JP2003517842A - 核酸の検出方法 - Google Patents

核酸の検出方法

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Abstract

(57)【要約】 粒子状および非粒子状の基質に固定化されているオリゴヌクレオチド・プローブに対してハイブリッド形成した目的の核酸に対する同質で多重式の定量方法が記載されている。目的の核酸は各粒子の光散乱または蛍光の特性に基づく粒子の識別が可能なフロー・サイトメトリー法等の検出方法、または基質上の特異的な位置において固定化されている各オリゴヌクレオチドの空間的解像により決定される。基質に固定化したオリゴヌクレオチドに対してハイブリッド形成した目的の核酸から生じる目的物に相関している蛍光信号が当該目的の核酸の存在または量の測定値として決定される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の分野 本発明は核酸の検出方法に関する。特に、基質固定化したオリゴヌクレオチド
による目的の核酸の検出および基質または基質固定化したオリゴヌクレオチドに
付随する検出可能な信号および当該オリゴヌクレオチドに対してハイブリッド形
成した目的の核酸に関連する検出可能な信号を生じる方法に関する。
【０００２】 発明の背景 核酸の検出は特異的な遺伝子、既知のシーケンスの存在およびコピー数の決定
、および臨床的および環境的なサンプル内のウイルス、原核生物および真核生物
の病原体の同定および定量化において広く採用されている。核酸の重要な特徴は
相補的なヌクレオチド・シーケンスを有する核酸に対するシーケンス特異性の水
素結合を形成する能力である。この核酸の相補的なストランドにハイブリッド形
成するための核酸の能力はハイブリッド形成の定量として知られている技法、お
よびＤＮＡ精製技法において役立てるために使用されてきた。
【０００３】 ハイブリッド形成の定量において、既知のシーケンスを有する核酸が相補的な
核酸シーケンスを有する目的の核酸に対してハイブリッド形成するプローブとし
て用いられる。さらに、このプローブをラベル（標識）化することにより、その
ハイブリッドの検出が可能になり、これに付随して、目的の核酸が検出可能にな
る。
【０００４】 分析物の定量は、理想的には、同質のフォーマットでの検出可能な信号におけ
る分析物依存の変化の発生に依存している。多数の目的の核酸の同質で同時の決
定（多重処理（multiplexing））を可能にする分析的なシステムは極めて望まし
い。しなしながら、このようなシステムは核酸の分析において利用できない。
【０００５】 チップ上のＤＮＡアレイによる目的の核酸の検出方法は当該技術分野において
有意義な進歩を示している。このような方法が米国特許第５，８５６，１０１号
、同第５，８３７，８３２号、同第５，６５８，８０２号および同第５，５７１
，６３９号において記載されている。
【０００６】 フロー・サイトメーター（flow cytometers）は多重型の粒子−基本式の定量
（Fulwyler他、Methods Cell Biology、第２版、Academic Press社、第３３巻、
６１３頁（１９９０年）、McHugh、Methods Cell Biology、第２版、Academic P
ress社、第４２巻、５７５頁（１９９４年）、McHugh他、Cytometry、２９、１
０６頁（１９９７年））における微粒子分析装置として使用されている。一般に
、ミクロン−サイズの球体粒子（ビーズ）が蛍光信号の発生源として作用する固
体相として用いられ、その強度は分析物の濃度の関数である。この蛍光信号は粒
子が多数パラメータ式検出器の中における単一列を通過する時に上記フロー・サ
イトメーターにより個別に分析される。寸法または蛍光強度（またはこれら両方
の組み合わせ）により互いに識別できる各粒子において異なる定量を行なう場合
に、それぞれの蛍光強度または寸法が異なる定量値を示す。このような微小球体
の蛍光ラベル化は５１２種類の同時的な異なる定量までの多重処理能力を可能に
している（Chandler他、ISAC XIX国際会議、米国、コロラド州コロラド・スプリ
ングス、２月２８日乃至３月５日、１９９８年）。このフロー・サイトメトリー
式（flow cytometric）の粒子定量は信号がトリガー粒子の発生と共に記録され
るので潜在的に同質である。すなわち、定量に対して干渉する可能性のあるトリ
ガー粒子の発生に付随しない信号はこの器具により無視される。
【０００７】 フロー・サイトメトリー（flow cytometry）によるＤＮＡフラグメントの分子
量決定またはサイジング（sizing）のための方法がCastro他、Anal Chem ６５、
８４９頁（１９９３年）、Goodwin他、Nucleic Acid Res ２１、８０３頁（１９
９３年）、Petty他、Anal Chem ６７、１７５５頁（１９９５年）および米国特
許第５，５５８，９９８号において記載されている。蛍光発光可能（蛍光物質ま
たは蛍光体（fluor（ほたる石等））でＤＮＡフラグメントに対して化学量論的
に結合可能な化合物は各フラグメントがフロー・サイトメーターの検出装置の中
を個別に流れる時に検出される信号を発生する。レーザー・ビームが特定の波長
において蛍光物質を励起して、発光した蛍光がＤＮＡフラグメントに対して、す
なわち、そのフラグメントの一定の長さに対して結合している蛍光物質の分子の
数に比例する強度のパルスとして測定される。しかしながら、この方法はトリガ
ーの発生に付随する信号だけでなく、全ての信号の発生が検出されて記録される
ことを必要とする。さらに、この方法はシーケンス情報、または遺伝子の同定情
報を提供せず、フラグメントの相対的なサイズ情報だけを提供する。また、この
方法は同質的な方法（homogeneous method）として行なうことができない。
【０００８】 オリゴヌクレオチドのビーズ−セットに対する結合におけるラベル化したプロ
ーブと目的物との間の競争に基づくフロー・サイトメトリーによりＤＮＡシーケ
ンスを決定するための方法がFultonに発行されている米国特許第５，７３６，３
３０号（’３３０号特許）およびSpain、IVD Technology Magazine（１９９８年
）、およびMcDade他、Medical Device & Diagnostic Industry Magazine（１９
９７年）において記載されている。
【０００９】 また、ビーズ連結した挿入物質に対する二本鎖ＤＮＡの結合に基づくフロー・
サイトメトリー式の蛍光検出により二本鎖ＤＮＡを決定するための方法がBienia
rx他に発行されている米国特許第５，５８２，９８４号（’９８４号特許）にお
いて記載されている。
【００１０】 上記’３３０号特許は当該技術分野における有用な進歩を記載しているが、各
ＤＮＡの目的物に対してそれぞれ別のラベル化したプローブの使用が必要であり
、比較的に有利である直接的な結合方法ではなく、間接的な競争的結合方法によ
る目的物の検出を必要としている。
【００１１】 また、上記’９８４号特許において記載されている方法は二本鎖ＤＮＡの存在
を検出するために有用であるが、特定の目的の核酸の検出を可能にしない。挿入
する色素が溶液中に遊離しておらず、ビーズに連結していて、多数の色素分子が
単一分子の二本鎖ＤＮＡに対して結合するために遊離していないので、信号の強
度が制限される。
【００１２】 目的の核酸を決定するための上記およびその他の従来技術の方法は広い許容性
および実用性を既に認められている。しかしながら、特異的、定量的、同質的、
迅速、および自動化可能であり、多数の目的の核酸の決定および同定を可能にす
る方法が依然として要望されている。理想的には、この方法はさらに目的物の増
殖を必要としない程度に、または目的物が多数のコピー体の状態で既に存在して
いる場合に少数回の増殖工程のみを必要とする程度に十分に敏感であることが望
ましい。
【００１３】 発明の概要 上記の要望は本発明により達成されている。
【００１４】 態様の一例において、本発明は目的の核酸の存在および量を決定するための方
法に関し、この方法は、 （Ａ）（ｉ）目的の核酸、および （ｉｉ）上記目的の核酸の少なくとも一部分に対して相補的な核酸シーケンス
を含むオリゴヌクレオチドを固定化した基質を含む混合物を形成する工程、 （Ｂ）上記基質または基質−固定化したオリゴヌクレオチドに相関している一
定のパラメータの値を決定する工程、および （Ｃ）上記目的の核酸の存在および量の測定値として上記基質−固定化したオ
リゴヌクレオチドに対してハイブリッド形成している目的の核酸に相関している
信号を決定する工程を含む。
【００１５】 別の態様において、本発明は複数の別々の目的の核酸の存在および量を決定す
るための方法に関し、この方法は、 （Ａ）（ｉ）複数の目的の核酸、および （ｉｉ）１個の目的物に特異的なオリゴヌクレオチドが１個の個別の目的物の
核酸の少なくとも一部分に対して相補的な核酸シーケンスを含む１種類以上の目
的物に特異的なオリゴヌクレオチドを固定化した基質の混合物を形成する工程、 （Ｂ）上記基質または基質−固定化した目的物に特異的なオリゴヌクレオチド
に相関している一定のパラメータの値を決定する工程、および （Ｃ）上記目的の核酸の存在および量の測定値として上記基質−固定化した目
的物に特異的なオリゴヌクレオチドに対してハイブリッド形成している個別の目
的の核酸に相関している信号を決定する工程を含む。
【００１６】 別の態様において、本発明は目的の核酸の存在および量を決定するための方法
に関し、この方法は、 （Ａ）（ｉ）目的の核酸、および （ｉｉ）上記目的の核酸の少なくとも一部分に対して相補的な核酸シーケンス
を含むオリゴヌクレオチドを固定化した粒子を含む混合物を形成する工程を含み
、当該粒子が、 （ａ）約２００ｎｍ（ナノメートル）よりも長いかこれに等しい波長の電磁放
射線を散乱することが可能であり、または （ｂ）当該粒子に相当する蛍光信号を生成できる第１の化合物または複数の化
合物を含み、または、 （ｃ）約２００ｎｍよりも長いかこれに等しい波長の電磁放射線を散乱するこ
とが可能であり、且つ、当該粒子に相当する蛍光信号を生成できる第１の化合物
または複数の化合物を含む。
【００１７】 随意的に、上記混合物は二本鎖核酸を変性するために加熱した後に、上記固定
化したオリゴヌクレオチドに対する目的の核酸のハイブリッド形成を可能にする
ために冷却することが可能であり、望まれる場合には、目的の核酸を固定化した
オリゴヌクレオチドに混合する前に変性することができる。
【００１８】 上記の方法はハイブリッド形成した目的物および固定化したオリゴヌクレオチ
ド・プローブに対して相関している、蛍光等の、好ましくは光学的信号である、
検出可能な信号を生成するための工程を含む。実施形態の一例において、二本鎖
核酸に結合して当該核酸に結合した時に検出可能な蛍光信号を生成できる第２の
化合物が上記混合物に混合されている。また、別の実施形態において、上記オリ
ゴヌクレオチドは、必要とは限らないが、当該オリゴヌクレオチドに対して蛍光
発光が可能な第２の化合物が連結可能であり、上記混合物は一本鎖の特異的エン
ドヌクレアーゼに対して接触する。さらに、別の実施形態において、上記オリゴ
ヌクレオチドまたは基質は蛍光発光が可能な第２の化合物を含む。さらに、この
基質またはオリゴヌクレオチドは目的の核酸の固定化したオリゴヌクレオチドに
対するハイブリッド形成の前に上記第２の化合物の蛍光を消光するために当該第
２の化合物に十分に近接して蛍光消光性の化合物を含んでいる。また、別の実施
形態において、上記ビーズに結合しているオリゴヌクレオチドは既知の制限エン
ドヌクレアーゼの目的部位の１個の補体を表現するシーケンスを含んでいるか、
含むことが可能である。サンプルまたは増殖した核酸の各シーケンスは粒子に連
結したオリゴヌクレオチドに対してその部位を切断することのできる制限エンド
ヌクレアーゼの存在下にハイブリッド形成することが可能である。随意的に、こ
の制限エンドヌクレアーゼは後に添加できる。適当な目的の核酸が存在している
場合に、その完全な制限部位はヘテロ二本鎖の形成の結果として形成され、制限
酵素がこの核酸を切断して粒子からそのラベル化した二本鎖シーケンスの全体ま
たは一部分を放出する。このことは特定のトリガー（粒子）の発生に付随する核
酸に特異的な蛍光信号を減少または排除できる。
【００１９】 固定化したオリゴヌクレオチド・プローブに対してハイブリッド形成している
目的物に相関している検出可能な信号または信号の変化を生じるための上記各実
施形態の任意のものを使用することにより、粒子の基質の場合において、上記混
合物は当該粒子から散乱した電磁放射線または上記第１の化合物または複数の化
合物からの蛍光、またはこれらの散乱および蛍光の両方を検出できる装置または
器具の中に曝露または導入されることにより、各粒子をバックグラウンドから識
別することが可能になる。さらに、目的物に相関している蛍光である上記第２の
化合物からの蛍光信号も目的の核酸の存在または量の測定値として検出される。
【００２０】 粒子に付随する散乱および／または蛍光を検出することによるバックグラウン
ドからの粒子の識別および別の粒子からの１個の目的の特異的な粒子の識別が可
能であり、目的物に相関している信号が検出可能である任意の粒子分析方法およ
び装置が本発明の実施において使用できる。レーザー・フロー・サイトメトリー
法（Laser flow cytometric methods）が好ましい。本発明の実施において有用
なレーザー・フロー・サイトメーターはニュージャージー州ラリタンのOrtho-Cl
inical Diagnostics社からのORTHO CYTORONABSOLUTE（登録商標）フロー・サイ
トメーターである。蛍光顕微鏡法または装置もまた採用可能である。さらに、例
えば、マサチューセッツ州ケンブリッジのCompucyte CorporationからのCompucy
teレーザー・スキャニング・サイトメーター等のレーザー走査法および装置もま
た使用可能である。また、基質固定化したオリゴヌクレオチドの立体的解像が可
能な各種方法が使用可能であり、レーザー走査法が特に適している。さらに、上
記のように、バックグラウンドから各粒子を識別し、目的の特異的な各粒子から
の散乱または蛍光の信号を解像して、目的物に相関している信号を検出すること
が可能であって、個々の粒子の物理的な分離に依存しない方法および装置もまた
採用できる。
【００２１】 さらに、別の態様において、本発明は複数の個別の目的の核酸の存在または量
を決定するための方法に関し、この方法は、 （Ａ）（ｉ）目的の核酸、および （ｉｉ）目的物に特異的な粒子を含む混合物を形成する工程を含み、この場合
に、目的物に特異的な粒子は当該粒子に対して１個の個別の目的の核酸の少なく
とも一部分に対して相補的な核酸シーケンスを含むオリゴヌクレオチドが固定化
されており、各粒子がそれぞれ独立して、 （ａ）約２００ｎｍよりも長いかこれに等しい波長の電磁放射線を散乱するこ
とが可能であり、または （ｂ）当該粒子に相当する個別の蛍光信号を生成できる個別の第１の化合物ま
たは複数の化合物を含み、または、 （ｃ）約２００ｎｍよりも長いかこれに等しい波長の電磁放射線を散乱するこ
とが可能であり、且つ、当該粒子に相当する個別の蛍光信号を生成できる個別の
第１の化合物または複数の化合物を含む。
【００２２】 上述したように、上記混合物は、随意的に、二本鎖核酸を変性するために加熱
した後に上記固定化したオリゴヌクレオチドに対する目的の核酸のハイブリッド
形成を可能にするために冷却することが可能であり、望まれる場合には、この目
的の核酸を固定化したオリゴヌクレオチドに混合する前に加熱できる。
【００２３】 多数の目的の核酸を決定するための方法は固定化したオリゴヌクレオチドに対
してハイブリッド形成した目的物に相関している検出可能な信号、好ましくは光
学的信号、最も好ましくは蛍光を発生するための工程を含む。さらに、二本鎖核
酸に対して結合可能であり、当該核酸に結合した時に検出可能な蛍光信号を生成
する第２の化合物が上記混合物に混合されているか、上記オリゴヌクレオチドに
蛍光発光可能な第２の化合物が連結していて、上記混合物が一本鎖の特異的エン
ドヌクレアーゼに対して接触するか、上記オリゴヌクレオチドまたは基質が蛍光
発光可能な第２の化合物を含み、この基質またはオリゴヌクレオチドが目的の核
酸の固定化したオリゴヌクレオチドに対するハイブリッド形成の前に上記第２の
化合物の蛍光を消光するために当該第２の化合物に対して十分に近接して蛍光消
光性の化合物を含んでいる。
【００２４】 固定したプローブに対してハイブリッド形成した目的物に相関している検出可
能な信号を生成するための上記の各実施形態を使用することにより、上記混合物
は、粒子状の各基質の場合において、上述したように、粒子から散乱した電磁放
射線または粒子における第１の化合物または複数の化合物からの蛍光、またはこ
れらの両方が検出可能であり、さらに上記第２の化合物からの蛍光信号を各個別
の目的の核酸の存在または量の測定値として検出できる、装置または器具の中に
曝露または導入される。このことは、上記目的物に特異的な各粒子がそれぞれの
特異的な光散乱および／または蛍光発光により識別可能であるという理由により
、達成可能である。それゆえ、目的物に相関している蛍光信号を生じる上記第２
の化合物は各目的物と同一であると言うことができる。しかしながら、望まれる
場合において、各目的物に対応する各個別の第２の化合物を使用することが可能
である。
【００２５】 結果として得られた蛍光信号は固定化したオリゴヌクレオチドに対してハイブ
リッド形成した目的物の量に比例する。また、固定化したプローブに対してハイ
ブリッド形成されない溶液中において遊離している目的の核酸および非目的の核
酸に付随する可能性のある蛍光は、仮に存在しているとしても、測定される目的
の相関している信号に実質的に寄与しない。
【００２６】 高度の特異性および感度が長鎖のオリゴヌクレオチド・プローブのシーケンス
により得ることができ、これらのシーケンスは厳しいハイブリッド形成の諸条件
の使用も可能にする。
【００２７】 別の態様において、本発明は同一または別々の容器内において構成されている
目的の核酸を検出するためのキットに関し、このキットは、 （１）粒子を含み、当該粒子は、 （ａ）約２００ｎｍよりも長いかこれに等しい波長の電磁放射線を散乱するこ
とができるか、または （ｂ）当該粒子に相当する蛍光信号を生成できる一定の化合物または複数の化
合物を含むか、または （ｃ）約２００ｎｍよりも長いかこれに等しい波長の電磁放射線を散乱するこ
とが可能であり、且つ、当該粒子に相当する蛍光信号を生成できる一定の化合物
または複数の化合物を含み、さらに、 （２）上記目的の核酸の少なくとも一部分に対して相補的な核酸シーケンスを
含むオリゴヌクレオチド、および （３）二本鎖核酸に対して結合可能であり、当該核酸に結合する時または結合
している時に検出可能な信号を生成できる化合物を含む。
【００２８】 別の態様において、本発明は同一または別々の容器内において構成されている
目的の核酸を検出するためのキットに関し、このキットは、 （１）粒子を含み、当該粒子は、 （ａ）約２００ｎｍよりも長いかこれに等しい波長の電磁放射線を散乱するこ
とができるか、または （ｂ）当該粒子に相当する蛍光信号を生成できる一定の化合物または複数の化
合物を含むか、または （ｃ）約２００ｎｍよりも長いかこれに等しい波長の電磁放射線を散乱するこ
とが可能であり、且つ、当該粒子に相当する蛍光信号を生成できる一定の化合物
または複数の化合物を含み、さらに、 （２）上記目的の核酸の少なくとも一部分に対して相補的な核酸シーケンスを
含むオリゴヌクレオチドを含み、当該オリゴヌクレオチドがリガンドを含み、さ
らに、 （３）一本鎖に特異的なエンドヌクレアーゼ、および （４）蛍光発光可能であり、上記リガンドに対して結合可能な化合物を含む。
【００２９】 別の態様において、本発明は同一または別々の容器内において構成されている
目的の核酸を検出するためのキットに関し、このキットは、 （１）粒子を含み、当該粒子は、 （ａ）約２００ｎｍよりも長いかこれに等しい波長の電磁放射線を散乱するこ
とができるか、または （ｂ）当該粒子に相当する蛍光信号を生成できる一定の化合物または複数の化
合物を含むか、または （ｃ）約２００ｎｍよりも長いかこれに等しい波長の電磁放射線を散乱するこ
とが可能であり、且つ、当該粒子に相当する蛍光信号を生成できる一定の化合物
または複数の化合物を含み、さらに、 （２）オリゴヌクレオチドを含み、当該オリゴヌクレオチドが、 （ａ）上記目的の核酸の少なくとも一部分に対して相補的な核酸シーケンス、 （ｂ）蛍光発光可能な第１の化合物、および （ｃ）上記第１の化合物の蛍光を消光可能な第２の化合物を含む。
【００３０】 別の態様において、本発明は同一または別々の容器内において構成されている
目的の核酸を検出するためのキットに関し、このキットは、 （１）粒子を含み、当該粒子は、 （ａ）約２００ｎｍよりも長いかこれに等しい波長の電磁放射線を散乱するこ
とができるか、または （ｂ）当該粒子に相当する蛍光信号を生成できる一定の化合物または複数の化
合物を含むか、または （ｃ）約２００ｎｍよりも長いかこれに等しい波長の電磁放射線を散乱するこ
とが可能であり、且つ、当該粒子に相当する蛍光信号を生成できる一定の化合物
または複数の化合物を含み、さらに、 （２）上記目的の核酸の少なくとも一部分に対して相補的な核酸シーケンスを
含むオリゴヌクレオチドを含み、当該オリゴヌクレオチドがリガンドを含み、さ
らに、 （３）二本鎖シーケンスの特異的制限エンドヌクレアーゼ、および （４）蛍光発光可能であり、上記リガンドに対して結合可能な化合物を含む。
【００３１】 本発明のさらに別の実施形態において、生物サンプルの増殖した核酸シーケン
スを検出するための方法が開示されており、この方法は、 上記核酸シーケンスを含む生物サンプルに微小粒子、熱安定性の蛍光物質、お
よび熱安定性のポリメラーゼを混合する工程、 上記ポリメラーゼの連鎖反応により上記核酸の選択したセグメントを増殖する
工程、および 上記核酸シーケンスを検出する工程を含む。 上記熱安定性の蛍光物質はＳＹＢＲグリーンＩ（SYBR GREEN I）、臭化エチジウ
ムおよびヨウ化プロピジウムから成る群から選択され、好ましくは、この熱安定
性の蛍光物質はＳＹＢＲグリーンＩである。
【００３２】 本発明のさらに別の実施形態において、生物サンプルの増殖した核酸シーケン
スを検出するための方法が開示されており、この方法は、 上記核酸シーケンスを含む生物サンプルに微小粒子および熱安定性のポリメラ
ーゼを混合する工程、 上記ポリメラーゼの連鎖反応により上記核酸の選択したセグメントを増殖する
工程、 上記工程（ｂ）の増殖した生成物に一定の蛍光物質を混合する工程、および 上記核酸シーケンスを検出する工程を含む。 上記蛍光物質は濃縮ピコグリーン、ＳＹＢＲグリーンＩ、臭化エチジウムおよび
ヨウ化プロピジウムから成る群から選択され、好ましくは、濃縮ピコグリーンで
ある。
【００３３】 本発明さらに別の実施形態において、生物サンプルの増殖した核酸シーケンス
を検出するための方法が開示されており、この方法は、 熱安定性のポリメラーゼの存在下において当該ポリメラーゼの連鎖反応により
上記核酸シーケンスを増殖する工程、 上記工程（ａ）の増殖した生成物に一定の蛍光物質および微小粒子を混合する
工程、および 上記核酸シーケンスを検出する工程を含む。 上記蛍光物質は濃縮ピコグリーン、ＳＹＢＲグリーンＩ、臭化エチジウムおよび
ヨウ化プロピジウムから成る群から選択され、好ましくは、濃縮ピコグリーンで
ある。
【００３４】 本発明の別の実施形態において、目的物に特異的な座（loci）および複製座を
含むオリゴヌクレオチド・アレイにより構成されているＤＮＡチップが開示され
ている。このチップまたはスライドは１種類以上の特異的な目的のシーケンスの
存在または量を決定するために有用である。このチップは約５個乃至約２０個の
目的物に特異的な座および約５個乃至約２０個の複製座、さらに好ましくは約１
００個乃至約１０００個の目的物に特異的な座および各目的物に対して約１０個
乃至約１００個の複製座を含む。
【００３５】 さらに、ＤＮＡチップにより１種類以上の目的のＤＮＡシーケンスを検出する
方法が開示されており、この方法は、 検出するための上記１種類以上の目的のシーケンスに相当する１種類以上のオ
リゴヌクレオチドが固定されているＤＮＡチップを、一般に約３０ｐｇ（ピコグ
ラム）乃至約２００ｎｇ（ナノグラム）以上の蛍光によりラベル化したＤＮＡで
ある上記１種類以上の目的のシーケンスを含むサンプルに対して接触させる工程
、および 上記１種類以上の特異的な目的のシーケンスの存在または量を検出する工程を
含む。
【００３６】 上記の場合の蛍光物質はアクリジン・オレンジ、ヨウ化プロピジウム、臭化エ
チジウム、ミトラマイシン、クロモマイシン、オリボマイシンから成る群から選
択され、これについては、米国特許第５，０４９，４９０号および同第５，５６
３，０３７号も参照されたい。好ましい化合物はHoechst H33258、Hoechst H333
42、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）、およびMole
cular Probes社からのTOPRO、TOTO、YOPRO、YOYO、SYBR GREEN I、およびピコグ
リーン（Picogreen）、および当該技術分野において一般的に使用されているそ
の他の化合物を含み、この蛍光物質は好ましくは濃縮ピコグリーンである。
【００３７】 上記の方法またはキットの全ては単一の目的の核酸または複数の目的の核酸を
決定するために構成できる。
【００３８】 発明の詳細な説明 概論 本発明の目的において、用語の「基質（substrate）」は粒子状または非粒子
状の物質であって当該物質に対してまたは当該物質の上にオリゴヌクレオチドが
固定化される物質を言う。
【００３９】 一般的な意味において、目的の核酸を検出するための本発明の方法は定量を確
認するために第１の１個または複数のパラメータの一組の測定に依存している。
さらに、目的の核酸の存在を決定するため、または当該核酸を定量するために、
第２の１個または複数のパラメータの対応する組の測定が行なわれる。これらの
定量の確認および目的物決定の各パラメータは相関しているデータのリストを作
成するために用いられる。これらのパラメータ測定は連続的に行なうことができ
る。各組の測定は発生（event）と言う。この結果、データ・リスト（表１）は
以下のようになる。
【表１】
【００４０】 上記のデータ・リストは一般的にレーザー走査式サイトメトリーまたはフロー
・マイクロフルオリメトリー（微量蛍光定量法）により得られる。これらは一般
に「リスト−モード・データ（list-mode data）」と呼ばれる。
【００４１】 単一のパラメータＸに対応する各値の範囲（「Ａ」）を第１の目的の核酸につ
いての定量を定義するために使用できる。また、Ｘに対応する各値の別の範囲（
「Ｂ」）を第２の目的の核酸についての定量を定義するために使用できる。この
手段により、両方の定量を同時に行なうことができる。発生が領域ＡにおけるＸ
に対応する値に相関している時はいつでも、パラメータＺの測定は第１の目的の
核酸に対応すると考えられる。また、発生が領域ＢにおけるＸに対応する値に相
関している時はいつでも、パラメータＺの測定は第２の目的の核酸に対応すると
考えられる。同時に行なうことのできる定量の数は各目的の核酸についての定量
を指定するために使用されるパラメータＸ内において検出できる個別の範囲の数
のみにより制限される。このようなＡ，Ｂ等に対応する広い範囲を設定すること
により各発生が特定の定量の種類に属する高度の確実性が得られる。
【００４２】 同時に行なうことのできる定量の数は１個の定量を指定するために２個以上の
パラメータが用いられる場合に増加できる。第１の目的の核酸についての定量を
指定するために、パラメータＹに対応する各値の範囲（「Ｑ」）と共にパラメー
タＸに対応する各値の範囲（「Ａ」）を使用できる。また、第２の目的の核酸に
ついての定量を指定するために、パラメータＹに対応する各値の別の範囲（「Ｒ
」）と共にパラメータＸに対応する各値の別の範囲（「Ｂ」）を使用できる。こ
の手段により、両方の定量が同時に行なえる。発生が範囲ＡにおけるＸおよび範
囲ＱにおけるＹに対応する値に相関している時はいつでも、パラメータＺの測定
は第１の目的の核酸に対応すると考えられる。同様に、発生が範囲ＢにおけるＸ
および範囲ＲにおけるＹに対応する値に相関している時はいつでも、パラメータ
Ｚの測定は第２の目的の核酸に対応すると考えられる。このように、１個の定量
を同定するために多数のパラメータを使用する場合には、各パラメータの特定の
組み合わせが各目的の核酸についての定量を指定するために使用できるので、同
時に行なうことのできる定量の数は個々のパラメータの個別の範囲の数により制
限されなくなる。加えて、Ａ，Ｂ，Ｑ，Ｒ等に対応してそれぞれ広い範囲を設定
することにより各発生が特定の定量に属するさらに高度な確実性が得られる。
【００４３】 レーザー走査式サイトメトリーまたはフロー・サイトメトリーにおいて、多数
の同時的な定量を分類するための好ましいパラメータは前方光散乱、側方散乱、
またはハイブリッド形成した核酸からの信号を検出するために使用するパラメー
タとは異なる各蛍光パラメータである。ＤＮＡチップの場合には、多数の定量を
分類するための好ましいパラメータは当該チップにおける立体的な寸法、ｘおよ
びｙの各座標または各位置である。
【００４４】 本発明の主な利点は、多数の定量を同時に行なうことを可能にすることに加え
て、上記リスト・モード・データにより同一の定量における複製の各測定値を得
る能力である。例えば、発生１乃至ｎは、パラメータＹに対応する各値の範囲（
「Ｑ」）内における各測定値と共にパラメータＸに対応する各値の範囲（「Ａ」
）内における各測定値に基づいて、第１の目的の核酸についての定量に属してい
るとして分類される。また、発生ｎ＋１乃至ｐは、パラメータＹに対応する各値
の範囲（「Ｒ」）内における各測定値と共にパラメータＸに対応する各値の範囲
（「Ｂ」）内における各測定値に基づいて、第２の目的の核酸についての定量に
属しているとして分類される。
【００４５】 統計的な分析を行なって発生１乃至ｎを分析することにより上記第１の定量に
おけるＺの平均および標準の偏差を決定できる。同様に、統計的な分析を行なっ
て発生ｎ＋１乃至ｐを分析することにより上記第２の定量におけるＺの平均およ
び標準の偏差を決定できる。この結果、目的物と対照との間および各目的物のレ
ベルの間における信号の差が複製の各測定値の平均値の間の差として表現するこ
とができ、これにより、行なわれる全ての定量の感度が高められる。特定の定量
の種類に属する各発生は連続的に測定される必要がない。これらは例示的な目的
のみのために連続的に生じているとして示されている。
【００４６】 別の利点は多数の目的の核酸からの信号を同時に検出するために単一のパラメ
ータが使用できることである。この結果、決定される目的の核酸の数に無関係に
、１個のリポーター要素のみが必要になる。フルオレセイン・イソチオシアネー
ト（ＦＩＴＣ）の接合体が信号発生において有用である。好ましい実施形態にお
いて、挿入色素が用いられる。
【００４７】 一本鎖の核酸の存在下における二重鎖または二本鎖の核酸の存在または量の決
定は二本鎖の核酸に結合する時または結合している時に吸光または蛍光等の光学
特性における検出可能な変化を生じる化合物により達成できる（Ririe他、Anal
Biochem ２４５、１５４頁（１９９７年）、Wittwer他、BioTechniques ２２、
１３０頁（１９９７年）、Yamamoto他、欧州特許公告第０６４３１４０Ａ１号お
よびSutherland他に発行されている米国特許第５，０４９，４９０号および同第
５，５６３，０３７号）。
【００４８】 核酸はSambrook他、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第１巻乃至３
巻、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press社、コールド・スプリング
、ニューヨーク州（１９８９年）およびThompson他、Biol. Chem. ２６７、５９
２１頁（１９９１）年において記載されているような「ヌクレアーゼ保護定量法
（nuclease protection assay）」により決定できる。この方法は目的のＤＮＡ
またはＲＮＡ分子に対するラベル化した一本鎖ＤＮＡプローブのハイブリッド形
成、およびこれに続くＳ１ヌクレアーゼ等の一本鎖特異性エンドヌクレアーゼに
よる一本鎖核酸の加水分解を含む。ハイブリッド形成した二本鎖核酸は完全な状
態で残り、ラベル化したプローブをエンドヌクレアーゼによる加水分解から保護
する。このラベルは当該技術分野において認識されていて適当に検出できる色素
、蛍光体（ほたる石等）、放射線ラベル化した分子、酵素等とすることができる
。この定量は目的の核酸に対して定量的である。
【００４９】 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の核酸増殖法はラベル化したプローブ、あ
るいは、固定化した相補的なオリゴヌクレオチド・プローブ上に捕捉されている
検出可能な生成物内に伸長しているラベル化したプライマーによる目的の核酸の
検出においてしばしば行なわれる。多様な種類のラベル（標識）が開発されてい
る（Vlieger他、Anal Biochem ２０５、１頁（１９９２年）、Yang他、Blood ８
１、１０８３頁（１９９３年））。また、フルオレセイン処理したプライマーが
ｂｃｌ−２／ＭＢＲのフロー・サイトメトリー検出およびＩｇＨ遺伝子再配列に
おいて使用されている（Barker他、Blood ８３、１０７９頁（１９９４年））。
【００５０】 目的の核酸を決定するための別の方法は蛍光体（ほたる石等）によりラベル化
した目的物に特異的なオリゴヌクレオチド・プローブからの信号の線形増幅を含
む。このラベル化したプローブは、目的物に対してハイブリッド形成した時に、
二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）をその３’末端から加水分解するエキソヌクレアー
ゼＩＩＩのような二本鎖核酸−特異性のエキソヌクレアーゼにより加水分解され
る。この加水分解中に生成された末端部分を切り取ったヘテロ二本鎖の各ハイブ
リッド体は不安定である。さらに、このラベル化したプローブにおける短小化し
た各フラグメントは解離する。その後、新しい、完全な状態のラベル化したプロ
ーブが目的物に対してハイブリッド形成することができ、新たな段階の加水分解
が生じた後に、短小化したラベル化したプローブ等が解離する。その後、結果と
して得られた各プローブのフラグメントが電気泳動により分離されて、シーケン
ス化装置により決定される。（Okano他、Anal Biochem ２２８、１０１頁（１９
９５年））。
【００５１】 最近において、Tyagi他、Nature Biotechnolgy １４、３０３頁（１９９６年
）は核酸の検出のためのいわゆる分子ビーコン（molecular beacons）の使用を
記載している。分子ビーコンは蛍光体（ほたる石等）および当該蛍光体のすぐ近
くに消光剤を含む目的物−特異性のオリゴヌクレオチドである。目的の核酸に結
合すると、この蛍光体および消光剤が分離して、結果として生じる蛍光が検出さ
れる。
【００５２】 複数の個別の目的の核酸の場合に、１個の目的物−特異性の基質／粒子が１個
のみの個別の目的の核酸の少なくとも一部分に対して相補的なオリゴヌクレオチ
ドを当該基質／粒子に固定化することにより、１個の個別の目的の核酸に対して
特異的になる。
【００５３】 目的のＤＮＡは一本鎖（ｓｓＤＮＡ）または二本鎖のいずれの形態でもよい。
二本鎖の場合には、基質−固定化したオリゴヌクレオチドとの組み合わせの前、
組み合わせ中、またはこれに続いて、そのｄｓＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）を変性す
るために、通常において加熱により、当該ＤＮＡを処理することができる。その
後、ｓｓＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）が基質−固定化したオリゴヌクレオチドに対し
てハイブリッド形成可能になる。
【００５４】 基質−固定化したオリゴヌクレオチドに対してハイブリッド形成した目的の核
酸から誘導可能なまたは当該核酸に付随する任意の光学的な信号および当該信号
を生成する方法が本発明の実施において使用できる。既に述べたように、実施形
態の一例において、目的物に相関している信号はｄｓＤＮＡに結合する蛍光体（
ほたる石等）を利用することにより得られ、その結合時に検出可能な蛍光信号を
生じる。このことが図１において概略的に示されている。あるいは、基質−固定
化したオリゴヌクレオチドに対してハイブリッド形成した目的物に付随する蛍光
信号はこのオリゴヌクレオチドに連結している蛍光物質を利用することにより生
成できる。この基質−固定化したオリゴヌクレオチド・プローブが目的の核酸に
対してハイブリッド形成して二本鎖の核酸を形成している時に、一本鎖−特異性
のエンドヌクレアーゼはこのオリゴヌクレオチド、それゆえ、当該オリゴヌクレ
オチドに連結している蛍光体を含むオリゴヌクレオチドの部分を加水分解または
実質的に加水分解することができない。従って、このオリゴヌクレオチドに連結
している蛍光体は基質に結合した状態で維持され、ハイブリッド形成した目的物
に結合しているこの蛍光体から生じる当該目的物に相関している信号が検出され
る。この場合に、一本鎖エンドヌクレアーゼを媒介とする加水分解により放出さ
れる蛍光体から生じる信号は上記の測定される蛍光に実質的に寄与しない。関連
の実施形態において、目的物が基質−固定化したオリゴヌクレオチドに対してハ
イブリッド形成する時に制限部位を含む二本鎖ＤＮＡシーケンスを形成する場合
に、このオリゴヌクレオチドに結合している蛍光物質を放出するために制限エン
ドヌクレアーゼを媒介とする加水分解が使用できる。別の実施形態において、蛍
光物質がその蛍光を実質的に（約５０％以上）消光できる化合物に対して十分に
近接するようにオリゴヌクレオチドまたは基質に結合される。この蛍光体が基質
に連結される場合に、上記の消光剤はオリゴヌクレオチドに連結される。また、
消光剤が基質に連結される場合は、蛍光体がオリゴヌクレオチドに連結される。
あるいは、蛍光体および消光剤の両方がオリゴヌクレオチドに連結されることも
可能である。
【００５５】 ｄｓＤＮＡに結合する時のみに検出可能な信号を生じるという蛍光体の能力は
好ましいが、この能力は本発明の実施において有用であるための蛍光体における
必要条件ではない。
【００５６】 粒子および粒子−固定化したオリゴヌクレオチド 本発明の粒子の基質はオリゴヌクレオチドの共有結合的または非共有結合的な
連結を可能にする任意の材料または当該材料の組み合わせおよび／または蛍光物
質等のその他の化合物により構成できる。さらに、これらの基質は、蛍光が検出
可能であれば、蛍光物質等の化合物を封入可能にする構成にできる。また、これ
らの基質は電磁放射線を散乱するような寸法および組成にできる。好ましくは、
これらの粒子はリガンド、またはオリゴヌクレオチドおよび／またはその他の化
合物の直接的または適当な結合性の相手または連結性の基を介する非共有結合的
または共有結合的な結合を可能にする官能基を含む１種類以上の高分子により構
成されている。好ましくは、これらの粒子は実質的に球形状であり、約０．３ミ
クロン乃至約５０ミクロン、さらに好ましくは約０．９ミクロン乃至約１５ミク
ロンの範囲内の直径を有しており、且つ／または、約２００ナノメートルよりも
長いかこれに等しい（波長の）電磁放射線を散乱できる。本発明の実施において
使用するための高分子粒子は当該技術分野の熟練者において既知の各種方法によ
り作成可能である。例えば、米国特許第４，９９７，７７２号、同第５，１４９
，７３７号、同第５，２１０，２８９号および同第５，２７８，２６７号および
本明細書において引用した各参考文献を参照されたい。あるいは、例えば、イン
ディアナ州フィッシャーズのBangs Labs社およびイリノイ州リバティビルのSphe
rotech社および当該技術分野の熟練者において知られているその他の供給者から
適当な粒子が入手可能である。
【００５７】 オリゴヌクレオチドの粒子状または非粒子状の基質への結合は、例えば、米国
特許第５，１７７，０２３号、同第４，７１３，３２６号、同第５，１４７，７
７７号、同第５，１４９，７３７号、欧州特許（ＥＰ−Ｂ）第００７０６８７号
、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ８８／０１３０２号、および本明細書において引用した
各参考文献において記載されているような周知の方法により行なうことができる
。オリゴヌクレオチドは目的の核酸のハイブリッド形成に対して１種類以上の化
合物が実質的に干渉しない限り任意の所望の化合物をこれに連結することができ
る。例えば、ビオチン等のリガンド、蛍光体（ほたる石等）、蛍光消光化合物、
またはその他の化合物を上記の条件下に連結させることができる。また、オリゴ
ヌクレオチドはその３’または５’の端部において粒子に連結できる。
【００５８】 オリゴヌクレオチドは任意の所望の数の塩基を含むことができる。一般に、オ
リゴヌクレオチドは約５個乃至約１０5 個のヌクレオチド塩基の塩基長を有する
ことができる。好ましくは、このオリゴヌクレオチドは約１５個乃至約４０，０
００個の塩基、さらに好ましくは約３０個乃至約１０，０００個の塩基、さらに
好ましくは約３０個乃至約１０００個の塩基、最も好ましくは約３０個乃至約５
００個の塩基の塩基長を有している。
【００５９】 検出 粒子状の基質における本発明の重要な態様は各粒子の光散乱および／または蛍
光特性に基づいて粒子およびバックグラウンド上の目的物に関連している信号、
および目的物に特異的な各粒子を互いに識別できる方法および機械類の使用であ
る。目的物に特異的な各粒子はそれぞれの光散乱特性における明瞭な差および／
または各目的物に特異的な粒子に結合している１個または複数の蛍光物質から得
られる蛍光信号における明瞭な差により互いに識別可能であり、各蛍光信号は目
的物に相関している蛍光に対して区別できる。
【００６０】 粒子による光散乱はその大きさおよび／または屈折率により決まり、これらの
値は共に周知の方法により所望に応じて変更可能である。粒子が光を散乱できる
ことは必ずしも必要ではない。すなわち、粒子の識別は当該粒子を識別可能な蛍
光を生じることのできる１種類以上の化合物に組み込む、封入する、または非共
有結合的または共有結合的に結合することにより達成できる。
【００６１】 レーザー走査式サイトメトリーは血液細胞等の粒子を識別するために使用され
ている。細胞または細胞群（凝集体）をレーザー光ビームにより走査すると、そ
の照射光が細胞または細胞群により散乱して、その散乱の強度が細胞（または凝
集体）の大きさおよび形状の関数になる。例えば、個々の赤血球は凝集体よりも
弱い光を散乱し、この凝集体は大きな凝集体よりも弱い光を散乱する。
【００６２】 同様に、細胞または細胞群（凝集体）がレーザー光ビームにより走査されると
、その照射光は各細胞に結合している各蛍光体から蛍光を誘発する。蛍光体が１
個の細胞に比較的に均一に結合している場合は、その蛍光の強度は凝集体の大き
さに関係する。例えば、個々の赤血球は小さい凝集体よりも弱い蛍光を発して、
この凝集体は大きな凝集体よりも弱い蛍光を発すると考えられる。
【００６３】 散乱光および蛍光を組み合わせて利用することは異なる種類の凝集体を識別す
る場合にいずれかを単独で使用することよりもさらに信頼性が高い。
【００６４】 フロー・サイトメトリーにおいて、血液細胞等の粒子が高速で移動する流体の
流れの中心に導入されて、均一の速度で小さな直径のオリフィスから一列に強制
的に流し出される。これらの粒子は周囲のさや状の流体の層によりその流れの中
心に流体力学的に集められる。この流れの中の各粒子は測定ステーションを通過
し、この場所において、これらの粒子は光源により照射されて、赤血球の場合に
、１分当たり２．５×１０2 個乃至１０6 個の細胞の速度で各測定が行なわれる
。レーザー光源がこの粒子の測定に用いられ、使用される一般的なレーザー光源
はアルゴン・イオン・レーザー（ＵＶ、青色および緑色光）、クリプトン・レー
ザー（黄色および赤色光）、ヘリウム−カドミウム・レーザー（ＵＶおよび青色
光）、およびヘリウム−ネオン・レーザー（赤色光）を含む。
【００６５】 蛍光顕微鏡において、各粒子は顕微鏡スライドまたはその等価物の上において
検出できる。一般的に、これらは白色光源または実質的に単色の光源により照射
される。この場合においても、レーザー光源が単色光の供給源として使用できる
。粒子の存在は白色光により評価することができ、付随する蛍光は単色光および
適当なフィルターにより評価できる。また、これらの読取の一方または両方に対
して視覚的なまたは自動化した手段を使用できる。
【００６６】 好ましいフロー・サイトメーターが一定の範囲の前方角度および直角の散乱信
号強度または特定の蛍光を有する各粒子に付随する目的物に相関している信号の
検出のために選択できる（Yang他、Blood ８１、１０８３頁（１９９３年）、Ba
rker他、Blood ８３、１０７９頁乃至１０８５頁（１９９４年）、Chandler他、
ISAC XIX 国際会議、米国、コロラド州コロラド・スプリングス、Fulton他、Cli
nical Chem ４３、１７４９頁（１９９７年）、Fulwyler他、Methods Cell Biol
ogy、第２版、Academic Press社、第３３巻、６１３頁（１９９０年）、およびM
cHugh、Methods Cell Biology、第２版、Academic Press社、第４２巻、５７５
頁、（１９９４年））。データの取得は粒子に付随する光散乱および／または蛍
光により開始される。粒子に付随する信号に対する選択により、各粒子が浸漬し
ている全体の溶液相から発生する蛍光による干渉を含むことなく目的物に相関し
ている信号の検出が可能になる。この結果、信号対雑音比が大きくなる。目的物
に相関している信号はその目的物の量に比例し、多数の目的の核酸の決定も上記
の好ましいフロー・サイトメトリー法により可能である。フロー・サイトメトリ
ーによる溶液中に遊離している複数の核酸の多重分析がChandler他、ISAC XIX
国際会議、コロラド州コロラド・スプリングス（１９９８年）、Fulton他、Clin
ical Chem ４３、１７４９頁（１９９７年）、Fulwyler他、Methods Cell Biolo
gy、第２版、６１３頁（１９９０年）、およびMcHugh、Methods Cell Biology、
第２版、５７５頁、（１９９０年））により記載されている。
【００６７】 ＤＮＡ結合性の蛍光物質 ｄｓＤＮＡに対して結合して当該ｄｓＤＮＡに結合している時に検出可能な信
号を生じることができる、あるいは、化学的に変性して検出可能な信号を生成で
きる多数の化合物が当該技術分野の熟練者において知られており、利用可能であ
る。これらに含まれる物質として、色素、抗生物質、および化学療法剤がある。
これらは挿入性または非挿入性のいずれでもよいが、オリゴヌクレオチドが固定
化されている基質に対して実質的に結合する必要はない。特定の例はアクリジン
・オレンジ、ヨウ化プロピジウム、臭化エチジウム、ミトラマイシン、クロモマ
イシン、オリボマイシンを含むがこれらに限らず、米国特許第５，０４９，４９
０号および同第５，５６３，０３７号も参照されたい。好ましい化合物はHoechs
t H33258、Hoechst H33342、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルイ
ンドール）、およびMolecular Probes社からのTOPRO、TOTO、YOPRO、YOYO、SYBR
GREEN I、ピコグリーンｄｓＤＮＡ定量試薬、およびチアゾール・オレンジ（Th
iazole Orange）を含む。なお、YOYO等の一部の化合物はこれらがｄｓＤＮＡに
結合するまで事実上は非蛍光発光性である。また、アクリジン・オレンジはｓｓ
ＤＮＡまたはｄｓＤＮＡに対する結合の間の識別を可能にする異染特性を有して
いる。本発明の目的において、化合物はいずれも一本鎖の固定化したオリゴヌク
レオチドに対して実質的に結合する必要はないが、結合する場合には、得られる
あらゆる信号はその化合物がｄｓＤＮＡに結合する場合に生じる信号から識別可
能であることが必要である。
【００６８】 一本鎖特異性エンドヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ 本発明の実施において使用可能な一本鎖特異性のエンドヌクレアーゼはＳ１エ
ンドヌクレアーゼおよびヤエナリ（mung bean）エンドヌクレアーゼを含むがこ
れらに限らない。また、使用可能な制限エンドヌクレアーゼはAcc65 I，Acc I，
Aci I，Alu I，Apa I，ApaL，Ava I，Ava II，Bae I，BamH I，Bcg I，Bcl I，B
fa I，Bgl I，Bgl II，Bsa I，BsaJ I，Bsl I，BspH I，BsrG I，Bst4C I，BssS
I，BstE II，BstU I，BstX I，BstY I，Cla I，Dde I，Dpn I，Dpn II，Dra I
，Dra III，EcoO109 I，EcoR I，EcoR V，Fau I，Fok I，Hae II，Hae III，Hha
I，Hinc II，Hind III，Hinf I，Hpa I，Hpa II，Kpn I，Mbo I，Mlu I，Mnl I
，Mse I，Msp I，Nae I，Nco I，Nde I，Nhe I，Nla III，Nru I，Pst I，Pvu I
，Pvu II，Rsa I，Sac I，Sac II，Sal I，Sau3A I，Sca I，Sfi I，Sma I，Sna
B I，Spe I，Sph I，Ssp I，Stu I，Sty I，Taq I，Xba I，Xcm I，Xho I，Xma
I，およびXmn Iを含むがこれらに限らない。
【００６９】 蛍光体および消光剤 蛍光物質および消光剤が共に供給されている実施形態において、Tyagi他、Nat
ure Biotecholgy １４、３０３頁（１９９６年）、Tyagi他、Nature Biotechnol
gy １６、４９頁（１９９８年）、Giesendorf他、Clin Chem ４４、４８２頁（
１９８８年）、およびEstrada他、Mol Cell Probes １２、２１９頁（１９９８
年）により記載されているステム−ループ構造（分子ビーコン）におけるように
、蛍光物質はオリゴヌクレオチドの一方の末端部分またはその近くに連結でき、
消光剤は他方の末端部分またはその近くに連結できる。ステム−ループ構造にお
いて、オリゴヌクレオチドはその両方の末端部分に相補的なヌクレオチドの塩基
対を有している。これらの相補的な塩基対のハイブリッド形成により、上記蛍光
物質と消光剤が十分に近接した状態で閉じたループが形成されて、その蛍光が消
光する。さらに、目的の核酸のオリゴヌクレオチドに対するハイブリッド形成に
より、このループが開いて、蛍光物質と消光剤が十分に分離することにより蛍光
発光が可能になる。
【００７０】 全ての場合において、基質に固定化したオリゴヌクレオチドが浸漬している溶
液からの当該オリゴヌクレオチドの分離は検出前に必要とされない。しかしなが
ら、この分離は、望まれる場合に、濾過、遠心分離または磁気分離等の周知の方
法により行なうことができる。
【００７１】 本発明の別の態様において、目的の核酸分子は相補的なシーケンスの微小球体
に結合したオリゴヌクレオチド・プローブに対して厳しい条件下でハイブリッド
形成することが可能であり、このハイブリッド形成はｄｓＤＮＡ特異性の蛍光色
素による染色により検出できる。また、上記微小球体を飽和するために十分な目
的物の濃度およびインキュベーション時間を使用することが可能であり、飽和が
達成される前後の各時間点における信号が測定可能である。さらに、無関係な目
的物のシーケンスについてバックグラウンドを超える信号は全く観察されない。
最大の蛍光信号は目的のシーケンスが全てのヌクレオチドの位置において微小球
体に結合しているオリゴヌクレオチドに対して相補的である場合にその微小球体
に付随して観察され、さらに、完全な相補性は分析物濃度の関数として信号にお
ける最も急速な上昇を生じる。１個の塩基が目的のシーケンス内において一致し
ていない場合に、その蛍光信号は完全に相補的な目的のシーケンスの場合よりも
低い。従って、経時的な蛍光信号における上昇は完全に相補的な目的のシーケン
スの場合よりも急速の程度が劣る。加えて、最大の蛍光および信号における上昇
速度は３種類の可能性のヌクレオチドが不一致であったということの関数である
。従って、この方法は、飽和結合状態における最大の蛍光を測定することによる
、あるいは、分析物濃度による信号増加の測定による、ＳＮＰ検出に対する精密
且つ簡潔な手法を提供する。おそらく、上記の不一致の位置もこの方法によりマ
ッピングすることが可能であると思われ、従って、この方法の利点をＤＮＡのシ
ーケンス決定の用途において利用することが可能であると考えられる。
【００７２】 この開示はＰＣＲ生成物を微小球体に混合して色素を挿入することによる当該
ＰＣＲ生成物の検出方法を説明しているが、さらに、微小球体に固定化したオリ
ゴヌクレオチド・プローブの添加および熱工程の前、あるいは、その後における
ＰＣＲ反応への色素の挿入が開示されている。この本発明の実施形態において、
色素（この実施形態において、好ましくは熱安定性の色素）または微小球体のい
ずれかが、単独で、熱工程の前に上記混合物中に存在することができ、あるいは
、これらの両方が存在していてもよい。従って、サンプルの取り扱いは上記およ
び本明細書における実施例６において説明した均質な様式、または当該技術分野
の熟練者により使用可能または発見可能な様式のいずれにおいてもＰＣＲ生成物
を測定する場合にさらに減少できる。
【００７３】 各実施例に対応する各材料および各方法 特別に示さない限り、各実施例において使用する粒子は、米国特許第５，１４
９，７３７号、同第５，２１０，２８９号および同第５，２７８，２６７号にお
いて記載されているように調製した、（ポリ［スチレン−コ（ｐ−ビニルベンジ
ルチオ）プロプリオン酸］９７．６：２．４のモル比）のコポリマーである。こ
れらの粒子は実質的に球形状であり、直径が約１．７マイクロメートルである。
これらの粒子に対するオリゴヌクレオチドの連結は米国特許第５，１４７，７７
７号に実質的に記載されているように行なった。特別に示さない限り、各オリゴ
ヌクレオチドは当該技術分野において周知の方法により合成した。各実施例にお
いて使用した２種類のオリゴヌクレオチドは以下のように同定される。 シーケンス認識番号１（SEQ ID NO:1）： 5'-TTTCCAAGTA AGCAATAACG TCAGCTCTTT CTTGTGGCTT CTTCATACCA GCGAAAGACA TCTTAGTACC TGGCATGAAC TTCTTTGGGT-3'
【００７４】 上記オリゴヌクレオチドを、以下に示すように粒子に対する結合のための３’
末端部分におけるアミノジオール（ＡＤＬ）リンカーを含む状態、および当該Ａ
ＤＬリンカーを含まない状態において、２個のテトラエチレン・グリコール（Ｔ
ＥＧ−ＴＥＧ）スペーサーを介してその５’末端にビオチンを連結することによ
り修飾した。 オリゴ−１Ａ（Oligo-1A） ［ビオチン］−ＴＥＧ−ＴＥＧ−5'-TTTCCAAGTA AGCAATAACG TCAGCTCTTT CTTGTG
GCTT CTTCATACCA GCGAAAGACA TCTTAGTACC TGGCATGAAC TTCTTTGGGT-3'−ＴＥＧ−
ＴＥＧ−ＡＤＬ−［粒子］ および オリゴ−１Ｂ（Oligo-1B） ［ビオチン］−ＴＥＧ−ＴＥＧ−5'-TTTCCAAGTA AGCAATAACG TCAGCTCTTT CTTGTG
GCTT CTTCATACCA GCGAAAGACA TCTTAGTACC TGGCATGAAC TTCTTTGGGT-3'
【００７５】 シーケンス認識番号２（SEQ ID NO:2）： 5'-ACCCAAAGAA GTTCATGCCA GGTACTAAGA TGTCTTTCGC TGGTATGAAG AAGCCACAAG AAAGAGCTGA CGTTATTGCT TTGGAAA-3'
【００７６】 ハイブリッド形成条件 １μｇの子ウシ胸腺ＤＮＡの存在下において１０μＬの０．１５Ｍ塩化カリウ
ム、０．０１Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）、１ｍＭ
のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ｐＨ８．３の中において１００フェム
トモルのプローブをインキュベーションすることにより、ビオチニル化（biotin
ylated）したオリゴヌクレオチド・プローブ（SEQ ID NO:1）の目的のＤＮＡ（S
EQ ID NO:2）に対するハイブリッド形成を行なった。すなわち、上記ＤＮＡを９
６℃で３分間にわたり加熱することにより変性した後に、この混合物を１０分間
にわたり６５℃においてインキュベーションすることにより、目的物およびオリ
ゴヌクレオチド・プローブのハイブリッド形成を可能にした。次に、この反応混
合物を５×１０4 個のビーズに供給して最終的な容量を１５μＬにすることによ
り上記ビオチニル化したオリゴヌクレオチドのストレプトアビジン−コーティン
グしたビーズ（Bangs Laboratories社）に対する結合を行ない、室温で１０分間
にわたりこの混合物をインキュベーションした。
【００７７】 蛍光物質の結合 蛍光物質の処理原料溶液の５００μＬの分量に、１０μＬのハイブリッド形成
した目的物−プローブのビーズ懸濁液を加えて、この混合液を最短で５分間にわ
たり室温でインキュベーションした。上記蛍光物質の処理原料溶液は以下のよう
な製造者により供給された元の調製物から調製した。すなわち、ピコグリーンは
ＴＥ緩衝液により１：１０，０００に希釈し、SYBR GREENはＴＥ緩衝液により１
：２００に希釈し、ＴＥ緩衝液中において１μｇ／ｍＬのチアゾール・オレンジ
（ウィスコンシン州ミルウォーキーのAldrich Chemical Company）、全てＴＥ緩
衝液中において０．５μＭのTOPRO-1、TOTO-1、YOPRO-1およびYOYO-1を用いた。
【００７８】 ヌクレアーゼ保護 ビーズに固定化したオリゴヌクレオチド・プローブ（SEQ ID NO:1）の目的の
ＤＮＡ（SEQ ID NO:2）に対するハイブリッド形成の後に、上記懸濁液の８μＬ
の分量を８μＬの２×Ｓ１ヌクレアーゼ緩衝液または２×ヤエナリ（mung bean
）ヌクレアーゼ緩衝液（ウィスコンシン州マディソンのPromega社）と共に混合
し、１単位のＳ１ヌクレアーゼまたはヤエナリ・ヌクレアーゼを消化して、３０
分間にわたり３０℃でインキュベーションした。この反応混合液に、ＴＥ緩衝液
中におけるストレプトアビジン共役型のフィコエリスリン蛍光物質の１：１０希
釈物を加えて、最終的な容量を２４μＬにした。
【００７９】 フロー・サイトメトリー Immunocount 2.2ソフトウェアによりOrtho CYTORONABSOLUTE（登録商標）を用
いてフロー・サイトメトリー分析を行なった。粒子分析における各パラメータは
ビーズに固定化したオリゴヌクレオチドの各ロットに対応して決定した。装置に
より各大きさのビーズを検出して解像できるように、前方角度散乱および直角散
乱に対する各ゲインおよび各増幅器を設定した。上記CYTORONABSOLUTE（登録商
標）フロー・サイトメーターにおける蛍光のゲインおよび増幅器をハイブリッド
形成を媒介とする蛍光検出が最適となるように調節した。蛍光および別のパラメ
ータ（例えば、前方散乱または直角散乱）の両方の閾値を予め設定することが可
能であり、分析する異なるサンプルに対して一定の基準を適用できるので、平均
ピーク・チャンネルの蛍光を決定するためにクラスター分析を採用した。この方
法は各粒子から生じるバックグラウンドのノイズを消去して、高度に散乱した蛍
光のチャンネル値を定める。
【００８０】 以下に説明する各実施例は目的の核酸としてＤＮＡを利用している。各実施例
は例示的な目的のためのものに過ぎない。必要であれば、本発明の方法は当該技
術分野の熟練者において理解されるようにＲＮＡの目的物に対して容易に適応で
きる。
【００８１】 実施例１ 粒子固定したオリゴヌクレオチドに対してハイブリッド形成した目的のＤＮＡの
検出：ＤＮＡ結合性の蛍光物質 ｄｓＤＮＡに結合する蛍光物質を用いてハイブリッド形成した目的のＤＮＡを
検出した。この実施例における目的のＤＮＡ（SEQ ID NO:2）を過剰の子ウシ胸
腺ＤＮＡの存在下においてビーズに固定化したプローブ（SEQ ID NO:1）に対し
てハイブリッド形成した。その後、蛍光物質をこのハイブリッド形成した目的物
−ビーズの懸濁液に混合して、フロー・サイトメトリーにより分析した。上記ｄ
ｓＤＮＡ結合性の蛍光物質としてチアゾール・オレンジを用いた各結果が図２Ａ
乃至図２Ｆにおいて示されている。目的のＤＮＡの非存在下（図２Ａ）および存
在下（図２Ｂ）における１μｇの子ウシ胸腺ＤＮＡによりインキュベーションし
たビーズの前方角度散乱（ＦＷ−ＳＣ）対直角散乱（ＲＴ−ＳＣ）のパタンが示
されている。画像分析ソフトウェア・アルゴリズムによるビーズの光散乱ゲート
処理により、ＦＷ−ＳＣ対ＲＴ−ＳＣの各値の狭い範囲内における選択した粒子
の分析が可能になり、これにより、その大きさの範囲外の粒子を除外できる。各
粒子のゲート化された群は図２Ｃおよび図２Ｄにおいて示されているＦＷ−ＳＣ
対緑色蛍光（ＧＲ−ＦＬ）のパタンを有しており、ｄｓＤＮＡ結合性の蛍光物質
としてチアゾール・オレンジが用いられており、この場合に、さらにゲート処理
することにより平均チャンネルの蛍光値を計算するために用いる発生数を選択し
ている。図２Ｃおよび図２Ｄにおいて選択した各粒子の群が図２Ｅおよび図２Ｆ
において蛍光のヒストグラムにおいて示されており、この場合に、陰性の対照（
目的のＤＮＡ無し）および陽性（１０００フェムトモルの目的物）のそれぞれの
分布の平均値が明瞭に分かれていることが分かる。以下の表２は目的のＤＮＡの
添加および無添加の状態におけるＣＴＤＮＡの存在下での７種類の異なる蛍光物
質についての平均ピーク・チャンネルの蛍光（ＭＣＦ）を示している。最終容量
が１０マイクロリットルにおける１マイクログラムのＣＴＤＮＡおよび０．１５
Ｍの塩化カリウム、０．０１ＭのＴｒｉｓ、および１ｍＭの（ＥＤＴＡ）、ｐＨ
８．３の存在下において目的物（SEQ ID NO:2、１０００フェムトモル）の存在
下または非存在下に、ビーズに固定したオリゴヌクレオチド・プローブ（SEQ ID
NO:1）を含む４×１０4 個のビーズを含有している混合物内においてハイブリ
ッド形成を行なった。このＤＮＡを３分間にわたり９６℃で変性し、６５℃にお
いてハイブリッド形成した。
【表２】
【００８２】 画像分析ソフトウェアによる各粒子の光散乱ゲート処理により凝集した狭い範
囲の前方角度散乱対直角散乱の値を示す粒子の群の分析を可能にして関係してい
る粒子のみにその分析を限定できるので、溶液中に遊離しているＤＮＡからハイ
ブリッド形成した目的物およびオリゴヌクレオチドに結合している粒子を分離す
る必要がない。
【００８３】 実施例２ ヌクレアーゼの保護 ビオチニル化した粒子−固定化したオリゴヌクレオチド・プローブ（オリゴ−
１Ａ）の目的のオリゴヌクレオチド（SEQ ID:2）に対するハイブリッド形成は一
本鎖特異性のＤＮＡエンドヌクレアーゼによる加水分解に対してこのプローブを
保護した。実施例１におけるように、粒子に固定化したオリゴヌクレオチドおよ
びＣＴＤＮＡを１０００フェムトモルの目的のＤＮＡの存在下および非存在下に
おいて共にインキュベーションした後に、Ｓ１ヌクレアーゼによりインキュベー
ションした。ビオチンは目的のＤＮＡに対するハイブリッド形成により加水分解
に対して保護されていない限り上記オリゴヌクレオチド・プローブのエンドヌク
レアーゼによる加水分解時に解離する。
【００８４】 ＴＥ緩衝液中において１：１０に希釈したストレプトアビジンに連結した蛍光
体（Molecular Probes社からのストレプトアビジン−フィコエリスリン）の８マ
イクロリットルの分量をヌクレアーゼにより処理したサンプルの１６マイクロリ
ットル分に加えて、室温で１０分間にわたりインキュベーションした。このスト
レプトアビジンに連結した蛍光体の結合性は完全な状態のビーズに連結したオリ
ゴヌクレオチドに対するリポーターとして作用した。この混合物をフロー・サイ
トメトリーにより分析した。この結果、フィコエリスリンの平均チャンネル蛍光
は目的物が存在していない場合に２１．５であり、１０００フェムトモルの目的
物が存在している場合には３４．７であった。
【００８５】 実施例３ 目的のＤＮＡの定量化：ＤＮＡ結合性の蛍光物質 目的のＤＮＡ（SEQ ID NO:2）およびビーズに結合化したオリゴヌクレオチド
（SEQ ID NO:1)のハイブリッドに結合しているｓｙｂｒグリーンである蛍光物質
の蛍光が図３において目的物のコピー数の関数として示されている。
【００８６】 ビーズに固定化したオリゴヌクレオチドに付随する蛍光信号はその濃度に単調
に依存しており、約６桁の濃度範囲にわたり目的のＤＮＡの量を定量的に決定す
る能力を示している。４４０アットモルまたは約２．５×１０8 個の目的物（th
e 90-mer target）に相当する２５．７ピコグラム程度の目的のｄｓＤＮＡが０
．８μｇの非特異性の子ウシ胸腺ＤＮＡのバックグラウンド内において明瞭に検
出された。この結果、約３．１１×１０4 倍の過剰な非特異性のＤＮＡの存在下
において目的のＤＮＡが容易に検出可能になった。また、これらの結果はこの方
法が上記の濃度範囲にわたり極めて感度が良く、目的のＤＮＡの濃度における２
倍の増加が８マイクロリットルの容積内における１．２５×１０8 個乃至１．０
９×１０12個の濃度範囲内において容易に検出可能であることも示している。さ
らに、チアゾール・オレンジ、TOPRO-1、TOTO-1、YOPRO-1、YOYO-1、およびピコ
グリーンにより得られた平均の蛍光も、それぞれの場合において、目的のＤＮＡ
の濃度に比例していた（データは示していない）。
【００８７】 実施例４ 目的のＤＮＡの定量化：ｄｓＤＮＡ結合性の蛍光物質 別の実施形態において、可溶性のビオチニル化したオリゴヌクレオチド・プロ
ーブを溶液中においてその目的のＤＮＡに対して自然にハイブリッド形成させた
。その後、この目的のＤＮＡ−ビオチン−オリゴヌクレオチド・プローブのハイ
ブリッドをストレプトアビジン−ビーズに対して自然に結合させた。さらに、こ
の懸濁液に、５００マイクロリットルのピコグリーンの１：２００希釈液を加え
て室温において２分間にわたりインキュベーションした。この懸濁液をフロー・
サイトメーターに導入した。算出された粒子付随の平均チャンネル蛍光はサンプ
ル内の目的のＤＮＡの濃度に比例していた（データは示していない）。
【００８８】 実施例５ 目的のＤＮＡの定量化：ヌクレアーゼの保護 図４は粒子に結合した目的の核酸の検出のためのヌクレアーゼ保護を基本とす
るアッセイ（定量）の概略を示している。
【００８９】 ヌクレアーゼＳ１の消化からのオリゴヌクレオチド・プローブの保護は目的の
ＤＮＡの量に比例していた。図５は一本鎖型の目的のＤＮＡの濃度増加の関数と
しての平均の蛍光信号を示している。この結果、４０．９６フェムトモル程度（
約２．５×１０10個のコピー数）の９０個塩基対のＤＮＡ目的物（SEQ ID NO:2
）が約１００倍過剰の非目的物のＣＴＤＮＡ中において検出された。
【００９０】 実施例６ ＰＣＲ増殖生成物の検出：ＤＮＡ結合性蛍光物質 少量の核酸を定量的に測定するために、目的のＤＮＡのＰＣＲ増殖を増殖工程
数の関数として頻繁にモニターする。この増殖工程の数は目的物のコピー数に比
例している生成物を検出するために必要とされる。
【００９１】 この実施例において、１０種類の目的のＤＮＡのコピーをＰＣＲによりプラス
ミド−クローン化したＤＮＡインサート（SEQ ID NO:3）から増殖した。目的の
ＤＮＡ（１０回のコピー体、SEQ ID NO:3）をＣＴ（子ウシ胸腺）ＤＮＡ、５マ
イクロモルのＮａＯＨ、４ミリモルのＭｇＣｌ2 、１８ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液、
５４ｍＭのＫＣｌ、０．４ｍＭの各プライマー（SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:5
）、０．３ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．１０８マイクログラム／マイクロリットルの
ゼラチン、０．７２５ｍＭのＥＤＴＡ、４０マイクロモルのＤＴＴ、９．５％の
グリセロール、０．０２％のTWEEN 20、０．０２％のNonidet P40を含有してい
る混合物の１００マイクロリットルの容積分中において増殖した。
【００９２】 目的のＤＮＡ ｐＵＣｌ８内においてクローン化したＤＮＡフラグメントから成る以下のシー
ケンスを有する目的のＤＮＡ シーケンス認識番号３（SEQ ID NO:3） 5'-CTGCAGGCGC CAGCGTGGAC CATCAAGTAG TAATGAACGC ACGGACGAGG ACATCATAGA GATTACACCT TTATCCACAG TTCTCGGTCT AACGCAGCAG TCAGTGTATC AGCACCAGCA TCCGTAGTGA GTCTTCAGTG TCTGCTCCAG GATCGTG GCG CTGCAG-3' 下線部の各シーケンスは以下に記載した各ＰＣＲプライマー（SEQ ID NO:4およ
びSEQ ID NO:5）により目的のＤＮＡから増殖した領域に相当する。
【００９３】 ＰＣＲ プライマー 目的のＤＮＡ増殖において使用する各プライマーは以下の各シーケンスに従っ
て合成的に調製した各オリゴヌクレオチドである。 シーケンス認識番号４（SEQ ID NO:4）（正プライマー） 5'-CGCCAGCGTG GACCATCAAG TAGTAA-3' シーケンス認識番号５（SEQ ID NO:5）（逆プライマー） 5'-CACGATCCTG GAGCAGACAC TGAAGA-3' ＰＣＲを各標準的な熱工程（thermal cycling）プロトコル（工程１乃至工程５
：９６℃において３０秒、６８℃において６０秒、工程６乃至工程４０：９６℃
において１５秒、６８℃において６０秒）により行ない、各反応をPerkin Elmer
9600 ＰＣＲシステム・サーモサイクラー（PCR System Thermocycler）におい
て５，１０，１５，２０，２５，３０，３５および４０工程のいずれかで終結し
た。
【００９４】 ハイブリッド形成 増殖後、１０μＬの上記ＰＣＲ混合物を２×ハイブリッド形成緩衝液（０．３
Ｍの塩化カリウム、０．０２ＭのＴｒｉｓおよび２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．３
）中において懸濁したオリゴヌクレオチド・プローブ（SEQ ID NO:6）に対して
既に連結されている約１０5 個の３．５ミクロン直径の粒子（インディアナ州フ
ィッシャーズのBangs Labs社）を含有している懸濁液の１０マイクロリットルと
混合した後に、この混合液を９６℃において３分間にわたり加熱し、その後、６
５℃に自然冷却して１０分間インキュベーションした。
【００９５】 微小粒子−固定化したＤＮＡプローブ 上記粒子に固定化したオリゴヌクレオチド・プローブは以下のシーケンスを有
している。 シーケンス認識番号６（SEQ ID NO:6） 5'-CTGCGTTAGA CCGAGAACTG TGGATAAAGG-3' 上記SEQ ID NO:6をその３’末端部分におけるビオチンの共有結合により修飾
した。このプローブを標準的な各プロトコルにより３．５マイクロメートルの直
径のストレプトアビジン−コーティングした粒子（Bangs Laboratories社）に対
して自然に結合させた。
【００９６】 ＤＮＡ染色 濃縮ピコグリーン蛍光色素の１：２００希釈液の５００μＬをハイブリッド形
成した目的物を含むビーズ懸濁液の２０μＬに混合して、この懸濁液を室温にお
いて最短で２分間にわたりインキュベーションすることによりＤＮＡ染色を行な
った。次に、各サンプルをCYTORONABSOLUTE（登録商標）フロー・サイトメータ
ーにより分析した。
【００９７】 結果 ＰＣＲ生成物をハイブリッド形成した目的物および粒子−固定化したオリゴヌ
クレオチドｄｓＤＮＡに結合したピコグリーンから得た平均チャンネル蛍光とし
て測定した。図６において、上記平均チャネル蛍光は３０工程後におけるＰＣＲ
工程数の増加に伴って増加して、ＰＣＲ増殖生成物の定量的な検出を示している
ことが分かる。
【００９８】 実施例７ レーザー走査サイトメトリー レーザー走査サイトメトリーは本発明の実施において使用できる。Compucyte
Laser Scanning Cytometer等のレーザー走査サイトメーターにおいて、光学検出
器が、例えば、顕微鏡スライドの表面上等の空間における一定の二次元表面にお
いて、通常において均一に、分散している物質を通過して移動する。このことは
粒子が一方向（１個の移動の流れにおいて一度に実質的に一方向）に検出器を通
過して移動するフロー・マイクロフルオリメトリー（微量蛍光定量法）と異なる
。
【００９９】 目的物に特異的なオリゴヌクレオチド・プローブを含む各粒子はレーザー走査
サイトメーター内において使用されている検出システムにより解像されるために
十分な大きさである必要がある。各粒子は好ましくは約０．３ミクロンよりも大
きいかこれに等しく、さらに好ましくは約１ミクロン乃至約５ミクロンである。
これらの粒子、目的の核酸を含むサンプル、およびｄｓＤＮＡへの結合時に検出
可能な蛍光を生じる化合物を混合して混合物を形成する。この混合物を十分に希
釈して各粒子の顕微鏡スライド上における均一な分散を可能にする。その後、レ
ーザー・スキャナーがこのスライドの上方を移動して、ハイブリッド形成した目
的物および粒子−固定化したオリゴヌクレオチドに結合している化合物からの検
出可能な蛍光の測定を開始するために上記粒子の光散乱および／または蛍光発光
を利用する。このレーザー走査サイトメーターは目的物に特異的な各粒子の特定
の光散乱および／または蛍光の特性により複数の異なる目的物に特異的な粒子を
識別する。
【０１００】 実施例８ ＤＮＡアレイ レーザー走査サイトメトリーおよびフロー・マイクロフルオリメトリーにおい
て、分析物の検出は空間的な解像に依存している。フロー・サイトメトリーにお
いて、解像は一次元的である。一方、レーザー走査サイトメトリーにおいては、
二次元的である。
【０１０１】 オリゴヌクレオチド・アレイを含むＤＮＡチップは二次元的な分離装置を代表
する。このようなアレイを調製するための方法はＰＣＴ国際公開第ＷＯ９８１８
９６１号および発明の背景の部分において記載した各米国特許において記載され
ている。
【０１０２】 動作において、一方向、すなわち、ｘ方向において一定の測定値の範囲ｘ１が
定められ、当該ｘ方向に対して直交する方向、すなわち、ｙ方向において一定の
測定値の範囲ｙ１が定められる。この場合にｘ１ｙ１として検出される各発生は
１個の特定の目的物−特異性のプローブに付随していると考えられる。同様に、
ｘ２ｙ２の各測定値は上記と同一の目的物または異なる目的物等に対応するプロ
ーブに付随すると考えられる。
【０１０３】 オリゴヌクレオチド・アレイを含むＤＮＡチップまたはスライドは、当業界に
おいて既知の各技法およびＰＣＴ国際公開第ＷＯ９８１８９６１号並びに本明細
書に記載した各米国特許において見られる各技法により、表面に対して直接的に
、または化学的リンカーまたはその他の固定化物質により間接的にオリゴヌクレ
オチドを付着および固定することにより調製できる。これらは１個のチップまた
はスライド上の異なるｘｙ（方向）の位置に固定化される。さらに、各ｘｙの位
置または点（スポット）は任意の望まれる目的の核酸に特異的に対応している。
定量の反復を行なうために単一の目的物に対して特異的な多数個の点（反復点）
をチップまたはスライド上に配置できる。任意の所望の数の目的物に特異的な点
および反復点を使用できる。好ましくは、上記チップまたはスライドは、各目的
物に対して、約５個乃至約２０個の目的物に特異的な点およびほぼ同数の反復点
を有しており、さらに好ましくは当該チップまたはスライドは約１００個乃至約
１０００個の目的物に特異的な点および約１０個乃至約１００個の反復点を有し
ている。このＤＮＡチップまたはスライドはサンプルおよびｄｓＤＮＡへの結合
時に検出可能な蛍光信号を生じる化合物に接触する。その後、各点から発生する
目的物に相関している蛍光、すなわち、このチップまたはスライド上の各特定の
ｘｙの位置が、例えば、レーザー走査装置により測定される。この蛍光信号は特
定の目的の核酸の存在または量に関係している。
【０１０４】 特に、ＤＮＡチップはSEQ ID NO.1に対して約１００個の目的物に特異的な位
置および約１０個の反復位置を有しており、これらのオリゴヌクレオチド・シー
ケンスはシリル化（silylated）したスライド（CEL Associates社）上に印刷さ
れている。各印刷点は直径が約１２５μｍであり、それぞれの中心から中心まで
３００μｍ離間している。また、約１０個の無関連のシーケンスに対する反復プ
ローブ（例えば、哺乳類動物のシーケンスを検出する場合の植物遺伝子に対する
プローブ）も各スライド上に印刷される。印刷したガラス・スライドは水素化ホ
ウ素ナトリウム溶液（０．０６６ＭのＮａＢＨ４、０．０６ＭのＮａＡＣ）によ
り処理されてプローブのスライドに対するアミノ結合を確実にする。その後、各
スライドを水中で２分間にわたり煮沸してｃＤＮＡを変性する。約３０個乃至約
３０，０００個の目的の核酸分子を含む生物材料を９９℃で５分間にわたり加熱
した後に、この場合には、ハイブリッド形成の前に冷却して、室温で５分間にわ
たり保持し、その後、各スライドに供給する。各スライドはガラス・カバー・ス
リップにより被覆されて、ＤＰＸ（Fluka社）によりシールされた後に、６０℃
で４時間乃至６時間にわたりハイブリッド形成が行なわれる。このハイブリッド
形成の終了時において、各スライドは室温まで冷却される。その後、各スライド
は１×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ中において５５℃で５分間にわたり洗浄され、さ
らに、０．１×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ中において５５℃で５分間にわたり洗浄
される。さらに、各スライドは濃縮ピコグリーン蛍光色素の１：２００希釈液に
対して全面を接触して、室温において最短で２分間にわたりインキュベーション
することにより染色される。０．１×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ中において速やか
にすすいだ後に、各スライドはエアーブロー乾燥処理されて走査の準備が整う。
各アレイはScanArray 3000（General Scanning社）によりピコグリーン色素の蛍
光について走査される。次に、ImaGene Software（Biodiscovery社）を定量化の
ために使用する。各点における強度はすぐ周囲のバックグラウンドを差し引くこ
とにより修正される。
【０１０５】 上記の蛍光信号は特定の目的の核酸の存在または量に関係しており、上記スラ
イドは各反復試験点から得た蛍光の平均値を統計学的な方法により無関連シーケ
ンスに対する各反復プローブから得た蛍光の平均値に対比しながら上記の定量の
１０回の反復処理を行なった。
【０１０６】 上記の各方法および処理を上記の各シーケンス認識番号SEQ ID NO.1、SEQ ID
NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5およびSEQ ID NO.6に対して約１
００個の目的物に特異的な位置および約１０個の反復位置を有するＤＮＡチップ
により繰り返した。
【０１０７】 実施例９ ＰＣＲ増殖生成物の検出：同質法 この実施例の目的は上記ＰＣＲ混合物におけるＩＰＣ−ＩＰビーズによるＰＣ
Ｒ熱工程を行なうことである。さらに、この熱工程に続いてＤＮＡ染色を行なっ
た。
【０１０８】 実施例６の各材料および各処理方法を採用し、以下に定める各条件、プライマ
ーおよびプローブを用いた。目的のＤＮＡ（１０回のコピー体）のSEQ ID NO.3
をＰＣＲ混合物における各成分、１０5 個のオリゴヌクレオチドが結合した１．
７ミクロンのビーズの０．２５マイクロリットルを含む適当なＰＣＲプロトコル
により１００マイクロリットルの容量で増殖する。使用したビーズは米国特許第
５，１４９，７３７号、同第５，２１０，２８９号および同第５，２７８，２６
７号において記載されているように調製したポリ［スチレン−コ（ｐ−ビニルベ
ンジルチオ）プロプリオン酸］の９５：５のモル比のビーズであり、ＤＮＡ結合
性の蛍光物質の適当な濃度は、この場合において、濃縮ピコグリーンの１：２０
０希釈液の５００マイクロリットルであり、これを上記熱工程に続いて添加した
。各増殖反応を実施例６のＰＣＲの諸条件において設定したが、１０5 個のオリ
ゴヌクレオチドが結合した微小粒子が上記混合物内に含まれていること、および
各ＰＣＲ工程の後にハイブリッド形成のための一定温度の工程が加わっているこ
とが異なる。
【０１０９】 その後、得られた混合物における増殖した目的のＤＮＡの存在を、例えば、CY
TORONABSOLUTE（登録商標）フロー・サイトメーターによるフロー・サイトメト
リーにより決定する。
【０１１０】 目的のＤＮＡ 以下のシーケンスを有する目的のＤＮＡをｐＵＣｌ８においてクローン化した
。 シーケンス認識番号（SEQ ID NO.3） 5'-CTGCAGGCGC CAGCGTGGAC CATCAAGTAG TAATGAACGC ACGGACGAGG ACATCATAGA GATTACACCT TTATCCACAG TTCTCGGTCT AACGCAG CAG TCAGTGTATC AGCACCAGCA TCCGTAGTGA GTCTTCAGTG TCTGCTCCAG GATCGTG GCG CTGCAG-3'
【０１１１】 増殖およびハイブリッド形成の反応 以下に定めたＰＣＲの各条件および各プライマーにより、上記SEQ ID NO.3に
おける下線部の各シーケンスをPE9600サーモサイクラーにおいて変更を加えた各
増殖プロトコル（工程１乃至工程５：９６℃で３０秒、６８℃で６０秒、工程６
乃至工程４０：９６℃で１５秒、６８℃で６０秒、工程４１：７２℃で５分、工
程４２：９６℃で３分、工程４３：５０℃で６０秒）により増殖した。 シーケンス認識番号（SEQ ID NO.4）（正プライマー） 5'-CGCCAGCGT GGACCATCA AGTAGTAA-3' シーケンス認識番号（SEQ ID NO.5）（逆プライマー） 5'-CACGATCCT GGAGCAGAC ACTGAAGA-3'
【０１１２】 上記粒子に固定化されているオリゴヌクレオチド・プローブは以下のシーケン
スを有している。 シーケンス認識番号（SEQ ID NO.6） 5'-CTGCGTTAG ACCGAGAAC TGTGGATAA AGG-3'
【０１１３】 上記SEQ ID NO.6を標準的な各プロトコルにより１マイクロメートルの直径の
ポリスチレン粒子の表面に対する供給結合により修飾する。
【０１１４】 ＤＮＡ染色 濃縮ピコグリーンの１：２００希釈液の５００μｌをハイブリッド形成および
増殖した目的物を含む上記において定めたＰＣＲビーズ懸濁液の２０μＬと混合
して、この懸濁液を室温で２分間にわたりインキュベーションすることによりＤ
ＮＡ染色を行なう。
【０１１５】 結果 上記のＰＣＲ生成物をハイブリッド形成した目的物および粒子−固定化したオ
リゴヌクレオチドのｄｓＤＮＡに結合したピコグリーンにより得られる平均チャ
ンネル蛍光として測定した。
【０１１６】 実施例１０ ＰＣＲ増殖生成物の検出：同質法 この実施例の目的はＰＣＲ混合物におけるビーズおよびＤＮＡ色素を伴うＰＣ
Ｒ熱工程を行なうことである。
【０１１７】 実施例９の各材料および各処理方法を採用したが、２．５マイクロリットルの
濃縮した熱安定性の色素（例えば、オレゴン州ユージーンのMolecular Probes社
のSYBR Green I色素）を熱工程の前に目的物を含有しているＰＣＲ懸濁液に加え
たことが異なる。なお、使用可能な別の熱安定性の色素は臭化エチジウムおよび
ヨウ化プロピジウムを含む。
【０１１８】 結果 上記のＰＣＲ生成物をハイブリッド形成した目的物および粒子−固定化したオ
リゴヌクレオチドのｄｓＤＮＡに結合したSYBR Green色素により得られる平均チ
ャンネル蛍光として測定した。
【０１１９】 実施例１１ ＰＣＲ増殖生成物の検出：同質法 この実施例の目的はＰＣＲ混合物内における熱安定性色素の存在下においてＰ
ＣＲ熱工程を行なうことである。この熱工程に続いてマイクロビーズを添加した
。
【０１２０】 図９の各材料および処理方法を採用し、２．５マイクロリットルの濃縮した熱
安定性のSYBR Green色素を熱工程の前に上記ＰＣＲ目的物懸濁液に添加した。な
お、使用可能な別の熱安定性の色素は臭化エチジウムおよびヨウ化プロピジウム
を含む。
【０１２１】 ＤＮＡハイブリッド結合 上記熱工程に続いて、２×ハイブリッド形成緩衝液（０．３Ｍの塩化カリウム
、０．０２ＭのＴｒｉｓおよび２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．３）中に懸濁した１
０5 個のオリゴヌクレオチドが結合した微小粒子（１ミクロン乃至１０ミクロン
の粒度）の１０マイクロリットルを上記増殖した生成物−色素の混合物の１０マ
イクロリットルに添加して、９６℃で３分間にわたり加熱した後に、６５℃に自
然冷却してそのままハイブリッド形成させた。
【０１２２】 分析 上記ハイブリッド形成した各サンプルに５００μＬの１ｍＭのＴｒｉｓおよび
１０ｍＭのＥＤＴＡを補充して、例えば、CYTORONABSOLUTE（登録商標）フロー
・サイトメーターにより分析する。
【０１２３】 結果 上記のＰＣＲ生成物をハイブリッド形成した目的物および粒子−固定化したオ
リゴヌクレオチドのｄｓＤＮＡに結合したSYBR Green色素により得られる平均チ
ャンネル蛍光として測定した。
【０１２４】 以上において、本発明の特定の好ましい各実施形態に基づいて詳細に説明した
。しかしながら、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく種々の変形およ
び変更を行なうことが可能であることが当然に理解されると考える。なお、本明
細書において引用した各特許、特許出願、および非特許の開示の全ての内容全体
が明らかに本明細書に参考文献として含まれる。
【０１２５】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 粒子に固定化したオリゴヌクレオチドに対してハイブリッド形成した目的の核
酸のハイブリッド形成および検出を示している概略図である。
【図２】 Ａは、ＣＴＤＮＡの存在下における、チアゾール・オレンジを目的のＤＮＡの
指示薬としての、前方角度の光散乱（ＦＷ−ＳＣ）対直角の光散乱（ＲＴ−ＳＣ
）（粒度選択）のプロット図であり、目的のＤＮＡは存在しなかった。Ｂは、過
剰のＣＴＤＮＡにおける１０００フェムトモルの目的のＤＮＡの場合の、チアゾ
ール・オレンジを目的のＤＮＡの指示薬としての、前方角度対直角の光散乱（粒
度選択）のプロット図である。Ｃは、ＣＴＤＮＡの存在下における、チアゾール
・オレンジを目的のＤＮＡの指示薬としての、前方角度の光散乱対緑色蛍光（Ｇ
Ｒ−ＦＬ）のプロット図であり、目的のＤＮＡは存在しなかった。Ｄは、過剰の
ＣＴＤＮＡにおける１０００フェムトモルの目的のＤＮＡの場合の、チアゾール
・オレンジを目的のＤＮＡの指示薬としての、前方角度の光散乱対緑色蛍光のプ
ロット図である。Ｅは、ＣＴＤＮＡの存在下における、チアゾール・オレンジを
目的のＤＮＡの指示薬としての、発生数の分布対緑色蛍光のプロット図であり、
目的のＤＮＡは存在しなかった。Ｆは、過剰のＣＴＤＮＡにおける１０００フェ
ムトモルの目的のＤＮＡの場合の、発生数の分布対緑色蛍光のプロット図である
。
【図３】 二本鎖の目的のＤＮＡにおける平均緑色蛍光対コピー数のプロット図である。
【図４】 粒子に結合した目的の核酸のヌクレアーゼ保護および検出の概略図を示してい
る。
【図５】 平均のチャンネル・オレンジ蛍光（ストレプトアビジン共役型Ｒ−フィコエリ
スリンにより染色されている、ビーズ上に捕捉されているヌクレアーゼ保護した
ｄｓＤＮＡ）対二本鎖の目的のＤＮＡのコピー数のプロット図である。
【図６】 平均のチャンネル蛍光対ＰＣＲ増殖工程数のプロット図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 コネリー・マーク・シー アメリカ合衆国、18901 ペンシルベニア 州、ドイルスタウン、ブルー・リッジ・ド ライブ 4451 (72)発明者 セリノ・ジャーマン アルゼンチン国、ブエノスアイレス、ベカ ー（ビー1643シーブイイー） 1541、ジェ イビー・デ・ラサレ (72)発明者 メルコリーノ・トーマス・ジェイ アメリカ合衆国、08559−1910 ニュージ ャージー州、ストックトン、ランバートビ ル・ヘッドクオーターズ・ロード 121 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA01 CA11 HA12 4B063 QA13 QQ42 QQ52 QR56 QR58 QR82 QS34 QS39 QX02

Claims (32)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 目的の核酸の存在および量を決定するための方法において、 （Ａ）（ｉ）目的の核酸、および （ｉｉ）前記目的の核酸の少なくとも一部分に対して相補的な核酸シーケンス
    を含むオリゴヌクレオチドを固定化した基質を含む混合物を形成する工程、 （Ｂ）前記基質または基質に固定化したオリゴヌクレオチドに相関している一
    定のパラメータの値を決定する工程、および （Ｃ）前記目的の核酸の存在および量の測定値として前記基質に固定化したオ
    リゴヌクレオチドに対してハイブリッド形成している目的の核酸に相関している
    信号を決定する工程を含む方法。
  2. 【請求項２】 複数の異なる目的の核酸の存在および量を決定するための方
    法において、 （Ａ）（ｉ）複数の目的の核酸、および （ｉｉ）１個の目的物に特異的なオリゴヌクレオチドが１個の個別の目的物の
    核酸の少なくとも一部分に対して相補的な核酸シーケンスを含む１種類以上の目
    的物に特異的なオリゴヌクレオチドを固定化した基質の混合物を形成する工程、 （Ｂ）前記基質または基質に固定化した目的物に特異的なオリゴヌクレオチド
    に相関している一定のパラメータの値を決定する工程、および （Ｃ）前記目的の核酸の存在および量の測定値として前記基質に固定化した目
    的物に特異的なオリゴヌクレオチドに対してハイブリッド形成している個別の目
    的の核酸に相関している信号を決定する工程を含む方法。
  3. 【請求項３】 目的の核酸の存在および量を決定するための方法において、 （Ａ）（ｉ）目的の核酸、および （ｉｉ）前記目的の核酸の少なくとも一部分に対して相補的な核酸シーケンス
    を含むオリゴヌクレオチドを固定化した粒子を含み、当該粒子が、 （ａ）約２００ｎｍよりも長いかこれに等しい波長の電磁放射線を散乱するこ
    とが可能であるか、または （ｂ）当該粒子に相当する別個の蛍光信号を生成できる第１の化合物または複
    数の化合物を含むか、または、 （ｃ）約２００ｎｍよりも長いかこれに等しい波長の電磁放射線を散乱するこ
    とが可能であり、且つ、当該粒子に相当する別個の蛍光信号を生成できる第１の
    化合物または複数の化合物を含み、さらに、 （ｉｉｉ）二本鎖核酸に結合可能であり、当該二本鎖核酸に結合した時に検出
    可能な蛍光信号を生成する第２の化合物を含む混合物を形成する工程を含み、随
    意的に、 （Ｂ）前記混合物を加熱して二本鎖核酸を変性した後に当該混合物を冷却して
    前記目的の核酸を前記固定化したオリゴヌクレオチドに対してハイブリッド形成
    可能にする工程、 （Ｃ）蛍光を検出可能であり、随意的に、散乱した電磁放射線を検出可能な検
    出装置に対して前記混合物を曝露する工程、 （Ｄ）前記粒子の散乱した電磁放射線または前記第１の化合物または複数の化
    合物の蛍光、またはこれらの両方を検出する工程、および （Ｅ）前記ハイブリッド形成した目的の核酸および固定化したオリゴヌクレオ
    チドに結合している前記第２の化合物の蛍光信号を前記目的の核酸の存在または
    量の測定値として検出する工程を含む方法。
  4. 【請求項４】 前記検出装置がフロー・サイトメーター、走査型サイトメー
    ター、または蛍光顕微鏡である請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】 複数の個別の目的の核酸の存在または量を決定するための方
    法において、 （Ａ）（ｉ）複数の目的の核酸、および （ｉｉ）目的物に特異的な粒子を含み、この場合において、目的物に特異的な
    粒子は当該粒子に対して１個の個別の目的の核酸の少なくとも一部分に対して相
    補的な核酸シーケンスを含むオリゴヌクレオチドが固定化されており、各粒子が
    それぞれ独立して、 （ａ）約２００ｎｍよりも長いかこれに等しい波長の電磁放射線を散乱するこ
    とが可能であるか、または （ｂ）当該粒子に相当する個別の蛍光信号を生成できる個別の第１の化合物ま
    たは複数の化合物を含むか、または、 （ｃ）約２００ｎｍよりも長いかこれに等しい波長の電磁放射線を散乱するこ
    とが可能であり、且つ、当該粒子に相当する個別の蛍光信号を生成できる個別の
    第１の化合物または複数の化合物を含み、さらに （ｉｉｉ）二本鎖核酸に結合可能であり、当該二本鎖核酸に結合した時に検出
    可能な光学的信号を生成する化合物を含む混合物を形成する工程を含み、随意的
    に、 （Ｂ）前記混合物を加熱して二本鎖核酸を変性した後に当該混合物を冷却して
    前記目的の核酸を前記固定化したオリゴヌクレオチドに対してハイブリッド形成
    可能にする工程、 （Ｃ）蛍光を検出可能であり、随意的に、散乱した電磁放射線を検出可能な検
    出装置に対して前記混合物を曝露する工程、 （Ｄ）前記粒子の散乱した電磁放射線または各粒子の前記第１の化合物または
    複数の化合物の蛍光、またはこれらの両方を検出する工程、および （Ｅ）前記ハイブリッド形成した目的の核酸および固定化したオリゴヌクレオ
    チドに結合している前記第２の化合物の蛍光信号を前記目的の核酸の存在または
    量の測定値として検出する工程を含む方法。
  6. 【請求項６】 前記検出装置がフロー・サイトメーター、走査型サイトメー
    ター、または蛍光顕微鏡である請求項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】 目的の核酸の存在または量を決定するための方法において、 （Ａ）（ｉ）目的の核酸、および （ｉｉ）前記目的の核酸の少なくとも一部分に対して相補的な核酸シーケンス
    を含むオリゴヌクレオチドが固定化されている粒子を含む混合物を形成する工程
    を含み、前記オリゴヌクレオチドがリガンドを含み、前記粒子が、 （ａ）約２００ｎｍよりも長いかこれに等しい波長の電磁放射線を散乱するこ
    とが可能であるか、または （ｂ）当該粒子に相当する個別の蛍光信号を生成できる個別の第１の化合物ま
    たは複数の化合物を含むか、または、 （ｃ）約２００ｎｍよりも長いかこれに等しい波長の電磁放射線を散乱するこ
    とが可能であり、且つ、当該粒子に相当する個別の蛍光信号を生成できる個別の
    第１の化合物または複数の化合物を含み、随意的に、 （Ｂ）前記混合物を加熱して二本鎖核酸を変性した後に当該混合物を冷却して
    前記目的の核酸を前記固定化したオリゴヌクレオチドに対してハイブリッド形成
    可能にする工程、 （Ｃ）前記混合物を一本鎖または二本鎖に特異的なエンドヌクレアーゼに対し
    て接触させる工程、 （Ｄ）前記工程（Ｃ）の混合物を蛍光発光可能であり前記リガンドに対して結
    合可能である第２の化合物に対して接触させる工程、 （Ｅ）蛍光を検出可能であり、随意的に、散乱した電磁放射線を検出可能な検
    出装置に対して前記混合物を曝露する工程、 （Ｆ）前記粒子の散乱した電磁放射線または前記第１の化合物または複数の化
    合物の蛍光、またはこれらの両方を検出する工程、および （Ｇ）前記リガンドに結合している前記第２の化合物の蛍光信号を前記目的の
    核酸の存在または量の測定値として測定する工程を含む方法。
  8. 【請求項８】 前記検出装置がフロー・サイトメーター、走査型サイトメー
    ター、または蛍光顕微鏡である請求項７に記載の方法。
  9. 【請求項９】 複数の個別の目的の核酸の存在または量を決定するための方
    法において、 （Ａ）（ｉ）複数の目的の核酸、および （ｉｉ）目的物に特異的な粒子を含み、この場合において、目的物に特異的な
    粒子は当該粒子に対して１個の個別の目的の核酸の少なくとも一部分に対して相
    補的な核酸シーケンスを含むオリゴヌクレオチドが固定化されており、当該オリ
    ゴヌクレオチドがリガンドを含み、前記各粒子がそれぞれ独立して、 （ａ）約２００ｎｍよりも長いかこれに等しい波長の電磁放射線を散乱するこ
    とが可能であるか、または （ｂ）当該粒子に相当する個別の蛍光信号を生成できる個別の第１の化合物ま
    たは複数の化合物を含むか、または、 （ｃ）約２００ｎｍよりも長いかこれに等しい波長の電磁放射線を散乱するこ
    とが可能であり、且つ、当該粒子に相当する個別の蛍光信号を生成できる個別の
    第１の化合物または複数の化合物を含み、さらに （ｉｉｉ）二本鎖核酸に結合可能であり、当該二本鎖核酸に結合した時に検出
    可能な光学的信号を生成する化合物を含む混合物を形成する工程を含み、随意的
    に、 （Ｂ）前記混合物を加熱して二本鎖核酸を変性した後に当該混合物を冷却して
    前記目的の核酸を前記固定化したオリゴヌクレオチドに対してハイブリッド形成
    可能にする工程、 （Ｃ）前記混合物を一本鎖または二本鎖に特異的なエンドヌクレアーゼに対し
    て接触させる工程、 （Ｄ）前記工程（Ｃ）の混合物を蛍光発光可能であり前記リガンドに対して結
    合可能である第２の化合物に対して接触させる工程、 （Ｅ）蛍光を検出可能であり、随意的に、散乱した電磁放射線を検出可能な検
    出装置に対して前記工程（Ｄ）の混合物を曝露する工程、 （Ｆ）前記各粒子の散乱した電磁放射線または当該各粒子の前記第１の化合物
    または複数の化合物の蛍光、またはこれらの両方を検出する工程、および （Ｇ）前記リガンドに結合している前記第２の化合物の蛍光信号を前記目的の
    核酸の存在または量の測定値として測定する工程を含む方法。
  10. 【請求項１０】 前記検出装置がフロー・サイトメーター、走査型サイトメ
    ーター、または蛍光顕微鏡である請求項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 目的の核酸の存在または量を決定するための方法において
    、 （Ａ）（ｉ）目的の核酸、および （ｉｉ）前記目的の核酸の少なくとも一部分に対して相補的な核酸シーケンス
    を含むオリゴヌクレオチドが固定化されている粒子を含む混合物を形成する工程
    を含み、前記オリゴヌクレオチドが蛍光発光可能な第２の化合物を含み、前記粒
    子またはオリゴヌクレオチドが当該オリゴヌクレオチドの前記目的の核酸に対す
    るハイブリッド形成の前に前記第２の化合物の蛍光を消光するために当該第２の
    化合物に十分に近接して蛍光消光性の化合物を含み、前記粒子が、 （ａ）約２００ｎｍよりも長いかこれに等しい波長の電磁放射線を散乱するこ
    とが可能であるか、または （ｂ）当該粒子に相当する個別の蛍光信号を生成できる第１の化合物または複
    数の化合物を含むか、または、 （ｃ）約２００ｎｍよりも長いかこれに等しい波長の電磁放射線を散乱するこ
    とが可能であり、且つ、当該粒子に相当する個別の蛍光信号を生成できる個別の
    第１の化合物または複数の化合物を含み、随意的に、 （Ｂ）前記混合物を加熱して二本鎖核酸を変性した後に当該混合物を冷却して
    前記目的の核酸を前記固定化したオリゴヌクレオチドに対してハイブリッド形成
    可能にする工程、 （Ｃ）蛍光を検出可能であり、随意的に、散乱した電磁放射線を検出可能な検
    出装置に対して前記混合物を曝露する工程、 （Ｄ）前記粒子の散乱した電磁放射線または前記第１の化合物または複数の化
    合物の蛍光、またはこれらの両方を検出する工程、および （Ｅ）前記第２の化合物の蛍光信号を前記目的の核酸の存在または量の測定値
    として測定する工程を含む方法。
  12. 【請求項１２】 前記検出装置がフロー・サイトメーター、走査型サイトメ
    ーター、または蛍光顕微鏡である請求項１１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 複数の個別の目的の核酸の存在または量を決定するための
    方法において、 （Ａ）（ｉ）複数の目的の核酸、 （ｉｉ）目的物に特異的な粒子を含み、この場合において、目的物に特異的な
    粒子は当該粒子に１個の個別の目的の核酸の少なくとも一部分に対して相補的な
    核酸シーケンスを含むオリゴヌクレオチドが固定化されており、当該オリゴヌク
    レオチドが蛍光発光可能な第２の化合物を含み、前記粒子またはオリゴヌクレオ
    チドが当該オリゴヌクレオチドの前記目的の核酸に対するハイブリッド形成の前
    に前記第２の化合物の蛍光を消光するために当該第２の化合物に十分に近接して
    蛍光消光性の化合物を含み、前記粒子がそれぞれ独立して、 （ａ）約２００ｎｍよりも長いかこれに等しい波長の電磁放射線を散乱するこ
    とが可能であるか、または （ｂ）当該粒子に相当する個別の蛍光信号を生成できる第１の化合物または複
    数の化合物を含むか、または、 （ｃ）約２００ｎｍよりも長いかこれに等しい波長の電磁放射線を散乱するこ
    とが可能であり、且つ、当該粒子に相当する個別の蛍光信号を生成できる個別の
    第１の化合物または複数の化合物を含み、さらに （ｉｉｉ）二本鎖核酸に結合可能であり、当該二本鎖核酸に結合した時に検出
    可能な光学的信号を生成する化合物を含む混合物を形成する工程を含み、随意的
    に、 （Ｂ）前記混合物を加熱して二本鎖核酸を変性した後に当該混合物を冷却して
    前記目的の核酸を前記固定化したオリゴヌクレオチドに対してハイブリッド形成
    可能にする工程、 （Ｃ）蛍光を検出可能であり、随意的に、散乱した電磁放射線を検出可能な検
    出装置に対して前記混合物を曝露する工程、 （Ｄ）前記粒子の散乱した電磁放射線または前記第１の化合物または複数の化
    合物の蛍光、またはこれらの両方を検出する工程、および （Ｅ）前記第２の化合物の蛍光信号を前記各個別の目的の核酸の存在または量
    の測定値として検出する工程を含む方法。
  14. 【請求項１４】 前記検出装置がフロー・サイトメーター、走査型サイトメ
    ーター、または蛍光顕微鏡である請求項１３に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 同一または別々の容器内において構成されている目的の核
    酸を検出するためのキットにおいて、 （１）粒子を含み、当該粒子は、 （ａ）約２００ｎｍよりも長いかこれに等しい波長の電磁放射線を散乱するこ
    とができるか、または （ｂ）当該粒子に相当する蛍光信号を生成できる一定の化合物または複数の化
    合物を含むか、または （ｃ）約２００ｎｍよりも長いかこれに等しい波長の電磁放射線を散乱するこ
    とが可能であり、且つ、当該粒子に相当する蛍光信号を生成できる一定の化合物
    または複数の化合物を含み、さらに、 （２）上記目的の核酸の少なくとも一部分に対して相補的な核酸シーケンスを
    含むオリゴヌクレオチド、および （３）二本鎖核酸に対して結合可能であり、当該核酸に結合する時または結合
    している時に検出可能な信号を生成できる化合物を含むキット。
  16. 【請求項１６】 同一または別々の容器内において構成されている目的の核
    酸を検出するためのキットにおいて、 （１）粒子を含み、当該粒子は、 （ａ）約２００ｎｍよりも長いかこれに等しい波長の電磁放射線を散乱するこ
    とができるか、または （ｂ）当該粒子に相当する蛍光信号を生成できる一定の化合物または複数の化
    合物を含むか、または （ｃ）約２００ｎｍよりも長いかこれに等しい波長の電磁放射線を散乱するこ
    とが可能であり、且つ、当該粒子に相当する蛍光信号を生成できる一定の化合物
    または複数の化合物を含み、さらに、 （２）前記目的の核酸の少なくとも一部分に対して相補的な核酸シーケンスを
    含むオリゴヌクレオチドを含み、当該オリゴヌクレオチドがリガンドを含み、さ
    らに、 （３）一本鎖に特異的なエンドヌクレアーゼ、および （４）蛍光発光可能であり、上記リガンドに対して結合可能な化合物を含むキ
    ット。
  17. 【請求項１７】 同一または別々の容器内において構成されている目的の核
    酸を検出するためのキットに関し、このキットは、 （１）粒子を含み、当該粒子は、 （ａ）約２００ｎｍよりも長いかこれに等しい波長の電磁放射線を散乱するこ
    とができるか、または （ｂ）当該粒子に相当する蛍光信号を生成できる一定の化合物または複数の化
    合物を含むか、または （ｃ）約２００ｎｍよりも長いかこれに等しい波長の電磁放射線を散乱するこ
    とが可能であり、且つ、当該粒子に相当する蛍光信号を生成できる一定の化合物
    または複数の化合物を含み、さらに、 （２）オリゴヌクレオチドを含み、当該オリゴヌクレオチドが、 （ａ）前記目的の核酸の少なくとも一部分に対して相補的な核酸シーケンス、 （ｂ）蛍光発光可能な第１の化合物、および （ｃ）前記第１の化合物の蛍光を消光可能な第２の化合物を含むキット。
  18. 【請求項１８】 生物サンプルの増殖した核酸シーケンスを検出するための
    方法において、 前記核酸シーケンスを含む生物サンプルに微小粒子、熱安定性の蛍光物質、お
    よび熱安定性のポリメラーゼを混合する工程、 前記ポリメラーゼの連鎖反応により前記核酸の選択したセグメントを増殖する
    工程、および 前記核酸シーケンスを検出する工程を含む方法。
  19. 【請求項１９】 前記熱安定性の蛍光物質がＳＹＢＲグリーンＩ、臭化エチ
    ジウムおよびヨウ化プロピジウムから成る群から選択される請求項１８に記載の
    方法。
  20. 【請求項２０】 前記熱安定性の蛍光物質がＳＹＢＲグリーンＩである請求
    項１９に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 生物サンプルの増殖した核酸シーケンスを検出するための
    方法において、 前記核酸シーケンスを含む生物サンプルに微小粒子および熱安定性のポリメラ
    ーゼを混合する工程、 前記ポリメラーゼの連鎖反応により前記核酸の選択したセグメントを増殖する
    工程、 前記工程（ｂ）の増殖した生成物に一定の蛍光物質を混合する工程、および 前記核酸シーケンスを検出する工程を含む方法。
  22. 【請求項２２】 前記蛍光物質が濃縮ピコグリーン、ＳＹＢＲグリーンＩ、
    臭化エチジウムおよびヨウ化プロピジウムから成る群から選択される請求項２１
    に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 前記蛍光物質が濃縮ピコグリーンである請求項２２に記載
    の方法。
  24. 【請求項２４】 生物サンプルの増殖した核酸シーケンスを検出するための
    方法において、 前記核酸シーケンスを熱安定性のポリメラーゼの存在下に当該ポリメラーゼの
    連鎖反応により増殖する工程、 前記工程（ａ）の増殖した生成物を蛍光物質および微小粒子に混合する工程、
    および 前記核酸シーケンスを検出する工程を含む方法。
  25. 【請求項２５】 前記蛍光物質が濃縮ピコグリーン、ＳＹＢＲグリーンＩ、
    臭化エチジウムおよびヨウ化プロピジウムから成る群から選択される請求項２４
    に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 前記蛍光物質が濃縮ピコグリーンである請求項２５に記載
    の方法。
  27. 【請求項２７】 １種類以上の特定の目的のシーケンスの存在または量を決
    定するために有用な目的物に特異的な位置および反復位置を含むオリゴヌクレオ
    チド・アレイを備えているＤＮＡチップ。
  28. 【請求項２８】 約５個乃至約２０個の目的物に特異的な位置および約５個
    乃至約２０個の反復位置を含む請求項２７に記載のＤＮＡチップ。
  29. 【請求項２９】 各目的物に対して約１００個乃至約１０００個の目的物に
    特異的な位置および約１０個乃至約１００個の反復位置を含む請求項２７に記載
    のＤＮＡチップ。
  30. 【請求項３０】 ＤＮＡチップにより１種類以上の目的のＤＮＡシーケンス
    を検出する方法において、 （ａ）検出する１種類以上の目的のシーケンスに対応する１種類以上のオリゴ
    ヌクレオチドが固定されているＤＮＡチップを１種類以上の目的のシーケンスお
    よび蛍光物質を含むサンプルに接触させる工程、および （ｂ）前記１種類以上の目的のシーケンスの存在または量を検出する工程を含
    む方法。
  31. 【請求項３１】 前記蛍光物質がアクリジン・オレンジ、ヨウ化プロピジウ
    ム、臭化エチジウム、ミトラマイシン、クロモマイシン、オリボマイシン、Hoec
    hst H33258、Hoechst H33342、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニル
    インドール）、TOPRO、TOTO、YOPRO、YOYO、SYBR GREEN I、およびピコグリーン
    から成る群から選択される請求項３０に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 前記蛍光物質が好ましくはピコグリーンである請求項３１
    に記載の方法。
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