的公众健康相关性，诸如细菌、真菌或原生动物，并且靶序列可存在于但不限于下列中的一种或多种中：沙眼衣原体、淋病奈瑟氏球菌、阴道滴虫、脲原体物种、恶性疟原虫、间日疟原虫、溃疡分枝杆菌、大肠埃希氏菌0157：117；乙型肝炎；人乳头状瘤病毒；甲、乙、丙或丁型流感病毒；人类免疫缺陷病毒；或疱疹病毒。
测定区域
本发明所公开的装置的实施方案可包括测定区域。在一个实施方案中，测定区域可包括至少一个第一指示装置，其包括第一指示序列以将报道分子系链到固体载体。在一些实施方案中，固体载体可以为可使得未系链报道分子易位的过滤器或膜。
测定区域可包括具有第一指示序列的第一指示装置和具有第二指示序列的第二指示装置。
检测区域
本发明所公开的装置的实施方案包括用于捕获、鉴定或检测未系链报道分子的存在的检测区域。在一些实施方案中，检测区域不含系链报道分子，并且与固体载体分离且远离固体载体。例如，在装置为侧向流装置的一部分的实施方案中，检测区域可以为测试线或控制线并且在样品板或过滤器的远侧端部，该样品板或过滤器包括系链到报道分子的固体载体。
所述检测区域可包括用于与未系链报道分子相互作用的底物。例如，在这些实施方案中，装置可通过未系链分子可透过的过滤器、膜、凝胶、水凝胶或聚合物与检测区域分开。在这些实施方案中，施加力(例如，离心力、电磁场、流体流动或它们的组合)可帮助将未系链报道分子跨过或穿过过滤器/膜运输到检测区域中。在这些实施方案的一些中，未系链报道分子可结合至底物并产生信号，所述信号可由检测设备检测到。在这些实施方案中，固体载体可能不能移动跨过或穿过过滤器或膜，因此可帮助防止仍然系链到固体载体上的报道分子进入检测区域。
检测区域可包括可捕获或结合报道分子的蛋白质或分子。在这些实施方案中，捕获分子可有助于运输、定位、固定和/或集中未系链报道分子。这继而可有助于增强来自报道分子的信号，并因此增加用于检测未系链报道分子的测定的灵敏度。在这些实施方案的一些中，捕获分子可以为对报道分子具有亲和力的蛋白质，例如抗体或单体。在这些实施方案中，可修饰报道分子以包括可被抗体结合的标签。在其他实施方案中，捕获分子可以为磁性颗粒，所述磁性颗粒可与报道分子在磁性上相互作用。
方法
本文公开的方法包括制造本发明所公开的装置的方法和使用所述方法来检测样品中的靶序列的方法。本发明所公开的方法可用于检测样品(例如生物样品)中的靶核酸序列，而无需在样品中扩增遗传物质。
在图4A中以流程图的方式示出了本发明所公开的方法800的实施方案。在该实施方案中，Cas蛋白为编程的Cas12a蛋白820(包括指导RNA)，其与可包含或不包含靶DNA序列的样品810结合830，并温育以产生测定混合物840。在温育之后，将测定混合物840与指示装置850结合860以产生检测混合物870，所述指示装置850包含经由系链分子而系链到固体载体的报道分子，所述系链分子包含至少一个单链DNA指示序列。将检测混合物870温育一段时间以允许裂解指示序列。然后，将系链报道分子900与未系链报道分子890分离880。可测定未系链报道分子890的信号910，并且可以对其进行检测920。可将所检测到的信号930与背景值进行比较940，以确定950样品评分是正960还是负970从而确定是否存在靶DNA序列。如上所述，在图3A和图3B中的其他实施方案可包括第一报道分子与第一指示装置的未系链，以及第二报道分子与第二指示装置的未系链。
本发明所公开的方法可用于测定各种样品，包括来自人类或非人类来源的生物样品。在一些实施方案中，样品可选自或来源于下列中的一种或多种：血液、汗液、血浆、血清、痰液、唾液、粘液、细胞、排泄物、尿液、脑脊液(CSF)、母乳、精液、阴道液、组织等。通过本发明所公开的方法可检测的靶核酸序列可来源于多种来源或可合成制备。当靶核酸序列是生物来源的时，该来源可以为下列中的一种或多种：真菌、细菌、病毒、原生动物、真核生物、哺乳动物细胞或人细胞。
本发明所公开的方法可使用多种检测方法来确定靶核酸序列是否存在。检测可以为直接或间接检测未与固相载体系链的报道分子。合适的报道分子可包括但不限于荧光分子、发光分子、融合蛋白、蛋白质、酶、荧光或发光蛋白、SERS颗粒或纳米颗粒中的一种或多种。合适的报道分子可产生信号，所述信号可通过拉曼光谱、荧光光谱、光谱、电化学方法、目视检测(例如，颜色、浊度)或表面等离子体共振中的一种或多种检测到。在一些实施方案中，本发明所公开的方法可包括可导致报道分子从固体载体中解链的步骤。在一些实施方案中，固体载体可选自纤维或小珠中的一种或多种，其包括但不限于纤维素、琼脂糖、丙烯酰胺、葡聚糖或金属中的一种或多种。在一些实施方案中，多个系链分子可附接到固体载体，并且多个报道分子可附接到单个系链分子。在一些实施方案中，该系链分子可包括下列中的一种或多种：PEG、DNA、链霉亲和素、生物素、马来酰亚胺、硫、硫醇、氨基酸、蛋白质、琥珀酰亚胺、细菌蛋白质、烷基卤脱卤酶(HaloTag)、氯代烷烃、三唑、砜，并且系链分子共价附接到固体载体和/或报道分子。
系统
本发明还公开了用于确定靶核酸序列的存在的系统。本发明所公开的系统的一个实施方案可包括经修饰的Cas分子，包括系链分子、报道分子和固体载体的装置，其中系链分子具有至少一个指示核酸序列，Cas蛋白被“编程”并包括与靶核酸序列互补的指导核酸序列。该系统还可包括测定隔室、检测隔室和定位于测定隔室与检测隔室之间的过滤器，其中未系链报道分子可透过该过滤器。在许多实施方案中，该系统还可包括至少一个检测器，所述至少一个检测器被配置为检测来自检测区域内的未系链报道分子的信号。
在一些实施方案中，该系统可包括如图4B所示的数字计算机。系统5000可包括检测装置5100，以及至少一个检测器5200，其被配置为在检测装置5100的检测区域内检测来自未系链报道分子的信号。该系统还可包括输入设备5300、输出设备5400、存储设备5500、存储器单元5600和数字计算机5700(或中央处理单元，CPU)，它们全部可与母线5800电通信。检测器和检测装置可以直接通信，例如光通信或电通信。CPU可包括处理电路，其被配置用于接收来自检测器的信号并处理该信号。输入和/或输出装置可提供用户界面，诸如用于监测系统和/或信号。在一个实施方案中，系统可指示给定样品中是否存在靶序列。
此类数字计算机在本领域中是众所周知的，并且可包括中央处理单元中的一个或多个、存储器和/或存储装置中的一个或多个、一个或多个输入设备、一个或多个输出设备、一个或多个通信接口和数据母线。在一些实施方案中，存储器可以为RAM、ROM、硬盘、光盘驱动器、可移动驱动器等。在一些实施方案中，存储装置也可包括在本发明公开的系统中。在一些实施方案中，存储装置可类似于存储器，其可远程集成到系统中。
本发明所公开的系统还可包括至少一个输出装置，例如一个或多个监视器、显示单元、视频硬件、打印机、扬声器等。在一些实施方案中，至少一个输出装置是用于观看诊断视频的监视器。还可包括一个或多个输入装置，例如指示设备(例如鼠标)、文本输入设备(例如键盘)、触摸屏、照相机、检测器等。在一些实施方案中，至少一个输入设备是检测器以接收得自监测区域中的未系链报道分子的信号。在一些实施方案中，检测器可以为单波长或广谱检测器。
本发明所公开的系统还可包括至少一个通信接口，诸如LAN网络适配器、WAN网络适配器、无线接口、蓝牙接口、调制解调器和其他联网接口。
本发明所公开的系统还可包括用于在本发明所公开的系统的各个部件之间进行通信的一个或多个数据母线，例如输入/输出母线和母线控制器。
在一些实施方案中，本发明所公开的系统可包括一个或多个分布式计算机，并且可以以各种类型的软件语言来实施，其包括但不限于C、C++、COBOL、Java、FORTRAN、Python、Pascal等。技术人员可将各种软件源代码编译成可执行软件，以用于本发明所公开的系统。
用于检测靶核酸序列的方法
本发明公开了用于检测样品中的靶核酸序列的各种方法。在一个实施方案中，该方法可包括：(i)将样品与Cas蛋白混合以产生测定混合物，其中Cas蛋白包括具有与感兴趣的靶序列互补的间隔区序列的指导RNA，(ii)温育测定混合物以使样品中的靶核酸与间隔区序列杂交，(iii)将测定混合物与所述装置组合以产生检测混合物，(iv)温育检测混合物，(v)将力施用于检测混合物，所述力足以使未系链报道分子与装置中的固体载体分离；以及(v)检测未系链报道分子。
本发明所公开的方法可包括将Cas蛋白与样品组合，所述样品可以为测试样品，所述测试样品可包含或可不包含靶核酸序列。在这些实施方案中，Cas蛋白包括指导RNA序列。在一些实施方案中，该方法包括在将Cas蛋白与样品组合之前将Cas蛋白与指导RNA序列组合的步骤。在各种实施方案中，样品可与多个Cas蛋白组合，所述Cas蛋白可包括相同或不同序列的多个指导RNA。在这些实施方案中，该方法可能能够检测样品中一个或多个靶序列的存在。将Cas蛋白与样品组合以形成测定混合物。如下所述，样品可以不是测试样品，例如，样品可以为对照样品(已知不具有靶核酸序列)或具有已知量的靶样品的标准样品。
样品可得自各种来源，并且可包括各种核酸序列。在一些实施方案中，样品可得自生物来源、环境来源或合成来源。生物样品可包括例如来自受试者的组织、细胞或体液及其裂解物。在许多这些实施方案中，受试者可以为人类、非人类、真核生物、原核生物等。样品也可得自农业和兽医学科的受试者，包括植物和动物中。环境样品可得自食品、工业、商业、医学和环境表面、空气样品和水样品。在一些实施方案中，体液可包括血液、痰液、血清、血浆、尿液、汗液、唾液、粘液、细胞、细胞器等。
可以将编程的Cas蛋白与样品混合并温育任何合适的时间。在一些实施方案中，样品与Cas蛋白一起温育少于约2小时、90分钟、60分钟、40分钟、30分钟、20分钟、10分钟、5分钟、4分钟、3分钟、2分钟、1分钟、55秒、50秒、40秒、30秒、20秒或10秒，且大于约5秒、10秒、20秒、30秒、40秒、50秒、60秒、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟或90分钟。
可在各种条件下温育测定混合物，以使靶核酸序列(如果存在于样品中)与指导RNA的间隔区序列杂交。在一些实施方案中，条件被设计成有助于RNA-RNA、RNA-DNA或DNA-DNA序列(例如间隔区RNA序列与靶核酸序列)的杂交，其中序列是100％互补的。在其他实施方案中，可改变温育测定混合物的条件以允许间隔区序列与靶序列之间的小于100％的互补性，例如靶核酸与间隔区RNA之间的1个错配或小于约2个错配、3个错配、4个错配或5个错配。在一些实施方案中，当互补性大于约80％时，靶DNA和指导RNA之间的杂交可激活Cas12a蛋白的非特异性DNase活性。
靶序列可以为任何单链或双链核酸序列，例如单链或双链DNA。靶序列可以来源于编码或非编码DNA、cDNA、mRNA、tRNA、rRNA、iRNA、miRNA、编码和非编码RNA。在一些实施方案中，靶核酸来源于病原体，诸如微生物、细菌、真菌或病毒。
如上所述，可包括或可不包括活化的Cas蛋白的测定混合物可与指示装置组合以产生检测混合物。在一些实施方案中，检测混合物被设计成允许活化的Cas蛋白裂解指示核酸序列。在一个实施方案中，指示序列选自单链和双链DNA。在一些实施方案中，活化的Cas蛋白将裂解装置的系链分子中的指示序列。可以选择温育条件以减少未活化的Cas蛋白和具有DNase活性的非Cas蛋白对指示序列的裂解。
核酸酶抑制剂可存在于测定混合物中。在一些实施方案中，测定混合物可包括一个或多个分子，所述分子抑制非Cas 12a依赖性DNA酶活性，但不由于活化的Cas12a蛋白影响DNase活性。例如，抑制剂可抑制哺乳动物、细菌或病毒DNA酶。在一些实施方案中，可将DNase抑制剂添加到样品中以帮助保存靶核酸序列。在这些实施方案中，该方法可包括将一种或多种DNA保存化合物，例如一种或多种DNA酶抑制剂，添加到样品中的步骤。
检测混合物可在各种条件下温育，所述条件可有助于裂解系链分子中的指示序列。在一些实施方案中，温育条件可有助于增强活化的Cas蛋白的活性，同时最小化其他酶的活性。在一些实施方案中，温育条件可促进存在于检测混合物中的所有或基本上所有系链分子的裂解，以帮助优化未系链报道分子的浓度。
在充分温育之后，可将力施加于检测混合物，以帮助分离系链和未系链的报道分子。在一些实施方案中，装置可包括过滤器或者可将检测混合物转移到第二分离装置，所述第二分离装置包括未系链报道分子可透过但固体载体和系链报道分子不可透过的过滤器或膜。分离力可允许未系链报道分子远离固体载体移动或易位。分离力还可有助于通过或经由过滤器或膜使未系链报道分子易位到检测区域中。
分离力可以为磁力、引力、流体、气体或其他力中的一种或多种的结果。在一些实施方案中，可通过对检测混合物进行离心来施加力。在这些实施方案中，离心可提供检测混合物中的流体穿过过滤器或膜所需的力。在这些实施方案中，未系链报道分子(和其他合适的溶质)可流过过滤器或膜并进入检测区域。在这些实施方案中，检测区域可以为检测装置的一部分，该检测装置可以为测试管，例如微量离心管。在其他实施方案中，检测装置可以为多孔板。
在一些实施方案中，所述装置或检测装置可以为侧向流测定装置。在这些实施方案中，当来自样品的溶剂被拉向芯吸垫时，未系链报道分子可穿过过滤器、膜或垫。
可以各种方式来实现对未系链报道分子的检测。在大多数情况下，将未系链报道分子转移到检测区域进行检测。在这些实施方案中，检测区域可包括可用于检测报道分子的存在的底物。在其他实施方案中，检测区域可包括一个或多个分子，其可有助于集中和/或定位报道分子。在一些实施方案中，报道分子可直接或间接产生可通过各种方式检测到的信号。在一些实施方案中，例如其中报道分子为酶，信号可以为比色信号、荧光信号或发光信号。在其他实施方案中，例如其中报道分子为荧光团、纳米颗粒或包括染料分子，信号可以为特定波长下的光的吸收和/或发射。在一些实施方案中，可以通过目视检查、显微镜或光检测器来检测信号。
如果检测区域中的信号大于背景信号，则可确定存在靶序列。在这些实施方案中，背景信号可由已知不包含靶序列，或者其中靶序列已通过添加一个或多个核酸酶或化合物而故意破坏的样品来确定。检测高于背景信号的信号可指示样本中存在靶序列，其中未检测到信号或检测到低于背景信号的信号可指示样本中不存在靶序列。
用于对样品中的靶序列定量的方法
在一些实施方案中，本发明所公开的装置和方法可用于检测生物样品中的靶核酸序列，并提供关于靶核酸序列丰度的定量或定性信息。在这些实施方案中，可将从上述方法检测到的信号与背景信号和/或标准信号进行比较。标准信号可以为包含已知量的报道分子、已知量的靶序列或上述两者的样品的结果。在一个实施方案中，标准样品中的报道分子可附接到系链分子、系链分子的一部分或不含任何其他分子。在一些实施方案中，靶序列可包含在标准样品中，例如在报道分子是酶的情况下。在一个实施方案中，靶序列可以与测试样品中的靶序列相同或不同。测试样品是得自其中靶序列的存在是未知的受试者、患者或来源的样品。
量化测试样品中靶核酸序列的量可包括测量由具有已知浓度的靶核酸序列的标准样品中的未系链报道分子产生的信号的步骤。在这些实施方案中，标准样品可包括测试样品中被测定的相同靶核酸序列，或者其可以是与测试样品中可能存在或可能不存在的靶核酸序列不同的参考靶核酸序列。在这些实施方案中，指导RNA序列与参考核酸序列互补。比较由标准样品和测试样品产生的信号可有助于确定测试样品中靶核酸序列的量。如果检测到的信号大于背景值，则靶核酸序列存在于生物样品中，然后可将该信号与一个或多个标准样品进行比较以确定测试样品中靶核酸序列的数量。
用于检测信号的靶序列的含量
本发明所公开的装置和方法可用于在各种样品中特异性地且灵敏地检测靶核酸序列。在一些实施方案中，本发明所公开的装置和方法可检测样品中的靶核酸序列，其中靶核酸序列的浓度小于约1x10-6M，例如小于约100x10-9M、10x10-9M、1x10-9M、100x10-12M、10x10-12M、1x10-12M、100x10-15M、10x10-15M、1x10-15M、100x10-18M、10x10-18M、1x10-18M。可通过作为未系链报道分子的结果来测量检测区域中检测到的信号量来定量样品中靶核酸的浓度。
用于检测和/或量化靶序列的含量的试剂盒
本发明所公开的装置和方法可与试剂盒(诸如测试试剂盒)一起使用，以用于检测各种样品中的病原体感染，包括活性感染。在一些实施方案中，样品可来源于慢性感染的受试者或个体(人类或非人类)。在一些实施方案中，试剂盒可通过定量样品中靶核酸序列的量来帮助提供感染水平。在一些实施方案中，试剂盒可包括一个或多个指导RNA序列和Cas蛋白质。在一些实施方案中，提供一种或多种Cas蛋白质，其中Cas蛋白质结合到指导RNA序列。在这些实施方案中，对于每种不同的Cas蛋白质，指导RNA序列可以相同，因此试剂盒可识别和/或区分两种或更多种靶序列。在其他实施方案中，试剂盒可包括编码Cas蛋白质和指导RNA的一个或多个核酸。该试剂盒还可包括装置，所述装置至少包括系链到固体载体的报道分子，其中所述系链分子包括至少一个指示序列。该试剂盒还可包括具有检测区域的检测装置，该检测区域可包括可与未系链报道分子相互作用的一个或多个底物分子。
制备用于检测靶序列的装置的方法
本文公开了构建用于确定靶核酸序列的存在的装置的方法，该方法包括：合成系链分子，所述系链分子具有第一末端、第二末端和定位于第一末端和第二末端之间的至少一个指示序列。在一些实施方案中，所述至少一个指示序列可由在3'或5'端处的一个或多个分子以及在两者之间的至少两个胸腺嘧啶碱基合成。所述系链分子可在所述系链分子的第一末端附接到报道分子，并在另一末端附接到固体载体。在一些实施方案中，3'和/或5'末端处的分子可以为锚分子，其用于直接附接到报道分子和固体载体，在其他实施方案中，附加分子可以定位于系链分子和报道分子或固体载体之间。在一些实施方案中，附接固体载体或至少一个报道分子的步骤包括通过一个或多个半胱氨酸键或胺键共价附接到系链分子。
检测装置
本发明所公开的系链报道分子可包括在检测装置中，该检测装置还包括可用于将未系链报道分子与系链报道分子分离的过滤器或膜。检测装置还可包括检测隔室中的检测区域和测定隔室中的测定区域。在一些实施方案中，所述测定区域和检测区域可由一个或多个过滤器或膜分开，其中未系链报道分子可透过但系链报道分子不可透过所述过滤器或膜。在一些实施方案中，报道分子可系链到过滤器或膜上以防止未系链报道分子进入检测区域或检测隔室。
实施例
实施例1
Lba Cas12a A488-ssDNA裂解测定
本实验旨在检测指导RNA和活化剂DNA刺激cas12裂解指示ssDNA序列的能力。具体地讲，将cas12a/指导RNA/靶DNA混合物与A488-ssDNA-磁性小珠混合，并量化ssDNA裂解后释放的A488量。根据具有修改的制造商的方案进行DNase测定。
准备以下材料。从Lba(
Figure BDA0002923447490000251
得自New England BioLabs#M6053T)获得的Cas12a以100μM供应并在-20℃下储存。如下从IDT获得三个指导RNA样品(Gl、G2和G3)，并在DEPC处理水中稀释至100μM(CRI-17，Guidel或Gl，UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCGUCGCCGUCCAGCUCGACC；CRI-18 Guide2或G2，UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGAUCGUUACGCUAACUAUGA；CRI-19，Guide3或G3，U AAUUU CU AC U A AGU GU AGAU C CU GGGU GUU C C AC AGCU GA)。7.2nmol CRI-17/G1在72μL DEPC处理水中稀释。11.2nmol CRI-18/G2在112μL DEPC处理水中稀释。10.2nmol CRI-19/G3在102μL DEPC处理水中稀释。5μL每种指导RNA序列混合物在DEPC处理水中进一步稀释20倍以提供100μL的5μM最终工作原液。将指导RNA序列混合物的原始和工作原液储存在-80℃下直至使用。
还准备了100μM靶dsDNA溶液(活化剂序列；Al、A2、A3)。具体地讲，从制造商获得作为杂交双链体的正义和反义寡核苷酸并如下准备。将66.9nmol的CRI-20正义和反义双链体(序列)(活化剂l或Al＝GCTTGTGGCCGTTTACGTCGCCGTCCAGCTCGACCAGGATGGGCACCACCCCGGC+GCCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGC在669μL DEPC处理水中稀释以获得100μM。将90.4nmol CRI-21(活化剂2或A2＝GACGACAAAACTTTAGATCGTTACGCTAACTATGAGGGCTGTCTGTGGAATGCTA+TAGCATTCCACAGACAGCCCTCATAGTTAGCGTAACGATCTAAAGTTTTGTCGTC)稀释在904μL DEPC-处理水中以获得100μM；将71.3nmol CRI-22(活化剂3或A3＝AGTTGTGTTAGTTTACCTGGGTGTTCCACAGCTGATAGTGATTGCCTTGAATAAA+TTTATTCAAGGCAATCACTATCAGCTGTGGAACACCCAGGTAAACTAACACAACT)稀释在713μL DEPC处理水中以获得100μM。接着，将1μL每种ds靶/活化剂序列在DEPC处理水中稀释100倍以得到1μM最终工作原液。将原始溶液和工作原液在-20℃下储存，直至使用。
如下，按照制造商的建议准备与共价附接到生物素化ssDNA的绿色荧光素染料(A488)结合的链霉亲和素磁珠(SA-Mag珠)。简而言之，将准备用于RNA应用的20μL含有2mgMyOneTM链霉亲和素C1-珠TM在室温下与2000pmol ssDNA一起温育16小时，然后广泛洗涤以去除未结合的ssDNA珠，定量并显示含有约201pmol/mg小珠的序列CRI-13(TTATT)的ssDNA和约433pmol/mg小珠的序列CRI-14(TTATT)的ssDNA，并在4℃下储存。
按照制造商(NEB)和其他地方(Chen等人，Science 2018)的建议，在缓冲液中进行Cas12a DNase测定：测定缓冲液含有50mM NaCl、10mM Tris-HCl、25℃下的pH 7.9、10mMMgCl2、100mg/mL BSA和1M DTT，并由1M MgCl2、1M Tris pH 7.5、5M NaCl、20mg/mL BSA、1MDTT和DEPC处理水的原液制备(如Chen等人，Science，2018中那样)，在使用前在冰上保存，并在-20℃下储存。在48孔无边缘、小型板(BIO-RAD多板PCR板，目录号MLL4801)中进行反应。
如下进行测定。如上所述制备指导RNA和靶DNA，将其解冻并保存在冰上直至使用。从-20℃储存中取出100μM Cas12a原液并保持在冰上直至使用。如下制备4X Cas12a、指导RNA、活化剂DNA溶液：用250μL缓冲液(4X＝200nMCas12a)稀释0.5μL 100μM Cas12a；用24μL缓冲液(4X＝200nM指导RNA)稀释1.0μL 5μM指导RNA；用249μl缓冲液(4.X＝4nM活化剂DNA)稀释1.0μl 1μM活化剂DNA。下文为表，表1，示出了测定板的各个孔的添加组分。
表1：每种4X Cas12a、指导RNA、活化剂DNA的5μL板，根据：
行 酶 指导RNA 活化剂DNA
A - - -
B + - -
C + G1 -
D + G1 A1
E + G2 -
F + G2 A2
G + G3 -
H + G4 A3
如下制备磁性小珠。在制备其他试剂之前，在室温下将含CRI-13小珠或含CRI-14小珠的原液稀释到1mL缓冲液中。然后通过暴露于磁铁2分钟来收集小珠，然后移除上清液并将其丢弃，然后将小珠重新悬浮于40μL缓冲液(4x＝400nM ssDNA底物)中。向每个孔中添加5μL小珠以引发反应。用透明的粘合膜密封该板，并立即放置在37℃下，端到端摇晃。60分钟后，将板在PCR板旋转器中脉冲，并将小珠在24柱磁铁上收集2分钟。然后小心地除去所有上清液，并如下所述进行测定。
A488测定
使用系链在ssDNA上的A488(A488-ssDNA，CRI-13或CRI-14)形成10μM标准品，该标准品储存在-20℃下。如下在缓冲液中制备A488标准品。将12.5μL的10μM ssDNA稀释到112.5μL缓冲液中，以产生1000nM标准溶液。然后将该1000nM标准溶液连续10倍稀释四次，以形成包含1000nM、100nM、10nM、1.0nM和0.1nM ssDNA标准品的五种溶液。将10μL的每种测试溶液与90μL缓冲液混合，并与100μL标准品一起铺板，用于在平底、不透明壁的板上进行荧光检测。
轨道摇动1分钟后，在T＝22℃的BIOTEK Gen5 Synergy H1酶标仪中读取板。Ex/Em波长490/525用于收集荧光发射。
得自这些实验的结果如图5所示。如图5所示的柱状图所示，在存在指导ssRNA和活化剂dsDNA的情况下，Cas12a能够裂解将A488萤石与磁性小珠连接的单链DNA寡核苷酸。图5还展示出来自小珠的A488信号显著高于背景信号，即来自标记为-Cas12a、-指导RNA、-活化剂dsDNA和+Cas12a、+指导RNA、-活化剂dsDNA的泳道的信号均显著小于包含+Cas12a、+指导RNA、+活化剂dsDNA的那些泳道的信号。还观察到，用于这些研究中的Cas12a以比裂解包含两个TTATT序列(CRI-14，下图；释放的52.7-102.3nM)的较长ssDNA引发剂显著更低的效率(CRI-13，上图；释放的1.4-3.4nM)裂解包含序列TTATT的ssDNA指示剂序列。这与DNaseI相反，后者显示CRI-14的裂解效率约为CRI-13的两倍(未示出)。图5还表明，指导2/活化剂2的配对在刺激Cas12a针对较长桥接的DNase活性方面比其他两对(指导1/活化剂1或指导3/活化剂3)更有效。然而，指导2/活化剂2看起来与指导3/活化剂3激活较短桥接上的Cas12aDNase活性的能力大致相同。指导l/活化剂1在两种测定中效力均最低。
实施例2
Lba Cas12a A488-ssDNA裂解测定以分析指导/活化剂特异性
在这些实验中，如实施例1中的方法进行A488-ssDNA-磁性小珠DNase测定。简而言之，从制造商(NEB；M6053T)以100μM获得Lba Cas12a，并储存在-20℃。CRI-17(指导l)、CRI-18(指导2)、CRI-19(指导3)如上所述。CRI-20(活化剂1)、CRI-21(活化剂2)、CRI-22(活化剂3)如上所述。如上所述，与A488结合的SA-磁性小珠与ssDNA，特别是CRI-14结合。如上所述制备在-20℃下储存的测定缓冲液(50mM NaCl，10mM Tris-HCl，25℃下的pH 7.9，10mMMgCl2，100μg/mL BSA，1mM DTT)。同样，这些DNAse酶测定在48孔、无边缘、小型的BIO-RAD多板PCR板(目录号MIX 4801)中进行。对于荧光检测而言，在平底不透明壁的板中对释放到上清液中的A488进行检测，并且如上所述制备一系列包含ssDNA序列CRI-14的A488标准品的稀释液。
在进行测定之前，将试剂在冰上解冻。也将100μM Cas12a原液保持在冰上直至使用。如下制备4x Cas12a、指导RNA和活化剂DNA混合物。用250μL缓冲液稀0 5μL 100μMCasl2a(4X＝200nM Cas12a)；对于Cas12a/EDTA样品，用19μL 200nM Cas12a稀释1μL 0.5MEDTA(4X＝200nM Cas12a，25mM EDTA)；对于指导1和3：用48μL缓冲液稀释将2.0μL 5μM指导RNA(4X＝200nM指导RNA)；对于指导2：用144μL缓冲液稀释6.0μL 5μM指导RNA(4X＝200nM指导RNA)；对于指导/EDTA：用19μL 200nM指导稀释1μL 0.5M EDTA(4X＝200nM指导，25mMEDTA)；对于活化剂1-3：用249μL的缓冲液稀释1.0μL 1μM活化剂DNA(4X＝4nM活化剂DNA)；对于活化剂2稀释液，制备了10倍系列稀释液：用45μL稀释5μL活化剂(4X＝4000、400、40、4、0.4、0.04pM活化剂DNA)；对于活化剂/EDTA：用19μL 4nM活化剂稀释1μL0.5M EDTA(4X＝4nM活化剂，25mM EDTA)。
根据下表2，将5μL的4X Cas12a、指导RNA和活化剂DNA溶液各自加入到板中。
表2
Figure BDA0002923447490000291
如下制备包含ssDNA指示剂序列和A488的磁性小珠珠。将含CRI-14小珠原液稀释到0.5mL缓冲液中，并在试剂制备期间在室温下静置。通过暴露于磁体2分钟来收集小珠，并去除并丢弃上清液。然后将小珠重新悬浮于210μL缓冲液中(以4x＝400nM)。将5μL小珠转移到每个孔中以引发反应。在含有EDTA的孔中，实现19mM的EDTA，这比10mM MgCl2的1X缓冲液溶液过量。
将测定板用透明的粘合膜密封，并立即在端到端摇动的情况下置于37℃下。60分钟后，将板在PCR板旋转器中脉冲，并在24柱磁体上收集小珠2分钟，并小心除去所有上清液。
A488测定
如上所述制备A488定量标准品。简而言之，通过在112.5μL缓冲液中稀释12.5μL的10μM标准溶液，然后连续稀释四次以形成1000nM、100nM、10nM、1.0nM和0.1nM ssDNA的5个标准溶液来制备A488-ssDNA标准品。对于荧光检测，在不透明壁板上测定10μL的每种上清液(用90μL缓冲液稀释)和100μL标准溶液。
如上所述，在BIOTEK Gen5 Synergy H1酶标仪上读取读数(T＝22℃，在轨道上摇动1分钟，Ex/Em波长为490/525)。结果示于下表3和图6-8中。
表3：响应于不同活化剂DNA浓度而释放的A488
Figure BDA0002923447490000301
对于活化剂2dsDNA的指导2RNA活化的检测的这些测定的检测限(LOD)在1pM至10pM之间(图6)。这些实验示出，Cas12a对DNA底物的裂解(a)取决于游离Mg2+(因为EDTA消除了活性)，并且(b)取决于RNA指导和dsDNA靶的正确组合(图7-8)。如上所示，使用指导2RNA/活化剂2组合观察到最大的活性。然而，在这些实验中，指导1RNA/活化剂1比指导3RNA/活化剂3刺激了更多的活性，这与实施例1中在CRI-14小珠上获得的相反。
本公开已经参考各种示例性实施方案进行。然而，本领域技术人员将认识到，可在不脱离本公开的范围的情况下对实施方案进行改变和修改。例如，取决于特定的应用或考虑与系统的操作相关联的任何数量的成本函数，可以以替代方式来实现各种操作步骤以及用于执行操作步骤的组件例如，这些步骤中的一个或多个可以删除、修改或与其他步骤组合。
为了概念上的清楚起见，将本文所述的组件(例如，步骤)、装置和对象以及伴随它们讨论用作示例。因此，如本文所使用的，所述的具体示例和所附的讨论旨在代表其更通用的类别。一般来讲，本文中任何特定示例的使用也旨在代表其类别，并且不包括本文中的此类特定组件(例如，步骤)、装置和对象不应视为表示期望进行限制。
关于本文中基本上任何复数和/或单数术语的使用，读者可以视上下文和/或应用而定地将其从复数转换为单数和/或将单数转换为复数。为了清楚起见，本文未明确示出各种单数/复数置换。
尽管已经示出和描述了本文所述的本发明主题的具体方面，但是对于本领域技术人员而言将显而易见的是，基于本文的教导内容，可在不脱离本文所述的主题的情况下进行改变和修改，并且其更广泛的方面，因此，所附权利要求将所有这些改变和修改都包含在其范围内，如在本文所述主题的真实精神和范围内那样。此外，应当理解，本发明由所附权利要求限定。一般来讲，本文所用的术语，并且尤其是在所附权利要求中使用的术语(例如，所附权利要求的主体)一般旨在作为“开放”术语(例如，术语“包括”应解释为“包括但不限于”，术语“具有”应解释为“至少具有”，术语“包含”应解释为“包含但不限于”等)。本领域技术人员还将理解，如果旨在引入特定数量的引入的权利要求列举，则将在权利要求中明确地列举这种意图，并且在不存在此类列举的情况下，不存在这种意图。例如，为了帮助理解，以下所附权利要求可包含介绍性短语“至少一个”和“一个或多个”的使用以引入权利要求的列举。然而，此类短语的使用不应当理解为暗示由不定冠词“一”或“一个”引入的权利要求列举将包含此类引入的权利要求列举的任何具体权利要求限制为仅包含一个此类列举；即使相同的权利要求包括介绍性短语“一个或多个”或“至少一个”以及不定冠词诸如“一个”或“一个”也是如此(例如，“一个”和/或“一个”通常应解释为意指“至少一个”或“一个或多个”)；使用用于引入权利要求列举的定冠词也是如此。此外，即使明确列举了具体数量的引入权利要求列举，这种叙列举通常也应解释为至少意指所列举的数目(例如，没有其他修饰语的“两次列举”的裸列举，通常意指至少两次列举，或者两次或更多次列举)。此外，在使用类似于“A、B和C等中的至少一个”的约定的那些情况下，一般来讲，此类构造旨在从约定意义来看(例如，“具有A、B和C中至少一个的系统”将包括但不限于仅具有A，仅具有B，仅具有C，A和B一起，A和C一起，B和C一起，和/或A、B和C一起等等的系统)。在使用类似于“A、B或C等中的至少一个”的约定的那些情况下，一般来讲此类构造从约定意义上来看(例如，“具有A、B或C中至少一个的系统”将包括但不限于仅具有A，仅具有B，仅具有C，A和B一起，A和C一起，B和C一起，和/或A、B和C一起等等的系统)。实际上，无论是在说明书、权利要求书还是附图中，呈现两个或更多个替代术语的任何析构词和/或短语都应理解为考虑包括这些术语中的一个、这些术语中的任一个或两个术语的可能性。例如，短语“A或B”将被理解为包括“A”或“B”或“A和B”的可能性。
尽管本文已公开了各个方面和实施方案，但本文所公开的各个方面和实施方案是出于说明的目的，而不旨在进行限制，真实的范围和精神由所附权利要求指示。
序列表
<110> 脱其泰有限责任公司
<120> 使用新型CRISPR酶介导的检测策略特异性检测脱氧核糖核酸序列
<130> 0917-002-002-000000
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 1
ttattttatt 10
<210> 2
<211> 41
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 2
uaauuucuac uaaguguaga ucgucgccgu ccagcucgac c 41
<210> 3
<211> 41
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 3
uaauuucuac uaaguguaga ugaucguuac gcuaacuaug a 41
<210> 4
<211> 41
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 4
uaauuucuac uaaguguaga uccugggugu uccacagcug a 41
<210> 5
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 5
gcttgtggcc gtttacgtcg ccgtccagct cgaccaggat gggcaccacc ccggc 55
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<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 6
gccggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg taaacggcca caagc 55
<210> 7
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 7
gacgacaaaa ctttagatcg ttacgctaac tatgagggct gtctgtggaa tgcta 55
<210> 8
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 8
tagcattcca cagacagccc tcatagttag cgtaacgatc taaagttttg tcgtc 55
<210> 9
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 9
agttgtgtta gtttacctgg gtgttccaca gctgatagtg attgccttga ataaa 55
<210> 10
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 10
tttattcaag gcaatcacta tcagctgtgg aacacccagg taaactaaca caact 55

Claims (35)

1.一种用于确定靶核酸序列存在的装置，所述装置包括：
测定区域，所述测定区域包括：
至少一个报道分子，
系链分子，所述系链分子具有：
第一末端，
第二末端，和
至少一个指示核酸序列，所述指示核酸序列用于感测定位于所述第一末端和所述第二末端之间的活化Cas核酸酶的存在，其中所述至少一个报道分子附接在所述第一末端处；以及
固体载体，所述固体载体附接在所述系链分子的所述第二末端处；
检测区域；以及
过滤器，所述过滤器定位于所述检测区域和所述测定区域。
2.根据权利要求1所述的装置，其中所述至少一个指示核酸序列大于两个核碱基，包括选自腺苷、尿嘧啶或胸苷的至少两个碱基。
3.根据权利要求1所述装置，其中所述系链分子包括下列中的至少一种：聚乙二醇(PEG)、脱氧核糖核酸(DNA)、链霉亲和素、生物素、马来酰亚胺、硫、硫醇、氨基酸、蛋白质、琥珀酰亚胺、细菌蛋白质、烷基卤脱卤酶(HaloTag)、氯烷烃、三唑、砜、谷氨酰胺或赖氨酸。
4.根据权利要求1所述的装置，其中所述至少一个报道分子包括下列中的一种或多种：荧光分子、发光分子、蛋白质、融合蛋白、酶、SERS(表面增强拉曼光谱)颗粒或纳米颗粒。
5.根据权利要求1所述的装置，其中所述固体载体附接到远离所述检测区域的过滤器或为所述过滤器的部分。
6.根据权利要求1所述的装置，其中所述系链分子包括附接到所述固体载体的多个系链分子，并且其中所述固体载体包括纤维或小珠中的至少一种，所述纤维或小珠各自包括下列中的一种或多种：纤维素、琼脂糖、丙烯酰胺、葡聚糖或金属。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的装置，其中所述Cas蛋白为Cas12。
8.根据权利要求7所述的装置，其中所述Cas蛋白为Cas12a并且所述指示核酸序列为单链脱氧核糖核酸。
9.一种构建用于确定靶核酸序列存在的装置的方法，所述方法包括：
合成系链分子，所述系链分子具有：
第一末端，
第二末端，和
至少一个指示核酸序列，所述指示核酸序列定位于所述第一末端和所述第二末端之间，所述至少一个指示序列包括选自两个尿嘧啶碱基和两个胸苷碱基的至少两个核碱基；
将报道分子附接在所述系链分子的所述第一末端；以及
将所述系链分子的所述第二末端附接到固体载体，其中所述固体载体具有至少一个至少约1μm的可测量尺寸。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述固体载体或所述至少一个报道分子的所述附接包括共价附接所述半胱氨酸键或胺键中的一个或多个。
11.根据权利要求9或权利要求10所述的方法，其中所述指示核酸序列为单链核糖核酸。
12.根据权利要求10或权利要求11所述的方法，其中所述指示核酸序列为单链或双链脱氧核糖核酸。
13.一种用于确定靶核酸序列存在的系统，所述系统包括:
经修饰的Cas蛋白分子，其包括与所述靶序列互补的指导RNS序列；
用于确定核酸内切酶的存在的装置，所述装置包括：
至少一个报道分子；
系链分子，所述系链分子具有：
第一末端，
第二末端，和
至少一个指示核酸序列，所述指示核酸序列定位于所述第一末端和所述第二末端之间，其中所述至少一个报道分子附接在所述第一末端；以及
固体载体，所述固体载体附接在所述系链分子的所述第二末端；
测定隔室；
检测隔室；以及
过滤器，所述过滤器定位于所述测定隔室和所述检测隔室之间，其中未系链的报道分子可透过所述过滤器。
14.根据权利要求13所述的系统，其中所述固体载体或所述至少一个报道分子中的至少一者通过半胱氨酸键或胺键中的一者或多者共价附接到所述系链分子。
15.根据权利要求14所述的系统，其中所述Cas蛋白分子为Cas12a。
16.根据权利要求15所述的系统，其中所述Cas蛋白为Cas12a并且所述指示核酸序列为单链脱氧核糖核酸。
17.一种检测生物样品中的靶核酸序列的方法，所述方法包括：
将生物样品与组合物混合以形成样品混合物，所述组合物包含至少一种经修饰的Cas蛋白分子，所述经修饰的Cas蛋白分子包含具有与靶序列互补的序列的指导RNA；
将所述样品混合物与核酸酶检测装置一起温育以形成测定混合物，所述核酸酶检测装置包括：
固体载体，
至少一个报道分子；和
系链分子，所述系链分子具有第一末端和第二末端，所述系链分子在第一末端处附接到所述固体载体并且在第二末端处附接到所述至少一个报道分子，所述系链分子包含定位于所述第一末端和所述第二末端之间的至少一个指示序列；
将所述测定混合物温育测定时间段；
将分离力施加于所述测定混合物；以及
检测来自未系链报道分子的信号，其中如果所检测到的信号大于背景值，则所述靶序列存在于所述生物样品中，其中所述背景值得自缺乏所述靶序列的生物样品。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述生物样品来自人并且选自或来源于血液、汗液、血清、痰液、唾液、粘液、细胞或组织中的一种或多种。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述靶序列来源于真菌、细菌、病毒、原生动物或哺乳动物细胞。
20.根据权利要求17所述的方法，其中所述至少一个报道分子选自下列中的一种或多种：荧光分子、发光分子、融合蛋白、蛋白质、酶、SERS颗粒或纳米颗粒。
21.根据权利要求17所述的方法，其中所述固体载体为纤维或小珠，包括纤维素、琼脂糖、丙烯酰胺、葡聚糖或金属中的一种或多种，其中多个系链分子附接到所述固体载体。
22.根据权利要求17所述的方法，其中所述系链分子包括下列中的一种或多种：PEG、DNA、链霉亲和素、生物素、马来酰亚胺、硫、硫醇、氨基酸、蛋白质、琥珀酰亚胺、细菌蛋白质、烷基卤脱卤酶(HaloTag)、氯烷烃、三唑、砜、谷氨酰胺或赖氨酸，并且所述系链分子共价附接到所述固体载体和/或所述报道分子。
23.根据权利要求17所述的方法，其中所述分离力选自下列中的至少一种：离心、侧向流体流、微流体流或磁力。
24.根据权利要求17所述的方法，其中所述信号通过下列中的一者或多者检测：拉曼光谱、荧光光谱、发光计、目视检测或表面等离子体共振。
25.根据权利要求17所述的方法，其还包括在检测来自所述未系链报道分子之前，通过过滤器过滤所述未系链报道分子。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述固体载体为侧向流装置中的过滤器。
27.根据权利要求17至26中任一项所述的方法，其中所述Cas蛋白分子为Cas12a。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述Cas蛋白为Cas12a并且所述指示核酸序列为单链核糖核酸。
29.一种检测生物样品中的靶核酸序列的方法，所述方法包括：
获得生物样品；
将所述生物样品与组合物混合以形成样品混合物，所述组合物包含用与所述靶序列互补的指导RNA序列修饰的至少一个Cas分子；
将所述样品混合物与指示装置温育以形成测定混合物，所述指示装置包括：
聚丙烯酰胺葡聚糖小珠，
系链分子，所述系链分子具有第一末端和第二末端，其中所述第一末端附接到所述聚丙烯酰胺葡聚糖小珠；以及
至少一种荧光素酶，所述荧光素酶附接到所述系链分子的第二末端，其中所述系链分子包括定位于所述第一末端和所述第二末端之间的至少一个指示核酸序列，并且所述至少一个指示序列包括至少2个核碱基，所述至少2个核碱基包括至少两个尿嘧啶碱基；
将所述测定混合物温育测定时间段；
将离心力施加于所述测定混合物；
迫使所述测定混合物中的至少一部分通过所述报道分子可透过的过滤器；
使未系链的报道分子穿过所述过滤器到包括荧光素的检测隔室中；
检测响应于由荧光素酶氧化荧光素而产生的光。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述Cas蛋白分子为Cas12a。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述Cas蛋白为Cas12a并且所述指示核酸序列为单链核糖核酸。
32.一种用于确定靶核酸序列存在的系统，所述系统包括：
经修饰的Cas蛋白分子，其包括与所述靶序列互补的指导RNA序列；
用于确定核酸内切酶的存在的装置，所述装置包括：
第一指示装置，所述第一指示装置包括：
至少一个第一报道分子；
第一系链分子，所述第一系链分子具有：
第一末端，
第二末端，和
至少一个第一指示核酸序列，所述第一指示核酸序列定位于所述第一末端和所述第二末端之间，其中所述至少一个第一报道分子附接在所述第一末端；以及
第二指示装置，所述第二指示装置包括：
至少一个第二报道分子；
第二系链分子，所述第二系链分子具有：
第一末端，
第二末端，和
至少一个第二指示核酸序列，所述第二指示核酸序列定位于所述第一末端和所述第二末端之间，其中所述至少一个第二报道分子附接在所述第一末端；以及
固体载体，所述固体载体附接在所述第一系链分子和所述第二系链分子的第二末端；
测定隔室；
检测隔室；以及
过滤器，所述过滤器定位于所述测定隔室和所述检测隔室之间，其中未系链的报道分子可透过所述过滤器。
33.根据权利要求32所述的系统，其中所述Cas蛋白分子为Cas12a。
34.根据权利要求33所述的系统，其中所述Cas蛋白为Cas12a并且所述第一指示核酸序列为单链核糖核酸。
35.根据权利要求32-34中任一项所述的系统，所述第一报道分子为选自脂肪酶、甘氨酸酶、核酸酶、限制性核酸内切酶和蛋白酶的酶，并且所述第二指示序列选自脂质、碳水化合物、核酸、肽和蛋白质。
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