CN101821411A - 核酸序列的鉴定 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于检测靶核酸的方法，包括以下步骤：(i)将单链探针核酸与目的样品在如果存在靶核酸时通过所述探针核酸与所述靶核酸的特异性杂交而有效地产生探针/靶核酸双链体的条件下接触；(ii)将任意的探针/靶核酸双链体与核酸外切酶接触以引起该双链体的消化并从该双链体释放标记分子；以及(iii)通过拉曼光谱法检测该标记。
Description
技术领域
本发明涉及核酸序列的鉴定。更具体地，本发明涉及使用核酸外切酶通过降解靶核酸序列和探针核酸序列之间形成的核酸双链体来促进靶序列的鉴定，使得当探针与靶标或核酸双链体结合/缔合时在降解时生成可辨别的信号，该信号可通过拉曼光谱法检测到。
介绍
现代分子诊断学产业价值200亿英镑，并且以每年10％的速度增长。尽管依赖于多种不同的技术，此不断增长的市场中主流的是基于扩增的方法(主要是基于聚合酶链式反应(PCR)的测定法)。其原因是生物体和人的基因组的确特别复杂，并且对于特定的疾病或诊断试验需要对目的区进行简化。除了降低基因组的复杂性以外，基于扩增的方法还增加了为检测所获取的材料量。当考虑诸如荧光或化学发光的常规技术的可利用性和灵敏度时这是很重要的。
PCR是一种用于复制和扩增DNA链的特定区(或基因)的分子生物学技术。小量的DNA可被指数地扩增，而不使用活生物体诸如酵母或大肠杆菌(E.coli)，从而得到足够的要被适当地检测的DNA。该技术用于多种应用诸如检测感染性或遗传性疾病和疾病状态、基因的克隆、法医学中的亲子鉴定和遗传指纹分析。
PCR方法循环进行。每个循环由三个步骤组成：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，要被扩增的含有靶区或目的基因的双链DNA模板被加热以破坏两条链之间的氢键。这导致它们分离并能与引物(与要扩增的DNA区的起始和末端互补的DNA或RNA短片段)接触。
在退火步骤中，温度降低，使得引物与靶DNA上的互补序列杂交，所述互补序列侧邻要扩增区。由于经常使用大量过量的引物，靶链与引物彼此相对地结合。
在延伸步骤中，DNA聚合酶(合成目的DNA区的新拷贝的酶)以各个引物开始拷贝DNA链，并将新链以5’至3’的方向延伸。这样产生了组成用于下一循环的模板的两个拷贝的双链DNA。由此，在各个新循环中复制两倍的DNA量。第二循环产生4个拷贝的双链靶DNA序列。在第三个循环后，有8个拷贝的双链靶DNA序列，其中两个恰好组成靶区。其他拷贝也包括侧翼DNA区。一般进行约20～35个循环。
定量PCR(QPCR)也称为实时PCR，是一种PCR的改良方法。该技术通常用来检测样品内的DNA的特定序列。如果存在该特定序列，则QPCR可实时地迅速测定PCR产物的量。由此，其可用于间接地测定存在的起始物质的量。大多数QPCR法使用荧光报告分子，该报告分子随着每个扩增循环的PCR产物的积累而增加。
一种此类技术是SYBR Green法。SYBR Green染料可与刚合成的双链DNA结合，并且因此可测量到荧光强度的增加。这样随后能够测定初始DNA浓度。
序列特异性探针(例如，TaqMan探针或分子信标(Molecular Beacon))也普遍用于QPCR。TaqMan探针被设计成与特定DNA序列，通常为所需PCR产物的一段杂交。探针含有发荧光的报告染料。探针也含有猝灭剂，其吸收由报告染料发射的荧光。猝灭剂紧密接近报告染料会阻止后者的荧光。在PCR循环的延伸期间，DNA聚合酶的核酸外切酶活性使得其“重写”探针将探针断裂成多个独立的片段。因而，猝灭剂分子与报告染料分开，荧光增加。
分子信标的作用方式类似于TaqMan探针。分子信标是发夹形探针，其一般也含有荧光团/猝灭剂对，并且被设计成检测DNA的特定序列。猝灭剂的紧密接近也阻止了荧光团的荧光。然而，当该探针与互补的核苷酸序列杂交时，该探针矫正，在荧光团和猝灭剂之间引入了足够的距离以发生荧光。尽管如此，荧光检测与灵敏度有关，为了成功地检测，可能需要扫描超过背景的相对大的荧光信号。
放射性标记的探针也已经用来检测DNA。其应用的优点在于允许非常敏感的技术，但缺点是难以安全地处理和处置放射性标记探针。另外，这些技术不能进行持续的测定(有时称为均相测定)，因为在可能进行任何定量测定之前需要分离未反应的底物。因此，这些技术常常不能用作较新的技术诸如涉及分子信标和TaqMan探针的技术。
S.C.Hillier等人报道(Electrochemistry Communications(电化学通信)，6，1227-1232(2004))了一种利用针对互补探针靶寡核苷酸序列的T7核酸外切酶活性的电化学基因检测测定法，其中说明的方法用于使用5’-二茂铁标记的探针检测特定DNA序列。该探针与靶区杂交，然后对双链DNA显示5’至3’核酸外切酶活性的T7核酸外切酶在探针的5’端切割末端核苷酸，释放二茂铁。释放的二茂铁迁移至电极表面导致电极处的二茂铁氧化电流增加。然而，该测定不是均相的，因为任何未掺入或未杂交的探针要在检测之前被分离，否则它们会产生背景信号。
美国专利第5,853,990号(Winger等人)描述了使用RNA探针测定核苷酸序列。RNA探针与靶DNA序列杂交，该RNA探针已经被修饰使得其含有类似于TaqMan测定中使用的标记。然后使用RNaseH酶来选择性地降解嵌合体的RNA链以便从猝灭剂释放该标记。
发明概述
本发明基于对某些核酸外切酶消化双链(即，双链体)核酸的能力的认识。该加工能力能够提供一种系统，其中信号传导分子可在消化核酸双链体时被释放并且该信号传导分子/标记可通过拉曼光谱法并且尤其是SE(R)RS而被检测到。
因此，在第一个方面，本发明提供了一种用于检测靶核酸的方法，包括以下步骤：
(i)将单链探针核酸与目的样品在以下条件下接触：如果存在所述靶核酸，通过所述探针核酸与靶核酸的特异性杂交，则有效产生探针/靶核酸双链体；
(ii)将任意的探针/靶核酸双链体与核酸外切酶接触以实现所述双链体的消化并从所述双链体释放标记分子；以及
(iii)通过拉曼光谱法检测所述标记。
优选地，核酸外切酶不具有寡核苷酸合成或聚合酶能力；换句话说，与核酸外切酶接触仅导致寡核苷酸降解，而非寡核苷酸的构建。
靶核酸获自目标样品，目标样品可以是流体、液体、空气、来自固体表面的拭子等。
在进一步的方面，本发明提供了一种由多个部分组成的试剂盒，包括：
(i)单链探针核酸；
(ii)能够消化双链核酸的核酸外切酶；以及
(iii)拉曼可检测标记。
在本发明的一个实施方案中，探针核酸用标记进行标记。在另一个实施方案中，该标记能够与双链体核酸结合。该标记是这样的，以致其可通过拉曼光谱法检测，其中使用诸如表面增强拉曼散射(surface-enhancedRaman scattering)(SERS)或表面增强共振拉曼散射(surface-enhancedresonance Raman scattering)(SERRS)技术的方法。适当的标记公开在后面提到的现有技术中，并且可称为“SE(R)RS标记”，该术语指可由SERS和/或SERRS检测到的标记。
本发明相对于现有技术诸如PCR的一个特殊的优点在于，没有必要必须进行靶核酸的扩增，因为可检测信号，尤其是采用SE(R)RS，使用微量靶核苷酸就能提供足够的灵敏度。
例如，在WO97/05280、WO99/60157和WO2005/019812以及许多研究文章，尤其是Duncan Graham(共同)编著的那些文章(见例如，SERRSDyes(SERRS染料).第二部分Synthesis and evaluation of dyes for multiplelabelling for SERRS(用于SERRS多重标记的染料的合成和评价)(McHugh，C.J.，Docherty，F.T.，Graham，D.，Smith，W.E.Analyst，2004，129，1，69-72)；以及Biosensing Using Silver Nanoparticles and Surface Enhanced ResonanceRaman Scattering(使用银纳米颗粒的生物传感和表面增强共振拉曼散射)(Graham，D，Faulds，K，Smith，W.E.，Chemical Communications(化学通信)，2006，42，4363-4371))中公开了SE(R)RS作为检测方式的应用。
在WO97/05280、WO99/60157和WO2005/019812中，说明了SE(R)RS在用于检测或鉴定特定核酸序列的方法中的应用。在这些出版物中，检测基于/测定靶序列的结合对SE(R)RS的直接作用。相反，要理解的是本发明允许通过核酸双链体的消化而引起的可检测标记的释放来检测靶序列，该释放指示探针已经结合于靶序列。
据我们所知，其中使用核酸外切酶来从杂交的探针/靶双链体中释放拉曼/SE(R)RS可检测标记的拉曼或SE(R)RS检测与核酸序列鉴定的组合至今还未曾报道过，并且该组合代表了本发明进一步的方面。在此方面，本发明提供了一种用于检测靶核酸的方法，包括以下步骤：
(i)将单链探针核酸与目的样品在有效地允许所述探针核酸与靶核酸的特异性杂交的条件下接触，如果在所述目的样品中存在所述靶核酸则生成探针/靶核酸双链体；
(ii)将任意的探针/靶核酸双链体与核酸外切酶接触以实现所述双链体的消化并从所述双链体释放标记分子；
该标记分子通过SE(R)RS检测。
在本发明的一个更进一步的方面，提供了一种同时检测目的样品中的多个不同的靶核酸的方法，包括使用多种根据本发明的用于检测靶核酸的方法，其中不同的标记用于检测各种所述靶核酸。
在本发明的一个进一步的方面，本发明提供一种由多个部分组成的试剂盒，包括：
(i)探针核酸；
(ii)能够消化双链核酸的核酸外切酶；以及
(iii)SE(R)RS可检测标记。
在某些实施方案中，试剂盒中的探针核酸是具有5’-磷酸酯基团的单链探针核酸；并且核酸外切酶是λ核酸外切酶。
检测有时小量的靶核酸而不需复制靶标的能力是本发明的一个特别的优势，并且代表了本发明的一个进一步的方面。
在此方面，本发明提供了一种用于检测靶核酸的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)将单链探针核酸与目的样品在通过所述探针核酸与靶核酸的特异性杂交，如果存在所述靶核酸则有效产生探针/靶核酸双链体的条件下接触；以及
(ii)将任意的探针/靶核酸双链体与核酸外切酶接触以实现所述双链体的消化并从所述双链体释放标记分子，
其中在步骤(i)中过量的所述探针核酸与所述目的样品接触使得步骤(ii)中双链体的所述消化使靶核酸再循环一次或多次，从而使更多的探针分子与靶核酸特异性地杂交，形成额外的探针/靶核酸双链体，额外的探针/靶核酸双链体被消化以释放更多的标记分子。
在本发明的一个更进一步的方面，提供了靶核酸作为模板的应用，单链探针核酸与该模板特异性杂交并且得到的探针/靶核酸双链体被核酸外切酶降解从而从该双链体释放标记分子，其中所述靶核酸用作所述模板多次以便从多个双链体中释放多个标记分子，并且其中各个所述多个双链体包括相同的靶核酸。
附图简述
图1(a)示意性地显示本发明的一个采用SERRS检测的实施方案。开始采集含基因组未扩增DNA的样品，并加热使DNA成为单链。然后加入探针，探针特异性地与DNA的靶序列结合。此探针以特定的方式设计，取决于所使用的检测策略：其可具有5’磷酸酯基团，例如，用于使λ核酸外切酶发生作用。在SERRS检测的情况下，探针可以，例如，含有3’羟基喹啉染料，该染料在附着于探针的同时不产生SERRS信号。然而，在酶的作用和探针的消化后，染料被释放至溶液中，使得在添加适当的基底诸如银纳米颗粒时获得SERRS信号。
图2显示了本发明进一步的实施方案，其中检测探针是附着在探针序列表面上的金属纳米颗粒。由于静电排斥作用，使得这些纳米颗粒不能聚集在一起。探针序列可以不同的方式被修饰，尤其是被修饰以促进SERRS检测以及可视化检测。系统(a)使用在3’端处附着于表面并且在5’端处已经用磷酸酯基团修饰的探针。在与靶序列杂交并且随后由核酸外切酶消化后，DNA被降解导致颗粒的聚集，此聚集可作为表面等离子体上的位移以及任选地独特的颜色变化而被观察到。在系统(b)中，SERRS活性染料将间隔地排列在纳米颗粒的表面上，然而，直至与靶标杂交、被酶消化并且因此发生聚集时才观察到信号。在发生聚集后，将获得SERRS信号。在系统(c)中，使用的探针与图1中使用的探针相同；在杂交和消化后，SERRS染料将被释放，并且当纳米颗粒杂交时其能够与表面附着并产生SERRS信号。
图3是根据本发明的测定的示意流程图，该测定当寡核苷酸探针与靶核酸结合时采用λ核酸外切酶来消化寡核苷酸探针并去除未被消化的探针。
图4显示当其中一条链带有5’磷酸酯部分的双链DNA暴露于λ核酸外切酶时荧光随时间的变化而增加，并且与缺少λ核酸外切酶时进行的相同试验进行比较。
图5显示当其中一条链带有5’磷酸酯部分的双链DNA暴露于两种不同用量的λ核酸外切酶时荧光随时间的变化而增加，并且与缺少λ核酸外切酶时进行的相同试验进行比较。
图6显示在λ核酸外切酶对暴露于λ核酸外切酶的同一双链DNA(其结果显示在图1和图2中)和其中基底具有5’缺口；平5’端和3’尾；5’缺口和3’尾的修饰的DNA加工时荧光的增加；以及在缺少λ核酸外切酶时与未修饰的DNA比较。
图7显示在存在/缺少互补序列时在酶消化和随后的清除步骤后测定反应物的SERRS光谱。
图8显示在存在/缺少互补靶序列时被λ核酸外切酶消化后在TAMRA标记探针(PTBPROBE)的1650em-1处的平均主峰高的SERRS强度。也显示了在相同条件下操作但缺少酶的对照反应用于比较。引用的值为对每种类型反应的三个单独的重复试验进行的三次测定的平均值。
图9显示在消化、灭活和生物素去除步骤后的测定反应(虚线)以及在缺少酶时进行的相同反应(直线)的SERRS光谱。
图10显示基于FRET的测定的示意图。
图11显示在低靶标浓度催化研究中使用的测定形式。染料标记的探针显示为八角星，小沟结合剂为十字(X)，靶标为粗线。在λ核酸外切酶的存在下消化不同比例的FAM-标记探针与互补的靶序列(1∶1；10∶1，100∶1)。FAM标记探针和H33258的浓度恒定地保持在1μM；减小互补序列的浓度。反应混合物加热至37℃30分钟，然后在75℃下进行酶灭活步骤15分钟。在荧光的水平低于检测器水平时，加入过量的靶标以试图形成双链体并且因此如果有相当大的量的探针未被消化则产生熔解曲线。
图12显示在存在(下部的曲线)/缺少(上部的曲线)λ核酸外切酶时FRET双链体在30分钟内的荧光强度变化。荧光强度减小表明消化破坏了FRET系统。标记探针：补体的比例为(1∶1)。
图13显示含有相对于靶序列初始过量(100∶1)的探针的样品的荧光退火曲线。两种样品中掺入额外的靶标。下部的迹线显示其中加入酶的样品，显示荧光强度没有大的变化。上部的迹线缺少酶，因此显示急剧的荧光跃迁～58C，与此序列的双链体的Tm相关。
图14显示在H33258和λexo的存在下对照单链FAM探针(下部的实线)；具有H33258的双链DNA(杂交的FAM探针)(上部实线)；以及具有H33258和λexo的双链DNA(虚线)的荧光，显示在30分钟内消化作用的进程。
图15显示未消化的(实线)和消化的(虚线)DNA的退火曲线。未消化的样品显示Tm≈57℃。
图16显示使用FAM探针的不同补体用λexo消化30分钟后的强度变化。对于每对，左侧条形代表无酶样品的荧光变化，右侧为有酶样品(除5’突出端仅一个测定值以外，显示三次测定的平均值)。
图17显示本发明的一个实施方案的示意图，其中使用包括SE(R)RS标记和生物素的单链探针核酸，使用链霉抗生物素蛋白涂布的磁体去除未反应或过量的探针，使得在被核酸外切酶降解之前仅检测到存在于探针/靶双链体中的SE(R)RS标记。
图18显示琼脂糖TBE凝胶，该凝胶显示了根据本发明的实施例对靶核酸(沙眼衣原体(C.trachomatis)DNA)(2～9泳道)与阴性对照(12～19泳道)相比较的检测。
图19描绘了沙眼衣原体DNA与阴性对照，以及不同的探针浓度的SERRS分析的结果。
图20描绘了含有沙眼衣原体DNA的样品与阴性对照相比较的SERRS光谱。
图21示意性地绘制了一个测定试验方案，其中靶核酸相继地与结合于链霉抗生物素蛋白涂布磁珠的生物素化捕获探针接触，然后与末端为SERRS活性染料标记的5’-磷酸酯的探针接触，所得的双链体被λ核酸外切酶消化，使得能够使用SERRS检测染料。
图22显示图21中绘制的测定(上部的光谱)与其中使用无染料标记的探针的阴性对照(下部的光谱)的SERRS响应。
图23显示8-羟基喹啉衍生染料的SERRS光谱。
图24显示本发明的一种方法，该方法涉及从在两个探针核酸和靶核酸杂交时形成的探针/靶核酸双链体释放标记。
图25显示图24中绘制的实施方案的变型，其中靶DNA被固定在固体表面诸如珠子或平板上的捕获探针捕获。
发明详述
术语“靶标”、“样品”或“目的样品”在此是指含任意核酸的样品，例如从(多个)个体分离的含核酸的样品。“靶核酸”可以是任意的核酸，包括DNA(来自任意来源，例如，基因组、cDNA、合成的等)、RNA(例如，mRNA、tRNA、rRNA、合成的等)或它们的衍生物(诸如本领域中已知的稀有/罕见的天然来源核苷酸碱基和/或合成的核苷酸碱基的内含物)。样品可代表指定来源中存在的所有或仅一些核酸。可在检测之前制备样品以便使其中的靶核酸更有效地为检测方法所利用。例如，靶核酸可全部或部分地被纯化和/或可产生并分离其片段。作为直接使用样品中的核酸的替代方法，或除直接使用以外，可制备并使用其拷贝(例如，通过PCR)。术语“靶核酸”涵盖所有这些可能性。
术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”在此用来指基于含有2-脱氧-D-核糖或D-核糖的核苷酸，以及本领域中已知的PNA或LNA分子的聚合物或寡聚体。因此，这些术语包括dsDNA和ssDNA，以及dsRNA和ssRNA。这些术语还可能包涵前述物质的嵌合混合物，该混合物的一个实例是包括DNA和PNA或LNA的单链寡核苷酸构建体。在术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”之间没有实际的区别；这些术语可互换使用。
靶核酸不一定是从任意现有或天然序列中分离的物种，但可以是存在于需要研究其的样品中或之内的任意长度的任意序列。因此其可以是基因组，或亚基因组核酸，染色体，染色体外载体，或基因，或基序，或非编码序列，或序列标签位点，或表达序列标签中存在的任意序列。该序列可来自任意来源，例如，根据已发表的资料制备的或数据库上的资料制备的。
术语“特异性杂交”意指与靶标的核酸序列基本上互补的探针核酸序列。其指这样的一些寡核苷酸，当对位排列使得一条序列的5′端与另一条序列的3′端配对时，序列之间的同一性(即，Watson-Crick碱基配对)为至少95％、典型地为至少97％，更典型地为至少98％和最典型地为至少99％。在核酸中可掺入(经酶或合成地)天然核酸中通常不存在的修饰的碱基类似物。如本领域所公知的，两条核酸链的互补性可能并不完美：一些稳定的双链体可含有错配的碱基对或不匹配的碱基，并且核酸技术领域的技术人员可通过考虑除寡核苷酸长度和寡核苷酸中胞嘧啶和鸟嘌呤碱基的浓度和同一性之外的许多变量来推测确定其稳定性。就此而言，要理解的是在任何给定情况下使用的溶液的严格性可根据涉及的实施例的要求而变化，并且专业技术人员能够选择适当的严格性。
专业技术人员知晓例如，适当地控制温度和/或盐浓度，能够确保仅与特定靶标具有所需程度的特异性的探针序列能与靶标杂交，并且非特异性探针不与该靶标杂交。专业技术人员理解此涉及特异性杂交。
如本领域公知的，可改变盐浓度和/或温度的参数以达到探针和靶核酸之间所需的同一性。本领域技术人员很容易获得关于这些条件的指导，并且尤其可见Sambrook等人，Molecular Cloning：ALaboratory Manual(分子克隆：实验室指南)(第三版)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor(冷泉港实验室印刷，冷泉港)，NY，7.9～7.12页(2001)。
通过熔解或解链温度，或“Tm”来测定核酸双链体的稳定性。在特定反应条件下特定核酸双链体的Tm是碱基对的一半存在于双链体结构中并且一半存在于单链DNA中时的温度。
测定Tm的主要决定因素是序列长度和G-C含量。用于测定Tm的理论和试验步骤公开在Molecular Cloning-A Laboratory Manual(分子克隆-实验室指南)，第二版，J Sambrook等人，Cold Spring Harbor(冷泉港)，第II章46和55节。实际上，对于短于18个核苷酸的寡核苷酸，通过将杂交体中A+T残基的数目乘以2℃，G+C残基的数目乘以4℃，并将两者加在一起来估计杂交体的Tm。对于长度为约14～70个核苷酸的寡核苷酸，由Bolton和McCarthy设计的用于测定长DNA分子的TM的下列等式也适用：
Tm＝81.5-16.6(log[Na+])+0.41(％G+C)-(600/N)。
(其中N为链长，[Na+]是杂交溶液的离子强度)。
用于计算Tm的其他公式对本领域技术人员是公知的。
如上所述，专业技术人员知晓确切的Tm将取决于许多因素，诸如反应温度、盐浓度、变性剂诸如甲酰胺的存在，以及与寡核苷酸要杂交的序列的互补程度。
对于寡核苷酸杂交，最佳杂交温度通常在Tm之下2～10℃的条件下进行。理想地，杂交温度被精确地控制在优选±2℃，更优选±0.5℃或更好一些，尤其是当捕获寡核苷酸的可杂交长度很小并且需要区分可能在可杂交序列的一个或另一个末端处仅有单个核苷酸不同的两条序列时。
选择的杂交条件被设计为尽可能接近探针和靶核酸形成的双链体的计算Tm。使用的杂交溶液中的盐的浓度特别重要。在1M NaCl时，G∶C碱基对比A∶T碱基对更稳定。类似地，具有较高G-C含量的双链寡核苷酸的Tm比具有相同长度但具有较高A-T含量的双链寡核苷酸的Tm高。如果在需要被区分的靶核酸中差别很小，即，单核苷酸差异，则建立最佳杂交条件是很重要的，尤其是当寡核苷酸的可杂交长度很小时(＜约30mers)。因为目的样品中除靶核苷酸以外还有不同组成的核苷酸，因此Tm的范围很宽。由此，这些条件可通过使用离液序列高的杂交溶液来操作以便消除Tm对核苷酸组成的依赖性。这可以例如，通过向杂交溶液中掺入叔酰胺或季酰胺来实现。
如在此所使用的，探针核酸或“探针”包括被设计为与靶核酸中基本上互补的序列形成双链体结构的核酸序列。要理解的是探针核酸可由此，例如，与单链或双链靶核酸形成双链体。采用后者，所得的三联体结构将包括靶核酸的一条链和单链探针之间杂交形成的双链体。本领域技术人员要理解，有可能是含更高级双链体的寡核苷酸体系，例如，四联体结构(quartet structure)。
在某些实施方案中，标记与“探针”核酸的一个或多个核苷酸碱基直接附着、结合或以其他方式缔合。缔合要被理解为包涵其中形成原始探针核酸的一部分的单个核苷酸或其一部分一旦不再与原始探针核酸附着就可被检测到的实施方案。
用于通过拉曼/SE(R)RS检测的适当的标记描述在，例如，W097/05280、W099/60157和W02005/019812中。其他适当的标记包括在SERRSDyes(SERRS染料)，第二部分，Synthesis and evaluation of dyes for multiplelabelling for SERRS(用于SERRS多重标记的染料的合成和评价)(McHugh，C.J.，Docherty，F.T.，Graham，D.，Smith，W.E.Analyst，2004，129，1，69-72)；以及Biosensing Using Silver Nanoparticles and Surface Enhanced ResonanceRaman Scattering(使用银纳米颗粒的生物传感和表面增强共振拉曼散射)(Graham，D，Faulds，K，Smith，W.E.，Chemical Communications(化学通信)，2006，42，4363-4371)中公开的那些染料。也有可能包括具有特殊的共振频率的标记，当大量标记紧密接近时该频率可改变。
荧光标记普遍用于多种检测系统中，并且多种荧光标记是本领域技术人员所熟知的。本发明还可采用FRET和/或猝灭荧光信号的技术，将在后面更详细地说明。
因此，术语“标记”指可被用于提供可检测的，优选可以计量的，优选实时的信号的任意原子或分子。可检测标记可以附着在核酸探针上或是核酸探针固有的部分或可以其他的方式与探针核酸和靶核酸之间形成的双链体结合。这些标记可与双链体的小沟或大沟结合，或另外地嵌入至双链体核酸中。然而，要理解，此类型的标记应该不能够与靶核酸连接，除非探针和靶核酸之间形成了双链体。许多此类标记是已知的，并且包括
(G Tolun和S.Myers(A real-time DNase assay(ReDA)based on
fluorescence(基于
荧光的实时DNase(ReDA)测定)Nucleic Acids Res(核酸研究).2003，31：e111))。
如在本申请中所使用的，“实时”指检测信号的动态生成，包括获取多个读数以便在一段时间内表征信号。例如，实时测定可包括测定可检测产物增加的速率。可选地，实时测定可包括测定在靶序列被扩增至可检测水平前所需的时间。
在一些实施方案中，可能必须要从反应中去除未杂交的探针以便能够仅检测已经掺入探针/靶核酸双链体中或与探针/靶核酸双链体缔合的标记。达到此目的的一种方式是将捕获部分(在此也称为可捕获部分)掺入至探针核酸之上/之中(例子包括磁性部分和/或生物素)。在磁性部分的情况下或使用链霉抗生物素蛋白涂层材料在生物素的情况下，如果探针核酸不与靶标结合，则探针将不被核酸外切酶消化，并且未被消化的探针可被磁体诸如磁珠去除。然而，如果探针形成探针/靶双链体，在双链体消化时捕获部分将从探针释放但标记仍然可被检测到。
因此，例如，通过例如，在3’-端，用可由拉曼光谱法(例如，SE(R)RS)检测到的标记和生物素双重标记探针，可通过使用链霉抗生物素蛋白涂布的磁珠去除未消化的探针(例如，因为靶核酸不存在)或过量探针，这意味着仅当靶核酸存在时检测到信号。
此法示意性地显示在图17中(作为实例，使用SE(R)RS检测和生物素/链霉抗生物素蛋白捕获)。
此方法学可被理解为类似Taq-Man探针的使用。采用Taq-Man探针，通过使用猝灭剂抑制信号，在PCR扩增期间一旦该猝灭剂从报告染料中分离就不再抑制报告染料的荧光，并且荧光是可检测的。然而，在本发明中，可省略猝灭剂的使用，因为另外作为过量或未杂交探针的结果而产生的信号可通过使用可捕获部分诸如附着在探针上的生物素以及拉曼可检测染料的使用来去除。有益的是，在检测方式的灵敏度允许时(例如，当使用SE(R)RS时)可使用尽量小的探针。
还在本发明的进一步的实施方案中，本发明的方法可任选地利用一个以上的探针核酸组合作用来探测靶核酸。因此，例如，可采用使用两个探针，一个用来捕获目的样品中的靶核酸(如果存在)，并且另一个为存在靶标的信号提供(一般地)可检测标记。因此第一探针核酸可以，例如，在3’-端被生物素化，从而提供可捕获部分。该部分可与目的样品接触。如果存在靶核酸，其与第一探针杂交，并且使用链霉抗生物素蛋白涂布的磁珠捕获所形成的双链体。然后目的样品中未结合的探针和其他组分被洗掉。可选地，第一探针核酸可初步与链霉抗生物素蛋白涂布的磁体(或磁珠)接触，在与目的样品接触之前未结合的捕获探针被洗掉，之后目的样品的未杂交组分可被洗掉。此可选实施方案示意性地绘制在图21中。
在捕获靶核酸后，然后拉曼可检测标记可被导入至第一探针核酸与靶核酸杂交生成的双链体中。这可通过使用如在此所述可嵌入至双链体内的标记来完成。可选地，并且一般地，标记与第二探针核酸一起被导入，该第二探针核酸与已经结合于第一探针核酸的靶核酸杂交。然后可通过核酸外切酶降解所得到的包括与靶核酸的不同区互补的第一和任选的第二探针核酸的链的双链体以释放拉曼可检测(例如，SE(R)RS活性)标记。
在本发明的所有实施方案中，在有可能从靶核酸分离未结合标记，例如，通过使用在此所述的捕获技术时，在探针包括拉曼可检测标记时对于探针中的该标记，不包括猝灭部分是有可能的并经常是有益的。这是因为有可能去除未结合的含标记的探针(否则考虑到标记的检测指示靶核酸，会产生背景假阳性结果)。然而，在不使用在此所述的捕获技术时，或甚至在使用所述捕获技术时，对于探针核酸中的标记包括猝灭剂会是有益的。以此方式，任何残余的但是未杂交的含标记的探针不会有助于任何被检测到的信号。
图21示意性地概括地绘制了之前以通用术语描述的实施方案的实例，其中采用了独立的第一和第二核酸探针，并描述了特定的但非必须的一系列洗涤阶段。将观察到第二探针核酸包括标记和猝灭剂(猝灭剂为“标记”探针中的黑圈)，尽管从前面的讨论中会立即理解，此猝灭剂的存在非必要特征。“P”描述的是末端5’-磷酸酯部分，其作用是使所得的双链核酸作为λ核酸外切酶的底物。因此图21显示与链霉抗生物素蛋白涂布的磁珠结合的短捕获探针(3’生物素化)。未结合的探针被洗掉。然后靶序列与被固定的捕获探针(第一探针核酸)杂交。未结合的靶核酸被洗掉。然后染料标记的寡核苷酸序列(具有5’磷酸酯基团)与被捕获的靶序列杂交。λ核酸外切酶的作用发生在杂交的探针序列上。该酶将杂交的探针DNA降解为单核苷酸，使染料游离。
作为本发明的可利用一个以上的核酸组合探测靶核酸的实施方案的其他实例，可使用两个探针核酸，其中第一探针包括被设计成探测靶核酸的序列。除了与靶核酸的至少一部分互补的第一探针的一部分以外，第一探针还包括与第二探针核酸互补的序列。此第二探针核酸可包括SE(R)RS或其他拉曼活性标记(当从第二探针核酸裂解时至少是SE(R)RS或拉曼可检测的)和任选地包括猝灭剂。可选地，该标记可另外地提供为，例如，如在此所述的可嵌入至靶核酸和探针核酸(在此实施方案中由第一和第二探针核酸组成)之间杂交形成的双链体中的标记。第一或第二探针，一般为第二探针，也可包括5’-磷酸酯基团，其中使用的核酸外切酶为λ核酸外切酶。图24显示了本发明的此实施方案的示意图，其中检测方式被指示为SERRS；靶核酸是DNA；第二探针核酸用SERRS活性染料标记(显示为星号)并且具有5’-磷酸酯；并且使用的核酸外切酶为λ核酸外切酶。
本发明的此实施方案的一个优点是该实施方案基于第一探针的一部分序列被设计成与靶核酸杂交，从而使第一探针用作靶特异性探针。该序列与第二探针杂交的序列的部分可以是通用的，意味着该序列与靶核酸是非特异的而与第二探针是特异的。因此第二探针不需要具有与靶核酸互补的任意序列，并且因此可用于检测多个靶核酸。这是有益的，如所指出的，因为第二探针核酸一般在结构上较为复杂，一般包括标记和任选地包括猝灭剂，以及任选地包括5’-磷酸酯基团。第二探针不一定是基于靶核酸定制的；部分地基于靶核酸中存在的序列的第一探针可通过简单的寡核苷酸合成来制备。
该方法可允许使用通用探针来用于测定，即，第二探针的序列(和第一探针中的其互补序列)可用于每一个靶核酸，并且可被优化从而为酶的作用、发生杂交以及为最佳标记构型提供最可能好的条件。
然后第一探针核酸的靶区可被改变以与靶标杂交。特别有益的是，该序列的此部分序列也可含有增加杂交效率的碱基，诸如LNA碱基。
本发明的此实施方案的进一步优点是，该实施方案允许包括PNA或LNA的靶核酸的直接检测：由于其不是靶标和被裂解的第一探针之间杂交形成的(任选地嵌合的)双链核酸，因此不需要利用基于靶DNA的构造选择的核酸外切酶，或使用仅结合例如，DNA或RNA的探针核酸。通过采用LNA和PNA所提供的杂交效率的提高可由(i)由第一探针的靶向区靶向的靶核酸的部分或(ii)靶向区本身包括PNA或LNA中的任一种或两种因素来提供。
因此这是比仅对RNA或DNA更通用的检测方法学。靶标可以是使用形成三联体的寡核苷酸(TFO)的dsDNA、使用适体的蛋白质或与适当的靶标结合的抗体。在这些实施方案中，可以与在此所述的相同方式进行检测(例如，对于具有包括第一和第二探针序列的探针序列的单链DNA)。因此，例如，采用双链DNA作为靶核酸，第一探针核酸可以是具有形成三联体的独特序列的TFO，即，其靶向双链DNA，并且其缀合于与第二探针核酸互补的核酸序列。第二探针核酸的杂交和所得双链体的随后降解的作用是检测所需dsDNA的存在而不需要熔解。
类似地，核酸可与抗体缀合，然后抗体，例如，可被固定在固体载体上。结合事件(例如，与抗原)的检测可通过本发明的方法来完成，在该方法中用作靶核酸的核酸可附着于另一抗体(例如，在类似于夹心ELISA测定的测定中)。然后可根据本发明的方法通过检测靶核酸来确定固体支持的抗原的存在。以此方式，在任何指定研究中，本发明的方法可用来通过将作为靶核酸的适当核酸与生物分子探针缀合来检测任何结合事件。然后可通过将生物分子探针-靶核酸缀合物暴露于探针核酸并实施本发明的方法来检测结合作用。
本发明的此实施方案的进一步优点是只需通过改变第二探针中的标记和第一探针的靶向序列轻松地实现多重检测。实际上被核酸外切酶降解的序列可仍然不变，关于核酸外切酶仅需要建立一组优化条件，其可以保持不变，甚至在要检测多个靶核酸的多重测定中，对核酸外切酶仅需建立一组最佳条件。
前面所述的通用的核酸外切酶可裂解序列的应用也可与在此所述的捕获方法学结合使用。因此，例如，被设计成与第二探针核酸杂交的第一探针核酸的部分可在3’-端用生物素衍生从而能够使用在此所述并参照图21的基于链霉抗生物素蛋白-生物素的捕获和洗涤方法学。以此方式，第一探针核酸可用作在此所述的可捕获探针。这些方法学的应用(如果需要)可提高本发明的方法的特异性(并且因此提高可靠性)。
提高特异性的可选方式描述在图25中。该图描述了使用两种捕获探针，它们可附着在固体表面例如，珠子或平板上，或示例性的备选地用生物素衍生以允许被链霉抗生物素蛋白涂布的磁体捕获。描述了两种捕获探针；可使用一种或多种。因此在采用捕获方法学时，在使用由通用的核酸外切酶可裂解序列制成的捕获探针时，该捕获探针不需要是与标记探针杂交的探针相同的探针(如图24中所示)。
在本发明的一个实施方案中，与靶核酸特异地杂交的含5’-磷酸酯的探针核酸被核酸外切酶诸如λ核酸外切酶消化，从而降解含5’-磷酸酯的链。在两条链可被降解和消化的同时，在本发明的一些实施方案中足以仅消化探针并释放拉曼/SE(R)RS可检测标记。
λ核酸外切酶是由λ噬菌体编码的24kD酶。该酶涉及噬菌体的遗传重组但也可作为DNA加工酶从商业渠道获得。酶的晶体结构揭示其是一种具有环形四级结构的同源三聚体。
λ核酸外切酶消化以磷酸化5’末端起始的双链(dsDNA)的一条链。λ核酸外切酶的中央通道的尺寸是这样的以致其可以在通道的一端仅可容纳dsDNA。该酶是高度持续的，使3’DNA链穿过该酶中央的锥形通道(tapered channel)的中部。5’链被消化，释放游离的5’单核苷酸。具有磷酸化5’末端的单链DNA也显示被消化，但与dsDNA相比是较差的底物。(见P.G Mitsis和J.G Kwagh，Nucleic Acids Research(核酸研究)，27(15)，3057-3063(1999)以及其中引用的参考文献)。
在本发明的一些实施方案中，核酸外切酶是λ核酸外切酶。在其他实施方案中，核酸外切酶不是λ核酸外切酶。适合用于本发明中的其他核酸外切酶是不管5’还是3’末端核酸被修饰，诸如被磷酸化，能够持续性地以5’或3’方向消化核酸双链体的一条或两条链的核酸外切酶。然而，应该理解的是核酸外切酶应该具有很小地或不具有消化单链核酸的能力。其他适当的核酸外切酶包括聚合酶，诸如Taq聚合酶、DNA聚合酶I和DNA聚合酶T4。
探针可具有任意合适的长度。其实际长度将取决于需要如何精确地测定指定的靶序列。然而，一般来说，探针的长度将为约10～50个核苷酸，例如，长度为20～30个核苷酸。修饰探针以便能够在核酸外切酶，诸如λ核酸外切酶消化探针时在要检测的标记的环境中发生变化。优选当探针的部分，或是当探针作为单链核酸存在时和/或当其与靶序列杂交时，标记基本上是不可检测的。以此方式，过量的、未杂交的探针，不太优选被所述的核酸外切酶加工，其将是不可检测的，并且因此当附着于探针双链体核酸并且在双链体核酸消化过程中已经被释放时，仅存在可检测的标记。以此方式，检测到的标记的任何变化指示目的样品中靶序列的存在。
与现有技术中的方法相反，在本发明的方法过程中探针链不需要一定被延伸。使用拉曼光谱法，例如，尤其是SE(R)RS，使用可检测的标记的检测的灵敏度使得可检测极低水平的标记。在本发明的某些实施方案中，另外的益处是由于某些核酸外切酶，诸如λ核酸外切酶的非常高的转换率，使得一旦起始探针被消化，第二探针分子可与靶核酸结合并被消化以从靶核酸的相同片段生成更多的信号。实际上在这些实施方案中信号被放大，而相反例如在PCR中靶标被扩增。过量的探针序列可被使用，例如，为样品中存在，或预期或估计存在的模板的10倍或更多倍或100倍或更多倍，以确保杂交动力学有利于快速的生成信号。该方法也通过使用不同标记的探针允许多重反应。
然而如果需要可进行靶标的扩增。适当的扩增方法是专业技术人员所公知的，并且包括等温扩增和滚环扩增。
在本发明的某些实施方案中，荧光本身作为检测方式可增添由拉曼光谱法进行的检测，其中可由拉曼光谱法检测到的标记是荧光。在这些实施方案中，探针一般包括荧光团和猝灭剂，如前面所述的分子信标或TaqMan探针。当完整时，猝灭剂将猝灭来自荧光团的任何荧光。然而，在核酸外切酶降解探针DNA时，在与靶核酸杂交后，荧光团将从猝灭剂释放，使得能够获得荧光。有疑问时，可通过使用共聚焦显微镜来改善背景荧光。这样能够使超灵敏检测达到单分子水平。还有可能使用FRET配置而非猝灭剂-供体并且还可使用荧光寿命测定。可使用任何合适的荧光团。在一个实施方案中可使用荧光素-dT(在516nm处发射)。荧光素-dT是修饰的碱基，其中荧光素(FAM)通过6个碳原子间隔臂附着于胸腺嘧啶环的5位。可使用任何合适的猝灭剂，例如Dabcyl(在380-530nm处猝灭)。
在另一个实施方案中，检测方式基于等离子体光子学，其依赖于纳米颗粒等离子体共振作为杂交的指示剂，并且因此依赖于核酸外切酶的作用后溶液中纳米颗粒的聚集状态的变化。根据本实施方案，单个纳米颗粒用探针功能化，使得末端磷酸酯(例如，在λ核酸外切酶用作核酸外切酶时的5’-磷酸酯)或核苷酸碱基远离纳米颗粒的表面。当功能化时，探针将具有特定的共振频率。当这些探针与靶区杂交时，末端磷酸酯/碱基用作核酸外切酶的识别位点从而能够消化纳米颗粒表面上的探针。涂布以探针序列的纳米颗粒在溶液中是分离的和不聚集的，而在与靶序列杂交以及随后探针序列的降解后纳米颗粒不再分开，并将聚集在一起产生可检测的变化。
在一个实施方案中，可提供探针核酸附着的表面。该表面是适合用于拉曼(SE(R)RS检测中的表面，并且可以是粗糙的金属表面，诸如银表面。该表面可以是，例如，纳米颗粒的表面、微量滴定板、微阵列表面等。拉曼(例如，SE(R)RS)可检测标记可在消化核酸双链体时落在该表面上。
如果该表面是纳米颗粒的表面，探针还会防止颗粒聚集，但在探针消化时，颗粒可聚集，从而增强了任何可检测的拉曼(例如，SE(R)RS)信号。
如果足够少量的探针附着在纳米颗粒表面上(例如，10-20％表面覆盖度)，则可假设当探针被降解时纳米颗粒的聚集状态将会改变，并引起纳米颗粒的等离子体振子频率的变化。这种变化可使用，例如，暗视野显微镜来测定(见例如，基于金纳米颗粒探针的比色散射均相检测未扩增基因组DNA序列(J.J.Storhoff等人，Nature Biotech.(自然生物技术)2004，22(7)，883-887))。
根据此实施方案，SE(R)RS活性染料(SE(R)RS标记)可直接附着于纳米颗粒，但当探针仍然完整时，由于没有发生聚集作用，标记是不可见的。探针/靶双链体的消化使颗粒发生聚集，并且还开启了SERRS效应。
金或银胶体可用作纳米颗粒。这些胶体可被认为是溶胶，即，分散在水中的固体颗粒。这些颗粒的大小在纳米尺度上，因此术语纳米颗粒的使用一般指2-100nm，尤其是10-80nm，诸如15-40nm。胶体介质非常适合于DNA杂交反应，因为寡核苷酸可被固定在金或银纳米颗粒的表面上。
在优选的实施方案中，如前面所讨论的，检测方式基于SE(R)RS。关于SERS和SERRS的详情见，例如，WO97/05280、WO99/60157和WO2005/019812以及其中引用的参考文献。
如本领域中所公知的，拉曼光谱的产生是因为入射至分析物上的光由于分析物中的核运动和电子的激发而散射。在被记录光谱的分析物与适当的表面诸如粗糙的金属表面紧密缔合时，导致检测灵敏度的大大增加，分析物与“活性”表面越接近，则该效应越显著(最佳位置为表面周围的第一分子层内，即，表面的约2nm内)。这称为SERS。
通过在分析物(在此情况下通常为附着于目的靶标的染料)的共振频率处操作可获得灵敏度的进一步增加。使用调节至染料的最大吸光度的相干光源，使灵敏度增加103-105倍(激光激发也可设置为表面等离子体共振的最大值，可以与染料最大值一致或不一致)。表面增强效应和共振效应可合并在一起以得到SERRS，并且一定范围的激发频率仍将得到联合增强效应。
因此，当满足两个条件时SERRS技术提供分析物的振动指纹谱。它们是(i)吸附在合适的金属表面上以及(ii)可见生色团的存在。金属的使用还意味着荧光被有效地猝灭。这意味着大量的有色分子，包括标准的荧光团，产生优良的SE(R)RS信号。
通常优选SERRS，并且在此提到的所有SE(R)RS都可被理解为SERRS除非上下文特指相反的含义。然而，要理解的是，本发明还可采用SERS，并且通常采用拉曼光谱法来实施。例如，当使用红外区内的激发频率而尽量减小背景荧光时，SERS具有有益的效果。
在例如，Moore等人(2004Nature Biotech.(自然生物技术)，22，p1133-1138)中描述了如何生成对于SE(R)RS不可见，然后在酶作用后变得可见的标记的实例。在此实例中，使用脂肪酶来水解酯键释放染料，该染料变成SE(R)RS活性染料。在其促进下，当应用于本发明时，羟基喹啉偶氮染料可通过染料的酚基附着在探针核酸的3’磷酸酯上。这样将染料遮蔽使其不能附着于金属表面上，并且使该染料对SERRS“不可见”。以此方式，一旦探针与其特异性序列杂交，则核酸外切酶将消化寡核苷酸并释放羟基喹啉染料，然后由于染料能够附着在SE(R)RS活性表面上，因此该染料可被SERRS检测到。
由SE(R)RS的极端灵敏度，在许多情况下可以不需要扩增模板就能使该过程进行运转。然而，如果需要可进行靶标的扩增。适当的扩增方法对于专业技术人员是公知的，并且可包括等温扩增和滚环扩增。
根据进一步的实施方案，可使用其上附着有5’-修饰的SE(R)RS活性染料的探针。染料可以以这种方式附着，从而使探针不粘在金属表面上并产生SERRS。在形成探针/靶双链体并加入核酸外切酶诸如Taq后，发生降解并释放标记。此探针以与Taqman探针类似的方式被降解；然而，不是在酶作用后去除荧光猝灭并增加荧光，在本发明的此实施方案中，染料粘在金属表面上的能力增加，并且因此增加了SERRS信号。如前所述，此实施方案可与可捕获部分诸如生物素的使用结合实施以去除未结合或过量的探针。采用本发明的这些、或其他实施方案中的任一个方案，这些探针可与例如通过PCR扩增目的样品中存在的核酸联合应用。
方便的是，在扩增技术与拉曼可检测探针结合使用时，使用的探针可被设计成与这样的靶核酸部分杂交，其不同于例如与PCR中使用的引物杂交的部分。以此方式，如果探针被杂交，核酸外切酶，例如，Taq对引物的作用继续作用于探针，释放拉曼可检测标记。
实施本发明的另一方法涉及使用SE(R)RS活性插入剂，或优选地使用小沟结合剂(MGB)，如果它们附着于探针序列将增加杂交的特异性。当探针序列与靶标杂交时，插入剂或MGB被设计成这样以致不获得SE(R)RS；然而，在核酸外切酶消化后，其被释放至溶液中，并且能够吸收在金属表面上并产生SE(R)RS。
本发明可进一步参照下列非限制性的条项来进一步理解：
1.一种用于检测靶核酸的方法，包括以下步骤：
(i)将单链探针核酸与目的样品在以下条件下接触：如果存在所述靶核酸，通过所述探针核酸与靶核酸的特异性杂交，则有效产生探针/靶核酸双链体；
(ii)将任意的探针/靶核酸双链体与核酸外切酶接触以实现所述双链体的消化并从所述双链体释放标记分子；以及
(iii)通过拉曼光谱法检测所述标记。
2.如项1所述的方法，其中所述核酸外切酶不具有寡核苷酸合成能力。
3.如项1或2所述的方法，进一步包括如果所述标记中存在任意的可检测到的变化，检测所述变化从而检测所述靶核酸。
4.如项3所述的方法，其中在所述目的样品中任意靶核酸的数量参照所述变化的幅度来测定。
5.如项1-4中任意一项所述的方法，其中所述标记与所述探针核酸附着、结合或以其他方式缔合。
6.如项5所述的方法，其中所述探针核酸与所述标记结合。
7.如前面任意一项所述的方法，其中所述标记仅当通过所述探针/靶核酸双链体的消化从所述双链体核酸中释放时能够通过拉曼光谱法而被检测到。
8.如项1-7中任意一项所述的方法，其中所述标记是SE(R)RS活性染料。
9.如项1-8中任意一项所述的方法，其中所述探针序列附着于SE(R)RS活性基底上。
10.如项9所述的方法，其中所述基底是纳米颗粒的表面。
11.如项1-10中任意一项所述的方法，其中所述探针核酸是DNA。
12.如前面任意一项所述的方法，其中所述靶核酸是DNA。
13.如前面任意一项所述的方法，其中所述靶核酸是双链核酸。
14.如前面任意一项所述的方法，其中所述靶核酸是单链核酸。
15.如前面任意一项所述的方法，其中所述探针核酸包括约20～约30个核苷酸。
16.如前面任意一项所述的方法，其中所述核酸外切酶是λ核酸外切酶。
17.如项1-15中任意一项所述的方法，其中所述核酸外切酶不是λ核酸外切酶。
18.一种由多个部分组成的试剂盒，包括：
(i)单链探针核酸；
(ii)核酸外切酶；以及
(iii)用于项1-17中任意一项所限定的方法中的通过拉曼光谱法可检测到的标记。
19.一种用于检测靶核酸的方法，包括以下步骤：
(i)将单链探针核酸与目的样品在以下条件下接触：如果存在所述靶核酸，通过所述探针核酸与具有5’-磷酸酯基团的靶核酸的特异性杂交，则有效产生探针/靶核酸双链体；以及
(ii)将任意的探针/靶核酸双链体与λ核酸外切酶接触以实现所述双链体的消化并从所述双链体释放标记分子。
20.一种用于检测靶核酸的方法，包括以下步骤：
(i)将单链探针核酸与目的样品在以下条件下接触：如果存在所述靶核酸，通过所述探针核酸与靶核酸的特异性杂交，则有效产生探针/靶核酸双链体；以及
(ii)将任意的探针/靶核酸双链体与核酸外切酶接触以实现所述双链体的消化并从所述双链体释放标记分子，
其中在步骤(i)中过量的所述探针核酸与所述目的样品接触使得步骤(ii)中双链体的消化使靶核酸再循环一次或多次，从而使更多的探针分子与靶特异性地杂交，形成额外的探针/靶核酸双链体，所述额外的探针/靶核酸双链体被消化以释放更多的标记分子。
21.如项19或20所述的方法，进一步包括如果存在靶核酸，检测所述标记中任何可检测的变化从而检测所述靶核酸。
22.如项21所述的方法，其中在所述目的样品中任意靶核酸的数量参照所述变化的幅度来测定。
23.如项19-22中任意一项所述的方法，其中所述标记仅能够当通过所述探针/靶核酸双链体的消化从所述双链体核酸中释放时而被检测到。
24.如项19-23中任意一项所述的方法，其中所述检测基于等离子体光子学、荧光或SE(R)RS。
25.如项19-24中任意一项所述的方法，其中所述标记与所述探针核酸附着、结合或以其他方式缔合。
26.如项25所述的方法，其中所述探针核酸与所述标记结合。
27.如项19-26中任意一项所述的方法，其中所述标记是可通过拉曼光谱法检测的。
28.如项27所述的方法，其中所述标记是SE(R)RS标记。
29.如项28所述的方法，其中所述标记是SERRS标记。
30.如项29所述的方法，其中所述标记是3’羟基喹啉染料。
31.如项19-26中任意一项所述的方法，其中所述标记是荧光团。
32.如项31所述的方法，其中所述探针包括荧光团和在所述消化之前猝灭所述荧光团的猝灭剂。
33.如项19-24中任一项所述的方法，其中在步骤(i)中所述标记与所述探针核酸和所述目的样品接触，如果形成探针/靶核酸双链体则所述标记可嵌入至任意一个所述探针/靶核酸双链体中。
34.如项33所述的方法，其中所述标记可与所述双链体的小沟或大沟结合。
35.如项34所述的方法，其中所述标记是大沟结合物。
36.如项35所述的方法，其中所述标记是
37.如项19-36中任意一项所述的方法，其中所述探针核酸是DNA。
38.如项19-37中任意一项所述的方法，其中所述靶核酸是DNA。
39.如项19-38中任意一项所述的方法，其中所述靶核酸是双链核酸。
40.如项19-39中任意一项所述的方法，其中所述靶核酸是单链核酸。
41.如项19-40中任意一项所述的方法，其中所述探针核酸包括约20～约30个核苷酸。
42.如项19-41中任意一项所述的方法，其中所述探针序列附着或吸附于基底。
43.一种由多个部分组成的试剂盒，包括：
(i)具有5’-磷酸酯基团的单链探针核酸；
(ii)λ核酸外切酶；以及
(iii)用于项19-42中任意一项所限定的方法中的标记。
44.如项43所述的试剂盒，其中所述标记是SE(R)RS活性标记。
45.靶核酸作为模板的应用，单链探针核酸与该模板特异性杂交并且得到的探针/靶核酸双链体被核酸外切酶降解从而从所述双链体释放标记分子，其中所述靶核酸用作所述模板多次以便从多个双链体中释放多个标记分子，并且其中各个所述多个双链体包括相同的靶核酸。
下列的实施例说明本发明但不以任何方式限制其范围。
使用的寡核苷酸
寡核苷酸购自atdbio(英国)和MWG(德国)并经HPLC纯化。
| 名称 | 序列 | 来源 | 浓度/μM | 修饰 |
| RW01A | 5’-TTTTCCCAGTCACGACGT-3’ | atdbio | 41.17 | 5’磷酸酯3’巯基 |
| RW01B | 5’-TTTTCCCAGTCACGACGT-3’ | atdbio | 63.17 | 5’磷酸酯3’巯基 |
| RW02A | 5’-TTTTCCCAGTCACGACGT-3’ | atdbio | 85.73 | 5’磷酸酯3’氨基接头 |
| RWFAM | 5’-TTTTCCCAG*TCACGACGT-3’ | atdbio | 18.31 | 5’磷酸酯3’Dabcyl*T荧光素dT |
| 名称 | 序列 | 来源 | 浓度/μM | 修饰 |
| RWCOMP1 | 5’-ACGTCGTGACTGGGAAAA-3’ | atdbio | 31.47 | - |
| RWCOMP2 | 5’-ACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTA-3’ | MWG | 29.60 | - |
| RWCOMP3 | 5’-TCACTGGCCGTCGTITTACAACGTCGTGACTGGGAAAA | MWG | 32.30 | - |
| RWCOMP4 | 5’-TCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAA-3’ | MWG | 14.40 | - |
荧光探针和互补链的UV熔解
使用Cary 300Bio UV-Vis分光光度计获得荧光素标记的寡核苷酸(RWFAM)和互补序列(RWCOMP1)的UV熔解曲线。熔解曲线用来发现两条链的熔解温度。
将54.6μl RWFAM和31.8μl RWCOMP1加入至石英玻璃杯中的1913.6μl的0.3M PBS中。这样在2ml的总体积中得到的各寡聚体的总浓度为0.5μM。
以4个梯度进行UV熔解，每个阶段后保持1分钟：
●梯度1：25℃→90℃
●梯度2：90℃→25℃
●梯度3：25℃→90℃
●梯度4：90℃→25℃
各梯度的第一条导数曲线用来找到RWFAM和RWCOMP 1的平均熔解温度。
荧光探针试验介绍
概述
这些试验包括使用用荧光团和猝灭剂修饰的寡核苷酸探针。探针被设计成与一系列互补的靶寡核苷酸杂交，并且在此情况下，对λ核酸外切酶的作用敏感。通过荧光的增加检测到探针的任何降解作用。
寡核苷酸稀释液
下表列举了用于这些试验中的寡核苷酸母液的稀释液。
酶规格
●购自Epicentre(Cambio)的λ核酸外切酶
●酶储存缓冲液：含有50mM Tris-HCl(pH 7.5)，100mM NaCl，1.0mM DTT，0.1mM EDTA和0.1％
X-100的50％甘油溶液。
●在收到酶后，将其分装为25份x 10μl并储存在冰箱中。每份10μ1含100单位的酶。
λ核酸外切酶反应缓冲液
●10X反应缓冲液：670mM甘氨酸-KOH(pH 9.4)，25mM MgCl2和0.1％X-100
●反应缓冲液分成每份150μl。
仪器
●所有反应在Stratagene MX4000QPCR上进行。
样品制备
●所有样品在洁净环境中在无菌手套箱中制备。
●样品在无菌的200μl管条(tube strip)中制备。
●样品制备为总体积150μl。
●由于使用的一些反应成分的体积微小，在每个阶段之间样品均简单地离心。这确保所有试剂混合并且样品的主体不附着在管的侧面。
实验步骤
使用Stratagene MX4000QPCR工作站进行采用荧光探针的实验，并且涉及两个阶段：
1.无酶的反应混合物加热至90℃，并在此温度下保持10分钟以确保DNA链的分离。通过将样品冷却至20℃并在此温度保持5分钟，从而使探针和靶链能够杂交。在用于第二阶段的制备中温度回到37℃。
2.将酶(或作为对照的水)加入至反应混合物中。样品加热至37℃并且测定荧光。使用三个稍有不同的程序：
| 程序 | 循环次数 | 循环持续时间/分钟 | 总持续时间/分钟 |
| A | 40 | 2 | 80 |
| B | 40 | 1 | 40 |
| C | 60 | 1 | 60 |
在每次循环结束时进行重复三次的荧光测定。
荧光实验
下面给出的数据通过从各个数据点减去初始荧光值而进行标准化。重复测定，仅显示平均值。
实验1：初步试验
进行本实验以确认该技术的可行性。在此进行详细描述作为也用于实验2和3中的步骤的实例。
下列的样品在8联管条的各个试管中重复制备：
制备两个测试样品从而一旦杂交得到0.1μM浓度的dsDNA。将RWFAM(8.2μl，1.8μM)和RWCOMP1(4.8μl，3.1μM)加入至在121μl无菌水中的10X反应缓冲液(15μl)中。
使用相同体积和浓度的寡核苷酸和反应缓冲液，但使用122μl无菌水制备一式二份的对照样品。
将样品置于QPCR仪中用于该步骤的杂交阶段。杂交后，取出样品并将1μl(10单位)的λ核酸外切酶加入至两个测试样品中。将样品返回至QPCR仪中，并使用程序A测定荧光。
结果显示在图4中，该图显示仅在加入λ核酸外切酶的样品中出现荧光增加。这表明酶能够降解探针，并从猝灭剂中释放荧光团。在50-60分钟后获得恒定水平的荧光。对照样品仍然在基线处。
实验2
本试验研究了双倍浓度的λ核酸外切酶的作用。
下列的测试样品和对照一式二份地制备：
如实验1中所述制备和杂交样品。杂交后，从QPCR仪中取出样品。
将1μlλ核酸外切酶加入至样品A&B中。
将2μlλ核酸外切酶加入至样品C中。
样品D用作对照。
样品返回至QPCR仪并使用程序C测定荧光。
图5中的图再次显示在对照样品中荧光没有发生变化。该数据显示当使用的酶的单位数加倍时，荧光发生更快速的增加，并且在较短的时间内达到最高荧光水平。该数据显示了降解相同浓度的荧光探针所需的时间与存在的酶的浓度大概成比例。对于0.1μM浓度的荧光探针，使用两倍单位数的λ核酸外切酶似乎使达到最大荧光水平所需的时间减半。
实验3
本实验研究了缺口5’端和3’尾对λ核酸外切酶降解探针链的能力的作用，并且使用三条不同的靶链：
●RWCOMP2-提供20个碱基的5’缺口
●RWCOMP3-提供平5’端，20个碱基的3’尾。
●RWCOMP4-提供20个碱基的5’缺口和20个碱基的3’尾。
制备一式两份的下列样品：
如前面一样制备样品并杂交。杂交后，从QPCR仪去除样品，并将1μl(10单位)λ核酸外切酶加入至样品A、B、C和D中。
将样品返回至QPCR仪，并使用程序C测定荧光。
本实验的目的是测定当荧光探针与较长链长的靶DNA杂交时λ核酸外切酶是否能够降解荧光探针。这将使探针的5’端与靶链相比是缺口的，并还产生长尾片段。这是要反映真实的DNA样品，其中互补的靶序列将是较长的核酸链的一部分。
实验数据(显示在图6中)显示探针和靶链之间形成的双链体实际上不影响酶的总体活性，因为在每种情况下获得的总荧光增加量是类似的。
化学品和试剂：
化学品购自Sigma(西格玛)或Aldrich(奥尔德里奇)，并且均为分析级。
λ核酸外切酶(2500单位，10单位/μl，参见LE032K)和λ核酸外切酶反应缓冲液(670mM甘氨酸-KOH，25mM MgCl2，0.1％Triton X-100，x10母液，参见LE-缓冲液)获自Cambio Ltd.，U.K.。λ核酸外切酶以含50mMTris-HCl(pH 7.5)，100mM NaCl，1.0mM二硫苏糖醇，0.1mM EDTA和0.1％
X-100的50％甘油溶液供应。
链霉抗生物素蛋白涂布的磁珠购自新英格兰生物实验室(New EnglandBiolabs)。缓冲液用前通过0.2μm孔径注射器式过滤器(Whatman)过滤。
寡核苷酸序列：
寡核苷酸购自ATDbio和MGW。
A2020/PTBPROBE(18mer)
5’-TTT TCC CAG TCA CGA CGT
修饰：5’磷酸酯
中间(10)dT TAMRA
3’生物素
A2020/PFBPROBE(18mer)
5’-TTT TCC CAG TCA CGA CGT
修饰：5’磷酸酯
中间(10)dTFAM
3’生物素
A0977/互补序列(18mer)-用于上面两条序列
5’-ACG TCG TGA CTG GGA AAA
CT序列
A2057/CTPROBE(22mer)
5’-GCTAAACTT GCT TGC CAC TCAT
修饰：5’磷酸酯
中间(12)dTFAM
A2058/CTCOMP(22mer)
5’-ATG AGT GGC AAG CAA GTT TAG C
第一链CT(100mer扩增子)
GGA ATT TCC ACT TGA TAT TAC CGC AGG AAC AGA AGC TGC GAC
AGG GAC TAA GGA TGC CTC TAT TGA CTA CCA TGA GTG GCA AGC
AAG TTT AGC CCT TTC T
FAM探针的结合位点以粗体显示。
5’7个碱基突出端
3’71个碱基
仪器
使用结合在514.5nm和30mW功率下工作氩离子激光器的RenishawIn-Via拉曼显微镜系统收集SERRS光谱。硅标准品用来通过测定520cm-1峰的强度来校准仪器。
在Stratagene MX400Q-PCR上进行荧光测定，该仪器使用石英卤素灯作为光源。带通滤光片通常设定在EX.350nm，EMM.516。所有其他通道通过使用遮光滤光片遮蔽。Cary Eclipse分光光度计也用于一般的荧光测定。
测定使用λ核酸外切酶。
下面的测定基于市售的标记有5’-磷酸酯、内部TAMRA dT修饰和3’末端生物素的18-mer(根据图3的示意图)作为可降解探针的应用。
PTBPROBE＝5’磷酸酯-TIT TCC CAG T(X)CA CGA CGT-生物素3’
其中X＝邻近T的TAMRA修饰
简言之，反应混合物(9-10μl，1微微摩尔PTBPROBE在存在/不存在1当量的互补ssDNA时)加热至90℃并冷却至20℃以促进互补序列的杂交。然后加入λ核酸外切酶，并将反应物在37℃下温育30分钟以开始消化。该酶是高度持续性的5′至3′外切脱氧核糖核酸酶，其释放5′-单核苷酸和未水解的互补单链DNA(ssDNA)链作为产物。TAMRA-标记的单核苷酸应该在上述PTBPROBE的消化时被释放。
在消化后，反应混合物加热至75℃15分钟以完全地使酶灭活并在将样品冷却回室温之前基本上猝灭反应。然后将在洗涤和结合缓冲液(0.5MNaCl，20mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 7)中的链霉抗生物素蛋白涂布的磁珠用来经与标记的寡核苷酸上的3’生物素修饰的强相互作用而去除任何未消化的PTBPROBE。引入该步骤是为了去除会引起背景信号的未消化的染料标记的探针。使用磁体将磁珠吸引至eppendorf的侧面，然后将上清液转移至干净的微量滴定孔板。加入聚集剂(aggregating agent)(20μl)，然后加入柠檬酸盐还原的银胶体(100μl)。在InVia拉曼显微镜上使用514nm激发激光线在加入银胶体后立即记录SERRS光谱。
λ核酸外切酶是高度持续性的5′至3′外切脱氧核糖核酸酶，其释放5′-单核苷酸和未水解的互补单链DNA(ssDNA)链作为产物。染料-标记的单核苷酸应该在消化时被释放。
SERRS检测策略：
反应混合物含有酶、全长寡核苷酸、截短的消化产物和大量化合物的复杂组合。
在SERRS分析前反应混合物(20μl，包括生物素洗涤步骤)中不同种类的近似浓度列举在下面：
0.1μM寡核苷酸标记探针(初始地，加消化产物)
0.1μM互补寡核苷酸靶标
33.5mM甘氨酸KOH，
1.25mM MgCl2
0.01％TX-100(表面活性剂)
0.255M NaCl，
12.5mM Tris-HCl
0.505mM EDTA
2.5％甘油
0.05mM DTT
10单位的λ核酸外切酶
甘氨酸，一种简单的氨基酸，以高浓度存在，并且其已知与柠檬酸盐还原的银胶体的表面相互作用(Surface-enhanced Raman scattering ofbiological molecules on metal colloid II：effects of aggregation of gold colloidand comparison of effects of pH of Glycine solutions between gold and silvercolloids(生物分子在金属胶体II上的表面增强拉曼散射：金胶体聚集的作用以及金和银胶体之间甘氨酸溶液的pH的作用的比较)：X.Dou，Y.M.Jung，Z.Cao和Y.Ozaki，Appl.Spectrosc.，1999，53，1140)。其与银表面的相互作用程度受pH的影响，并且该作用程度与不同的离子化种类的pKa值相关：
稳定银和金胶体中的种类的pKa值：
柠檬酸盐：3.1，4.7，6.4
EDTA：2.0，2.7，6.1，10.2
甘氨酸：pK1＝2.34(COOH)，pK2＝9.6(NH3 +)等电点为5.97
在pH 9.4(缓冲的)下进行消化反应，但加入柠檬酸盐还原的银胶体(pH6-7)可能在一定程度上降低总pH。无论如何，这表明银胶体上的柠檬酸盐基团在这些条件下将完全地去质子化。此外，在分析时大量的甘氨酸应该为两性离子(NH3 +，COO-)状态。
当核酸外切酶反应缓冲液加入至银纳米颗粒中时(以与实际测定中使用的相同比例，但不同的体积)，观察到-veζ电位(ve Zeta-potential)的减少(表1)。这表明颗粒表面电荷的变化。然而，在此阶段颗粒显示没有明显的聚集变化。
表1.银胶体在水和核酸外切酶反应缓冲液中的pH和ζ电位值(在本研究中不使用金但其被包括用于比较)。
这用来强调pH的重要性以及其对反应混合物中的一些不同种类的作用。pH有可能决定不同化学品与金属表面的亲和力，并且该亲和力又将影响随后的任何SERRS研究。
当使用TAMRA标记的寡核苷酸探针时，用来聚集SERRS颗粒的MgSO4证明达到了我们的目的(图7和8)。有可能获得释放的TAMRA标记的SERRS信号，尽管也观察到来自对照样品的一些背景信号。然而，在使用一系列重复三次的反应的研究中，有可能在对照样品和含有靶序列的阳性检测反应物之间建立很大的鉴别度。
简要实验方案：
将PTBPROBE(5’-磷酸酯，内部dT(TAMRA)，3’生物素)与其互补序列在λ核酸外切酶反应缓冲液(67mM甘氨酸-KOH，2.5MgCl2，0.01％TX-100)中混合，加热至90℃，然后在约15分钟的时间内冷却至20℃(0.1μM，1∶1比例，10μl反应规模，1微微摩尔dsDNA)。加入λ核酸外切酶(1μl，10单位)，并且在37℃下消化30分钟，紧接着进行灭活步骤(75℃15分钟)。将反应混合物转移至96孔微量滴定板，并与链霉抗生物素蛋白涂布的磁珠(10μl，4mg/ml)在室温下在旋转式振荡器上温育30分钟。然后将微量滴定板置于磁座上，将磁珠朝向孔的侧面分离，然后将上清液(20μl)转移至干净的孔中。加入聚集剂(20μl，1M MgSO4)，然后加入100μl柠檬酸盐还原的银胶体。之后立即获取SERRS光谱(Renishaw in Via Raman，514.5nm，x10物镜，100％功率，10秒，3accu.)。(见图9)
基于Fret的测定
用于此类型测定的示意图显示在图10中。
使用FAM标记探针(5’磷酸酯-TTT TCC CAG(AT-FAM)CA CGACGT-生物素)与互补靶序列的不同比例(1∶1；10∶1，100∶1)，以10μl的规模进行反应。FAM标记探针和H33258染料(M.Teng，N.Usman，C.A.Frederick和H.J.Wang，Nucl.Acids Res.(核酸研究)，1988，16No.6；D.E.Wemer，Biopolymers(生物聚合物)，1999，52，197-211；以及F.M.Ho&E.A.H Hall，Biosensors and Bioelectronics(生物传感器和生物电子学)，2004，20，5，1001-1010)的浓度为1μM。加入λ核酸外切酶反应缓冲液(1μl，10单位)，并且将反应混合物加热至37℃30分钟，紧接着在75℃下进行酶灭活步骤15分钟。将含有互补靶序列(100μl，0.1μM)的溶液加入至各反应物中，并且测定熔解/退火曲线(温度范围15-75℃，监测每1℃在@Ex350nm，Emm520nm处的荧光变化，x3退火曲线和x3熔解曲线)。对照样品(不加入酶)显示Tm～58℃，该值与UV-熔解数据一致。消化的样品中没有一个显示可辨别的熔解曲线，表明在每个消化的样品中FAM标记探针都被消化了。
这些结果显示在图12和图13中。
进一步实施例
1.材料
DNA序列购自ATDbio。使用的DNA序列列在表2中。
表2：用于核酸外切酶测定法的DNA探针
| 名称 | 核苷酸序列 | 5’修饰 | 中间修饰 | 3’修饰 |
| A1220/FAM探针 | 5′TTT-TCC-CAG-TCA-CGA-CGT3′ | 磷酸酯 | FAM碱基10 | 生物素 |
| A1219/TAMRA探针 | 5’TTT-TCC-CAG-TCA-CGA-CGT 3’ | 磷酸酯 | TAMRA碱基10 | 生物素 |
| A1710/无FAM探针 | 5′TTT-CC-CAG-TCA-CGA-CGT3′ | 磷酸酯 | - | - |
| A0977/完全互补 | 5′ACG-TCG-TCA-CTG-CGA-AAA3′ | - | - | - |
| LE1/3’突出端 | 5′ACG-TCG-TCA-CTG-CGA-AAA-CCC-TGG-CGT-TAC-CCA-ACT-TA 3′ | - | - | - |
| 名称 | 核苷酸序列 | 5’修饰 | 中间修饰 | 3’修饰 |
| LE2/5’突出端 | 5′TCA-CTG-GCC-GTC-GTT-TTA-CAA-CGT-CGT-CAC-TGC-CGA-AA3′ | - | - | - |
| LE3/两侧均有突出端 | 5′TCA-CTG-GCC-GTC-GTT-TTA-CAA-CGT-CGT-CAC-TGC-CGA-AAC-CCT-GGC-GTT-ACC-CAA-CTT-A3′ | - | - | - |
Hoechst染料H33258购自Sigma-Aldrich(西格玛-奥尔德里奇)。
Quant-iTTM 
试剂购自Invitrogen。
重组λ核酸外切酶和x10核酸外切酶反应缓冲液购自Cambio。当稀释至x1时，该缓冲液的组成为67mM甘氨酸-KOH，2.5mM MgCl2，0.1％Triton X-100；在25℃下pH 9.4。
各种(miscellaneous)化学品购自Sigma-Aldrich(西格玛-奥尔德里奇)。
实验使用的磷酸盐缓冲液为具有0.3M NaCl的6mM磷酸酯。
2.仪器
在CARY 300生物紫外-可见光分光光度计(Bio UV-visiblespectrophotometer)上进行吸收研究和UV-熔解。使用Varian CaryEclipse荧光分光光度计进行发射研究。在两个实验中均使用1cm径长和3ml体积的光学透明塑料杯。使用Stratagene Mx4000PCR仪进行酶学测定。
6.核酸外切酶测定
在x1λ核酸外切酶缓冲液中制备样品，最终体积为150μl。在每个试验中序列、补体和/或Hoechst染料的浓度为1μM。在有酶的样品中，向反应混合物中加入10单位的λexo(1μl10单位/μl浓度)。激发波长设定在350nm(10nm带通)，并且对于FRET系统在519nm处获取发射测定值，对于Hoechst染料荧光(10nm带通)在440nm处获取发射测定值。在制备期间将样品置于冷板(cool plate)中以避免过早消化。
将样品在37℃下保持30分钟(消化阶段)，每分钟测定荧光。然后酶在75℃下变性(灭活阶段)15分钟。之后进行三个熔解阶段：75～20℃的退火曲线，然后再次加热至75℃，并且最后冷却阶段冷却至25℃。加热或冷却速率为1℃/min，每分钟测定荧光。
对于PicoGreen-TAMRA系统使用相同的测定，使用0.1μM浓度的TAMRA探针和互补序列以及1/10000稀释度的PicoGreen的样品。样品为λexo反应缓冲液中的150μl体积。激发波长为492nm(10nm带通)，在515nm处测定发射(10nm带通)。
V.结果和讨论
4.核酸外切酶测定
4.1.FAM探针的消化
如实验章节中所述用λ核酸外切酶进行消化。使用两个对照：
●对照单链DNA：存在酶的含有1μM FAM探针和核酸外切酶反应缓冲液中的1μM H33258的样品。我们假设此对照的荧光等于100％消化的DNA。
●对照双链DNA：含有1μM FAM探针、补体和Hoechst的样品，但不含核酸外切酶。假设此对照等于0％消化。
图14显示在消化30分钟内消化的对照和样品的荧光(显示来自三个重复试验品之一的数据)。对于对照样品，荧光强度没有可观察到的变化。然而，杂交的FAM探针的发射显示优异的衰变，从100％双链DNA的水平开始，并且达到单链的值。我们可看到荧光强度随时间变化而进行性地下降，显示该FRET系统实时监测酶消化的能力。
之后对样品测定的退火曲线(图15)提供了对消化更多的证据。无酶样品当冷却时再杂交，显示Tm为57℃左右，与前面对FAM探针的研究所观察到的相同。用λ核酸外切酶消化的样品显示没有能力再杂交，意味着消化作用实际上已经完全地降解了FAM探针。
4.2.使用不同的补体消化FAM探针
研究当DNA与比完全补体长的序列杂交时λ核酸外切酶消化DNA的能力。为此，对下列的样品进行相同的酶反应：
●对照单链DNA(FAM探针)
●完全补体：FAM探针，完全补体和Hoechst染料，在λexo反应缓冲液中各自为1μM
●3’突出端：相同，但使用3’端中多12个碱基对的互补序列
●5’突出端：相同，但5’端中具有突出端
●两侧均有突出端：在3’和5’端中均有12个碱基对的突出端
对于上述各个样品，使用一组反应物作为对照双链DNA(无酶)(每个类型的样品三次重复)，并且如前所述另一组使用λ核酸外切酶进行测定。
在每个情形中，荧光的出现相对时间的作图非常类似于完全补体(图未显示)，均显示强度的显著降低(见图16)。之后测定的熔解曲线显示所有样品均已经被消化。
在得到这些结果后，我们可得出结论λ核酸外切酶能够消化DNA，即使互补序列比探针长也是这样。
使用双标记探针通过SERRS来检测生物样品中的人类病原体。
通过SERRS对来自生物样品的人类病原体进行单管检测以检测沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)。使用类似Taq-Man的技术，通过PCR扩增ompA基因的一个区(GenBank序列AY535172)，同时消化双重标记探针。下面的数据显示基于SERRS信号的强度有可能区分沙眼衣原体阳性和沙眼衣原体阴性样品。在此实施例中，使用SE(R)RS活性罗丹明染料R6G；然而可使用任意的SE(R)RS(或其他拉曼)活性标记。在此测定中使用的探针/引物组基于用于鉴定衣原体感染的临床诊断性PCR。通过QCMD程序(用于分子诊断学的质量控制)以加入了各种浓度的沙眼衣原体基因组DNA的冻干尿液的形式提供样品。沙眼衣原体DNA来自在McCoy细胞上生长的3天培养物，这些培养物被收获并被热灭活。
材料和方法
样品的重构
接受含有冻干尿液和沙眼衣原体基因组DNA的无菌橡胶密封瓶作为样品。向样品中注入1.2mL无菌milliQ水，并在37℃下摇动1小时以重构样品。
制备模板
从瓶中取出全部样品至无菌的1.5mL试管中，并加入酵母tRNA(Sigma(西格玛))至100μg.mL-1的终浓度。向样品中加入2体积的冰冷乙醇和1/10体积的3M乙酸钠。将样品充分地混合并在-20℃下温育15分钟。样品在bench离心机中以最大速度离心15分钟，并弃去上清液。用冰冷70％v/v乙醇将沉淀物洗涤两次，用冰冷乙醇洗涤一次，并风干。将沉淀物重新悬浮在60μL无菌milliQ水中，在37℃下摇动1小时。将其在随后的PCR反应中用作模板。
扩增
基于用于检测沙眼衣原体ompA基因(Personal communication，ProfPaul Wallace)的临床诊断性PCR，使用探针/引物组(MWG Biotech)。引物被设计成从碱基501～碱基600扩增基因的100bp区(基于GenBank序列AY535172)，探针退火至碱基596～535。使用的引物和探针的序列从5’至3’详述如下：
引物1：cacttratattaccgcaggaacag
引物2：gctaaacttgctgccactcat
探针：生物素-agaggcatccttagtccctgtcgcagc-R6G
使用热启动NovaTaq聚合酶(Novagen)、25pmol各引物，100pmol～0.1pmol的探针、2μL模板和3mM MgSO4进行PCR。反应物的总体积为50μL，并且在矿物油中进行这些反应。
使用下列参数进行PCR 30个以上的扩增循环：
1循环94℃10分钟
30循环94℃20s，58℃20s以及72℃20s
1循环72℃2分钟。
使用链霉抗生物素蛋白珠的样品加工
从新英格兰生物实验室(New England Biolabs)获得4mg.mL-1的链霉抗生物素蛋白顺磁珠。对于生物素化寡核苷酸，所述珠具有的结合容量为500pmol.mg-1珠。因为任何PCR反应中的生物素化探针的最大量为100pmol，每个反应需要0.2mg(50μL)的珠。
制备链霉抗生物素蛋白珠供使用
通过轻轻地涡旋将所述珠重悬浮。取出所需的等分试样(50μL乘以要测定的PCR反应的次数)并置于无菌1.5mL试管中。将所述珠置于磁分离支架≥2分钟直至所有珠被螯合。将试管固定在支架上，去除并弃去上清液。从支架上取下试管并将所述珠重悬浮在2体积2x B/W缓冲液，[2x结合和洗涤缓冲液：10mM Tris-HCl pH 7.5，1mM EDTApH 7.5，2M NaCl]中。将试管返回至分离支架上并温育≥2分钟。洗涤过程重复两次。将所述珠重悬浮在2x B/W中，使得其最终体积与初始体积相同。
样品加工
将50μL制备的珠加入至50μLPCR反应物中并轻轻混合，然后在室温下温育≥15分钟并不时混合。将试管置于分离支架中使得磁体在矿物油层上方，并在室温下温育≥2分钟或直至所述珠已经移动至矿物油之上。将试管固定在支架上，同时将上清液移至新鲜试管中。然后该上清液用于所有随后的SERRS分析。
SERRS检测
制备银纳米颗粒
使用改良的Lee和Meisel法制备柠檬酸盐还原的银纳米颗粒的胶体悬浮液。
仪器
使用下列的拉曼仪器：带有514.5-nm氩离子激光器的Renishaw 100型探针系统，采用20x物镜将激光束聚焦至含样品的1-cm塑料杯中。
样品制备
使用下列用量的试剂制备用于SERRS分析的所有样品：10μL分析物，10μL精胺，250μL水和250μL柠檬酸盐还原的银纳米颗粒。
琼脂糖凝胶电泳
在水平、中性、2.5％(w/v)琼脂糖凝胶上使DNA显像。常规制备凝胶，并将其在1x TBE缓冲液(Sigma(西格玛))中跑电泳。100bp标志物(Novagen)和Hyper V(Bioline)标志物用作大小标准品。使用较大的16.5x23cm(200mL)凝胶以确保良好的分离。DNA样品与1/10体积的10xBluejuice加样缓冲液(Sigma(西格玛))混合，然后加样至凝胶上。凝胶在溶解在1x TBE中的0.5μg.mL-1溴化乙锭溶液中染色10-20分钟。
结果和讨论
该技术是Taq-man的改良技术，使用引物组来扩增来自沙眼衣原体的ompA的特定区，同时消化双重标记探针。
在Taq-man中，有两条引物和使两者之间退火的一个双重标记探针。该探针在一端带有猝灭剂，并且在另一端带有荧光染料。尽管探针是完整的，猝灭剂与荧光标记足够接近以防止发射。在PCR扩增期间，随着聚合酶使引物延伸，聚合酶的5’至3’核酸酶活性消化探针，将猝灭剂与荧光标记有效地分离并能够进行检测。
在此实施例中，探针用生物素和罗丹明标记。在扩增期间，一定比例的探针被破坏，释放生物素和罗丹明。两者仍然附着在一些核苷酸上，但彼此不再有物理上的联系。PCR后，存在附着有生物素和罗丹明的未反应(完整的)探针、游离的生物素和游离的罗丹明的混合物。
链霉抗生物素蛋白珠，以链霉抗生物素蛋白和生物素之间的几乎不可逆的相互作用，很容易捕获完整的探针和游离的生物素，在上清液中仅留有游离的罗丹明。该过程螯合了所有的未反应探针，并将其从随后的SERRS分析中去除，使得罗丹明信号指示沙眼衣原体的阳性检测。
由于SERRS极度灵敏的特性，如果需要，使用的探针量可以减少到最低程度以减少任何背景并减少成本。我们研究了100pmol～0.1pmol的探针浓度范围以观察那个浓度最有效。试验重复进行两次，进行两组阳性和两组阴性PCR(阴性PCR缺少沙眼衣原体DNA)。10μL等分试样的各PCR产物在2.5％(w/v)TBE琼脂糖凝胶上电泳以检查产物的存在，图18。所有阳性反应物扩增良好，阴性反应物没有一个显示有产物。
图18显示PCR扩增的试验：2.5％(w/v)琼脂糖TBE凝胶对于100pmol探针、10pmol、1pmol和0.1pmol的探针稀释范围显示有两个阳性重复试验品(2-9泳道)和2个阴性重复试验品(12-19泳道)。泳道1)100bp标志物，泳道2)100a，泳道3)100b，泳道4)10a，泳道5)10b，泳道6)1a，泳道7)1b，泳道8)0.1a，泳道9)0.1b，泳道10)100bp标志物，泳道11)Hyper V标志物，泳道12)100a，泳道13)100b，泳道14)10a，泳道15)10b，泳道16)1a，泳道17)1b，泳道18)0.1a，泳道19)0.1b，泳道20)100bp标志物。
制备PCR反应物回到50μL，并使用链霉抗生物素蛋白珠加工以分离完整的和消化的探针。然后上清液用于SERRS分析。
SERRS分析显示阳性反应得到强SERRS信号，并且尽管也有来自PCR阴性样品的信号，但该信号比阳性对照弱许多倍。见图19&20。图19显示对于探针稀释实验的光谱，图中显示通过SERRS分析的两个阳性系列(红和绿)以及两个阴性系列(蓝和黑)的样品。探针浓度从左至右增加。图20显示使用每个反应100pmol探针，阳性和阴性样品之间光谱的差异。
ExoSERRS珠测定
所谓的exoSERRS珠测定描述在图21中。在示意图的开始，即最上面，描述了单链靶DNA和在3’端被生物素化的短捕获探针(绘为小灰白色矩形内部的“B”，其已经与显示为大灰色圆圈的链霉抗生物素蛋白涂布的磁珠结合)。在3’-生物素化捕获探针与链霉抗生物素蛋白涂布的磁珠结合后，未结合的探针被洗掉。在显示的第一步骤中，靶DNA与固定的捕获探针杂交。未结合的靶DNA可被洗掉。核苷酸的5’-磷酸酯标记包括SERRS活性染料(显示朝向5’端的灰白色圆圈(在此例中为TAMRA))并且还任选地包括3’-标记猝灭剂(在此例中BHQ2允许与捕获的靶DNA杂交)。最后得到的包括靶DNA，捕获探针和染料标记探针的双链DNA暴露于λ核酸外切酶的作用，该酶将杂交的染料标记的探针DNA降解为单核苷酸，使染料游离从而能够通过SERRS检测。
图21中描述的测定法，利用生物素-链霉抗生物素蛋白的强相互作用，使用短捕获探针、全长靶标和染料标记探针。裂解探针测定法采用具有下列组成的上述的三种合成寡核苷酸：
捕获探针
3’TCT CCG TAG GAA 3’dT被生物素化
染料标记探针
3’TCA GGG ACA GCG XCG 3’dT用BHQ2修饰
X是用TAMRA修饰的dT
靶标补体
5’AGA GGC ATC CTTAGT CCC TGT CGC AGC
试验步骤
1.将捕获探针在1x结合和洗涤(B/W)缓冲液中与链霉抗生物素蛋白涂布的磁珠经3’生物素修饰作用结合。将未结合的探针用B/W缓冲液洗掉，同时结合的探针通过磁力分离。
2.使用加热程序(90℃10分钟，20℃5分钟)将靶标互补序列与结合的捕获探针杂交。未结合的靶标再次使用1x B/W洗涤3+次而被洗掉。
3.然后使用前面的加热条件将染料标记探针与已形成的捕获探针/靶双链体杂交。再次如上将未结合的探针洗掉。
4.然后将裂解的探针复合体暴露于λ核酸外切酶和核酸外切酶反应缓冲液。在37℃下消化30分钟，然后在75℃下进行酶灭活步骤15分钟。
5.将复合体转移至96孔微量滴定板中，并在用于SERRS的制剂中加入银胶体、聚集剂和水。
6.利用Renishaw inVia拉曼光谱检测仪(Renishaw inVia Raman)在514.5nm，100％功率，x20物镜，10s和3次累积的设置下立即获取SERRS。
7.还可能进行荧光测定。
结果
图22图示说明了全程测定与去除染料标记探针的全程测定相比较的SERRS响应。TAMRA响应的形状是非常明显的。令人高兴的是对照中没有峰出现。
SERRS活性探针的合成
合成SERRS活性探针，该探针由含有无活性的SERRS标记(即，当其为探针的形式时不产生SERRS信号)的探针序列组成。一旦该序列与靶序列杂交，探针在λ或其他核酸外切酶的作用之前仍然是无活性的，在核酸外切酶的作用下其释放SERRS标记，从而使其成为有SERRS活性的探针。
SERRS活性探针可如下制备：生成带有5’磷酸酯、探针序列的寡核苷酸，然后将3’磷酸酯连接至染料上，该探针在酶裂解后成为有SERRS活性的探针。3’磷酸酯连接允许直接附着于羟基喹啉偶氮染料，已经显示当使用SERRS检测时在从“关”至“开”状态的转换中该染料是碱性磷酸酶的良好底物(F.M.Campbell等人，Analyst，2008，DOI 10.1039/B8087A)。以此方式，使用寡核苷酸的反向亚磷酰胺合成将羟基喹啉偶氮染料加到3’端，即从5’至3’方向的合成(正常寡核苷酸合成为从3’至5’)。这样使得在标准固相合成期间羟基喹啉偶氮染料作为亚磷酰胺被加入。通过改变偶氮染料的其他芳香成分，可对不同的序列使用不同的染料，每个都具有不同的SERRS信号。因此这样能够进行多重检测。
8-羟基喹啉衍生染料的合成
8-羟基喹啉衍生染料(3)通过邻氨基苄腈的重氮化然后与8-羟基喹啉偶联而制备。为了纯化该染料，其首先被乙酰化，使得其可通过快速柱色谱从起始原料中分离，并且在转变为亚磷酰胺之前被脱乙酰化。染料的合成通过1H，13C NMR，质谱来确认。
实验步骤：
邻氨基苄腈(1当量)在HC1(50％，10ml)中搅拌，并小心地加热10分钟。将混合物在冰浴中冷却至0℃，向其中逐滴加入NaNO2(1.2当量)/2ml水(蒸馏的)。使反应物在0℃下搅拌30min，生成浅黄色溶液。单独地将8-羟基喹啉(1当量)溶解在其中加入NaOH(10％，100ml)的MeOH(30ml)中。将8-羟基喹啉溶液在15分钟内逐滴地加入至重氮盐溶液中，并搅拌过夜。
通过加入HCl(50％)将反应物中和，通过过滤收集所得沉淀物，并干燥过夜。将沉淀物溶解在含有催化量的4-二甲基氨基吡啶的乙酸酐(100ml)中。TLC分析显示完全反应。将混合物倒入1600ml冰/水中，并静置3h。倒掉过量水，将更多的冰加入至红色的油/水混合物中，产生沉淀。收集沉淀物并干燥，并且通过快速柱色谱纯化(二氧化硅，洗脱剂：DCM-1％MeOH/DCM)，得到脱乙酰化的靶产物3，收率为38％。δH(400MHz；DMSO)3.31(1H，br，s，OH)，7.29-7.31(1H，d，J 8.0，ArH)，7.67-7.71(1H，td，ArH)，7.78-7.81(1H，q，J 4.0，ArH)，7.87-7.91(1H，td，ArH)，8.06-8.12(3H，m，ArH×3)，9.00-9.02(1H，dd，ArH)，9.36-9.38(1H，dd，ArH)。
8-羟基喹啉衍生染料3的SERRS
通过使用1％聚左旋赖氨酸(poly-L-lysine)作为聚集剂分析溶液(0.1μM)来确认染料3的SERRS活性。514nm激光源，1s采集，100％功率，1400cm-1。SERRS光谱显示在图23中。
8-羟基喹啉衍生染料DNA修饰
使用氯亚磷酸化(chlorophosphitylating)试剂4进行8-羟基喹啉衍生染料3的亚磷酰化(phosphitylation)以产生亚磷酰胺5。PIII亚磷酰胺的合成通过31P NMR确认。使用逆向碱基合成将亚磷酰胺5用来生成3’-染料标记的探针序列，通过使用磷酸酯CPG柱在5’端掺入磷酸酯。
序列表
<110>斯特拉斯克莱德大学
邓肯·格雷姆
凯伦·福尔兹
尤安·史密斯
阿拉斯泰尔·里基茨
<120>核酸序列的鉴定
<130>P15146PC
<160>27
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸探针
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ncagggacag cgncg 15
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<223>寡核苷酸
<400>27
agaggcatcc ttagtccctg tcgcagc 27
Claims (36)
1.一种用于检测靶核酸的方法，包括以下步骤：
(i)将单链探针核酸与目的样品在以下条件下接触：如果存在靶核酸，通过所述探针核酸与所述靶核酸的特异性杂交有效产生探针/靶核酸双链体；
(ii)将任意的探针/靶核酸双链体与核酸外切酶接触以实现所述双链体的消化并从所述双链体释放标记分子；以及
(iii)通过拉曼光谱法检测所述标记。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述核酸外切酶不具有寡核苷酸合成能力。
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述探针核酸具有5’-磷酸酯基团并且所述核酸外切酶是λ核酸外切酶。
4.如前面任意一项权利要求所述的方法，其中在步骤(i)中过量的所述探针核酸与目的样品接触使得步骤(ii)中双链体的消化使所述靶核酸再循环一次或多次，从而使更多的探针分子与所述靶特异性地杂交，形成额外的探针/靶核酸双链体，所述额外的探针/靶核酸双链体被消化以释放更多的标记分子。
5.如前面任意一项权利要求所述的方法，所述方法进一步包括：如果所述靶核酸存在，检测所述标记中任意的可检测到的变化，从而检测所述靶核酸。
6.如权利要求5所述的方法，其中在所述目的样品中任意靶核酸的数量参照所述变化的幅度来测定。
7.如前面任意一项权利要求所述的方法，其中所述探针核酸是DNA。
8.如前面任意一项权利要求所述的方法，其中所述靶核酸是DNA。
9.如前面任意一项权利要求所述的方法，其中所述靶核酸是双链核酸。
10.如权利要求1-8任意一项所述的方法，其中所述靶核酸是单链核酸。
11.如前面任意一项权利要求所述的方法，其中所述标记仅当通过所述探针/靶核酸双链体的消化从所述双链体核酸中释放时能够通过拉曼光谱法而被检测到。
12.如前面任意一项权利要求所述的方法，其中所述标记是SE(R)RS活性染料。
13.如前面任意一项权利要求所述的方法，其中所述标记是SERRS标记。
14.如前面任意一项权利要求所述的方法，其中所述标记是荧光团。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述标记是3’羟基喹啉染料。
16.如前面任意一项权利要求所述的方法，其中所述探针包括荧光团和在所述消化之前猝灭所述荧光团的猝灭剂。
17.如前面任意一项权利要求所述的方法，其中通过拉曼光谱法的所述检测由基于等离子体光子学或荧光的检测来补充。
18.如前面任意一项权利要求所述的方法，其中所述探针序列附着于SE(R)RS活性基底上。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述基底是纳米颗粒的表面。
20.如前面任意一项权利要求所述的方法，其中在步骤(i)中所述标记与所述探针核酸和所述目的样品接触，如果形成探针/靶核酸双链体则所述标记可嵌入至任意一个所述探针/靶核酸双链体中。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述标记可与所述双链体的小沟或大沟结合。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述标记是小沟结合物。
23.如权利要求1-19中任意一项所述的方法，其中所述标记与所述探针核酸附着、结合或以其他方式缔合。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述探针核酸与所述标记结合。
25.如前面任意一项权利要求所述的方法，其中所持探针核酸包括约20～约30个核苷酸。
26.如权利要求1-17中任意一项权利要求所述的方法，其中所述接触包括与第一探针核酸和第二探针核酸接触，其中所述第一探针核酸包括与所述靶核酸的一部分序列互补的核酸序列，和可捕获部分，所述可捕获部分允许捕获由第一探针核酸与靶核酸杂交生成的任意双链体，并且其中所述第二探针包括与所述靶核酸的与所述第一探针核酸互补的序列以外的一部分序列互补的核酸序列和所述标记。
27.如权利要求26所述的方法，其中通过所述目的样品与所述第一和所述第二探针核酸接触形成的所述双链体在所述接触之后所述检测之前与非所述双链体的一部分的其他物质分离。
28.如权利要求1-17中任意一项所述的方法，其中所述接触包括与第一探针核酸和第二探针核酸接触，其中所述第一探针核酸包括与所述靶核酸的一部分序列互补的核酸序列，和与所述第二探针核酸的一部分序列互补的核酸序列。
29.如权利要求28所述的方法，其中所持接触进一步包括与捕获核酸接触，所述捕获核酸与所述靶核酸的不与所述第一探针核酸互补的部分序列互补并与可捕获部分结合，所述可捕获部分允许捕获任意可捕获的核酸复合体，所述可捕获的核酸复合体可当所述靶核酸存在时在所述接触时形成。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述可捕获的核酸复合体在所述接触之后所述检测之前与非所述双链体的一部分的其他物质分离。
31.如权利要求26-30中任意一项所述的方法，其中所述标记与所述第二探针核酸附着、结合或以其他方式缔合。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述第二探针核酸与所述标记结合。
33.如权利要求26-32中任意一项所述的方法，其中所述第一和第二探针核酸各自包括约20～约30个核苷酸。
34.一种同时检测目的样品中的多个不同的靶核酸的方法，包括同时实施多种如权利要求1-33中任意一项所限定的方法，其中不同的标记用于检测各种所述靶核酸。
35.一种由多个部分组成的试剂盒，包括：
(i)单链探针核酸；
(ii)核酸外切酶；以及
(iii)用于权利要求1-34中任意一项所限定的方法中的通过拉曼光谱法可检测到的标记。
36.如权利要求35所述的试剂盒，其中所述核酸外切酶是λ核酸外切酶。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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