CN1312287C - 核酸的检测 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了与固定在颗粒性支持物和非颗粒性支持物上的寡核苷酸探针杂交的靶核酸的均相多重测定。采用根据所述颗粒的光散射或荧光特性能够辨别颗粒的检测方法如流式细胞计量方法，或者通过空间分辨固定在支持物特定点阵上的寡核苷酸，从而测定靶核酸。测定源自与所述支持物-固定的寡核苷酸杂交的靶核酸的靶相关性荧光信号，从而测量所述靶核酸的存在或含量。

Description

核酸的检测
发明领域
本发明涉及核酸的检测。更准确地说，本发明涉及采用支持物-固定的寡核苷酸并且提供与所述支持物或支持物-固定的寡核苷酸相关性可检测信号以及与其杂交的靶核酸相关性可检测信号的方法来检测靶核酸。
发明背景
核酸的检测广泛用来测定特定基因、已知序列的存在和拷贝数，以及用来鉴定和定量临床样品和环境样品中的病毒、原核病原体和真核病原体。核酸的一个重要特征是其与具有互补核苷酸序列的核酸形成序列特异性氢键的能力。核酸与核酸的互补链杂交的这种能力已经有利地用于被称为杂交分析和DNA纯化技术中。
在杂交分析中，使用具有已知序列的核酸作为与具有互补核酸序列的靶核酸杂交的探针。标记所述探针使得可以检测杂交体，相应地检测所述靶核酸。
分析测定取决于产生理想为均相形式的可检测信号分析物相关性变化。可均相同时测定多种靶核酸(多重性)的分析系统是最理想的。没有这类系统用于核酸分析。
采用芯片上的DNA阵列检测靶核酸的方法代表本领域一个显着进步。这种方法在美国专利5,856,101、5,837,832、5,658,802和5,571,639中有介绍。
流式细胞仪已经作为微粒分析仪用于基于多种颗粒的测定中(Fulwyler等，Methods Cell Biology，第二版，Academic Press，第33卷，613(1990)，McHugh，Methods Cell Biology，第二版，Academic Press，第42卷，575(1994)，McHugh等，Cytometry 29，106(1997))。一般而言，应用微米大小的球形颗粒(微珠)作为固相，该固相用作荧光信号源，所述荧光信号的强度随分析物的浓度而变化。当颗粒通过多参数检测器送到单储存器，通过流式细胞仪逐一分析所述颗粒时，所述荧光信号被检测出来。当对大小或荧光强度(或两者的组合)彼此不同的粒进行差别测定时，每种荧光强度或大小代表一种不同的测定。微球体的荧光标记允许多容量高达512种同时不同的测定(Chandler等，ISAC XIX International Congress；Colorado Springs，Colorado USA，1998年2月28日至3月5日)。流式细胞计量颗粒测定是潜在的均相测定，因为信号连同触发颗粒事件一起被记录下来。所述仪器会略去与触发颗粒事件无关的信号，否则会干扰所述测定。
采用流式细胞术对DNA片段按大小进行分辨的方法在以下文献中有介绍：Castro等，Anal Chem 65，849(1993)，Goodwin等，NucleicAcids Res 21，803(1993)，Petty等，Anal Chem 67，1755(1995)和美国专利第5,558,998号。能够发荧光的化合物(荧光团或荧光剂)以及能够与DNA片段化学计量性结合的化合物随着所述DNA片段逐一流经流式细胞仪的检测器时产生可检测信号。激光束在特定波长激发荧光团，然后测量所发射的荧光，由于脉冲强度与结合DNA片段的荧光团分子的数目成正比，因此，也与所述片段的长度成正比。然而，该方法需要检测和记录所有的信号事件，而不是检测和记录恰好与触发事件相关的信号事件。此外，该方法不提供序列信息或基因身份，仅仅提供所述片段的相对大小。另外，该方法也不能作为一种均相方法。
根据标记探针和靶与寡核苷酸微珠组(bead-set)竟争结合，采用流式细胞术检测DNA序列的方法在以下文献中有介绍：Fulton的美国专利5,736,330(′330专利)，还有Spain，IVD Technology Magazine(1998)，和McDade等，Medical Device & Diagnostic Industry Magazine(1997)。
根据双链DNA与连接微珠的嵌入剂的结合，通过流式细胞计量荧光检测测定双链DNA的方法在Bieniarx等的美国5,582,984(′984专利)中有介绍。
′330专利介绍了本领域一个有用的进步；然而，对于不同的DNA靶，它需要应用不同的标记探针，并且采用间接竞争性结合方法来检测靶，而不是采用更为先进的直接结合方法来检测靶。
′984专利介绍的方法可用来检测双链DNA的存在，但是不能检测具体的靶核酸。嵌入染料不存在于溶液中，而是与微珠连接；信号强度有限，由于多个染料分子不能自由与一个双链DNA分子结合所致。
用于测定靶核酸的这些现有技术和其它现有技术的方法已得到广泛认可和利用。然而，仍需要特异性、定量、均相、快速、能够自动化的方法，使得可以测定多种靶核酸并对其进行鉴定。理想的是，这样的方法也足够灵敏，使得当靶以多拷贝存在时，不需要扩增靶或者仅需要次数较少的扩增循环。
发明概述
本发明满足了上述需求。
一方面，本发明涉及测定一种靶核酸存在或含量的方法，所述方法包括以下步骤：
A)生成包含以下成分的混合物
i)所述靶核酸，和
ii)一种寡核苷酸固定在其上的支持物，所述寡核苷酸包含与所述靶核酸的至少一部分互补的核酸序列；
B)测定与所述支持物或支持物-固定寡核苷酸相关的参数值；和
C)测定与所述支持物-固定寡核苷酸杂交的靶核酸相关的信号，作为所述靶核酸存在或含量的度量。
另一方面，本发明涉及测定多种不同的靶核酸存在或含量的方法，所述方法包括：
A)生成包含以下成分的混合物
i)所述多种靶核酸，和
ii)一种或多种靶特异性寡核苷酸固定的其上的支持物，其中一种靶特异性寡核苷酸包含与一种不同的靶核酸的至少一部分互补的核酸序列；
B)测定与所述支持物或支持物-固定的靶特异性寡核苷酸相关的参数值；和
C)测定与所述支持物-固定的靶特异性寡核苷酸杂交的不同靶核酸相关的信号，作为所述靶核酸存在或含量的度量。
另一方面，本发明涉及测定一种靶核酸存在或含量的方法，所述方法包括以下步骤：
A)生成包含以下成分的混合物
i)所述靶核酸，和
ii)一种寡核苷酸固定在其上的颗粒，所述寡核苷酸包含与所述靶核酸的至少一部分互补的核酸序列，其中所述颗粒
a)能够散射波长大于或等于约200nm的电磁辐射，或
b)包含能够产生对应于所述颗粒的荧光信号的一种第一化合物或多种化合物，或
c)能够散射波长大于或等于约200nm的电磁辐射并且包含能够产生对应于所述颗粒的荧光信号的一种第一化合物或多种化合物。
可以将所述混合物任选加热至使双链核酸变性，然后冷却至让所述靶核酸与所述固定寡核苷酸杂交，或者，如有需要，可以在与固定寡核苷酸混合之前使靶核酸变性。
所述方法包括产生与杂交靶和固定寡核苷酸探针相关的可检测信号、最好是诸如荧光的光学信号的步骤。在一个实施方案中，将能够与双链核酸结合并且当与其结合时产生可检测荧光信号的第二化合物与所述混合物混合。在一个不同的实施方案中，所述寡核苷酸可以(但不是必须)与能够发荧光的第二化合物连接，然后将所述混合物与一种单链特异性内切核酸酶接触。在另一个实施方案中，所述寡核苷酸或所述支持物包含能够发荧光的第二化合物。另外，所述支持物或寡核苷酸包含足够接近所述第二化合物的一种荧光猝灭化合物，以在靶核酸与所述固定寡核苷酸杂交之前猝灭所述第二化合物的荧光。在另一个实施方案中，与微珠连接的寡核苷酸包含或能够包含代表已知的限制性内切核酸酶靶位点的一个互补序列的序列。让样品或扩增核酸序列在能够切割所述位点的一种限制性内切核酸酶存在下与结合在颗粒上的寡核苷酸杂交。任选的是，可以稍后加入所述限制性内切核酸酶。如果存在合适的靶核酸，则由于异源双链体的形成而形成完整限制位点，并且所述限制性酶切割所述核酸，从所述颗粒释放全部或部分标记双链序列。这减少或消除了与该特定触发事件相关的核酸特异性荧光信号。
采用用来产生可检测信号或与固定寡核苷酸探针杂交的靶相关的信号变化的任一上述实施方案，在颗粒支持物的情况下，将所述混合物暴露于或送进能够检测来自所述颗粒的散射电磁辐射或来自第一化合物或多种其它化合物的荧光、或者检测散射和荧光两者的装置或仪器中，从而将颗粒与背景区分开来。也检测来自第二化合物的荧光信号，即靶相关荧光，反映所述靶核酸的存在或含量。
在实施本发明时可以使用能够通过检测颗粒相关散射和/或荧光，将颗粒与背景区分开来以及将一种靶特异性颗粒与其它颗粒区分开来的任何颗粒分析方法或装置，并且所述方法或装置能够检测靶相关信号。优选激光流式细胞计量方法。可用于实施本发明的激光流式细胞仪是Ortho-Clinical Diagnostics，Inc.，Raritan，NJ的ORTHOCYTORONABSOLUTE_流式细胞仪。也可以使用荧光显微镜检方法和装置。也可以使用激光扫描方法和装置，例如Compucyte Corporation，Cambridge，MA的Compucyte激光扫描细胞仪。可以使用允许空间分辨支持物-固定寡核苷酸的多种方法；激光扫描方法是特别适合的方法。如上所述，也可以使用能够将颗粒与背景区分开来并且能够辨别来自靶特异性颗粒的散射或荧光信号、并且能够检测靶相关信号的方法和装置，所述方法和装置不依赖于各种颗粒的物理分离。
另一方面，本发明涉及测定多种不同的靶核酸存在或含量的方法，所述方法包括：
A)生成包含以下组分的混合物
i)所述靶核酸，和
ii)多种靶特异性颗粒，其中一种靶特异性颗粒上固定有包含与一种不同的靶核酸的至少一部分互补的核酸序列的寡核苷酸，其中每种颗粒独立地
a)能够散射波长大于或等于约200nm的电磁辐射，或
b)包含能够产生对应于所述颗粒的不同荧光信号的一种不同的第一化合物或多种其它化合物，或
c)能够散射波长大于或等于约200nm的电磁辐射并且包含能够产生对应于所述不同颗粒的不同荧光信号的一种不同的第一化合物或多种其它化合物。
如上所讨论，可以将所述混合物任选加热至使双链核酸变性，然后冷却至让所述靶核酸与固定寡核苷酸杂交，或者，如有需要，可以在与固定寡核苷酸混合之前将所述靶核酸加热。
用于测定多种靶核酸的方法包括产生与固定寡核苷酸杂交的靶相关的可检测信号、优选光学信号、最优选荧光的步骤。将能够与双链核酸结合并且当与其结合时产生可检测荧光信号的第二化合物与所述混合物混合，或者将所述寡核苷酸与能够发荧光的第二化合物连接，然后将所述混合物与单链特异性内切核酸酶接触，或者所述寡核苷酸或支持物包含能够发荧光的第二化合物，并且所述支持物或寡核苷酸包含足够接近第二化合物的荧光猝灭化合物，以在靶核酸与固定寡核苷酸杂交之前猝灭所述第二化合物的荧光。
采用用来产生与固定探针杂交的靶相关的可检测信号的上述实施方案，在颗粒性支持物的情况下，将所述混合物暴露于或送进如上所述的装置或仪器中，所述装置或仪器能够检测来自颗粒的散射电磁辐射或来自颗粒的第一化合物或多种其它化合物的荧光、或者能够检测两者、以及检测来自所述第二化合物的荧光信号，作为各种不同的靶核酸存在或含量的度量。因为所述靶特异性颗粒可以根据其特异性光散射和/荧光来区分，所以可以完成所述方法。因此，对于每种靶，提供靶相关荧光信号的第二化合物可以相同。然而，对于每种靶，如有需要，可以使用不同的第二化合物。
所产生的荧光信号与固定寡核苷酸杂交的靶含量成正比。可能与溶液中游离的不与固定探针杂交的靶核酸和非靶核酸相关的荧光基本上(如果有的话)不对测量的靶相关信号产生影响。
采用长寡核苷酸探针序列，可以获得高度的特异性和灵敏度，所述探针序列也允许应用严格性杂交条件。
另一方面，本发明涉及检测一种靶核酸的试剂盒，所述试剂盒在同一容器或不同容器中包含：
1)一种颗粒
a)能够散射波长大于或等于约200nm的电磁辐射，或
b)包含一种或多种能够产生对应于所述颗粒的荧光信号的化合物，或
c)能够散射波长大于或等于约200nm的电磁辐射并且包含一种或多种能够产生对应于所述颗粒的荧光信号的化合物；
2)一种寡核苷酸，所述寡核苷酸包含与所述靶核酸的至少一部分互补的核酸序列；和
3)一种化合物，所述化合物能够与双链核酸结合并且结合时或结合在其上时能够产生一种可检测信号。
另一方面，本发明涉及检测一种靶核酸的试剂盒，所述试剂盒在相同或不同容器中包含：
1)一种颗粒
a)能够散射波长大于或等于约200nm的电磁辐射，或
b)包含一种或多种能够产生对应于所述颗粒的荧光信号的化合物，或
c)能够散射波长大于或等于约200nm的电磁辐射并且包含一种或多种能够产生对应于所述颗粒的荧光信号的化合物；
2)一种寡核苷酸，所述寡核苷酸包含与所述靶核酸的至少一部分互补的核酸序列，所述寡核苷酸包含一种配体；
3)一种单链特异性内切核酸酶；和
4)一种化合物，所述化合物能够发荧光并且能够与所述配体结合。
另一方面，本发明涉及检测一种靶核酸的试剂盒，所述试剂盒在相同或不同容器中包含：
1)一种颗粒
a)能够散射波长大于或等于约200nm的电磁辐射，或
b)包含一种或多种能够产生对应于所述颗粒的荧光信号的化合物，或
c)能够散射波长大于或等于约200nm的电磁辐射并且包含
一种或多种能够产生对应于所述颗粒的荧光信号的化合物；
2)一种寡核苷酸，所述寡核苷酸包含
a)与所述靶核酸的至少一部分互补的核酸序列；
b)能够发荧光的第一化合物，和
c)能够猝灭所述第一化合物的荧光的第二化合物。
另一方面，本发明涉及检测一种靶核酸的试剂盒，所述试剂盒在相同或不同容器中包含：
1)一种颗粒
a)能够散射波长大于或等于约200nm的电磁辐射，或
b)包含一种或多种能够产生对应于所述颗粒的荧光信号的化合物，或
c)能够散射波长大于或等于约200nm的电磁辐射并且包含一种或多种能够产生对应于所述颗粒的荧光信号的化合物；
2)一种寡核苷酸，所述寡核苷酸包含与所述靶核酸的至少一部分互补的核酸序列，所述寡核苷酸包含一种配体；
3)一种双链序列特异性限制性内切核酸酶；和
4)一种化合物，所述化合物能够发荧光并且能够与所述配体结合。
在本发明的又一实施方案中，公开了检测生物样品中扩增核酸序列的方法，所述方法包括以下步骤：
将含有所述核酸序列的生物样品与微粒、热稳定性荧光团和热稳定聚合酶混合；
通过聚合酶链式反应扩增所述核酸的选定区段；和
检测所述核酸序列。
所述热稳定性荧光团选自SYBR green I、溴化乙锭和碘化丙锭，所述热稳定性荧光团最好是SYBR green I。
在本发明的再一实施方案中，公开了检测生物样品中扩增核酸序列的方法，所述方法包括以下步骤：
将含有所述核酸序列的生物样品与微粒和热稳定聚合酶混合；
通过聚合酶链式反应扩增所述核酸的选定区段；
将步骤(b)的扩增产物与荧光团混合；和
检测所述核酸序列。
所述荧光团选自浓缩picogreen、SYBR green I、溴化乙锭和碘化丙锭，并且所述荧光团最好是浓缩picogreen。
在本发明的再一实施方案中，公开了检测生物样品中扩增核酸序列的方法，所述方法包括以下步骤：
在热稳定聚合酶存在下通过聚合酶链式反应扩增所述核酸序列；
将步骤(a)的扩增产物与荧光团和微粒混合；和
检测所述核酸序列。
所述荧光团选自浓缩picogreen、SYBR green I、溴化乙锭和碘化丙锭，并且所述荧光团最好是浓缩picogreen。
在本发明的再一实施方案中，公开了包含寡核苷酸阵列的DNA芯片，所述寡核苷酸阵列包含靶特异性点阵(locus)和重复点阵。所述芯片或玻片可用于测定一种或多种特异性靶序列的存在或含量。对于每种靶，所述芯片包含约5个至约20个靶特异性点阵和约5个至约20个重复点阵，更优选约100个至约1000个靶特异性点阵和约10个至约100个重复点阵。
还公开了采用DNA芯片检测一种或多种靶DNA序列的方法，所述方法包括：
将已经锚定有对应于一种或多种待测靶序列的一种或多种寡核苷酸的DNA芯片与含有所述一种或多种靶序列的样品接触，一般而言，所述靶序列为约30pg至约200ng或更高含量的荧光标记DNA；和
检测所述一种或多种特异性靶序列的存在或含量。
所述荧光团选自吖啶橙、碘化丙锭、溴化乙锭、光神霉素、色霉素、橄榄霉素，另见美国专利第5,049,490号和第5,563,037号。优选的化合物包括Hoechst H33258、Hoechst H33342、DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)，和Molecular Probes的TOPRO、TOTO、YOPRO、YOYO、SYBR GREEN I和Picogreen，以及本领域常用的其它化合物；所述荧光团最好是浓缩Picogreen。
所有的上述方法或试剂盒可以具体用以测定一种或多种靶核酸。
附图简述
图1为一示意图，描绘了与颗粒-固定寡核苷酸杂交的靶核酸的杂交和检测。
图2A为前方位角光散射与直角光散射(颗粒大小选择)的曲线图，噻唑橙作为靶DNA指示剂，存在CTDNA、不存在靶DNA。
图2B为前方位角光散射与直角光散射(颗粒大小选择)的曲线图，噻唑橙作为靶DNA指示剂，1000费摩尔靶DNA，过量的CTDNA。
图2C为前方位角光散射与绿色荧光的曲线图，噻唑橙作为靶DNA指示剂，存在CTDNA、不存在靶DNA。
图2D为前方位角光散射与绿色荧光的曲线图，噻唑橙作为靶DNA指示剂，1000费摩尔靶DNA，过量的CTDNA。
图2E为事件分布与绿色荧光的曲线图，噻唑橙作为靶DNA指示剂，存在CTDNA、不存在靶DNA。
图2F为事件分布与绿色荧光的曲线图，1000费摩尔靶DNA，过量的CTDNA。
图3为平均绿色荧光与双链靶DNA拷贝数的曲线图。
图4显示核酸酶保护和检测颗粒结合靶核酸的示意图。
图5为平均信道橙色荧光(用链霉抗生物素蛋白缀合的R-藻红蛋白染色，捕获在微珠上的核酸酶保护性dsDNA)与双链靶DNA拷贝数的曲线图。
图6为平均信道荧光与PCR扩增循环次数的曲线图。
发明详述
一般性讨论
对于本发明而言，术语“支持物”表示任何颗粒物质或非颗粒物质，寡核苷酸可以固定至所述物质或寡核苷酸固定在所述物质上。
广义上说，用于检测靶核酸的本发明方法依赖于对一个第一参数或多个其它参数的一系列测量，以便鉴定一种测定。对一个第二参数或多个其它参数的相应一系列测量用来测定一种靶核酸的存在或对其进行定量。用所述分析鉴定和靶测定参数制出相关的数据表。可以连续进行这些参数的测量。每组测量值被称为一个事件。因此，数据表可以如下：
   事件   参数X   参数Y   参数Z
    1     X1     Y1     Z1
    2     X2     Y2     Z2
    3     X3     Y3     Z3
    …     …     …     …
    n     Xn     Yn     Zn
通常采用激光扫描细胞术或流式显微荧光测定法获得这样的数据表。它们统称为“表式数据”。
可以用一个参数X值的一个范围(“A”)来确定对第一靶核酸的一种测定。可以用X值的另一范围(“B”)来确定对第二靶核酸的一种测定。用这种方法，可以同时进行两种测定。每当一个事件与范围A内的X值有关时，则对参数Z的测量总是针对所述第一靶核酸。每当一个事件与范围B内的X值有关时，则对参数Z的测量总是针对所述第二靶核酸。可以同时进行的测定的数目仅受参数X范围内可被检测的不同范围的数目限制，所述参数X用来对各种靶核酸确定一种测定。通过对A、B等设定大范围，可以获得属于特殊测定类别的事件的高度可靠性。
如果用一个以上的参数来确定一种测定，则可以增加可以同时进行测定的数目。可以用参数X值的一个范围(“A”)连同参数Y值的一个范围(“Q”)一起确定针对第一靶核酸的一种测定。可以用X值的另一范围(“B”)连同参数Y值的另一范围(“R”)一起确定针对第二靶核酸的一种测定。用这种方法，可以同时进行两种测定。每当一个事件与范围A内的X值和范围Q内的Y值有关时，则对参数Z的测量总是针对所述第一靶核酸。同样，每当一个事件与范围B内的X值、和范围R内的Y值有关时，则对参数Z的测量总是针对所述第二靶核酸。当采用多参数来鉴定一种测定时，可以同时进行测定的数目不再受单个参数的不同范围数目限制，这是由于可以用参数的特定组合来确定对每种靶核酸的一种测定所致。另外，通过对A、B、Q、R等设定大范围，可以获得属于特殊测定类别的事件的更高可靠性。
在激光扫描细胞术或流式细胞术中，对多种同时测定分类的优选参数是前向光散射、侧向散射，或者与用来检测来自杂交核酸的信号不同的荧光参数。对于DNA芯片，对多种测定分类的优选参数是空间维度，即芯片表面上的x和y坐标或位置。
除可供用于同时进行多项测定外，本发明的一个主要优点是运用所述列表方式数据获得相同测定重复测量的能力。例如，基于参数X值的一个范围(“A”)的测量连同参数Y值的一个范围(“Q”)的测量一起，把事件1到事件n分成属于对第一靶核酸的一项测定。基于X值的一个范围(“B”)的测量连同参数Y值的一个范围(“R”)的测量一起，把事件n+1到事件p分成属于对第二靶核酸的一项测定。
可以进行统计学分析，以通过分析事件1到事件n来确定第一项测定的Z均数和标准偏差。同样，可以对第二项测定进行统计学分析，以通过分析事件n+1到事件p来确定Z的均数和标准偏差。因此，靶和对照之间的信号差异以及靶不同水平之间的差异可以以重复测量的均数之间的差异来表示，从而提高所进行的所有测定的灵敏度。属于特殊测定类别的事件不必连续测量。仅为了说明本发明，进行了连续性测定说明。
另一个优点是可以使用单参数来同时检测多种靶核酸的信号。因而，无论待测靶核酸的数目多少，仅需要一个报告因素。异硫氰酸荧光素(FITC)的缀合物可用来产生信号。在优选实施方案中，使用一种嵌入染料。
采用结合双链核酸时或当与双链核酸结合后产生在诸如吸收或荧光的光学特性方面的可检测变化的化合物，可以完成在单链核酸存在下测定双链核酸的存在或含量(Ririe等，Anal Biochem 245，154(1997)，Wittwer等，BioTechniques 22，130(1997)，Yamamoto等，欧洲专利公布0 643 140 A1和Sutherland等的美国专利第5,049,490号和第5,563,037号)。
采用以下文献中介绍的“核酸酶保护测定”，可以对核酸进行测定：Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第1-3卷，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)和Thompson等，Biol.Chem.267，5921(1991)。该方法包括标记的单链DNA探针与靶DNA或RNA分子的杂交并且随后用一种单链特异性内切核酸酶(例如S1核酸酶)水解单链核酸。杂交双链核酸仍保持完整，保护所述标记探针不被所述内切核酸酶水解。所述标记物可以是本领域已知并且适合检测的染料、荧光剂、放射性标记分子、酶等等。所述测定可以对所迷靶核酸进行定量。
诸如聚合酶链式反应(PCR)的核酸扩增方法，通常采用标记探针或者延伸至捕获在固定互补寡核苷酸探针上的可检测产物中的标记引物达到对靶核酸的检测，已经开发出各种各样的标记物，Vlieger等，Anal Biochem 205，1(1992)，Yang等，Blood 81，1083(1993)。荧光素化引物已经用于bcl-2/MBR和IgH基因重排的流式细胞计量检测中，Barker等，Blood 83，1079(1994)。
测定靶核酸的另一种方法包括线性增强荧光剂标记的靶特异性寡核苷酸探针的信号。所述标记探针当与靶杂交时，被一种双链核酸特异性外切核酸酶(例如从3′端水解双链DNA(dsDNA)的外切核酸酶III)水解。在水解期间产生的截短的异源双链杂交体是不稳定的。标记探针的缩短片段会解离。然后，新的完整标记探针可以与所述靶杂交，发生新一轮水解后，又是缩短的标记探针的解离，如此循环。然后，将所产生的探针片段通过电泳进行分离，并用测序仪对其进行测定。(Okano等，Ahal Biochem 228，101(1995))。
最近，Tyagi等，Nature Biotechnolgy 14，303(1996)介绍了应用所谓的分子信标(beacon)检测核酸。分子信标是包含一种荧光剂和紧靠着所述荧光剂的猝灭剂的靶特异性寡核苷酸。在结合靶核酸时，所述荧光剂和猝灭剂分离，然后检测所产生的荧光。
在多种不同的靶核酸的情况下，靶特异性支持物/颗粒因为在其上固定有与仅一种不同的靶核酸的至少一部分互补寡核苷酸，而对不同的靶核酸有特异性。
靶DNA可以为单链(ssDNA)或双链形式。如果为双链形式，则通常通过加热对其进行处理，以在与支持物-固定寡核苷酸混合之前、期间或之后使所述dsDNA变性。然后，让所述ssDNA靶与支持物-固定寡核苷酸杂交。
在实施本发明时可以使用任何光学信号和产生所述光学信号的方法，所述信号来源于与支持物-固定寡核苷酸杂交的靶核酸或与所述靶核酸相关。如上所述，在一个实施方案中，通过利用与dsDNA结合并且当如此结合时产生可检测荧光信号的荧光剂，获得靶相关信号。这在图1中用示意图说明。另一方面，通过利用与支持物-固定的寡核苷酸连接的荧光团，可以产生与所述寡核苷酸杂交的靶相关的荧光信号。当支持物-固定寡核苷酸探针与靶核酸杂交形成双链核酸时，单链特异性内切核酸酶不能水解或基本上不能水解所述寡核苷酸，因此不能水解或基本上不能水解具有与其连接的荧光剂的寡核苷酸部分。因而，与寡核苷酸连接的荧光剂仍然与所述支持物结合；检测与杂交靶结合的荧光剂的靶相关信号。通过单链内切核酸酶介导的水解释放的荧光剂产生的信号基本上不对所测量的荧光产生影响。在一个相关实施方案中，当靶与支持物-固定寡核苷酸杂交时产生含有一个限制位点的双链DNA序列后，限制性内切核酸酶介导的水解作用可用来释放与所述寡核苷酸结合的荧光团。在另一个实施方案中，将荧光团与所述寡核苷酸或所述支持物结合，使得足够接近能够基本上猝灭(大于或等于约50％)其荧光的化合物。如果所述荧光剂与所述支持物连接，则所述猝灭剂与所述寡核苷酸连接。如果所述猝灭剂与所述支持物连接，则所述荧光剂与所述寡核苷酸连接。或者荧光剂和猝灭剂两者都可以与所述寡核苷酸连接。
尽管优选荧光剂仅当与dsDNA结合时才产生可检测信号的能力，但是并不要求荧光剂具有这种能力，以便其可用于实施本发明。
颗粒和颗粒-固定的寡核苷酸
本发明的颗粒支持物可以由能够共价或非共价连接寡核苷酸和/或其它化合物(例如荧光团)的任何材料构成或多种材料组合构成。它们可以具有允许化合物(例如荧光团)被包囊的结构，只要所述荧光是可检测的即可。它们可以具有散射电磁辐射的大小和组成。所述颗粒最好由一种或多种包含配体或官能团的聚合物构成，所述配体或官能团使得能够直接或通过合适的结合配偶体或接头基团来非共价或共价结合寡核苷酸和/或其它化合物。它们最好大致为球形，其直径范围约0.3微米至约50微米，更优选0.9微米至约15微米，和/或它们能够散射的电磁辐射大于或等于约200纳米。用于实施本发明的聚合颗粒可以根据本领域技术人员已知的方法来制备。参见例如美国专利4,997,772、5,149,737、5,210,289和5,278,267和其中引用的参考文献。或者，合适的颗粒可以得自例如Bangs Labs，Fishers，IN和Spherotech，Libertyville，IL和本领域技术人员已知的其它来源。
采用众所周知的方法，例如在美国专利5,177,023、4,713,326、5,147,777、5149,737、EP-B-0 070 687、WO-A-88/01302和其中引用的参考文献中描述的方法，可以进行寡核苷酸与颗粒性支持物或非颗粒性支持物的连接。寡核苷酸可以与其任何所需的一种或多种化合物连接，只要所述一种或多种化合物基本上不干扰所述靶核酸的杂交即可。例如，也可以如此连接诸如生物素的配体、荧光剂、荧光猝灭化合物或其它合物。寡核苷酸可以在其3′端或5′端与颗粒连接。
寡核苷酸探针可以包含任何所需数目的碱基。一般而言，它可以包含的碱基长度在约5个至约105个核苷酸碱基之间。优选它包含的碱基长度在约15个至约40,000个碱基之间，更优选在约30个至约10,000个碱基之间，甚至更优选在约30个至约1000个碱基之间，最优选在约30个至约500个碱基之间。
检测
用颗粒性支持物的本发明的一个重要方面是应用基于颗粒的光散射和/荧光特性，将所述颗粒和靶相关信号与本底和靶特异性颗粒相互区分开来的方法和仪器。通过靶特异性颗粒的光散射特性和/或来源于与各种靶特异性颗粒相关的一种或多种荧光团的荧光信号方面的不同差异，将所述靶特异性颗粒相互区分开来，所述荧光信号与靶相关荧光不同。
颗粒的散射光取决于所述颗粒的大小和/或折射率，两者均可以采用熟知的方法按需进行改变。颗粒不一定能够散射光。颗粒的鉴别可以通过将一种或多种能够产生不同荧光的化合物掺入、包囊、非共价或共价与颗粒键合来实现。
激光扫描细胞术已用来鉴别颗粒，例如血细胞。当用激光光束对细胞或细胞团(聚集体)进行扫描时，照射光被所述细胞或细胞团散射；散射的强度随细胞(或聚集体)的大小或形状而异。例如单个红细胞散射的光小于小聚集体，进而小聚集体散射的光小于大聚集体。
同样，当用激光光束对细胞或细胞团(聚集体)进行扫描时，照射光可以诱导与一个或多个细胞结合的荧光剂的荧光。如果荧光剂与细胞相对均匀地结合，则荧光强度与聚集体大小有关。例如单个红细胞发射的荧光小于小聚集体，进而小聚集体发射的荧光小于大聚集体。
采用散射光并结合荧光比采用单独的散射光或荧光来鉴别不同类别的聚集体更为可靠。
在流式细胞术中，诸如血细胞的颗粒被送进快速流动的液体流的中心，并且迫使其排成单行以匀速流出直径小的小孔。由于流体动力学作用，所述颗粒被鞘流液的周围层流汇聚到流体中心。流体中的颗粒进入检测区，在检测区用外加的光源对其进行照射，在红细胞的情况下，以速率为2.5×102至106细胞/分钟进行测量。在测量颗粒时使用激光光源；所用的典型激光光源包括氩离子激光(UV，蓝绿光)、氪激光(黄红光)、氦-镉激光(UV和蓝光)和氦-氖激光(红光)。
在荧光显微镜检术中，可以在显微镜载玻片或等同物上对颗粒进行检测。通常，用白色光源或基本为单色光源对其进行照射。在此，也可以使用激光光源作为单色光的光源。可以用白光评价颗粒的存在，并且用单色光和适当的滤光片评价相关的荧光。对于这些读数中的一种或两种读数，使用可以目测或自动化手段。
优选的流式细胞仪能够选择性检测与颗粒相关的靶相关信号，所述颗粒具有已知范围的前方位角和直角散射的信号强度或特殊的荧光(Yang等，Blood 81，1083(1993)，Barker等，Blood 83，1709-1085(1994)，Chandler等，ISAC XIX International Congress；Colorado Springs，Colorado USA，Fulton等，Clinical Chem 43，1749(1997)，Fulwyler等，Methods Cell Biology，第二版，Academic Press，第33卷，613(1990)和McHugh，Methods Cell Biollogy，第二版，Academic Press，第42卷，575(1994))。用光散射和/或与颗粒相关的荧光主控数据获取。选择与颗粒相关的信号使得可以检测靶相关信号，而不受源自所述颗粒浸渍的混合溶液相的荧光的干扰。因而，信噪比大。靶相关信号与靶含量成正比，采用优选的流式细胞计量方法测定多种靶核酸也是可能的。采用流式细胞术对溶液中游离存在的核酸进行多重分析在以下文献中有描述：Chandler等，ISAC XIX International Congress；ColoradoSprings，Colorado(1998)，Fulton等，Clin Chem 43，1749(1997)，Fulwyler等，Methods Cell Biology，第二版，613(1990)和McHugh，Methods Cell Biology，第二版，575(1990)。
DNA结合的荧光团
能够与dsDNA结合并且当与其结合时能够产生一种可检测信号或可对其进行化学修饰以产生一种可检测信号的许多化合物是本领域技术人员已知并且可获得的。其中包括染料、抗生素和化学治疗剂。它们可以嵌入性的或非嵌入性的；但是，它们必须基本上不与固定寡核苷酸的支持物结合。具体的实施包括但不限于吖啶橙、碘化丙锭、溴化乙锭、光神霉素、色霉素、橄榄霉素，另见美国专利第5,049,490号和第5,563,037号。优选的化合物包括Hoechst H33258、Hoechst H33342、DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)，和Molecular Probes的TOPRO、TOTO、YOPRO、YOYO、SYBR GREEN I和PicogreendsDNA定量试剂和噻唑橙。某些化合物(例如YOYO)在它们结合dsDNA前实际上不发荧光。吖啶橙具有异染色特性，使得可以鉴别是与ssDNA结合还是与dsDNA结合。对于本发明而言，化合物必须基本上不与单链固定寡核苷酸结合，但如果确已结合，任何所产生的信号必须能够不同于当所述化合物与dsDNA结合时所产生的信号。
单链特异性内切核酸酶、限制性内切核酸酶
在实施本发明时可以使用的单链特异性内切核酸酶包括但不限于S1内切核酸酶和绿豆内切核酸酶。可以使用的限制性内切核酸酶包括但不限于Acc65 I、Acc I、Aci I、Alu I、Apa I、ApaL、Ava I、AvaII、Bae I、Bam HI、Bcg I、Bcl I、Bfa I、Bgl I、Bgl II、Bsa I、BsaJ I、Bsl I、BspH I、BsrG I、Bst4C I、BssS I、BstE II、BstU I、BstX I、BstYI、ClaI、 DdeI、Dpn I、Opn II、Dra I、Dra III、EcoO109 I、EcoR I、EcoR V、Fau I、Fok I、Hae II、Hae III、Hha I、Hinc II、Hind III、Hinf I、Hpa I、Hpa II、Kpn I、Mbo I、Mlu I、Mnl I、Mse I、Msp I、Nae I、Nco I、Nde I、Nhe I、Nla III、Nru I、Pst I、Pvu I、Pvu II、RsaI、Sac I、Sac II、Sal I、Sau3A I、Sca I、Sfi I、Sma I、SnaB I、，Spe I、Sph I、Ssp I、Stu I、Sty I、Taq I、Xba I、Xcm I、Xho I、Xma I和XmnI。
荧光剂和猝灭剂
在其中一起提供荧光团和猝灭剂的一个实施方案中，可以将荧光团连接在寡核苷酸的末端或附近，而将猝灭剂连接在另一末端或附近，正如Tyagi等，Nature Biotechnolgy 14，303(1996)，Tyagi等，Nature Biotechnolgy 16，49(1998)，Giesendorf等，Clin Chem 44，482(1998)和Estrada等，Mol Cell Probes 12，219(1998)描述的茎-环结构(分子信标)。在茎-环结构中，所述寡核苷酸在两个末端都包含互补核苷酸碱基对。互补碱基对的杂交导致形式具有与荧光团和猝灭剂足够接近的闭合环，使得荧光被猝灭。在靶核酸与所述寡核苷酸杂交后，所述环被打开，荧光团和猝灭剂变得足够分离，以允许发荧光。
在所有情况下，检测之前不需要支持物-固定寡核苷酸与其浸渍的溶液分离。然而，如有需要，采用众所周知的方法，例如过滤、离心或磁分离，可以进行这样的分离。
在本发明的另一方面，靶核酸分子可以在严格性条件下与微球体结合的互补序列的寡核苷酸探针杂交，并且杂交用dsDNA特异性荧光染料通过染色来检测。可以使用足以使所述微球体饱和的靶浓度和孵育时间，达到在饱和结合之前和之后的不同时间点对信号进行测量。对于无关的靶序列没有观察高于本底的信号。当所述靶序列与所述微球体结合的寡核苷酸在每一核苷酸位置都互补时，观察到与所述微球体相关的最大荧光信号，并且完全互补性也产生随分析物浓度上升而上升的最快速信号上升。当一个碱基在所述靶序列中被错配时，荧光信号低于完全互补的靶序列。相应的是，荧光信号随时间上升比完全互补靶序列慢。另外，最大荧光和信号的上升速率是错配3种可能性的核苷酸的函数。因此，通过测量饱和结合时的最大荧光，或通过测量随分析物浓度的信号升高，所述方法提供对SNP检测的精巧手段。推测通过该方法也可以对错配位置作图，因此，在DNA测序应用方面，应该可以利用该方法。
同时本说明书描述了对PCR产物的检测，即通过将这些PCR产物与微球体和嵌入染料混合来检测所述PCR产物，还公开了在热循环之前，或者之后，将微球体-固定寡核苷酸探针和嵌入染料加到PCR反应中。在本发明的这个实施方案中，单独的染料(在所述实施方案中，最好是热稳定性染料)或微球体可以在热循环之前存在于所述混合物中，或者，两者可以同时存在于所述混合物中。因此，当以本文上述的以及其后实施例6中描述的均相形式或以本领域技术人员可使用或研制的其它形式测量PCR产物时，甚至可以进一步减少样品处理。
用于实施例的材料和方法
除非另有说明，实施例中所用的颗粒是按照美国专利第5,149,737号、第5,210,289号和第5,278,267号中所述方法制备的(聚[苯乙烯-共(对乙烯基苄硫基)丙酸]97.6∶2.4摩尔比)的共聚物。所述颗粒为直径约1.7微米的大致球形。寡核苷酸与所述颗粒的偶联基本上按照美国专利第5,147,777号所述方法进行。除非另有说明，采用本领域熟知的方法合成寡核苷酸。下文鉴定了实施例中使用的两种寡核苷酸：
SEQ ID NO.1：
5′-TTTCCAAGTA AGCAATAACG TCAGCTCTTT CTTGTGCTT CTTCATACCAGCGAAAGACA TCTTAGTACC TGGCATGAAC TTCTTTGGGT-3′.
如下所示，与颗粒连接的3′端有和没有氨基二醇(ADL)接头、通过两个四甘醇(TEG-TEG)间隔区将生物素与5′端连接，对上述寡核苷酸进行修饰：
Oligo-1A：
生物素-TEG-TEG-5′-TTTCCAAGTA AGCAATAACG TCAGCTCTTT CTTGTGGCTTCTTCATACCAG CGAAAGACAT CTTAGTACCT GGCATGAACT TCTTTGGGT-3′-TEG-TEG-ADL-颗粒
和
Oligo-1B：
生物素-TEG-TEG-5′-TTTCCAAGTA AGCAATAACG TCAGCTCTTT CTTGTGGCTTCTTCATACCAG CGAAAGACAT CTTAGTACCT GGCATGAACT TCTTTGGGT-3′.
SEQ ID NO：2：
5′-ACCCAAAGAA GTTCATGCCA GGTACTAAGA TGTCTTTCGC TGGTATGAAGAAGCCACAAG AAAGAGCTGA CGTTATTGCT TTGGAAA-3′.
杂交条件
通过将含100费摩尔探针的10μl 0.15M氯化钾、0.01M三羟甲基氨基甲烷(Tris)、1mM乙二胺四乙酸(EDTA)、pH8.3在1μg小牛胸腺DNA存在下孵育，进行生物素化寡核苷酸探针(SEQ ID NO：1)与靶DNA(SEQ ID NO：2)的杂交。通过于96℃加热3分钟使DNA变性，然后将混合物于65℃孵育10分钟，让靶和寡核苷酸探针杂交。在终体积15μl中通过给反应混合物补充5×104微珠，并且将所述混合物在室温下孵育10分钟，进行使所述生物素化寡核苷酸与链霉抗生物素蛋白包被的微珠(Bangs Laboratories)结合。
荧光团的结合
向500μl等份荧光团的工作储备液加入10μl经杂交的靶-探针微珠悬浮液，然后将所述混合物在室温下最少孵育5分钟。用生产商供应的原始制剂如下制备荧光团的工作储备液：用TE缓冲液以1∶10,000稀释picogreen，用TE缓冲液以1∶200稀释SYBR GREEN，噻唑橙(Aldrich Chemical Company，Milwaukee，WI)1μg/ml的TE缓冲液，TOPRO-1、TOTO-1、YOPRO-1和YOYO-1，所有都为0.5μM的TE缓冲液。
核酸酶保护
微珠-固定寡核苷酸探针(SEQ ID NO：1)与靶DNA(SEQ ID NO：2)杂交后，将8μl等份悬浮液与8μl 2x S1核酸酶缓冲液或2x绿豆核酸酶缓冲液(Promega，Madison，WI)混合，以1单位S1核酸酶或绿豆核酸酶消化，于30℃孵育30分钟。向反应混合物加入1∶10稀释的链霉抗生物素蛋白缀合的藻红蛋白荧光团的TE缓冲液，至终体积为24μl。
流式细胞术
采用装有Immunocount2.2软件的Ortho CYTORONABSOLUTE_流式细胞仪，进行流式细胞计量分析。对于每批微珠-固定寡核苷酸，测定颗粒分析的参数。设置前方位角散射和直角散射的倍增放大器，使得各种大小的微珠都可以通过该仪器进行检测和分辨。将CYTORONABSOLUTE_流式细胞仪中设置的荧光倍增放大器调至使杂交介导的荧光检测最优化。用簇分析测定平均峰信道荧光，由于它允许既存在荧光又存在另一参数(例如，向前散射或90°散射)的阈值，因此允许对不同的待分析样品使用统一的标准。这种方法消除了由存在高散射荧光信道值的颗粒产生的本底噪声。
下文所述的实施例利用DNA作为靶核酸。这仅仅为了说明本发明。只要有必要，本发明的方法可容易地修改用于RNA靶，这是本领域技术人员已知的。
实施例1
与颗粒-固定寡核苷酸杂交的靶DNA的检测：DNA结合荧光团
用与dsDNA结合的荧光团检测杂交的靶DNA。将本实施例中的靶DNA(SEQ ID NO：2)与微珠-固定探针(SEQ ID NO：1)在过量的小牛胸腺DNA存在下杂交。将荧光团与经杂交的靶-微珠悬浮液混合，并且通过流式细胞术进行分析。使用噻唑橙作为dsDNA结合荧光团的结果示于图2A-F。显示了在靶DNA不存在(图2A)和存在(图2B)时与1μg小牛胸腺DNA孵育的微珠的前方位角散射(FW-SC)与直角散射(RT-SC)模式。借助图象分析软件算法，微珠的光散射门控允许在窄范围的FW-SC×RT-SC值内分析颗粒分选，因而，消除所述大小范围外的颗粒。用噻唑橙作为所述dsDNA结合荧光团，在进一步门控选择用来计算平均信道荧光值(mean channel fluorescencevalue)的事件的情况下，门控组的颗粒具有示于图2C和图2D的FW-SC x绿色荧光(GR-FL)模式。图2C和图2D中选定的颗粒组在图2E和图2F中以荧光直方图表示，其中可以观察到阴性对照(无靶DNA)和阳性(1000费摩尔靶)的分布均数被清晰地分开。下表1显示在存在CTDNA、加入和不加入靶DNA的情况下7种不同的荧光团的平均峰信道荧光(MCF)。杂交在终体积为10微升的以下混合物中进行：含有4×104个包含固定在其上的寡核苷酸探针(SEQ ID NO：1)的微珠、加入或不加入靶(SEQ ID NO：2，1000费摩尔)、存在1微克CTDNA和0.15M氯化钾、0.01M Tris和1mM EDTA，pH8.3。所述DNA于96℃变性3分钟，然后于65℃杂交。
表1
    MCF     MCF
 荧光团     无靶  1000费摩尔靶
 噻唑橙PicogreenSybrgreenTO-PRO-1TOTO-1YO-PRO-1YOYO-1     22.527.115.819.31320.636     87.4103.751.5101.649.159.863.6
不需要将与杂交靶和寡核苷酸结合的颗粒与溶液中的游离DNA分开，因为通过图象分析软件，光散射门控的颗粒允许对内聚性(cohesive)窄范围的前方位角散射x直角散射值的选定组颗粒进行分析；仅限于分析目的颗粒。
实施例2
核酸酶保护
生物素化颗粒-固定的寡核苷酸探针(Oligo-1A)与靶寡核苷酸(SEQ ID：2)杂交保护所述探针免被单链特异性DNA内切核酸酶水解。如实施例1所述，将颗粒-固定的寡核苷酸和CTDNA在存在和不存在1000费摩尔靶DNA时一起孵育，然后与S1核酸酶一起孵育。生物素在内切核酸酶水解所述寡核苷酸探针后被释放出来，除非它通过与靶DNA杂交避免水解而得以保护。
将8微升在TE缓冲液中以1∶10稀释的等份链霉抗生物素蛋白连接的荧光剂(Molecular Probes的链霉抗生物素蛋白-藻红蛋白)加到16微升经核酸酶处理的样品中，在室温下孵育10分钟。结合的链霉抗生物素蛋白连接的荧光剂用作完整的微珠连接寡核苷酸的报道物。采用流式细胞术分析所述混合物。不含靶的藻红蛋白的平均信道荧光为21.5，含有1000费摩尔靶的藻红蛋白的平均信道荧光为34.7。
实施例3
靶DNA的定量：DNA结合荧光团
如图3所示，与靶DNA(SEQ ID NO：2)和微珠-固定的寡核苷酸(SEQ ID NO：1)的杂交体结合的荧光团sybr green的荧光随靶拷贝数而变化。
与微珠-固定寡核苷酸相关的荧光信号单一性取决于所述浓度，证明在浓度范围数值约为6个数量级范围内可以定量测定所述靶DNA含量。在0.8μg非特异性小牛胸腺DNA的本底中，清晰地检测到低至相当于440阿摩尔(attomoles)或约2.5×108拷贝90-mer靶的25.7皮克靶dsDNA。因此所述靶DNA在约3.11×104倍过量的非特异性DNA存在下是容易检测的。结果也表明，所述方法在所述浓度范围内是非常灵敏的；约1.25×108至1.09×1012拷贝靶浓度范围在体积为8微升时，靶DNA浓度增加两倍是容易检测的。用噻唑橙、TOPRO-1、TOTO-1、YOPRO-1、YOYO-1和picogreen获得的平均荧光，在所有情况下，也与靶DNA的浓度成正比(数据未显示)。
实施例4
靶DNA的定量：dsDNA结合荧光团
在一个替代实施方案中，让可溶性、生物素化寡核苷酸探针与其靶DNA在溶液中杂交。然后让所述靶DNA-生物素-寡核苷酸探针杂交体与链霉抗生物素蛋白-微珠结合。然后向所述悬浮液加入500微升1∶200稀释的picogreen，在室温下孵育2分钟。将所述悬浮液送进流式细胞仪中。经计算的颗粒相关平均信道荧光与所述样品中的靶DNA浓度成正比(数据未显示)。
实施例5
靶DNA的定量：核酸酶保护
图4显示用以检测颗粒结合性靶核酸的基于核酸酶保护的测定示意图。
保护寡核苷酸探针免被核酸酶S1消化与所述靶DNA含量成正比。图5显示平均荧光信号随单链靶DNA浓度的增加而增加。在约100倍过量的非靶CTDNA中检测到少至40.96费摩尔(约2.5×1010拷贝)90个碱基对DNA靶(SEQ ID NO：2)。
实施例6
PCR扩增产物的检测：DNA结合荧光团
为了定量测量低丰度核酸，通常监测随扩增循环次数变化的PCR扩增的靶DNA；检测产物所需的扩增循环次数与所述靶拷贝数成正比。
在本实施例中，采用PCR，从质粒克隆的DNA插入片段(SEQ IDNO.3)扩增10拷贝靶DNA。在体积为100微升含有以下组分的混合物中扩增靶DNA(10拷贝，SEQ ID NO：3)：CT(小牛胸腺)DNA、5微摩尔NaOH、4毫摩尔MgCl2、18mM Tris缓冲液、54mM KCl、0.4mM各种引物(SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5)、0.3mM各种dNTP、0.108微克/微升明胶、0.725mM EDTA、40微摩尔DTT、9.5％甘油、0.02％Tween 20、0.02％Nonidet P40。
靶DNA
具有以下序列的靶DNA由在pUC18中克隆的DNA片段组成：
SEQ ID NO：3
5′-CTGCAGG CGC CAGCGTGGAC CATCAAGTAG TAATGAACGC ACGGACGAGG ACATCATAGA GATTACACCT TTATCCACAG TTCTCGGTCT AACGCAGCAG TCAGTGTATC AGCACCAGCA TCCGTAGTGA GTCTTCAGTG TCTGCTCCAG GATCGTGGCG CTGCAG-3′
下划线序列对应于采用下述PCR引物(SEQ ID NO：4和SEQ IDNO：5)从所述靶DNA扩增的区域。
PCR引物
用按照以下序列的寡核苷酸，合成方法制备用于靶DNA扩增的引物：
SEQ ID NO：4：(正向引物)
5′-CGCCAGCGTG GACCATCAAG TAGTAA-3′
SEQ ID NO：5：(反向引物)
5′-CACGATCCTG GAGCAGACAC TGAAGA-3′
在Perkin Elmer 9600 PCR系统热循环仪中，采用标准热循环方案(循环1-5：96℃30秒、68℃60秒；循环6-40：96℃15秒、68℃60秒)进行PCR，分别在5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个和40个循环后终止所述反应。
杂交
扩增后，将10μl PCR混合物与10微升含有约105个直径3.5微米、先前已与悬浮于2x杂交缓冲液(0.3M氯化钾、0.02M Tris和2mMEDTA，pH8.3)中的所述寡核苷酸探针(SEQ ID NO：6)偶联的颗粒(Bangs Labs，Fishers，IN)的悬浮液混合，然后将所述混合物于96℃加热3分钟，然后让其冷却至65℃，然后孵育10分钟。
微粒-固定的DNA探针
固定在颗粒上的寡核苷酸探针具有以下序列：
SEQ ID NO：6：
5′-CTGCGTTAGA CCGAGAACTG TGGATAAAGG-3′
通过将生物素与3′端共价连接来修饰SEQ ID NO.6：。采用标准方案，让所述探针与链霉抗生物素蛋白包被的、直径3.5微米的颗粒(Bangs Laboratories)结合。
DNA染色
DNA染色如下进行：将500μl 1∶200稀释的浓缩picogreen荧光染料与20μl包含杂交的靶微珠悬浮液混合，于室温下将所述悬浮液最少孵育2分钟。接下来，用CYTORONABSOLUTE_流式细胞仪对样品进行分析。
结果
根据得自与杂交的靶和颗粒固定寡核苷酸dsDNA结合的picogreen的平均信道荧光，测量PCR产物。在图6中，可以观察到所述平均信道荧光在30个循环后随PCR循环次数的增加而增加，证明对PCR扩增产物的定量检测。
实施例7
激光扫描细胞术
在实施本发明时可以使用激光扫描细胞术。在诸如Compucyte激光扫描细胞仪的激光扫描细胞仪中，光学检测器移经分散的、通常是均匀分散在二维空间表面(例如在显微镜载玻片的表面)上的物质。这与流式显微荧光测定法不同，在流式显微荧光测定法中颗粒以一维通过检测器(在移动流中基本上是一次一个颗粒)。
包含靶特异性寡核苷酸探针的颗粒必须大至足以被激光扫描细胞仪中所用的检测系统分辨。颗粒优选大于或等于约0.3微米，更优选在约1微米至约5微米之间。将颗粒、包含靶核酸的样品和当与dsDNA结合时产生可检测荧光的化合物进行混合，生成一种混合物。稀释所述混合物，让所述颗粒足以在显微镜载玻片上均匀分散。所述激光扫描仪在所述载玻片上移动，用颗粒的光散射和/或荧光触发测量与杂交的靶和颗粒-固定寡核苷酸结合的化合物的可检测荧光。所述激光扫描细胞仪通过靶特异性颗粒的特异性光散射和/或荧光特征来鉴别多种不同的靶特异性颗粒。
实施例8
DNA阵列
在激光扫描细胞术和流式显微荧光测定法中，分析物的检测取决于空间分辩率。在流式细胞术中，分辨为一维性的。在激光扫描细胞术中，分辨为二维性的。
包含寡核苷酸阵列的DNA芯片代表二维分离装置。用于制备这种阵列的方法在WO 9818961和背景部分指出的美国专利中有描述。
在操作中，在一个方向即x方向获得一系列测量测量值x1，在与x的垂直方向即y方向获得一系列测量值y1。已知检测的x1y1事件与特定靶特异性探针有关。同样，已知x2y2测量结果与相同靶或不同靶的探针有关，如此类推。
寡核苷酸直接或间接通过化学接头或其它固定化试剂而沉积或锚定至表面，可以制备包含寡核苷酸阵列的DNA芯片或载玻片，全部采用本领域已知的技术，并且在WO 9818961以及本文前面引用的美国专利中可以找到。它们在芯片或载玻片的一个表面上以不同的xy位置固定。每个xy点阵或点对任何所需靶核酸有特异性。在所述芯片或载玻片上可以有一个靶特异性的多个点，以实现重复测定(重复点)。可以使用任何所需数目的靶特异性核酸点和重复点。对于每种靶而言，优选所述芯片或载玻片包含约5个至约20个靶特异性点和约相同数目的重复点，更优选所述芯片或载玻片包含约100个至约1000个靶特异性点和约10个至100个重复点，使所述DNA芯片或载玻片与样品和当与dsDNA结合时产生可检测荧光信号的化合物接触。例如，采用激光扫描装置，测量所述芯片或载玻片上各点即各种具体xy位置的靶相关性荧光。所述荧光信号与所述特异性靶核酸的存在或含量有关。
具体地说，具有SEQ ID NO.1的约100个靶特异性点阵和约10个重复点阵的DNA芯片，所述寡核苷酸序列印制在硅烷基化载玻片(CEL Associates)上。印制点直径约125μm，中心之间的空间间隔为300μm。将约10个复份无关序列的探针(例如，检测哺乳动物序列的情况下针对植物基因的探针)也印制在所述载玻片上。印制的玻璃载玻片用硼氢化钠溶液(0.066M NaBH4、0.06M NaAC)处理，确保探针与所述载玻片形成氨基键。然后将所述载玻片在水中煮沸2分钟，使所述cDNA变性。将含有约30个至约30,000个靶核酸分子的生物样品于99℃加热5分钟，然后在杂交前进行预冷却，在这种情况下，在室温下保持5分钟，然后加样到所述载玻片上。所述载玻片用玻璃盖玻片盖上，用DPX(Fluka)密封，于60℃杂交4-6小时。杂交结束时，让载玻片冷却至室温。所述载玻片在1X SSC、0.2％SDS中于55℃洗涤5分钟，在0.1X SSC、0.2％SDS中于55℃洗涤5分钟。所述载玻片的染色如下进行：将全部表面与1∶200稀释的浓缩picogreen荧光染料接触，在室温下最少孵育2分钟。在0.1X SSC、0.2％SDS中快速冲洗后，将所述载玻片风干，待用于扫描。采用ScanArray 3000(General Scanning，Inc.)，对阵列的picogreen染料发出的荧光进行扫描。随后用ImaGene软件(Biodiscovery，Inc.)对其进行定量。通过减去即时周围本底，校正每个点的强度。
荧光信号与特异性靶核酸的存在或含量有关，对所述载玻片进行10个复份的所述测定，采用统计学方法将复份试验点平均荧光值与无关序列的复份探针的平均荧光值进行比较。
采用对SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6具有约100个靶特异性点阵和约10个重复点阵的DNA芯片，重复上述方法和步骤。
实施例9
PCR扩增产物的检测：均相方法
本实施例的目的是用IPC-IP微珠在所述PCR混合物中进行PCR热循环。热循环后加入DNA染色剂。
采用以下鉴定的条件、引物和探针，利用实施例6的材料和方法。采用合适的PCR方案，将靶DNA(10拷贝)SEQ ID NO.3在包含以下组分的100微升体积中扩增：PCR混合物、0.25微升105寡核苷酸结合的1.7微米微珠。使用的微珠是按照美国专利第5,149,737号、第5,210,289号和第5,278,267号中所述方法制备的聚[苯乙烯-共(对乙烯基苄硫基)丙酸]95∶5摩尔比的微珠，而合适浓度的DNA结合荧光团，在这种情况下，是500微升1∶200稀释的浓缩picogreen，在所述热循环之后加入所述荧光团。扩增反应依照实施例6的PCR条件设置，只是在所述混合物中包括105寡核苷酸结合的微粒，并且PCR循环的增加允许杂交的温度循环。
然后采用例如CYTORONABSOLUTE_流式细胞仪，通过流式细胞术测定所得混合物中扩增靶DNA的存在。
靶DNA
将具有以下序列的靶DNA克隆到pUC18中：
SEQ ID NO.3：
5′-CTGCAGG CGC CAGCGTGGAC CATCAAGTAG TAATGAACGCACGGACGAGG ACATCATAGA GATTACA CCT TTATCCACAG TTCTCGGTCT AACGCAGCAG TCAGTGTATC AGCACCAGCA TCCGTAGTGA G TCTTCAGTG TCTGCTCCAG GATCGTGGCG CTGCAG-3′
扩增和杂交反应
采用以下鉴定的PCR条件和引物，采用改进的扩增方案(循环1-5：96℃30秒、68℃60秒；循环6-40：96℃15秒、68℃60秒；循环41：72℃5分钟；循环42：96℃3分钟；循环43：50℃60秒)，在PE9600热循环仪中扩增SEQ ID NO.3：中的下划线序列。
SEQ ID NO.4：(正向引物)
5′-CGCCAGCGT GGACCATCA AGTAGTAA-3′
SEQ ID NO.5：(反向引物)
5′-CACGATCCT GGAGCAGAC ACTGAAGA-3′
固定在颗粒上的寡核苷酸探针具有以下序列：
SEQ ID NO.6：
5′-CTGCGTTAG ACCGAGAAC TGTGGATAA AGG-3′
采用标准方案，通过与聚苯乙烯颗粒(直径1微米)表面共价连接对SEQ ID NO.6：进行修饰。
DNA染色
DNA的染色如下进行：通过将500μl 1∶200稀释的浓缩picogreen与20μl包含杂交扩增靶以上鉴定的PCR微珠悬浮液混合，于室温下将所述悬浮液最少孵育2分钟，。
结果
根据得自与杂交的靶和颗粒-固定寡核苷酸dsDNA结合的picogreen的平均信道荧光，测定PCR产物。
实施例10
PCR扩增产物的检测：均相方法
本实施例的目的是用微珠和DNA染料在所述PCR混合物中进行PCR热循环。
采用实施例9的材料和方法，只是在热循环之前，将2.5微升浓缩热稳定染料(例如SYBR Green I染料，Molecular Probes，Eugene，Oregon)加入到含有靶的PCR悬浮液中。可以使用的其它热稳定染料包括溴化乙锭和碘化丙锭。
结果
根据得自与杂交的靶和颗粒-固定寡核苷酸dsDNA结合的SYBRGreen的平均信道荧光，测定PCR产物。
实施例11
PCR扩增产物的检测：均相方法
本实施例的目的是在所述PCR混合物中在热稳定DNA染料存在下进行PCR热循环。热循环之后加入微珠。
采用实施例9的材料和方法，以及在热循环之前，将2.5微升浓缩热稳定SYBR Green染料加入到所述PCR靶悬浮液中。可以使用的其它热稳定染料包括溴化乙锭和碘化丙锭。
DNA杂交
热循环之前，将10微升悬浮于2x杂交缓冲液(0.3M氯化钾、0.02MTris和2mM EDTA，pH8.3)中105寡核苷酸结合的微粒(规格为1-10微米)加到10微升扩增产物-染料混合物中，于96℃加热3分钟，然后让其冷却至65℃，以允许杂交。
分析
所述杂交样品补充500μl 1mM Tris、10mM EDTA缓冲液，并用例如CYTORONABSOLUTE_流式细胞仪进行分析。
结果
根据得自与杂交的靶和颗粒-固定寡核苷酸dsDNA结合的SYBRGreen的平均信道荧光，测定PCR产物。
参考具体的优选实施方案详细描述了本发明。不用说，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以进行各种变化和修改。所有引用的专利、专利申请和非专利公开文献的全部内容通过引用结合到本文中。
序列表
<110>Connelly，Mark
<120>核酸的检测
<130>CDS-228
<140>10/168，035
<141>2001-12-21
<160>6
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>90
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>1
tttccaagta agcaataacg tcagctcttt cttgtggctt cttcatacca gcgaaagaca    60
tcttagtacc tggcatgaac ttctttgggt                                     90
<210>2
<211>87
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>2
acccaaagaa gttcatgcca ggtactaaga tgtctttcgc tggtatgaag aagccacaag    60
aaagagctga cgttattgct ttggaaa                                        87
<210>3
<211>166
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>3
ctgcaggcgc cagcgtggac catcaagtag taatgaacgc acggacgagg acatcataga    60
gattacacct ttatccacag ttctcggtct aacgcagcag tcagtgtatc agcaccagca   120
tccgtagtga gtcttcagtg tctgctccag gatcgtggcg ctgcag                  166
<210>4
<211>26
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>4
cgccagcgtg gaccatcaag tagtaa                                        26
<210>5
<211>26
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>5
cacgatcctg gagcagacac tgaaga                                        26
<210>6
<211>30
<212>DNA
<213>合成构建体
<400>6
ctgcgttaga ccgagaactg tggataaagg                                    30

Claims (4)

1.一种测定一种靶核酸的存在或含量的方法，所述方法包括：
A)形成包含以下组分的混合物：
i)靶核酸，和
ii)一种寡核苷酸固定在其上的颗粒，所述寡核苷酸包含与所述靶核酸的至少一部分互补的核酸序列，其中所述寡核苷酸包含一种能够发荧光的第二化合物，所述颗粒或所述寡核苷酸包含足够接近所述第二化合物的荧光猝灭化合物，以在所述寡核苷酸与所述靶核酸杂交之前猝灭所述第二化合物的荧光，并且其中所述颗粒
a)能够散射波长大于或等于约200nm的电磁辐射，或
b)包含能够产生对应于所述颗粒的不同荧光信号的一种第一化合物或多种其它化合物，或
c)能够散射波长大于或等于约200nm的电磁辐射并且包含能够产生对应于所述颗粒的不同荧光信号的一种第一化合物或多种其它化合物；任选的是
B)将所述混合物加热至使双链核酸变性，然后冷却所述混合物，使所述靶核酸与所述固定寡核苷酸杂交；
C)将所述混合物暴露于能够检测荧光并且任选检测散射电磁辐射的检测器；
D)检测所述颗粒的散射电磁辐射或所述第一化合物或多种其它化合物的荧光，或者同时检测所述散射电磁辐射和荧光；
E)测定所述第二化合物的荧光信号，从而测得所述靶核酸的存在或含量。
2.权利要求1的方法，其中所述检测器是流式细胞仪、扫描细胞仪或荧光显微镜。
3.一种测定多种不同靶核酸的存在或含量的方法，所述方法包括：
A)形成包含以下组分的混合物：
i)靶核酸，和
ii)多种靶特异性颗粒，其中靶特异性颗粒上固定有包含与一种不同靶核酸的至少一部分互补的核酸序列的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含一种能够发荧光的第二化合物，所述颗粒或所述寡核苷酸包含足够接近所述第二化合物的荧光猝灭化合物，以在所述寡核苷酸与所述靶核酸杂交之前猝灭所述第二化合物的荧光，并且其中所述颗粒独立地
a)能够散射波长大于或等于约200nm的电磁辐射，或
b)包含能够产生对应于所述颗粒的不同荧光信号的一种不同的第一化合物或多种其它化合物，或
c)能够散射波长大于或等于约200nm的电磁辐射并且包含能够产生对应于所述不同颗粒的不同荧光信号的一种不同的第一化合物或多种其它化合物，
iii)一种化合物，所述化合物能够与双链核酸结合并且当其结合时产生一种可检测光学信号；任选的是
B)将所述混合物加热至使双链核酸变性，然后冷却所述混合物，使靶核酸与固定寡核苷酸杂交；
C)将所述混合物暴露于能够检测荧光并且任选检测散射电磁辐射的检测器；
D)检测一种颗粒的散射电磁辐射或一种颗粒的所述第一化合物或多种其它化合物的荧光，或者同时检测所述散射电磁辐射和荧光；
E)检测所述第二化合物的荧光信号，从而测得各种不同靶核酸的存在或含量。
4.权利要求3的方法，其中所述检测器是流式细胞仪、扫描细胞仪或荧光显微镜。
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