JPH0568593A

JPH0568593A - 核酸の検出方法

Info

Publication number: JPH0568593A
Application number: JP17120291A
Authority: JP
Inventors: Hisashi Okamoto; 尚志岡本; Takeshi Miyazaki; 健宮崎; Kazusane Tanaka; 和實田中; Masanori Sakuranaga; 昌徳桜永; Masahiro Kawaguchi; 正浩川口
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 1991-07-11
Filing date: 1991-07-11
Publication date: 1993-03-23

Abstract

(57)【要約】【目的】従来のハイブリダイゼーションを利用した核
酸の分析方法における標識物質の使用と、ハイブリダイ
ゼーション反応後の洗浄工程を省略して、測定時間の短
縮と、標識物質の使用に関連する種々の問題の排除を行
なう。【構成】一本鎖核酸プローブ３を固体微粒子１の表面
に、検出すべき一本鎖核酸（標的一本鎖核酸）とハイブ
リッドを形成した際に形成されたハイブリッドを介して
固体微粒子の凝集が生じるように固定し、その固定状態
で標的一本鎖核酸とのハイブリッドを形成反応を行な
い、形成されたハイブリッドを介して生じる固体微粒子
１の凝集を光学的手段によって検出する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、固体微粒子を用いた核
酸の検出方法に関する。更に詳しくは、一本鎖核酸プロ
ーブをその表面に固定した固体微粒子を検出用の坦体と
して用い、検体試料中に含まれる検出すべき一本鎖核酸
（標的一本鎖核酸）と固体微粒子表面に固定された一本
鎖核酸プローブとの反応により生じるハイブリッドを介
して固体微粒子を凝集させ、それを光学的に検出するこ
とにより、検体試料中の標的一本鎖核酸を検出する方法
に関する。

【０００２】

【従来の技術】検体試料中に含まれる特定の塩基配列を
有する核酸を測定する方法として、核酸のハイブリダイ
ゼーションを用いる方法が利用されている。この方法
は、一本鎖の核酸が、適当なハイブリッド形成条件下で
自己の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む他の一
本鎖核酸と塩基間の水素結合を介してハイブリッドを形
成することを利用するものである。

【０００３】以下に、従来より行われているハイブリダ
イゼーションを用いた核酸の測定方法の一般例について
説明する。

【０００４】まず、検体試料中の核酸が二本鎖であれ
ば、熱またはアルカリなどの適当な条件で解離させて一
本鎖とし、これをニトロセルロースフィルターやナイロ
ンフィルターなどに数時間焼付け固定する。

【０００５】次いで、場合によっては、標識一本鎖核酸
プローブのフィルターへの非特異的吸着を押えるため
に、プレハイブリダイゼーションを行う。ここで標識一
本鎖核酸プローブとは、検体試料中の標的一本鎖核酸の
有する特定塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する
一本鎖核酸であり、放射性標識、蛍光標識、酵素標識な
どの検出可能な標識が付与されているものである。

【０００６】次に、標的一本鎖核酸を固定したフィルタ
ーと標識一本鎖核酸プローブとをハイブリッドの形成に
適した緩衝液中に加え、これを一夜インキュベートす
る。その後フィルターに非特異的に吸着した標識核酸プ
ローブを適当な緩衝液でよく洗浄する。次いで、フィル
ターに固定化させた標的一本鎖核酸とハイブリッドを形
成している標識一本鎖核酸プローブの有する標識を用い
た標識に応じた方法で検出することにより検体試料中の
標的一本鎖核酸の存在あるいはその量を測定する。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】上記のフィルターを用
いた従来の測定法では、検体試料中の標的一本鎖核酸の
フィルターへの固定、一本鎖核酸プローブとのハイブリ
ダイゼーション、洗浄、標識の検出と、測定結果が得ら
れるまでの工程が煩雑であるばかりでなく、全工程に要
する時間も非常に長いという問題点を有し、これらの点
が、例えば日常的な臨床検査には適さない理由となって
いる。特に標的一本鎖核酸のフィルターヘの固定、洗浄
の工程は操作が煩雑で、これらの工程が全体の工程に要
する時間を長引かせる主因となっている。

【０００８】また、検出用の標識として一般的に用いら
れている放射性標識、蛍光標識、酵素標識等はその取扱
に充分な注意と経験が要求される場合が多く、その操作
に熟練しているかどうかが測定感度、測定精度に大きく
影響するという問題もある。これに対し、標的一本鎖核
酸を固定する固体坦体としてフィルターの代りに有機高
分子粒子を用いる改良技術（特開昭６３- １１７２６
２）が提案され、この技術によって、標的一本鎖核酸の
固定および洗浄操作はそれまでの方法に比べて簡単にな
ったものの、洗浄工程は必須でなお省略できるものでは
なく、洗浄工程に係わる煩雑さが解消されたわけではな
い。更に標識物の取扱に係わる上記の問題もなお残され
たままである。

【０００９】本発明の目的は、上述のハイブリダイゼー
ションを利用する核酸の検出方法における問題点を解決
し、検体試料中の標的一本鎖核酸を短時間で簡便に精度
良く検出できる方法を提供することにある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】従来の方法では、標的一
本鎖核酸と標識一本鎖核酸プローブとの反応がフィルタ
ー面上で行われ、しかも反応後には形成されたハイブリ
ッドと未反応の標識一本鎖核酸プローブが共存する。そ
こで、反応した標識一本鎖核酸プローブのみを検出する
ためには、標識一本鎖核酸プローブを取り込んだハイブ
リッドと未反応の標識一本鎖核酸プローブを洗浄によっ
て分離することが必要となる。

【００１１】本発明者らは、これらの点を考慮し、前述
の標的一本鎖核酸をフィルターに固定する従来の方法に
おける問題点について考察した結果、フィルターの代り
に固体微粒子を用いることで標的核酸の固定面積が増大
し、反応速度も大幅に上昇すること、さらにはハイブリ
ッドの形成が光学的に測定可能な凝集体の形成を起こす
ように反応系を設定することで、標識の使用を不要と
し、それを用いること関連する問題点をなくした核酸の
検出方法を提供できることを見出し、本発明を完成し
た。

【００１２】すなわち、本発明の核酸の検出方法は、検
体試料中に含まれる特定塩基配列を有する標的一本鎖核
酸を検出する方法において、前記標的一本鎖核酸に対し
て部分的な相補性を有する一本鎖核酸プローブを固体微
粒子表面に固定する過程と、該一本鎖核酸プローブが固
定された固体微粒子と前記検体試料とを液媒体中でハイ
ブリッド形成条件下で反応させ、標的一本鎖核酸・一本
鎖核酸プローブ・ハイブリッドを形成させるとともに該
ハイブリッドを介した固体微粒子の凝集物を形成する過
程と、該凝集物を光学的に検出する過程とを含むことを
特徴とする。

【００１３】以下、本発明について具体的に説明する。

【００１４】本発明に用いることのできる固体微粒子と
しては、例えば、シリカ、アルミナ、ベントナイトなど
の無機系微粒子、スチレン、塩化ビニル、アクリロニト
リル、酢酸ビニル、アクリル酸エステル類、メタクリル
酸エステル類等のビニル系モノマーの単一重合体及び共
重合体、スチレン- ブタジエン共重合体、メタクリレー
ト- ブタジエン共重合体などのブタジエン系共重合体な
どの各種ポリマーからなる固体微粒子を挙げることがで
きる。

【００１５】前記微粒子の径は、0.05〜5 μｍが好まし
く、0.1 〜2 μｍが特に好ましい。本発明の方法におい
ては、一本鎖核酸プローブが固体微粒子に固定される。
この一本鎖プローブ核酸としては、例えば高等動物、細
菌、かび、ファージを含むウイルス、各種プラスミドな
どに由来する遺伝子などを含む核酸断片、メッセンジャ
ーＲＮＡ、クローン化組換えＤＮＡ及び合成オリゴヌク
レオチドなどが利用でき、二本鎖である場合には適当な
条件下でそれを一本鎖化して用いる。また、これらを、
必要に応じて適当な制限酵素で処理して測定に適した長
さの断片としても良い。

【００１６】この一本鎖核酸プローブは標的一本鎖核酸
の有する塩基配列と相補的な塩基配列を有し、該相補部
分同士が二本鎖を形成することで一本鎖核酸プローブと
標的一本鎖核酸のハイブリッドを特異的に形成できるも
のである。しかも、該相補部分は、後述するハイブリッ
ドの形成にともなう固体微粒子の凝集が可能となるよう
に、標的一本鎖核酸の種類に応じて適宜選択される。該
相補部分は、標的一本鎖核酸及び一本鎖核酸プローブの
双方において、少なくとも各核酸の一部を構成するもの
であれば良く、また、該相補部分は各核酸において２以
上存在してもよい。

【００１７】固体微粒子への一本鎖核酸プローブの固定
は、通常の固定化技術が利用でき、例えば物理的吸着、
静電的吸着及び共有結合を含む化学的結合などを利用し
て行なうことができる。

【００１８】共有結合を利用する場合、固体微粒子表面
にカルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基、ホルミ
ル基、エポキシ基等の核酸と共有結合を形成し得る官能
基を存在させておくことで、共有結合による核酸の固定
を容易に行うことができる。共有結合を利用する方法と
しては、例えば、臭化シアン法、カルボジイミド法、イ
ソシアネート法、、アルキル化法などが利用できる。そ
の際、場合によっては一本鎖核酸プローブに対してあら
かじめ適当な化学修飾をおこなっても良い。

【００１９】次ぎに、本発明の方法で利用するハイブリ
ッドの凝集生成のメカニズムについて説明する。

【００２０】固体微粒子表面に固定された一本鎖核酸プ
ローブは実質的には様々な部位で固定されることにな
り、ハイブリッド形成に関与できる部分が異なった状態
で固定されるものが生じてくる。そこで、標的一本鎖核
酸と一本鎖核酸プローブの相補部分を適宜選択し、例え
ば、図１、２に模式的に示すように、一本鎖核酸プロー
ブ３を、標的一本鎖核酸２の部分Ａとハイブリッドを形
成することのできる部分Ａ’をフリーとする固定状態
と、標的一本鎖核酸２の部分Ａと重ならない部分Ｂとハ
イブリッドを形成することのできる部分Ｂ’をフリーと
する固定状態の２つの状態で固定すると、相補部分Ａ／
Ａ’、Ｂ／Ｂ’のハイブリダイゼーションによって図２
に示すようなハイブリッドを介した固体微粒子１の凝集
を生じさせることができる。また、図３に示すように一
本鎖核酸Ａ’のみを固定化させた微粒子と、一本鎖核酸
Ｂ’のみを固定化させた微粒子を混合して用いることに
より、Ａ／Ａ’、Ｂ／Ｂ’のハイブリダイゼーションに
よって図４に示すような凝集状態を生じさせることがで
きる。さらに、上記２例では２種類の一本鎖核酸プロー
ブを用いているが、３種以上の一本鎖核酸プローブを用
いても、同様の凝集を生じさせることができる。

【００２１】ハイブリッド形成の条件は、検体試料や一
本鎖核酸プローブの種類に応じて適宜選択され、通常の
ハイブリダイゼーション反応に用いられている条件が利
用できる。例えば、反応の液媒体としては、水を主成分
とする各種のハイブリダイゼーション用の緩衝液が利用
できる。なお、反応媒体中には、非特異的ハイブリッド
の形成の防止などの目的で、サケ精子ＤＮＡ、ドデシル
硫酸ナトリウム、ホルムアミドなどを必要に応じて添加
しても良い。また、一本鎖核酸プローブが固定された固
体微粒子の液媒体中での安定化をはかるために、ハイブ
リッド形成を阻害しない範囲内で界面活性剤、水溶性高
分子などを添加することもできる。

【００２２】こうしてハイブリッド形成によって生じた
凝集は光学的分析法によって測定可能となる。例えば、
ハイブリダイゼーション反応を行って得た反応混合物の
透過光強度を測定する方法、散乱光強度を測定する方
法、透過光と散乱光の強度を組み合せて測定する方法な
どの光学的手段を用いた方法により、凝集生成の有無や
その程度を測定することができる。

【００２３】測定には、角型セルを用いる分光光度計や
凝集塊を一つずつセルに送り込み測定するフローセルを
用いた分析装置などが利用できる。フローセルタイプの
ものとしては、例えば臨床検査、30(11)、1259(1986)に示
されているような光軸直行型、同一光軸型のフローサイ
トメーターが好適に用いられる。

【００２４】

【実施例】

実施例１１）一本鎖核酸プローブ固定化固体微粒子の調製１重量％の高分子固体微粒子水分散液（粒子径０．８μ
ｍ、高分子組成；スチレン−アクリルアミド共重合体）
５００μｌにＭ１３ｍｐ１８一本鎖核酸溶液（核酸濃
度；１０μｇ／ｍｌ、溶媒；リン酸緩衝生理食塩水（Ｐ
ＢＳ）に０．１Ｍの濃度でＭｇＣｌ₂ を含有させたも
の）２５００μｌを添加、混合し、室温に１０分間放置
した。遠心分離後、沈殿固体微粒子層に下記組成の前処
理液の１．５ｍｌを添加して、固体微粒子をこれに分
散、懸濁させた、これを室温に１０分間放置した。

【００２５】前処理液組成；２０×ＳＳＣ１０ｍｌ、１００×Denhardt液５ｍｌ、一本鎖化サケ精子ＤＮＡ（１０ng/ml) ２ｍｌ、ホルムアミド５０ｍｌ、水３３ｍｌ。

【００２６】遠心分離後、沈殿固体微粒子層をＰＢＳに
分散させ、Ｍ１３ｍｐ１８一本鎖核酸がプローブとして
固定された高分子固体微粒子の分散液（分散濃度０．５
重量％、以下プローブ分散液という）を得た。

【００２７】２）標的一本鎖核酸との反応下記組成の標的一本鎖核酸を含む検体試料溶液を調製
し、その１００μｌと先の１）項で調製したプローブ分
散液１００μｌとを混合し、これを４０℃で２時間放置
して反応させた。

【００２８】検体試料溶液組成；２０×ＳＳＣ１０ｍｌ、１００×Denhardt液１ｍｌ、一本鎖化サケ精子ＤＮＡ（１０ng/ml ）１ｍｌ、ホルムアミド５０ｍｌ、水１８ｍｌ、Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦＤＮＡを一本鎖化したもの（１００ng/ml ）２０ｍｌ。

【００２９】３）反応混合液に生じた凝集状態の光学的
測定先に２）項での反応で得られた反応混合液をＰＢＳによ
り２５００倍に希釈し、反応混合希釈液を得た。この反
応混合液希釈液を波長488nm のレーザー光を用いるフロ
ーサイトメーターで分析した。分析は、反応混合希釈液
を測定セル中に送り、１００００個のカウント粒子中に
含まれる単一粒子のカウント数の比率Ｃｄ（単一粒子の
比率、単位％）より凝集の度合を算出した（１００−Ｃ
ｄ、単位％）。５回の測定の平均値を表１に示す。ま
た、あわせて、反応前のプローブ分散液をＰＢＳにより
５０００倍に希釈し、上記と同様の方法により凝集の度
合を算出した結果も示す。

【００３０】

【表１】すなわち、反応により凝集が進行しているのが認められ
た。

【００３１】比較例１二本鎖の状態の、すなわちＭ１３ｍｐ１８ＲＦＤＮ
Ａを一本鎖化しないでそのまま用いる以外は実施例１と
同様に検体試料液を調製し、以下実施例１と同様にして
プローブ分散液との混合による凝集生成の有無をフロー
サイトメトリーにより測定したところ、凝集生成は認め
られなかった。

【００３２】

【発明の効果】本発明の核酸の分析方法によれば、従来
の方法におけるハイブリダイゼーション後の洗浄工程を
省略することができ、測定のための全工程の所用時間を
大幅に短縮することが可能となる。更に、取扱に熟練し
た技術が要求され、その取扱操作が検出感度や精度にも
影響する標識物質が不用なので、標識物質を使用するこ
とに起因するこのような問題がなく、簡便で精度良い測
定が可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の方法におけるハイブリッド形成時にお
ける凝集ノメカニズムを説明するための図である。

【図２】本発明の方法におけるハイブリッド形成時にお
ける凝集ノメカニズムを説明するための図である。

【図３】本発明の方法におけるハイブリッド形成時にお
ける凝集ノメカニズムを説明するための図である。

【図４】本発明の方法におけるハイブリッド形成時にお
ける凝集ノメカニズムを説明するための図である。

【符号の説明】

１固体微粒子２標的一本鎖核酸３一本鎖核酸プローブ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者桜永昌徳東京都大田区下丸子３丁目30番２号キヤノン株式会社内 (72)発明者川口正浩東京都大田区下丸子３丁目30番２号キヤノン株式会社内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】検体試料中に含まれる特定塩基配列を有
する標的一本鎖核酸を検出する方法において、前記標的
一本鎖核酸に対して部分的な相補性を有する一本鎖核酸
プローブを固体微粒子表面に固定する過程と、該一本鎖
核酸プローブが固定された固体微粒子と前記検体試料と
を液媒体中でハイブリッド形成条件下で反応させ、標的
一本鎖核酸・一本鎖核酸プローブ・ハイブリッドを形成
させるとともに該ハイブリッドを介した固体微粒子の凝
集物を形成する過程と、該凝集物を光学的に検出する過
程とを含むことを特徴とする核酸の検出方法。