ES2547052T3 - Identificación de secuencias de ácidos nucleicos - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento para su uso en la detección de un ácido nucleico diana que comprende las etapas de: (i) poner en contacto una sonda de ácido nucleico monocatenaria con una muestra de interés en condiciones eficaces para generar un duplo de sonda/ácido nucleico diana mediante la hibridación específica de dicha sonda de ácido nucleico a un ácido nucleico diana, si dicho ácido nucleico diana está presente; (ii) poner en contacto cualquier duplo de sonda/ácido nucleico diana con una exonucleasa para efectuar la digestión del duplo y la liberación de una molécula marcadora del duplo; y (iii) detectar el marcador mediante espectroscopía Raman detectando un cambio detectable en el espectro Raman del marcador tras su liberación del duplo, para detectar el ácido nucleico diana, si está presente.

Description

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exponiendo el conjugado biomolecular de sonda-ácido nucleico diana a una sonda de ácido nucleico y practicando un procedimiento de la invención.
Una ventaja adicional de esta realización de la invención es la facilidad con la que se permite la multiplexación, simplemente cambiando el marcador de la segunda sonda y la secuencia diana de la primera sonda. La secuencia que se degrada realmente por la exonucleasa puede permanecer constante necesitando únicamente establecer un conjunto de condiciones óptimas para la exonucleasa incluso en una matriz de complejos múltiples en la que pueden detectarse varios ácidos nucleicos diana.
El uso de secuencias genéricas escindibles por la exonucleasa descritas anteriormente en el presente documento también puede usarse en conjunción con la metodología de captura descrita en el presente documento. Por lo tanto, por ejemplo, la porción de la primera sonda de ácido nucleico diseñada para hibridar con la segunda sonda de ácido nucleico podría derivarse por ejemplo en el extremo 3’ con biotina para permitir el uso de una metodología de captura y de lavado basada en estreptavidina-biotina descrita en el presente documento y en referencia a la Figura
21. De este modo la primera sonda de ácido nucleico sirve como sonda capturable tal como se describe en el presente documento. El uso de dichas metodologías puede mejorar la especificidad (y por lo tanto la fiabilidad) de los procedimientos de esta invención (si se desea).
Un modo alternativo para mejorar la especificidad se representa en la Figura 25. Esta representa el uso de dos sondas de captura que pueden unirse a una superficie sólida, por ejemplo una esfera o una placa o una alternativa ejemplar derivada con biotina para permitir la captura mediante un imán recubierto de estreptavidina. Se representan dos sondas de captura; podrían usarse una o más. Por lo tanto, cuando se deriva la metodología de captura para usarse en los casos donde se hace uso de secuencias escindibles por exonucleasa, la sonda (o las sondas) de captura no necesitan ser la misma sonda que aquella que hibrida con la sonda marcada (tal como se ilustra en la Figura 24).
En una realización de la invención, la sonda de ácido nucleico que contiene un fosfato 5’ que hibrida con un ácido nucleico diana se digiere por una exonucleasa tal como la exonucleasa lambda, de modo que se degrada la cadena que contiene el fosfato 5’. Mientras que pueden degradarse ambas hebras por digestión, en algunas realizaciones de la invención es suficiente la para digestión únicamente de la sonda y la liberación del marcador detectable por Raman/(R)DRSP.
La exonucleasa Lamba es una enzima de 24 kD codificada por el bacteriófago Lambda. Esta enzima está implicada en la recombinación genética del bacteriófago pero también está disponible comercialmente como una enzima de procesamiento del ADN. Se ha desvelado que la estructura cristalina de la enzima es un homotrímero con una estructura cuaternaria toroidal.
La exonucleasa lambda digiere una cadena bicatenaria (ADNbc) comenzando por el extremo 5’ fosforilado. Las dimensiones del canal central de la exonucleasa lambda son tales que esta únicamente puede acomodar ADNbc en un extremo del canal. La enzima es altamente procesiva, pasando la cadena 3’ de ADN a través del centro del canal cónico del centro de la enzima. La cadena 5’ se digiere, liberando mononucleótidos 5’ libres. También se ha mostrado que se digiere el ADN monocatenario con un extremo 5’ fosforilado pero es un sustrato pobre en comparación con el ADNbc (véase P.G. Mitsis y J.G. Kwagh, Nucleic Acids Research, 27(15), 3057-3063 (1999) y referencias que se citan en el mismo).
En algunas realizaciones de la invención, la exonucleasa es exonucleasa lambda. En otras realizaciones la exonucleasa no es exonucleasa lambda. Otras exonucleasas que son adecuadas para el uso de la presente invención son exonucleasas que son capaces de digerir progresivamente una o ambas hebras de un duplo de ácido nucleico en una dirección 5’ o 3’ sin importar si el extremo 5’ o 3’ del ácido nucleico está modificado, tal como por fosforilación. Debe apreciarse sin embargo, que la exonucleasa debe poseer poca o ninguna capacidad de digerir un ácido nucleico monocatenario. Otras exonucleasas adecuadas incluyen polimerasas, tales como la Taq polimerasa, ADN polimerasa I, y la ADN polimerasa T4.
La sonda puede ser de cualquier longitud conveniente. Su longitud real dependerá de la precisión con la que se desee determinar una secuencia diana dada. Típicamente, sin embargo, la sonda tendrá entre aproximadamente 10 y 50 nucleótidos de longitud, for ejemplo de 20 a 30 nucleótidos de longitud. La sonda se modifica de modo que permita el cambio de entorno del marcador para que este se detecte tras la digestión de la sonda por la exonucleasa, por ejemplo, nucleasa lambda. Preferentemente, el marcador es sustancialmente no detectable cuando forma parte de la sonda, bien cuando la sonda está presente como ácido nucleico monocatenario y/o cuando hibrida con la secuencia diana. De este modo el exceso de sonda no hibridada, que se procesa mucho menos preferentemente por las exonucleasa descritas, no será detectable y de este modo el único marcador detectable será aquel presente cuando se encuentra unido al duplo de ácido nucleico sonda y que se ha liberado tras la digestión del duplo de ácido nucleico. De este modo cualquier cambio en el marcador es indicativo de la presencia de la secuencia diana en la muestra de interés.
A diferencia de los enfoques de la técnica anterior, la cadena de la sonda no necesita extenderse necesariamente durante los procedimientos de esta invención. La sensibilidad de detección mediante el uso marcadores detectables
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usando procedimientos de espectrometría Raman, en particular (R)DRSP, por ejemplo, es tal que pueden detectarse niveles extremadamente bajos de marcador. En determinadas realizaciones de la invención, un beneficio adicional es que una vez que la sonda inicial se ha digerido, puede unirse una segunda molécula de sonda al ácido nucleico diana y puede digerirse para generar más señal a partir del mismo fragmento de ácido nucleico diana, teniendo en cuenta la elevada velocidad de recambio de determinadas exonucleasas, tales como la exonucleasa lambda. En efecto, la señal se amplifica en estas realizaciones, en contraposición con la diana, por ejemplo, en la PCR. Puede usarse un exceso de secuencia de la sonda, por ejemplo 10 veces o más o 100 veces o más que el molde presente,
o que se espera o se estima que esté presente, en la muestra, para asegurar que la cinética de hibridación favorezca la regeneración de la señal rápida. Este enfoque también permite reacciones de multiplexación mediante del uso de sondas con marcadores distintos.
Sin embargo, si se desea, puede efectuarse la amplificación de la diana. Los procedimientos adecuados de amplificación son conocidos para la persona experta e incluyen la amplificación isotérmica y la amplificación en círculo rodante.
En determinadas realizaciones de esta invención, la fluorescencia, por sí misma, como modalidad de detección puede complementar la detección mediante espectroscopía de Raman en la que el marcador detectable por espectroscopía Raman es fluorescente. En estas realizaciones la sonda comprenderá típicamente un fluoróforo y un desactivador al igual que con las balizas moleculares o las sondas TaqMan descritas anteriormente. Cuando está intacto, el desactivador extinguirá cualquier fluorescencia del fluoróforo. Sin embargo, tras la degradación de la sonda de ADN por la exonucleasa, después de la hibridación con el ácido nucleico diana, se liberará el fluoróforo del desactivador permitiendo que se obtenga la fluorescencia. En los casos donde sea problemática, puede mejorarse la fluorescencia de fondo mediante el uso de microscopía confocal. Esta permite un enfoque de detección ultrasensible al nivel de una sola molécula. También es posible usar una configuración de FRET en contraposición al desactivador-diana y también el uso de mediciones del tiempo de vida de la fluorescencia. Puede usarse cualquier fluoróforo conveniente. En una realización puede usarse fluoresceína-dT (emisión a 516 nm). La fluoresceína-dT es una base modificada en la que la fluoresceína (FAM) está unida en la posición 5 del anillo de timina mediante un brazo espaciador en el carbono 6. Puede usarse cualquier desactivador conveniente, por ejemplo Dabcyl (que extingue a 380-530 nm).
En otra realización, la modalidad de detección se basa en la plasmónica, que se basa en la resonancia de plasmones de nanopartículas como un indicador de hibridación y de este modo el cambio en el estado de agregación de las nanopartículas en solución después de la acción de la exonucleasa. De acuerdo con esta realización, las partículas individuales se funcionalizan con la sonda de tal modo que un fosfato terminal (por ejemplo fosfato 5’ en el que la exonucleasa λ se usa como la exonucleasa) o la base del nucleótido está distante con respecto a la superficie de la nanopartícula. Cuando la sonda se funcionalice tendrá una frecuencia de resonancia particular. Cuando estas sondas hibridan con la región diana, el fosfato/base terminal actúa como sitio de reconocimiento para la exonucleasa para permitir la digestión de la sonda sobre la superficie de la nanopartícula. Mientras que las nanopartículas recubiertas con la secuencia de la sonda se aíslan y se desagregan en solución, tras la hibridación con la secuencia diana y la posterior degradación de la secuencia de la sonda las nanopartículas ya no se mantendrán separadas y se agregarán dando como resultado un cambio detectable.
En una realización, puede proporcionarse una superficie a la cual se une una sonda de ácido nucleico. La superficie es una que es adecuada para su uso en la detección Raman (R)DRSP y puede ser una superficie metálica rugosa, tal como una superficie de plata. La superficie puede ser, por ejemplo, la superficie de una nanopartícula, placa de microtitulación, superficie de micromatriz o similar. El marcador detectable por Raman (por ejemplo, (R)DRSP) puede disponerse sobre la superficie tras la digestión del duplo de ácido nucleico.
Asimismo, si la superficie es la superficie de una nanopartícula, la sonda evitaría que las partículas se agregasen, pero tras la digestión de la sonda, las partículas podrían agregarse, potenciando de este modo cualquier señal detectable por Raman (por ejemplo, (R)DRSP).
Si se unen cantidades suficientemente pequeñas de sonda a la superficie de la nanopartícula (por ejemplo, una cobertura del 10 -20 % de la superficie) entonces puede asumirse que el estado de agregación de las nanopartículas cambiará cuando se degraden las sondas y dará lugar a un cambio en la frecuencia de plasmones de las nanopartículas. Esto puede medirse usando, por ejemplo, microscopía de campo oscuro (véase por ejemplo Homogeneous detection of unamplified genomic DNA sequences based on colimetric scatter of gold nanoaparticle probes (J. J. Storhoff y col., Nature Biotech. 2004, 22(7), 883-887)).
De acuerdo con esta realización un colorante activo para (R)DRSP (un marcador de (R)DRSP) puede unirse directamente a la nanopartícula, pero cuando la sonda aún está intacta, el marcador es invisible ya que no hay agregación. La digestión del duplo sonda/diana permite que ocurra la agregación de las partículas y también activa el efecto RDRSP.
Pueden usarse coloides de oro o de plata como nanopartículas. Estos coloides pueden considerarse como soles, es decir, partículas sólidas dispersas en agua. El tamaño de estas partículas está en la escala nanométrica, por lo tanto el uso del término nanopartículas típicamente es de 1 -100 nm en particular 10 -80 nm, tales como 15 -40 nm). El
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medio coloidal se ajusta bien a las reacciones de hibridación de ADN mientras que los oligonucleótidos pueden inmovilizarse sobre la superficie de las nanopartículas de oro o de plata.
En realizaciones preferentes, tal como se explica anteriormente en el presente documento, la modalidad de detección se basa en la (R)DRSP. Los detalles relacionados con la DRSP y la RDSP se exponen, por ejemplo, en los documentos WO97/05280, WO99/60157 y WO2005/019812 y las referencias citadas en los mismos.
Tal como se conoce en la técnica, un espectro Raman surge debido que la luz incidente sobre el analito se dispersa debido al movimiento nuclear y a la excitación de los electrones del analito. Cuando el analito cuyo espectro se registra está estrechamente relacionado con una superficie adecuada, tal como una superficie metálica rugosa, esto da lugar a un gran aumento de la sensibilidad de detección, estando el efecto más marcado cuanto más cerca se sitúa el analito con respecto a la superficie "activa" (la posición óptima está en la primera capa molecular alrededor de la superficie, es decir, dentro de aproximadamente 2 nm de la superficie). Esto se denomina DRSP.
Puede obtenerse un aumento adicional de la sensibilidad funcionando a una frecuencia de resonancia del analito (en este caso debido a que se une un colorante a la diana de interés). El uso de una fuente de luz coherente, sintonizada al máximo de absorbancia del colorante, da lugar a un aumento de 103-105 veces en la sensibilidad (la excitación del láser también puede ajustarse al máximo de la resonancia de plasmones de superficie, que puede coincidir o no con el máximo del colorante). El efecto de potenciación de superficie y el efecto de resonancia puede combinarse para producir la RDRSP y un intervalo de frecuencias de excitación aún producirá un efecto potenciador combinado.
Por lo tanto la técnica de RDRSP proporciona una huella vibratoria del analito cuando se reúnen dos condiciones. Estas son (i) la absorción sobre una superficie metálica adecuada y (ii) la presencia de un cromóforo visible. El uso de un metal adicional significa que la fluorescencia se desactiva eficazmente. Esto significa que una amplia gama de moléculas coloreadas, incluyendo fluoróforos convencionales, producen excelentes señales de (R)DRSP.
Generalmente, se prefiere la RDRSP, y de este modo todas las referencias en el presente documento a la (R)DRSP pueden leerse en RDRSP a menos que el contexto indique específicamente lo contrario. Sin embargo se entenderá que la invención también puede practicarse con DRSP y espectroscopía Raman en general. La DRSP es ventajosa, por ejemplo cuando minimiza la fluorescencia de fondo usando una frecuencia de excitación en la región del infrarrojo.
Un ejemplo de cómo generar un marcador que sea invisible para la (R)DRSP, pero que luego se vuelva visible después de la acción de una enzima, se describe por ejemplo, en Moore y col. (2004 Nature Biotech., 22, páginas 1133-1138). En este ejemplo se usa una lipasa para hidrolizar un enlace éster que libera un colorante que se vuelve activo para (R)DRSP. Para cumplir con esto, tal como se aplica a la presente invención, puede unirse un colorante de azo hidroxiquinolina al fosfato 3’ de la sonda nucleica a través del grupo fenólico del colorante. Esto enmascara la unión del colorante a una superficie metálica y hace que el colorante sea "invisible" para RDRSP. En este enfoque una vez que la sonda ha hibridado con su secuencia específica, la exonucleasa digerirá el oligonucleótido y liberará el colorante de hidroxiquinolina que puede detectarse por RDRSP, gracias a que el colorante es capaz de unirse a una superficie activa de (R)DRSP.
Debido a la extrema sensibilidad de la (R)DRSP, puede no ser necesaria la amplificación del molde, en muchos casos, para hacer que este procedimiento funcione. Sin embargo puede efectuarse la amplificación de la diana si se desea. Los procedimientos adecuados de amplificación son conocidos para la persona experta e incluyen la amplificación isotérmica y la amplificación en círculo rodante.
De acuerdo con una realización adicional, puede usarse una sonda que tenga una colorante de (R)DRSP modificado en 5’ unido a esta. El colorante puede unirse de tal modo que la sonda no se adhiera a la superficie metálica y produzca RDRSP. Después de la formación del duplo sonda/diana y la adición de una exonucleasa, tal como Taq, se produce la degradación y se libera el marcador. Esta sonda se degrada de un modo similar a una sonda TaqMan; sin embargo en lugar de retirar la extinción de la fluorescencia y un aumento en la fluorescencia tras la acción de la enzima, en esta realización de la presente invención la capacidad del colorante para adherirse a la superficie metálica aumenta y de este modo produce un aumento de la señal de RDRSP. Tal como se describe anteriormente en el presente documento, esta realización puede practicarse en conjunción con el uso de un resto capturable tal como la biotina para permitir la eliminación de la sonda no unida o en exceso. Con cualquiera de estas, u otras, realizaciones de la invención, dichas sondas pueden desplegarse en combinación con la amplificación del ácido nucleico presente en la muestra de interés, por ejemplo por PCR.
De un modo conveniente, cuando se usan técnicas de amplificación en conjunción con sondas detectables por Raman, las sondas usadas pueden diseñarse para hibridar con una porción distinta de una diana de ácido nucleico a la que se hibrida, por ejemplo, mediante cebadores usados en PCR. De este modo, la acción de la exonucleasa, por ejemplo Taq, sobre los cebadores continúa en la sonda, siempre que hibride, liberando el marcador detectado por Raman.
Otro procedimiento para poner en práctica la invención implica el uso de un intercalante activo para (R)DRSP o, preferentemente, un aglutinante del surco menor (ASM) que en caso de unirse a la secuencia de la sonda
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1.
Las mezclas de reacción sin la enzima se calentaron a 90 ºC y se mantuvieron a esta temperatura durante 10 minutos para asegurarse de la separación de las hebras de ADN. Se permitió que las hebras de la sonda y la diana hibridaran enfriando las muestras a 20 ºC y manteniéndolas a esta temperatura durante 5 minutos. La temperatura se volvió a llevar a los 37 ºC en la preparación para la segunda etapa.
2.
Se añadió la enzima (o agua como control) a las mezclas de reacción. Las muestras se calentaron a 37 ºC y se midió la fluorescencia. Se usaron tres programas ligeramente distintos:
Programa
Número de Ciclos Duración de los Ciclos / minutos Duración de Total / minutos
A
40 2 80
B
40 1 40
C
60 1 60
Se efectuaron mediciones de la fluorescencia por triplicado al final de cada ciclo.
Experimentos de fluorescencia
10 Los datos presentados más adelante se normalizaron restando el valor de fluorescencia inicial a cada punto de datos. Cuando se tomaron las mediciones por duplicado, únicamente se mostró el valor medio.
Experimento 1: Ensayo Inicial
Se llevó a cabo este experimento para confirmar la viabilidad de la técnica. Se describe detalladamente en el presente documento como un ejemplo del procedimiento que se usa también en los Experimentos 2 y 3.
15 Se prepararon las siguientes muestras por duplicado en tubos separados de una tira de 8 tubos:
Muestras de Ensayo: ADNbc 0,1 µM + 10 U de enzima λExo
Muestras de control ADNbc 0,1 µM, sin enzima λExo
Componente
Conc./ µM Volumen / µl Componente Conc./ µM Volumen / µl
RWFAM
1,8 8,2 RWFAM 1,8 8,2
RWCOMP1
3,1 4,8 RWCOMP1 3,1 4,8
Tampón de reacción 10X
- 15 Tampón de reacción 10X - 15
Agua estéril
- 121 Agua estéril - 122
Se prepararon dos muestras de ensayo para producir una concentración 0,1 µM de ADNbc una vez que habían hibridado. Se añadieron RWFAM (8,2 µl, 1,8 µM) y RWCOMP1 (4,8 µl, 3,1 µM) al tampón de reacción 10X (15 µl) en 121 µl de agua estéril.
20 Se prepararon muestras de control por duplicado usando los mismos volúmenes y concentraciones de oligonucleótidos y tampón de reacción pero 122 µl de agua estéril.
Se colocaron las muestras en el instrumento de QPCR para la etapa de hibridación del procedimiento. Después de la hibridación, se recogieron las muestras y se añadió 1 µl (10 Unidades) de exonucleasa lambda a las dos muestras de ensayo. Se devolvieron las muestras al instrumento de QPCR y se midió la fluorescencia usando un programa A.
25 Los resultados se muestran en la Figura 4 que muestra que se dio un aumento de la fluorescencia únicamente en las muestras a las que se añadió exonucleasa lambda. Esto indica que la enzima fue capaz de degradar la sonda y de liberar el fluoróforo del desactivador. Se obtuvo un nivel constante de fluorescencia después de 50-60 minutos. Las muestras de control permanecieron en el nivel inicial.
Experimento 2
30 Este investigó el efecto de doblar la concentración de la exonucleasa lambda.
Se prepararon las siguientes muestras de ensayo y controles por duplicado:
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A) ADNbc 0,1 µM, sin λExo
B) ADNbc 0,1 µM + 10 U de λExo
Componente
Conc. / µM Volumen / µl Componente Conc. / µM Volumen / µl
RWFAM
1,8 8,2 RWFAM 1,8 8,2
RWCOMP1
3,1 4,8 RWCOMP1 3,1 4,8
Tampón de reacción 10X
- 15 Tampón de reacción 10X - 15
Agua estéril
- 122 Agua estéril - 121
C) ADNbc 0,1 µM + 10U de enzima λExo
D) Agua al 100 %
Componente
Conc. / µM Volumen / µl Componente Conc. / µM Volumen / µl
RWFAM
1,8 8,2 RWFAM - -
RWCOMP1
3,1 4,8 RWCOMP1 - -
Tampón de reacción 10X
- 15 Tampón de reacción 10X - -
Agua estéril
- 120 Agua estéril - 150
Se prepararon las muestras y se hibridaron tal como se describe en el Experimento 1. Después de la hibridación, se recogieron las muestras del instrumento de QPCR.
5 se añadió 1 µl de exonucleasa lambda a las muestras A y B. se añadieron 2 µl de exonucleasa lambda a la muestra C.
Se usó la muestra D como control.
Se devolvieron las muestras al instrumento de QPCR y se midió la fluorescencia usando el programa C.
La gráfica de la Figura 5 muestra de nuevo que no se da ningún cambio en la fluorescencia en las muestras control.
10 Los datos muestran que cuando se dobla el número de unidades de la enzima usadas, se da un aumento más rápido de la fluorescencia y que el nivel máximo de fluorescencia se alcanza en un periodo más corto de tiempo. Los datos muestran que el tiempo que toma degradar la misma concentración de sonda fluorescente es aproximadamente proporcional a la concentración de enzima presente. Para una concentración 0,1 µM de la sonda fluorescente, parece que el uso del doble de unidades de exonucleasa reduce a la mitad el tiempo necesario para
15 alcanzar el nivel máximo de fluorescencia.
Experimento 3
Este investigó el efecto de los extremos 5’ con huecos y de las colas 3’ sobre la capacidad de la exonucleasa lambda para degradar la cadena de la sonda y usar tres hebras diana distintas:
• RWCOMP2 -proporcionó un hueco de 20 bases 5’ 20 • RWCOMP3 -proporcionó un extremo romo 5’ y una cola de 20 bases 3’.
• RWCOMP3 -proporcionó tanto un hueco 5’ como una cola de 20 bases 3’.
Se prepararon duplicados de las siguientes muestras:
A) Hueco de 20 bases en 5’
B) Extremo romo 5’ y cola de 20 bases
Componente
Conc. / µM Volumen / µl Componente Conc. / µM Volumen / µl
RWFAM
1,8 8,2 RWFAM 1,8 8,2
RWCOMP2
3,0 5,0 RWCOMP3 3,2 4,7
(continuación)
A) Hueco de 20 bases en 5’
B) Extremo romo 5’ y cola de 20 bases
Componente
Conc. / µM Volumen / µl Componente Conc. / µM Volumen / µl
Tampón de reacción 10X
- 15 Tampón de reacción 10X - 15
Agua estéril
- 120,8 Agua estéril - 121,1
C) Hueco de 20 bases 5’ y cola de 20 bases
D) ADNbc 0,1 µM + 10U de λExo
Componente
Conc. / µM Volumen / µl Componente Conc. / µM Volumen / µl
RWFAM
1,8 8,2 RWFAM 1,8 8,2
RWCOMP4
1,4 10,7 RWCOMP1 3,1 4,8
Tampón de reacción 10X
- 15 Tampón de reacción 10X - 15
Agua estéril
- 115,1 Agua estéril - 121
E) Control: Agua
Componente
Conc. / µM Volumen / µl
RWFAM
- -
RWCOMP_
- -
Tampón de reacción 10X
- -
Agua estéril
- 150
Se prepararon las muestras y se hibridaron tal como se llevó a cabo anteriormente. Después de la hibridación, se retiraron las muestras del instrumento de QPCR y se añadió 1 µl (10 Unidades) de exonucleasa lambda a las muestras A, B, C y D.
5 Se devolvieron las muestras al instrumento de QPCR y se midió la fluorescencia usando el programa C.
El objetivo de este experimento fue determinar si la exonucleasa lambda era capaz de degradar la sonda fluorescente cuando hibrida con un ADN diana de una longitud de cadena mayor. Esto produciría que el extremo 5’ de la sonda tuviera huecos en comparación con la cadena diana y también produciría una sección de cola larga. Esto pretendía reflejar una muestra de ADN real en la que la secuencia diana complementaria sería parte de una
10 cadena de ácido nucleico mucho más larga.
Los datos experimentales (mostrados en la Figura 6) muestran que la formación del duplo entre la sonda y la diana no afecta realmente a la actividad total de la enzima mientras que el aumento de fluorescencia total o en cada caso fue similar.
Agentes químicos y reactivos:
15 Los agentes químicos se adquirieron bien en Sigma o Aldrich y fueron todos para uso analítico.
La enzima exonucleasa lambda (2500 unidades, 10 unidades µl, Ref. LE032K) y el tampón de reacción de exonucleasa lambda (Glicina-KOH 670 µM, MgCl2 25 µM, Triton X-100 al 0,1 %, Madre 10x, Ref. tampón-LE) se obtuvieron a partir de Cambio Ltd., R.U. La Exonucleasa Lambda se suministró en una solución de glicerol al 50 % que contenía Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), NaCl 100 mM, ditiotreitol 1,0 mM, EDTA 0,1 mM y Triton®X-100 al 0,1 %.
20 Las esferas magnéticas recubiertas de estreptavidina se adquirieron en New England Biolabs. Los tampones se filtraron a través de un filtro de jeringuilla con un tamaño de poro de 0,2 µm (Whatman) antes de su uso.
Secuencias de oligonucleótidos:
Los oligonucleótidos se adquirieron de ATDbio y MGW. A2020 / SONDA PTB (18 mero)
25 5’-TTT TCC CAG TCA CGA CGT
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Tabla 2: Sondas de ADN usadas para el ensayo de exonucleasas
Nombre
Secuencia de Nucleótidos 5’ mod. Mid mod. 3’ mod.
A1220/sonda FAM
imagen15 Fosfato FAM 10 bases biotina,
A1219/sonda TAMRA
imagen16 Fosfato TAMRA 10 bases biotina
A1220/sin sonda FAM
imagen17 Fosfato - -
A0977/complementaria perfecta
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LE1/3’ protuberante
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LE2/5’ protuberante
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LE3/protuberante en ambos lados
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El colorante Hoechst H33258 se adquirió en Sigma-Aldrich.
5 El reactivo Quant-iT™ PicoGreen ® se adquirió en Invitrogen. La exonucleasa lambda y el tampón de reacción de exonucleasa 10x se adquirieron en Cambio. Cuando se diluyó a 1x, La composición del tampón fue de Glicina-KOH 67 mM, MgCl2 2,5 mM, Triton X-100 al 0,1 %, pH 9,4 a 25 ºC Los agentes químicos misceláneos se adquirieron en Sigma-Aldrich. El tampón fosfato usado para los experimentos fue fosfato 6 mM con NaCl 0,3 M.
10 2. INSTRUMENTACIÓN
Los estudios de la absorción y la fusión UV se llevaron a cabo en un espectrofotómetro CARY 300 Bio UV-visible. Los estudios de emisión se llevaron a cabo con un espectrofotómetro de fluorescencia Varian CaryEclipse. En ambos casos se usaron cubetas de plástico ópticamente claro con una longitud de paso de 1 cm y un volumen de 3 ml. Los ensayos enzimáticos se realizaron usando un instrumento de PCR Stratagene Mx4000.
15 6. ENSAYO DE EXONUCLEASAS
Se prepararon las muestras en tampón de reacción de la exonucleasa lambda 1x con un volumen final de 150 µl. La concentración de la secuencia, complemento y/o el colorante Hoechst fue 1 µM en todos los casos. En las muestras con la enzima, se añadieron 10 unidades de λexo (concentración de 1 µl de 10 unidades/µl) a la mezcla de reacción. Se ajustó la longitud de onda de excitación a 350 nm (10 nm de paso de banda) y se tomaron las mediciones de
20 emisión a 519 nm para el sistema FRET y 440 nm para la fluorescencia del colorante Hoechst (10 nm de paso de banda). Se colocaron las muestras en una placa fría durante el procedimiento de preparación para evitar la digestión temprana.
Se mantuvieron las muestras a 37 ºC durante 30 minutos (etapa de digestión) midiendo la fluorescencia cada minuto. Después se desnaturalizó la enzima (etapa de inactivación) a 75 ºC durante 15 minutos. Después se
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trachomatis basándose en la intensidad de una señal de RDRSP. En este ejemplo se usó el colorante de rodamina activo para (R)DRSP R6G; sin embargo podría usarse cualquier marcador activo para (R)DRSP (u otro para Raman). El conjunto sonda/cebador que se usó en este ensayo estaba basado en un diagnóstico clínico de PCR usado para la identificación de las infecciones por clamidia. Se proporcionaron las muestras por el programa QCMD (Control de Calidad para Diagnóstico molecular) en la forma de orina liofilizada enriquecida con diversas concentraciones de ADN genómico de C. trachomatis. El ADN de C. trachomatis se derivó de cultivos de 3 días que crecieron en células de McCoy que se recogieron y se inactivaron por calor.
Materiales y procedimientos
Reconstitución de muestras
Se recibieron las muestras como viales estériles sellados con goma que contenían orina liofilizada y ADN genómico de Chlamydia trachomatis. Estos se inyectaron con 1,2 ml de agua miliQ estéril y se agitaron a 37 ºC durante 1 hora para reconstituir las muestras.
Preparación del molde
Se pasó la muestra completa del vial a un tubo de 1,5 ml y se añadió ARNt de levadura (Sigma) a una concentración final de 100 µg.ml-1. Se añadieron dos volúmenes de etanol enfriado en hielo y 1/10 volúmenes de acetato de sodio 3 M a la muestra. Se mezcló la muestra vigorosamente y se incubó a -20 ºC durante 15 minutos. Se centrifugó la muestra al máximo durante 15 minutos en una centrífuga de mesa y se desechó el sobrenadante. Se lavó el sedimento dos veces con etanol al 70 % v/v enfriado en hielo y una vez con etanol enfriado en hielo y se permitió que se secara al aire. Se resuspendió el sedimento en 60 µl de agua miliQ estéril agitando a 37 ºC durante 1 hora. Este se usó como un molde en las reacciones de PCR posteriores.
Amplificación
Se usó un conjunto de sondas/cebadores (MWG Biotech) basándose en una PCR diagnóstica para detectar el gen ompA de Chlamydia trachomatis (Comuniación personal, Prof Paul Wallace). Se diseñaron los cebadores para amplificar una región de 100 pb del gen a de la base 501 a la base 601 (basándose en la secuencia de GenBank AY535172), la sonda hibrida con las bases 596 a 535. Las secuencias de los cebadores y las sondas usadas de detallan más adelante de 5’ a 3’:
Cebador 1. cacttratattaccgcaggaacag
Cebador 2. gctaaacttgctgccactcat
Sonda: Biotina-agaggcatccttagtccctgtcgcagc-R6G
Se llevó a cabo la PCR usando una polimerasa hotstart NovaTaq (Novagen), 25 pmol de cada cebador, entre 100 pmol y 0,1 pmol de sonda, 2 µl de sonda y MgSO4 3 µM. El volumen total de reacciones fue de 50 µl y estos se llevaron a cabo en aceite mineral. Se llevó a cabo la PCR a lo largo de 30 ciclos de amplificación usando los siguientes parámetros:
1 ciclo 94 ºC durante 5 min 94 ºC durante 20, 58 ºC durante 20, y 72 ºC durante
30 ciclos
20 s 1 ciclo 72 ºC durante 2 min.
Procesamiento de la muestra con esferas de estreptavidina
Se obtuvieron las esferas paramagnéticas de estreptavidina a 4 mg.ml-1 de New England Biolabs. Las esferas tenían una capacidad de unión de 500 pmol.mg-1 de esferas para los oligonucleótidos biotinilados. Como la cantidad máxima de sonda biotinilada en cualquiera de las reacciones de PCR fue 100 pmol, se necesitaron 0,2 mg (50 µl) de esferas por reacción.
Preparación de esferas de Estreptavidina para su uso.
Se resuspendieron las esferas por agitación vorticial suave. Se retiraron las alícuotas necesarias (50 µl multiplicados por el número de reacciones de PCR a ensayar) y se colocaron en un tubo de 1,5 ml estéril. Se colocaron las esferas en una gradilla de separación magnética durante ≥ 2 minutos hasta que se secuestraron todas las esferas. Manteniendo el tubo en la gradilla, se retiró y se desechó el sobrenadante. Se retiró el tubo de la gradilla y las esferas resuspendidas en 2 volúmenes de tampón de U/L 2x, [Tampón de unión y lavado 2x: Tris-HCl 10 mM pH 7,5, EDTA1 mM pH 7,5, NaCl 2 mM]. Se devolvió el tubo a la gradilla de separación y se incubó durante ≥ 2 minutos. Se repitió el procedimiento de lavado dos veces. Se resuspendieron las esferas en U/L 2x de modo que su volumen final fuera el mismo que el volumen inicial.
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sonda a 100 pmol, 10 pmol, 1 pmol y 0,1 pmol). Línea 1 marcadores de 100 pb, 2) 100a, 3) 100b, 4) 10a, 5) 10 b, 6) 1 a, 7) 1 b, 8) 0,1 a, 9) 0,1 b, 10) marcador de 100 pb, 11) marcadores Hyper V, 12) 100a, 13) 100b, 14) 10a, 15) 10b, 16) 1 a, 17) 1 b, 18) 0,1 a, 19) 0,1 b, 20) marcador de 100 pb.
Se realizaron las reacciones de PCR de nuevo en 50 µl y se procesaron usando esferas de estreptavidina para separar la sonda intacta y la no digerida. Después se usó el sobrenadante para el análisis de RDRSP.
El análisis de RDRSP mostró que las reacciones positivas produjeron una señal de RDRSP fuerte y que aunque también había señales de las muestras negativas de la PCR, estos tiempos fueron mucho menos intensos que los controles positivos. Véase las Fig 19 & 20. La Fig. 19 muestra los espectros del experimento de dilución de la sonda en los que la gráfica muestra las dos series positivas (rojo y verde) y las dos series negativas (azul y negro) de muestras analizadas por RDRSP. La concentración de las sondas aumenta de derecha a izquierda. La Fig 20 muestra la diferencia en los espectros entre las muestras positivas y las negativas usando 100 pmol de sonda por reacción.
Ensayo de Esferas ExoRDRSP
Se representa un ensayo denominado exoRDSP en esferas en la Figura 21. Al comienzo del esquema se representa, más arriba, un ADN diana monocatenario y una sonda de captura corta que está biotinilada en el extremo 3’ (representado como el "B" dentro del rectángulo gris claro que se ha unido a una esfera recubierta de estreptavidina mostrada como el círculo grande de color gris. Después de la unión de la sonda de captura biotinilada en 3’ a las esferas recubiertas de estreptavidina, se lavó la sonda no unida. En la primera etapa mostrada, el ADN diana hibrida con la sonda de captura inmovilizada. Puede lavarse el ADN diana no unido. Un marcador de un nucleótido con un fosfato 5’ comprende un colorante activo de RDRSP (el círculo gris claro mostrado hacia el extremo 5’ (en este caso TAMRA) y también, opcionalmente un desactivador del marcador en 3’ (en este caso se permite que BHQ2 hibride con el ADN diana capturado). Finalmente el ADN bicatenario resultante que comprende el ADN diana, la sonda de captura y la sonda marcada con colorante se exponen a la acción de la exonucleasa lambda, que degrada la sonda de ADN marcada con colorante a mononucleótidos, liberando el colorante para permitir de este modo la detección por RDRSP.
El ensayo representado en la Figura 21, que utiliza la interacción fuerte entre biotina-estreptavidina, usa una sonda de captura corta, una diana de longitud completa y una diana marcada con colorante. El ensayo de separación de sonda emplea los tres oligonucleótidos sintéticos anteriores, de la siguiente composición:
Sonda de Captura
3’ TCT CCG TAG GAA 3’ dT está biotinilado
Sonda Marcada con Colorante
3’ TCA GGG ACA GCG XCG 3’ dT modificado con BHQ2
X está modificando en dT con TAMR
Complemento Diana
5’ AGA GGC ATC CTT AGT CCC TGT CGC AGC
Experimentación
1.
La sonda de captura se une a esferas magnéticas recubiertas de estreptavidina por medio de la modificación con biotina en 3’ en tampón de unión y lavado (U/l) 1 x. La sonda no unida se lava con el tampón de U/l mientras que la sonda unida se separa mediante un imán.
2.
La secuencia diana del complemento se hibrida con la sonda de captura unida usando un programa de calentamiento (90 ºC durante 10 min, 20 ºC durante 5 min). La diana no unida se lava de nuevo usando U/L 1 x, durante +3 lavados.
3.
La sonda marcadora con colorante se hibrida después con el duplo de sonda de captura /diana preformado usando las condiciones de calentamiento anteriores. Una vez más, se lava la sonda no unida como se hizo anteriormente.
4.
El complejo sonda separado se expone después a λ exonucleasas y tampón de reacción con exonucleasa. La digestión se lleva a cabo a 37 ºC durante 30 min seguida de una etapa de inactivación de 75 ºC durante 15 min.
5.
Se transfiere el complejo a una placa de microtitulación de 96 pocillos y se añade el coloide de plata, un agente aglutinante y agua en la preparación para la RDRSP.
6.
Se lleva a cabo inmediatamente la RDRSP usando un Renishaw inVia Raman a 514,5 nm, potencia al 100 %, objetivo 20x, 10 y 3 acumulaciones.
7.
También son posibles las mediciones por fluorescencia.
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Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK2385141T3 (da) 2005-10-07 2013-10-28 Speedx Pty Ltd Flerkomponentnukleinsyreenzymer og fremgangsmåder til anvendelse heraf
ZA200901742B (en) 2006-10-06 2010-06-30 Johnson & Johnson Res Pty Ltd Moleculor switches and methods for their use
WO2008122084A1 (en) 2007-04-05 2008-10-16 Johnson & Johnson Research Pty Limited Nucleic acid enzymes and complexes and methods for their use
GB0908633D0 (en) * 2009-05-20 2009-06-24 D3 Technologies Ltd Detection of target analytie by signal amplication
WO2012065231A1 (en) * 2010-11-19 2012-05-24 Speedx Pty Ltd Signal amplification
US20150031577A1 (en) * 2012-03-20 2015-01-29 UNIVERSITé LAVAL Nucleic acid detection method comprising target specific indexing probes (tsip) comprising a releasable segment to be detected via fluorescence when bound to a capture probe
US20150055132A1 (en) 2012-04-05 2015-02-26 Renishaw Diagnostics Limited Method for calibrating spectroscopy apparatus and equipment for use in the method
CN104350378B (zh) * 2012-04-05 2017-10-03 瑞尼斯豪公司 用于测量光谱系统的性能的方法和设备
AU2013202354A1 (en) * 2012-06-18 2014-01-16 Speedx Pty Ltd Target detection and signal amplification
GB201307013D0 (en) 2013-04-18 2013-05-29 Renishaw Diagnostics Ltd Seers based assays for oligonucleotides
CN103926397B (zh) * 2014-02-28 2016-08-24 河南省农业科学院 基于核酸外切酶ｉ循环酶切放大的赭曲霉毒素a荧光偏振快速检测方法
US20170198337A1 (en) * 2014-05-20 2017-07-13 Sens Foundation, Inc. High throughput telomeric circle assay
GB201415674D0 (en) * 2014-09-04 2014-10-22 Moorlodge Biotech Ventures Ltd Nucleic acid analysis
CN104297221B (zh) * 2014-09-28 2017-01-25 南京诺唯赞生物科技有限公司 一种λ核酸外切酶活性测定方法
EP3012221A1 (en) * 2014-10-23 2016-04-27 Universitat Rovira I Virgili Nucleic acid-induced aggregation of metal nanoparticles and uses thereof in methods for detecting nucleic acids
US10845312B2 (en) * 2015-07-22 2020-11-24 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Label-free detection of sialic acid using surface-enhanced Raman scattering microscopy
US20190032109A1 (en) * 2016-01-27 2019-01-31 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Single molecule timers and clocks
CN105802963B (zh) * 2016-04-01 2019-02-22 中国科学院成都生物研究所 一种寡核苷酸探针
JP6901507B2 (ja) * 2016-06-21 2021-07-14 コーニンクレッカ フィリップス エヌ ヴェＫｏｎｉｎｋｌｉｊｋｅ Ｐｈｉｌｉｐｓ Ｎ．Ｖ． 磁気ビーズの作動及び検出を用いた核酸突然変異の検出
EP3269444A1 (en) * 2016-07-14 2018-01-17 Base4 Innovation Ltd Method of identifying droplets in a stack and an associated sequencer
KR101941339B1 (ko) * 2016-11-21 2019-01-22 고려대학교 산학협력단 금 나노 입자를 포함하는 유전자 검출용 장치 및 금 나노 입자를 이용한 유전자 검출 방법
WO2019079125A2 (en) * 2017-10-19 2019-04-25 Bio-Rad Laboratories, Inc. DIGITAL AMPLIFICATION TESTS WITH UNCONVENTIONAL AND / OR INVERTED PHOTOLUMINESCENCE CHANGES
KR102063864B1 (ko) * 2018-05-16 2020-01-08 사회복지법인 삼성생명공익재단 표면-증강 라만 산란 기반의 감염 질환 진단용 마커 검출 방법
CN110184392B (zh) * 2019-06-13 2023-10-13 重庆医科大学 检测ebv相关基因的电化学生物传感器及其制备方法
CN111551534A (zh) * 2020-05-18 2020-08-18 上海交通大学 基于表面增强拉曼探针的试剂盒及其应用、成像方法
CN111879738B (zh) * 2020-06-15 2023-03-14 山东师范大学 一种非标记型适配体探针体系及其检测方法和应用
GB202011732D0 (en) * 2020-07-29 2020-09-09 Stemnovate Ltd Method of detection
CN114674806B (zh) * 2022-05-26 2022-08-12 中国药科大学 一种基于表面增强拉曼散射的细胞传感器及其应用
WO2024110422A1 (en) * 2022-11-23 2024-05-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for determining at least one analyte of interest

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0630799A (ja) * 1992-07-10 1994-02-08 Hitachi Ltd 遺伝子検出方法及び遺伝子検出装置
GB9517955D0 (en) * 1995-07-25 1995-11-08 Univ Strathclyde Nucleotide sequence detection and analysis
US6582921B2 (en) * 1996-07-29 2003-06-24 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses thereof
US6225053B1 (en) * 1997-12-12 2001-05-01 Digene Corporation Detection of hepatitis B virus
WO1999044045A1 (en) * 1998-02-27 1999-09-02 Massachusetts Institute Of Technology Single molecule detection with surface-enhanced raman scattering and applications in dna or rna sequencing
US6268146B1 (en) * 1998-03-13 2001-07-31 Promega Corporation Analytical methods and materials for nucleic acid detection
US6270974B1 (en) * 1998-03-13 2001-08-07 Promega Corporation Exogenous nucleic acid detection
GB9810865D0 (en) * 1998-05-20 1998-07-22 Zeneca Ltd Nucleic acid sequence identification
GB0008618D0 (en) * 2000-04-08 2000-05-31 Univ Strathclyde Analyte detection & apparatus therefor
US6982165B2 (en) * 2001-09-24 2006-01-03 Intel Corporation Nucleic acid sequencing by raman monitoring of molecular deconstruction
US6972173B2 (en) * 2002-03-14 2005-12-06 Intel Corporation Methods to increase nucleotide signals by raman scattering
JPWO2003035864A1 (ja) * 2001-10-26 2005-02-10 松下電器産業株式会社 標的核酸の検出方法及び核酸プローブ
US20040110208A1 (en) * 2002-03-26 2004-06-10 Selena Chan Methods and device for DNA sequencing using surface enhanced Raman scattering (SERS)
US20060166249A1 (en) * 2003-05-16 2006-07-27 University Of Rochester Methods for separating short single-stranded nucleic acid from long single-and double-stranded nucleic acid, and associated biomolecular assays
GB0319949D0 (en) * 2003-08-26 2003-09-24 Univ Strathclyde Nucleic acid sequence identification
US20050089915A1 (en) * 2003-10-27 2005-04-28 Hybridon, Inc. Hybridization-based fluorescence assay
US20050191665A1 (en) * 2003-12-29 2005-09-01 Xing Su Composite organic-inorganic nanoclusters
CN102680440A (zh) * 2004-06-07 2012-09-19 先锋生物科技股份有限公司 用于微流体器件的光学透镜系统和方法
EP1829964A4 (en) * 2004-12-08 2009-03-04 Takeshi Yamamoto METHOD OF STUDYING A SEQUENCE OF A GENE

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