CN110184392B - 检测ebv相关基因的电化学生物传感器及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种检测EBV相关基因的电化学生物传感器及其制备方法，该传感器包括底物链B、底物链A以及连接链，本发明构建了新型均相酶学体系和双模板化的纳米材料，该传感器无需复杂反应底物修饰，电流响应迅速，灵敏度高、特异性强，有望成为具有实际应用价值的传感器。

Description

检测EBV相关基因的电化学生物传感器及其制备方法
技术领域
本发明涉及核酸检测及电化学生物传感技术领域，特别是涉及一种检测爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)相关基因的电化学生物传感器及其制备方法。
背景技术
爱波斯坦-巴尔病毒(EBV)是γ-疱疹亚家族的一种DNA病毒。其潜伏状态可作为传染性单核细胞增多症的致病因素，并与Burkitt淋巴瘤、口腔癌、胃癌、鼻咽癌(NPC)、Hodgkin淋巴瘤、免疫缺陷个体的淋巴增生性疾病等有关。值得一提的是，EBV引起的鼻咽癌其发生率因地理区域、种族和性别的不同而有很大差异。目前，EBV感染的常规检测包括：(1)血清学检查：Western blot、ELISA检测EBV病毒衣壳抗原抗体IgA、EB核抗原IgM抗体以及早期抗原IgG抗体，由于抗体水平低，无法有效的鉴别疾病的早期阶段。(2)核酸检测：聚合酶链反应(PCR)，实时荧光定量PCR。(3)组织病理学检查：免疫组化、原位杂交等。其中，酶联免疫法主要是利用酶标抗体与吸附在固相载体上的抗原发生特异性结合，在底物作用下出现颜色反应，通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此方法特异性高，但耗时且灵敏度低，血清与体液中的嗜异性抗体，抗类风湿因子等自身抗体也可干扰测定结果，且不易应用于组织和细胞内部的标志物检测。基于PCR的方法灵敏度高，但是需要严格的温度控制和复杂的序列设计。另一方面，组织病理学检查能直观展现结果，但是对身体有创。因此，针对EBV核酸载量的灵敏分析对NPC的早期检测、预测和监测具有重要意义。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供检测EBV相关基因的电化学生物传感器及其制备与应用。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供用于检测EBV相关基因的试剂盒，包括底物链B(以下简称AB链)，其含有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列：
(SEQ ID NO.2)；其中，单下划直线标示的碱基为与捕获探针CP互补结合的区域，双下划直线标示的碱基为与LP互补结合的区域。
可选地，还包括底物链A(以下简称AA链)，包括靶基因结合区、底物链B结合区，所述底物链B结合区连接至所述靶基因结合区的3’端，所述底物链B结合区含有如下核苷酸序列：
5’-CCATCCCGAGCAACCCAGTG-3’。
可选地，还包括错配区，所述错配区连接至所述靶基因结合区的5’端，错配区可替代5’-PO4吸引Lambda核酸外切酶(简称λexo)的活性中心定位到5’末端第一个磷酸二酯键上。
可选地，所述错配区的碱基个数为1-4个，错配碱基的个数以及具体碱基的选择可根据实际操作中λexo对底物的水解效率而定。
可选地，所述错配区为5’-CT-3’。
可选地，所述靶基因结合区含有如下所示核苷酸序列：
5’-TCTTGTGTCCAGGCATCCCT-3’，靶基因结合区的序列与靶基因序列互补，根据所检测的靶基因的不同，靶基因结合区的序列也可随之改变。
可选地，还包括连接链(以下简称LP链)，所述连接链包括底物链B结合区，所述底物链B结合区含有如下所示核苷酸序列：
5’-CCATCCCGAGCAACCCAGTG-3’，该序列与底物链B互补结合。
可选地，还包括连接至所述底物链B结合区5’端的隔离区。
可选地，所述隔离区为4-8个重复碱基。
可选地，所述隔离区的重复碱基选自胸腺嘧啶(T)或腺嘌呤(A)。
可选地，还包括连接至所述隔离区5’端的羧基。
可选地，还包括捕获探针，其包括底物链B结合区，所述底物链B结合区含有如下所示核苷酸序列：
5’-GTCAGCTTATGC-3’。
可选地，还包括连接至所述底物链B结合区3’的隔离区。
可选地，所述隔离区为4-8个重复碱基。
可选地，所述隔离区的重复碱基选自胸腺嘧啶(T)或腺嘌呤(A)。
可选地，还包括连接至所述隔离区3’端的-(CH2)6-SH。
可选地，还包括核酸外切酶及其缓冲液。
可选地，所述核酸外切酶选自Lambda核酸外切酶(简称λexo)、核酸外切酶I、核酸外切酶III、T7核酸外切酶中的至少一种。上述核酸外切酶及其缓冲液可以从市场上购买得到。
优选地，所述核酸外切酶及其缓冲液选自Lambda核酸外切酶(λexo)及10×Lambda核酸外切酶(λexo)反应缓冲液。
可选地，还包括聚酰胺-胺(PAMAM)树枝状大分子封装的金属纳米复合物。
聚酰胺-胺树枝状大分子(PAMAM)是一种对称的、单体分散的超支化大分子，它由一些胺基构成并含有上百个位点以偶联其他活性物质。聚酰胺-胺树枝状大分子的低毒性、高度规则、支化的三维结构使其在能成为金属纳米材料形成的模板并形成稳定的树枝状大分子复合物或者纳米复合材料。
可选地，所述金属纳米复合物上还交联有DNA模板。
金属纳米团簇(mNCs)因其具有大表面积和良好电子性能，其中银纳米团簇(AgNCs)是典型的代表。DNA模板化的银纳米团簇通过C-Ag+-C配对形成的新型mNC，由少量银原子组成，直径通常小于2nm。
可选地，所述金属纳米复合物中的金属元素选自银、镍、金中的任一种。
优选地，所述金属纳米复合物中的金属元素为银。
可选地，所述DNA模板含有如下所示核苷酸序列：
5’-HOOC-ACCCGAACCTGGGCTACCACCCTTAATCCCC-3’。
适用于本发明的DNA模板不限于上述序列，以其他DNA模板合成DNA模板化的银纳米簇能直接产生电化学信号时，其DNA模板也适用于本发明。
本发明第二方面提供一种工作电极，所述工作电极上固定有捕获探针，所述捕获探针可与底物链B部分互补结合。
可选地，所述捕获探针为巯基修饰的捕获探针，含有如下核苷酸序列：
5’-GTCAGCTTATGCTTTTTTT-(CH2)6-SH-3’。
可选地，含有所述捕获探针的摩尔量为200nM～1000nM，优选为500nM。具体可以为200nM、250nM、300nM、350nM、400nM、450nM、500nM、550nM、600nM、650nM、700nM、750nM、800nM、850nM、900nM、950nM、1000nM等。
可选地，所述工作电极选自金电极、玻碳电极、氧化铟锡电极中的任一种。
对于非金电极，如玻碳电极等，可以先在电极上电沉积金膜，然后将捕获探针修饰至电极上，使得捕获探针与金膜之间通过“Au-S”键结合。
优选地，所述工作电极为金电极。
本发明第三方面提供一种检测EBV相关基因的电化学生物传感器，包括上述工作电极。
可选地，还包括上述底物链A(AA)。
可选地，还包括上述底物链B(AB)。
可选地，还包括上述连接链(LP)。
可选地，还包括双模板封装的金属纳米复合物，其中的模板包括利用胺基封端的第五代聚酰胺-胺树枝状大分子、DNA模板，所述连接链可与所述聚酰胺-胺树枝状大分子连接。
可选地，还包括参比电极、对电极，工作电极、参比电极、对电极构成三电极系统。
可选地，所述参比电极选自银/氯化银电极(Ag/AgCl)、饱和甘汞电极(SCE)中的任一种；优选为饱和甘汞电极。
可选地，所述对电极选自铂丝电极。
本发明第四方面提供一种检测EBV相关基因的电化学生物传感器的制备方法，采用上述试剂盒，包括如下步骤：
1)制备工作电极，在所述工作电极上固定捕获探针，然后封闭电极表面未结合位点并使捕获探针保持单层有序状态；
2)制备纳米材料：制备PAMAM树枝状大分子以及DNA模板封装的金属纳米复合物，并将连接链连接至该复合物；
3)制备循环放大体系：预先将底物链A、底物链B混合反应，形成双链DNA产物，加入核酸外切酶及其缓冲液，得到反应液；
4)将步骤3)所得反应液加至所述步骤1)制得的工作电极，反应结束后，将所述步骤2)制得的所述复合物加至所述工作电极，反应结束后，备用；
5)扫描测定：将步骤4)制得的所述工作电极置于本底溶液中，结合参比电极、对电极，用差分脉冲伏安法进行扫描测定，得到测定结果。
可选地，所述步骤1)中，采用6-巯基己醇(以下简称MCH)对电极表面未结合位点进行封闭。
可选地，所述步骤2)中，所述PAMAM树枝状大分子选自利用胺基封端的第五代PAMAM树枝状聚合物。
可选地，所述步骤2)中，先将DNA template、AgNO3、NaBH4混合反应，制得DNA封装的银纳米复合物。
可选地，所述步骤2)中，按摩尔计，DNA模板：AgNO3：NaBH4＝1：6：6。
可选地，所述步骤2)中，PAMAM树枝状大分子、AgNO3、NaBH4混合反应，制得PAMAM封装的银纳米复合物。
可选地，所述步骤2)中，将连接链、DNA封装的银纳米复合物、PAMAM树枝状大分子封装的银纳米复合物混合反应，制得PAMAM树枝状大分子以及DNA模板封装、并连接有连接链的银纳米复合物。
可选地，所述步骤2)中，所述连接链与所述DNA封装的银纳米复合物的摩尔比为(1-3)：(1-3)，具体可以为3:1、2:1、1:1、1:2、1:3等。
可选地，所述步骤3)中，所述核酸外切酶的浓度为0.04-0.24unitμL-1，具体可以为0.04unitμL-1、0.08unitμL-1、0.12unitμL-1、0.16unitμL-1、0.20unitμL-1、0.24unitμL-1等。
可选地，所述步骤3)中，待检测基因、核酸外切酶及其缓冲液混合反应的时间为40-140min。具体可以为40min、60min、80min、100min、120min、140min等。
可选地，所述步骤3)中，所述核酸外切酶选自λ噬菌体核酸外切酶(即λexo)。
可选地，所述步骤5)中，扫描范围-0.2V～0.3V、幅度50mV，脉冲宽度16.7ms，脉冲周期200ms。将位于约+0.055V的峰值电流作为电流响应信号。
如上所述，本发明的检测EBV相关基因的电化学生物传感器及其制备方法，具有以下有益效果：本发明成功构建了用于EBV相关基因的电化学生物传感器及其检测体系，应用本发明的传感器，对EBV相关基因的测定显示了宽至6个数量级的检测范围、灵敏度高、特异性强，适用于稀释血清样本中的EBV相关基因的测定等。与传统技术相比，克服了复杂的生物标记过程、灵敏度高、特异性好，有望成为具有实际应用价值的生物传感器。
附图说明
图1显示为本发明实施例的检测原理示意图。
图2显示为本发明实施例中的AgDNCs(A)、DNA/AgNCs(B)和AgDNCs@DNA/AgNCs(C)透射电镜图。
图3显示为本发明实施例中捕获探针CP/EBV相关基因参与的LNSAR的产物/纳米探针AgDNCs@DNA/AgNCs-LP共聚物的电化学EBV相关基因传感器组装过程的交流阻抗图。
图4显示为本发明实施例中捕获探针CP/EBV相关基因参与的LNSAR的产物/纳米探针AgDNCs@DNA/AgNCs-LP共聚物的电化学传感器组装过程的循环伏安曲线图。
图5显示为本发明实施例中空白对照体系、无LNSAR扩增放大反应的对照体系、无DNA/AgNCs的对照体系以及含有LNSAR和AgDNCs@DNA/AgNCs-LP共聚物体系的电化学差分脉冲伏安扫描信号对比图。
图6显示为本发明实施例中LNSAR体系的电泳验证图。
图7显示为本发明实施例中LP与DNA/AgNCs的浓度比例与其所构建的电化学EBV相关基因传感器信噪比结果图。
图8显示为本发明实施例中不同λexo浓度下LNSAR体系与其所构建的电化学EBV相关基因传感器差分脉冲伏安扫描结果图。
图9显示为本发明实施例中不同孵育时间下LNSAR体系与其所构建的电化学EBV相关基因传感器差分脉冲伏安扫描结果。
图10-1显示为本发明实施例中8种EBV相关基因浓度(a)0pM、(b)0.001pM、(c)0.01pM、(d)0.1pM、(e)1pM、(f)10pM、(g)100pM和(h)1nM下所构建的电化学EBV相关基因传感器差分脉冲伏安扫描曲线图
图10-2显示为本发明实施例中8种EBV相关基因浓度(a)0pM、(b)0.001pM、(c)0.01pM、(d)0.1pM、(e)1pM、(f)10pM、(g)100pM和(h)1nM下所构建的电化学EBV相关基因传感器差分脉冲伏安扫描结果与EBV相关基因浓度的对数的线性关系图。
图11为本发明实施例构建的电化学EBV相关基因传感器的特异性分析结果图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
超灵敏的核酸和蛋白质检测对于探索生命过程、解密疾病分子机制以及疾病标志物的甄选具有极其重要的意义。同时，临床早期快速诊断和个体化治疗是提高肿瘤、传染性疾病等重大疾病患者生存率的关键，对筛查和初诊患者组织或体液中低丰度核酸、蛋白标志物的即时、快速、高灵敏检测是疾病早期诊断的最有效手段之一。EBV相关基因的分析对NPC治疗反应的早期检测、预测和监测具有重要意义，也可作为移植后癌症风险的评估指标，例如移植后淋巴增殖性疾病、T细胞和NK细胞淋巴瘤。
本发明旨在研究一种简单、灵敏的电化学生物传感器，用于EBV相关基因的检测。
实施例1制备电化学EBV相关基因检测传感器
1.材料与方法
1.1材料
Lambda核酸外切酶(以下简称λexo)和10×λexo反应缓冲液(670mM glycine-KOH,25mM MgCl2,500μg mL-1BSA,pH 9.4)购自美国New England Biolabs公司，6-巯基己醇(MCH)、胺基封端PAMAM树枝状大分子(G5.0)和三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)均购自美国Sigma-Aldrich公司，1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)和1×TE缓冲液(pH 8.0)购自生工生物工程(上海)股份有限公司，AgNO3购自广州市金华大化学试剂有限公司，NaBH4购自成都市科龙化工试剂厂，乙醇沉淀试剂盒和DNA Marker(20bp)均购自宝生物工程(大连)有限公司(即大连TaKaRa公司)，核酸染料GoldView I购自北京索莱宝科技有限公司(即北京Solarbio公司)，所有经HPLC纯化的DNA序列均上海生工生物工程有限公司由合成。
捕获探针(以下简称CP)的序列为：(SEQ ID NO.1)；其中，单下划直线标示的碱基为与单链AB(即底物链B)互补结合区域，双下划直线标示的碱基为隔离区，用于延伸探针的整体长度，使其与单链AB互补结合的区域充分结合至单链AB。
λexo可水解5’末端含磷酸基团的双链DNA，单链AA(即底物链A)作为λexo水解底物链，EBV相关基因可与AA完全互补结合，现有技术中，单链AA-1的核苷酸序列为：
5’-PO4-TCTTGTGTCCAGGCATCCCTCCATCCCGAGCAACCCAGTG-3’(SEQ ID NO.2)，该序列需要预先进行磷酸化。
λexo还可以识别水解5’末端凸出2个核苷酸(2-nt)的双链DNA，AA作为λexo水解底物链，EBV相关基因可与AA完全互补结合，进而形成双链其中5’末端凸出2-nt的错配结构，所述单链AA的核苷酸序列为：
(SEQ IDNO.3)；
上述核苷酸序列中，单下划直线标示的碱基为2-nt错配碱基，双下划直线标示的碱基为与靶基因完全结合区域，单下划波浪线标示的碱基为与单链AB部分结合区域。
单链AB的核苷酸序列为：
(SEQ ID NO.4)；其中，单下划直线标示的碱基为与CP互补结合区域，双下划直线标示的碱基为与LP互补结合区域。
靶基因(EBV相关基因)的核酸序列为：
5’-AGGGATGCCTGGACACAAGA-3’(SEQ ID NO.5)，该靶基因片段序列来源于文献：2014.Int.J.Mol.Sci.15,9051-9066.Part 3.1。
DNA template由于其作为银纳米团簇形成的模板，棒状中性簇核(即Ag0)是外围。被碱基结合的Ag+包围Ag+可与嘧啶的N3位和嘌呤的N7位结合，中心富含胞嘧啶(C)，
DNA template的核苷酸序列为：
5’-HOOC-ACCCGAACCTGGGCTACCACCCTTAATCCCC-3’(SEQ ID NO.6)，该DNAtemplate的序列信息来源于文献：2017.Biosens.Bioelectron.93,293-297.Table S2。
连接链(以下简称LP)的核苷酸序列为：
(SEQ ID NO.7)，其中，双下滑直线标示的碱基为与单链AB互补结合的区域，单下滑直线标示的碱基为隔离区，用于延伸连接链的长度，使得与单链AB互补结合的区域充分结合至单链AB。
1.2检测仪器
所有电化学检测均在上海辰华CHI660D电化学工作站进行，形貌像结果来自场发射电镜JEM 2100。
1.3检测原理
图1显示为本发明实施例的检测原理示意图。工作电极为裸金电极，巯基修饰的捕获探针通过金-硫键固定至裸金电极上，随后用MCH封闭电极上的未结合位点。在λexo辅助非磷酸化底物偏好反应的均相体系中，EBV相关基因能与双链底物(AA/AB)结合形成5’端2核苷酸凸出位点，λexo识别此结构并水解双链底物中的与EBV相关基因结合的AA，释放出AB和循环利用EBV相关基因，完成λexo辅助的EBV相关基因(EBV相关基因)循环反应。游离出的大量短链DNA与电极上的捕获探针牢固结合，再和共聚物上的LP互补结合从而将AgDNCs@DNA/AgNCs-LP共聚物连接至电极表面，形成捕获探针/短链DNA/AgDNCs@DNA/AgNCs-LP共聚物的三夹心结构，通过AgDNCs@DNA/AgNCs-LP共聚物在0.1M PB中进行差分脉冲伏安扫描，产生显著的电学信号。通过检测DPV电流信息即可获得待测EBV相关基因的量。
具体地，银树枝状大分子纳米复合物(AgDNCs)以氨基封端的PAMAM(G5.0)为模板，通过NaBH4原位还原制备得到。DNA/AgNCs以富含C碱基的DNA为模板，通过NaBH4原位还原制备。AgDNCs@DNA/AgNCs-LP conjugates通过树枝状聚合物表面丰富的-NH2与DNA/AgNCs和LP的5’末端-COOH之间的酰胺化反应来制备。通过Au-S键将硫醇化的CP固定在裸金电极上，然后用MCH封闭电极表面未结合的位点并保持CP在电极表面的单层直立状态。在均相反应体系中，λexo具有识别含5’非磷酸化的2-nt凸出末端的双链DNA底物作用，并能逐步水解其中凸出2个核苷酸的DNA链。因此，本发明设计了双链DNA复合物(AA/AB)为LNSAR的初始结构。AA作为λexo水解底物，其包含三个功能区域，具体为5’末端的两个错配碱基(图1中AA链的红色部分，核苷酸序列中单下划直线部分)、EBV相关基因互补区域(图1中AA链的黄绿色部分，核苷酸序列中双下划直线部分)和AB链结合结构域(图1中AA链的黑色部分，核苷酸序列中单下划波浪线部分)，核苷酸序列为 AB可作为LNSAR的输出链，其具有与CP和LP结合的两个功能区域(分别为图1中AB链的黄色、绿色部分，具体为/>当EBV相关基因不存在时，AA/AB双链底物中AA链的5’末端处于游离状态，λexo不能识别并水解双链底物。而当EBV相关基因存在时，AA/AB复合体中AA的5’末端可形成2个核苷酸错配的双链体。随后，λexo将AA链5’末端的磷酸盐吸引到其带正电的口袋中，并将AA链5’末端的第一个磷酸二酯键定位到λexo的活性中心，水解磷酸二酯键，形成新的5’-PO4末端并重复消化AA，直至AA被完全水解，释放出AB，EBV相关基因可进入下一轮循环放反应，进行信号放大。将上述均相反应体系产物滴加在固定有CP的工作电极上，输出产物AB与CP特异性的结合，暴露出AB链上的AgDNCs@DNA/AgNCs-LP conjugates的结合位点。将预先制备好的AgDNCs@DNA/AgNCs-LP conjugates滴加在上述工作电极上，其可以与AB链特异性结合，在工作电极表面形成包含CP/AB/AgDNCs@DNA/AgNCs-LP conjugates的经典的“三夹心”结构，进而产生显著放大的电化学信号。
2.工作电极的制备
(1)金电极表面处理：
取裸金电极(3mm直径)，用0.05μm的氧化铝粉末抛光呈“镜面状”，用超纯水充分冲洗，然后分别浸没在去离子水、无水乙醇和去离子水中超声5min以移除残留的氧化铝粉末。随后，滴加10μL食人鱼溶液(浓H2SO4与30％H2O2体积比为3:1)于前述处理的工作电极表面，孵育10min以消除其他的杂质，用超纯水清洗工作电极后室温晾干；
(2)捕获探针的固定
将捕获探针CP(0.5μM)预先用50μM TCEP室温处理1小时，断裂巯基修饰的捕获探针之间的二硫键，随后滴加10μL上述处理的CP溶液于洁净的工作电极表面，4℃过夜孵育，使CP牢固固定在工作电极表面。
(3)封闭
将步骤(2)中孵育完的工作电极用洗涤缓冲液(20mM Tris,0.1M NaCl,5mMMgCl2and 0.05％Tween-20,pH 7.4)清洗三次之后，滴加10μL 1mM MCH室温孵育1h以封闭电极表面未结合位点，并保持CP的单层直立状态。再次用洗涤缓冲液清洗工作电极三次，得工作电极待用。
3.纳米材料的制备
(1)PAMAM树枝状大分子封装的银纳米复合物(即AgDNCs)的制备
将66.7μL 1.5mM的PAMAM树枝形大分子与300μL 10mM AgNO3溶液搅拌混合20min以形成Ag+/PAMAM树枝状大分子复合物。随后，将120μL 50mM新制备的NaBH4溶液逐滴添加到上述混合物中，室温下连续搅拌40min以还原Ag+。然后，所得溶液变为棕黄色，表明Ag+还原为Ag0并形成AgDNCs。
(2)DNA封装的银纳米团簇(即DNA/AgNCs)的制备
DNA模板、AgNO3、NaBH4的最终摩尔比为1：6：6。将40μL 300μM的AgNO3水溶液加入到40μL 50μM的DNA模板溶液中，室温下剧烈搅拌30s，然后在4℃的避光孵育15min以形成DNA-Ag+复合物。然后，将新鲜制备的40μL 300μM NaBH4溶液快速加入至上述混合物溶液，室温下剧烈振荡30s，以诱导Ag+的还原，制得DNA封装的银纳米团簇(即DNA/AgNCs)。将所得溶液在4℃避光至少4小时后再使用。
(3)AgDNCs@DNA/AgNCs-LP共聚物的制备
利用胺基封端的第五代PAMAM树枝状聚合物表面上具有数百个亲水氨基官能末端。通过AgDNCs上的-NH2与LP和DNA/AgNCs的5’-COOH之间的酰胺化反应，将LP和DNA/AgNCs同时修饰到步骤(1)中的AgDNCs表面上。
具体步骤为：在室温下，温和搅拌下，将100μL 133nM LP和100μL 67nM DNA/AgNCs添加至2mL含有1mM EDC的AgDNC溶液中，室温下温和搅拌约10h，以完成LP和DNA/AgNCs在AgDNC表面的缀合过程。将所得溶液以16000g离心20min，并将离心沉淀重悬于400μL 0.3MPB(pH7.0)中。将AgDNCs@DNA/AgNCs-LP共聚物溶液在4℃下避光储存以待下一步使用。
4.λexo辅助的非磷酸化底物偏好反应即LNSAR的操作过程
将1×TE缓冲液稀释的AA和AB溶液按AA：AB＝1：1的摩尔比混合(AA/AB终浓度为2μM)，在95℃下水浴变性5min，随后逐渐冷却至室温，形成稳定的双链底物(AA/AB)，将2μM的AA/AB作为双链复合物的母液，储存在4℃待用。
将12.5μL 2μM AA/AB、2μL 5unitμL-1λexo和20μL一系列不同浓度的EBV相关基因、5μL10×λexo反应缓冲液以及10.5μL去离子水混合，形成50μL混合液中，其中10×λexo反应缓冲液被稀释10倍，在37℃下孵育100min以产释放大量的AB。随后，将上述混合物在85℃持续5min以灭活λexo再冷却至室温。为了减少酶促缓冲液对反应电极表面造成的不稳定性，通过乙醇沉淀纯化LNSAR的产物，然后溶解在50μL的1×TE缓冲液(pH 8.0)中。
乙醇沉淀纯化步骤具体为：
将LNSAR的反应产物加入5μL 3M乙酸钠(pH 5.2)、4μLDr.GenTLE PrecipitationCarrier和150μL无水冰乙醇中，涡旋振荡约1min。将上述混合物在12000rpm、4℃下离心15min，弃去上清液。然后，将沉淀物用70％体积分数的冰乙醇冲洗并再次以12000rpm在4℃下离心5min。最后，丢弃上清液并室温干燥。将沉淀溶解在1×TE缓冲液(pH 8.0)中。
5.电化学EBV相关基因传感器的使用
(1)取10μL步骤4中已纯化的LNSAR产物，滴加至步骤2中已封闭处理的工作电极上，37℃反应40min；
(2)用洗涤缓冲液清洗三次后，滴加10μL步骤3中制备的AgDNCs@DNA/AgNCs-LP共聚物溶液于工作电极上，37℃孵育1h，用0.1M PB清洗工作电极三次；
(3)用0.1M PB(pH 7.0)作为本底溶液，将工作电极置于其中，饱和甘汞电极即SCE为参比电极，铂丝电极为对电极，在室温下，用差分脉冲伏安法即DPV进行扫描测定。具体参数为：扫描范围-0.2V～0.3V、幅度50mV，脉冲宽度16.7ms，脉冲周期200ms。将位于约+0.055V的峰值电流作为电流响应信号。
实施例2电化学EBV相关基因传感器的表征和检验
对实施例1中所制备的纳米材料进行的高分辨率透射电镜即HRTEM表征如下：
(1)如图2A所示，AgDNCs在HRTEM下呈现均一、单体分散的球形结构，粒径约为3.81nm；
(2)如图2B所示，DNA/AgNCs在HRTEM下呈现球形结构，粒径小于2nm；
(3)如图2C所示，AgDNCs@DNA/AgNCs-LP共聚物在HRTEM下呈现出较均一大小，粒径约为7.19nm。
对实施例1所得电化学EBV相关基因传感器进行如下表征：
1.电化学EBV相关基因传感器组装过程的电化学表征
如图3所示为不同修饰过程的工作电极在含有5mM铁氰化钾的0.1M KCl缓冲溶液中的交流阻抗曲线图：
a为裸金电极；
b为固定有捕获探针的工作电极；
c为MCH封闭后的工作电极；
d为加入EBV相关基因参与的LNSAR扩增产物后；
e为加入AgDNCs@DNA/AgNCs-LP共聚物后。
a、b、c、d、e曲线所对应的方法参照实施例1。
由于裸金电极对负电氧化还原探针[Fe(CN)6]3-/4-的强电子转移能力，裸金电极表现出非常小的半圆形区域(曲线a)。当CP组装至裸金电极上，电子转移阻抗值即Ret由于[Fe(CN)6]3-/4-对带负电荷的DNA链的静电排斥而产生上升(曲线b)。MCH封闭处理后，Ret进一步增加(曲线c)，因为它们阻止了电子在电极表面的转移。当EBV相关基因参与下的LNSAR产物滴加至电极表面时，Ret显著增加(曲线d)，显示LNSAR成功释放了AB，AB与CP部分杂交进一步增加了带负电荷的DNA链。随后，与AgDNCs@DNA/AgNCs-LP共聚物孵育并洗涤后，Ret显著降低(曲线e)，这归因于银纳米复合物在PAMAM树枝状大分子和DNA模板上的良好导电性。表明LNSAR和AgDNCs@DNA/AgNCs-LP共聚物的成功进行并良好整合至电化学EBV相关基因传感器的工作电极上。
如图4所示为不同修饰过程的工作电极在含有5mM铁氰化钾的0.1M KCl缓冲溶液中的方波伏安响应曲线图：
a为裸金电极；
b为固定有捕获探针的工作电极；
c为MCH封闭后的工作电极；
d为加入EBV相关基因参与的LNSAR扩增产物后；
e为加入AgDNCs@DNA/AgNCs-LP共聚物后。
a、b、c、d、e曲线所对应的方法参照实施例1。
结果与图3结果表现出良好的一致性，有效地表征了工作电极表面的逐层组装过程。
2.对LNSAR和DNA/AgNCs的双重信号放大的验证
图5中的曲线说明如下：
a为空白对照体系(LNSAR+AgDNCs@DNA/AgNCs-LP共聚物)；
b为无LNSAR放大体系的对照体系(AB+AgDNCs@DNA/AgNCs-LP共聚物)，实验中，此处无靶基因参与，仅是验证LNSAR放大作用；
c为无DNA/AgNCs增强体系的对照体系(靶基因+LNSAR+AgDNCs-LP共聚物)；
d为包含LNSAR和AgDNCs@DNA/AgNCs-LP共聚物的双重信号放大体系(靶基因+LNSAR+AgDNCs@DNA/AgNCs-LP共聚物)。
如图5所示，当电化学EBV相关基因生物传感器体系中不存在EBV相关基因时，空白对照显示出低的DPV信号(曲线a)，当体系中存在EBV相关基因时，实验组显示出显著增加的DPV信号(曲线d)。
为了探究LNSAR和DNA/AgNCs的信号放大作用，曲线b显示的是没有LNSAR参与的DPV信号，明显低于曲线d的电流值，此外，在纳米材料共聚物上不加DNA/AgNCs，其电流响应信号也低于曲线d，以上结果成功验证LNSAR和DNA/AgNCs的双重信号放大作用。
3.对LNSAR水解机制验证
对实施例1中的LNSAR水解机制用12％native PAGE进行验证。
具体过程为：电泳在1×TBE缓冲液(89mM Tris-硼酸，2mM EDTA，pH8.3)中在100V恒定电压下进行45分钟。然后，将凝胶浸入新制备的染色溶液(80mL含有4μL GoldViewI的1×TBE缓冲液)中30分钟。然后，使用凝胶图像系统(Bio-Rad Laboratories，USA)对凝胶成像。
如图6所示：
条带M为20bp的DNA Marker；
泳道1为EBV相关基因；
泳道2为AB；
泳道3为AA；
泳道4为AB/AA；
泳道5为AB/AA/λexo；
泳道6为AB/AA/EBV相关基因；
泳道7为AB/AA/EBV相关基因/λexo。
由图6结果可知，泳道1～3表明EBV相关基因、AB、AA的电泳迁移率随着核酸单链的长度增加而下降，泳道4为AB和AA通过碱基互补原则配对杂交形成了双链结构，电泳迁移率明显低于条带1～3中的核酸单链，泳道5为考察λexo对AB/AA是否存在非特异性水解，结果表明λexo不会对AB/AA中的AB或AA发生非特异性水解。泳道6为靶基因EBV相关基因与AB/AA双链底物形成的三交联结构，成像亮度明显高于泳道5，泳道7表明在EBV相关基因与所有底物共存时，λexo成功水解底物AA链，循环利用EBV相关基因，释放出AB链。电泳结果成功验证了LNSAR的水解机制。
实施例3电化学EBV相关基因传感器及其使用条件的研究
为了获得最佳的实验效能，我们对实验过程中重要的条件参数进行了研究，如LP与DNA/AgNCs的比例、λexo辅助非磷酸化底物偏好反应的λexo浓度和时间。对每一个实验条件都由低到高浓度至少取5个点进行一系列实验。
1.为考察LP与DNA/AgNCs浓度比对电化学EBV相关基因传感器的影响，本实验采用了不同摩尔比的LP与DNA/AgNCs(LP与DNA/AgNCs的摩尔比分别为3:1、2:1、1:1、1:2、1:3)，其他的实验方法同实施例1，如图7所示，当LP与DNA/AgNCs的摩尔比为2:1时，传感系统显示的信噪比最高，此为最佳比例。
2.为考察λexo辅助非磷酸化底物偏好反应中λexo浓度对电化学EBV相关基因传感器的影响，本实验采用了不同浓度的λexo(0.04unitμL-1、0.08unitμL-1、0.12unitμL-1、0.16unitμL-1、0.20unitμL-1、0.24unitμL-1)，实验方法的其他部分同实施例1，如图8所示，随着λexo浓度的增加，传感系统的电流响应值增加，而在λexo为0.20unitμL-1时，再增加λexo的浓度，其电流响应信号增加不打，说明λexo浓度为0.20unitμL-1为最佳浓度。
3.同理，为考察λexo辅助非磷酸化底物偏好反应的孵育时间对电化学EBV相关基因传感器的影响，本实验采用了不同孵育时间(40min、60min、80min、100min、120min、140min)，实验方法的其他部分同实施例1，然后进行电化学DPV扫描检测，如图9所示，最佳孵育时间为100min。
实施例4制备的电化学EBV相关基因传感器的性能分析
为了评估所制备的电化学EBV相关基因传感器的性能，对1×TE缓冲液(pH 8.0)配制的不同浓度EBV相关基因标准品进行分析。
具体地，(1)用1×TE缓冲液(pH 8.0)稀释EBV相关基因得到7个不同浓度的标准品(1000pM、100pM、10pM、1pM、0.1pM、0.01pM和0.001pM)，和0.25μM AA/AB、0.20unitμL-1λexo在37℃孵育100min，经乙醇沉淀纯化之后滴加至工作电极上，37℃孵育40min，用洗涤缓冲液清洗三次后，滴加10μLAgDNCs@DNA/AgNCs-LP共聚物于电极上，工作电极、共聚物的制备方法同实施例1，37℃孵育1h，用0.1M PB(pH 7.0)清洗三次。在0.1M PB(pH 7.0)本底溶液用DPV扫描测定，并进行独立重复试验三次。如图10-1所示，在优选的条件下，随着EBV相关基因的浓度增加(从0.1fM增加到1nM)，DPV响应信号增加。如图10-2所示，所得校准曲线检测范围为1000pM至0.001pM，回归方程为i(μA)＝12.09×lg c(pM)+64.27，相关系数为0.9958。将未添加EBV相关基因的1×TE缓冲液作为空白对照，并重复检测3次，计算平均值和标准差，根据空白信号平均值加上3倍标准差所对应的值估计最低检测限，计算得出最低检测限为0.38fM。
实施例5制备的电化学EBV相关基因传感器的特异性分析
电化学EBV相关基因传感器的特异性，在分析不分离的生物样本中的生物标志物时具有重要的作用，主要取决于设计的双链DNA底物中AA的特异性。为了考察该传感器对EBV相关基因的特异性，我们收集并设计了其他四种病毒的特异性基因片段(Ebola、HPV、HIV、H1N1)，用于评价本传感器的特异性，具体的实验方法同实施例4。
具体序列为：
Ebola：5’-AATTTATGTACAGCTTCGTACAA-3’(SEQ ID NO.8)Ebola的序列信息来源于文献：2018.Anal.Biochem.557,151-155.Table 1；
HPV：5’-GACGTGAGGTATATGACTTTGCTTT-3’(SEQ ID NO.9)HPV的序列信息来源于文献2019.Anal.Chim.Acta.1048,31-41.Table 1；
HIV：5’-AGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGC-3’(SEQ ID NO.10)，HIV的序列信息来源于文献：2018.RSC.Advances.8,31710-31716.Table S1；
H1N1：5’-CGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCA-3’(SEQ ID NO.11)，H1N1的序列信息来源于文献：2013.Biosens Bioelectron.44,164-170.Part 2.2。
上述特异性基因片段Ebola、HPV、HIV、H1N1由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
结果如图11所示，与相同浓度的EBV相关基因相比，其他四种病毒的特异性核酸序列的DPV电流响应值与空白信号接近。这些结果说明本发明制备的电化学EBV相关基因传感器具有良好的特异性。
综上，本发明至少具有以下有益效果：
(1)本发明研制了一种基于λexo辅助的非磷酸化底物偏好的靶标循环放大体系(LNSAR)和AgDNCs@DNA/AgNCs-LP conjugates作为新型电化学信号探针的超灵敏电化学生物传感器，用于EBV相关基因的检测。首先设计了λexo特异性的双链DNA底物链(AA/AB)，在样品中不存在EBV相关基因的情况下，不能触发LNSAR，不能从AA/AB中游离出链AB，在样品中存在EBV相关基因的情况下，λexo水解AA，循环利用EBV相关基因和持续释放大量的AB，AB可与工作电极上的CP(探针)结合，同时与新型电化学纳米共聚物探针上的LP(连接链)结合，在电化学平台上产生显著的电化学信号。所述电化学生物传感器对EBV相关基因进行检测，得到的电化学信号与EBV相关基因浓度的对数呈线性相关，线性方程为i(μA)＝12.09×lg c(pM)+64.27，检测范围为1fM～1nM，相关系数为0.9958，最低检测限为0.38fM。
(2)本发明中的LNSAR体系克服了传统λexo水解双链DNA底物的5’末端需要预先修饰磷酸基团的不足。本发明设计的双链DNA底物，其5’末端用凸出的2个核苷酸替代磷酸基团，有效避免复杂修饰过程，提供了简单、免标记的靶核酸循环放大体系。该双链DNA底物链可以与EBV相关基因完全互补，在EBV相关基因存在的情况下，底物链AA链5’末端凸出2个核苷酸，λexo识别此双链结构，通过凸出的AA链末端核苷酸通过静电作用吸附到双链底物上，逐一水解AA中的磷酸二酯键至完全水解AA链，从双链底物中释放出AB链，
(3)本发明中的新型电化学纳米聚合物探针含有两种可负载银纳米材料的聚合物模板和生物材料模板。PAMAM具有表面积大、高度规则和活化位点多等优点，能络合大量Ag+，经NaBH4原位还原，使PAMAM体腔内嵌有大量银纳米粒子，形成AgDNCs，从而实现灵敏的电流响应。同样，富含C的DNA链可以通过原位还原方法嵌入Ag+/Ag0，形成DNA/AgNCs，可显著增强AgDNCs在电极表面的电流，实现超灵敏的电化学生物传感器的构建。
本发明构建了新型均相酶学体系和双模板化的纳米材料，该传感器无需复杂反应底物修饰，电流响应迅速，灵敏度高、特异性强，有望成为具有实际应用价值的传感器。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
SEQUENCE LISTING
<110> 重庆医科大学
<120> 检测EBV相关基因的电化学生物传感器及其制备方法
<130> PCQYK194963
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 捕获探针CP
<400> 1
gtcagcttat gcttttttt 19
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 单链AA-1
<400> 2
tcttgtgtcc aggcatccct ccatcccgag caacccagtg 40
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 单链AA
<400> 3
cttcttgtgt ccaggcatcc ctccatcccg agcaacccag tg 42
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 单链AB
<400> 4
gcataagctg accactgggt tgctcgggat gg 32
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 靶基因
<400> 5
agggatgcct ggacacaaga 20
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> DNA template
<400> 6
acccgaacct gggctaccac ccttaatccc c 31
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 连接链LP
<400> 7
ttttttccat cccgagcaac ccagtg 26
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Ebola
<400> 8
aatttatgta cagcttcgta caa 23
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> HPV
<400> 9
gacgtgaggt atatgacttt gcttt 25
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> HIV
<400> 10
agtcagtgtg gaaaatctct agc 23
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> H1N1
<400> 11
cgtgcccagt gagcgaggac tgca 24

Claims (11)

1.一种用于检测EBV相关基因的试剂盒，其特征在于，包括底物链A、底物链B、捕获探针、连接链、聚酰胺一胺(PAMAM)树枝状大分子封装的金属纳米复合物，
所述底物链A包括靶基因结合区、底物链B结合区、错配区，所述靶基因结合区含有如下所示核苷酸序列：5’-TCTTGTGTCCAGGCATCCCT-3’，所述底物链A的底物链B结合区连接至所述靶基因结合区的3’端，并含有如下核苷酸序列：5’-CCATCCCGAGCAACCCAGTG-3’，所述错配区连接至所述靶基因结合区的5’端；
所述底物链B含有如下所示核苷酸序列：
5’-GCATAAGCTGACCACTGGGTTGCTCGGGATGG-3’；
所述连接链包括底物链B结合区、连接至所述底物链B结合区5’端的隔离区，所述连接链的底物链B结合区含有如下所示核苷酸序列：5’-CCATCCCGAGCAACCCAGTG-3’；
所述隔离区为4-8个重复碱基，所述重复碱基选自胸腺嘧啶或腺嘌呤；
所述捕获探针包括底物链B结合区、连接至所述底物链B结合区3’端的隔离区，所述捕获探针的底物链B结合区含有如下所示核苷酸序列：5’-GTCAGCTTATGC-3’；所述隔离区为4-8个重复碱基，所述重复碱基选自胸腺嘧啶或腺嘌呤；
所述金属纳米复合物上还封装有DNA模板，所述DNA模板含有如下所示核苷酸序列：5’-HOOC-ACCCGAACCTGGGCTACCACCCTTAATCCCC-3’；所述金属纳米复合物中的金属元素选自银、镍、金中的任一种。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述错配区的碱基个数为1-4个。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述错配区为5’-CT-3’。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述连接链还包括连接至所述隔离区5’端的羧基；
和/或，所述捕获探针还包括连接至所述隔离区3’端的-(CH2)6-SH。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：包括核酸外切酶及其缓冲液。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述核酸外切酶选自外切酶家族中Lambda核酸外切酶、核酸外切酶I、核酸外切酶III、T7核酸外切酶中的至少一种。
7.一种工作电极，其特征在于：所述工作电极应用于权利要求1～6任一项所述的检测EBV相关基因的试剂盒中，所述工作电极上固定有捕获探针，所述捕获探针的底物链B结合区可与权利要求1中所述底物链B部分互补结合，所述捕获探针的底物链B结合区含有如下所示核苷酸序列：5’-GTCAGCTTATGC-3’。
8.根据权利要求7所述的工作电极，其特征在于：所述捕获探针为巯基修饰的捕获探针，含有如下核苷酸序列：
5’-GTCAGCTTATGCTTTTTTT-(CH2)6-SH-3’；
和/或，含有所述捕获探针的摩尔量为200nM～1000nM。
9.一种检测EBV相关基因的电化学生物传感器，其特征在于：包括权利要求7-8任意一项所述工作电极。
10.根据权利要求9所述的电化学生物传感器，其特征在于：还包括权利要求1-6任意一项所述试剂盒；
和/或，还包括参比电极、对电极。
11.一种检测EBV相关基因的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，采用权利要求1-6任意一项所述试剂盒，包括如下步骤：
1)制备工作电极，在所述工作电极上固定所述捕获探针；
2)制备纳米材料：制备聚酰胺-胺树枝状大分子以及所述DNA模板封装的所述金属纳米复合物，并将所述连接链连接至所述金属纳米复合物；
3)制备循环放大体系：将所述底物链A、所述底物链B混合反应，形成双链DNA产物，加入待检测基因、核酸外切酶及其缓冲液，得到反应液；
4)将步骤3)所得反应液加至所述步骤1)制得的工作电极，反应结束后，将所述步骤2)制得的所述金属纳米复合物加至所述工作电极，反应结束后，备用；
5)扫描测定：将步骤4)制得的所述工作电极置于本底溶液中，结合参比电极、对电极，用差分脉冲伏安法进行扫描测定，得到测定结果。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN110646478B (zh) * 2019-10-18 2022-06-10 重庆医科大学 一种检测pik3ca基因h1047r位点突变的电化学传感器及其制备方法
CN111272742B (zh) * 2020-03-06 2022-11-08 安徽大学 基于金属有机凝胶复合材料和金属有机框架的电致化学发光传感器及其制备和检测方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101821411A (zh) * 2007-08-13 2010-09-01 斯特拉斯克莱德大学 核酸序列的鉴定
CN107589163A (zh) * 2017-09-06 2018-01-16 重庆医科大学 一种用于mecp2突变基因检测的电化学传感器制备方法
CN108680567A (zh) * 2018-05-30 2018-10-19 广西壮族自治区农业科学院农产品质量安全与检测技术研究所 一种基于功能化核酸的化学发光传感器对赭曲霉毒素a的测定方法
CN108896639A (zh) * 2018-04-25 2018-11-27 南京工业大学 lncRNA MEG3双重检测电化学基因传感器，其制备方法与应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101821411A (zh) * 2007-08-13 2010-09-01 斯特拉斯克莱德大学 核酸序列的鉴定
CN107589163A (zh) * 2017-09-06 2018-01-16 重庆医科大学 一种用于mecp2突变基因检测的电化学传感器制备方法
CN108896639A (zh) * 2018-04-25 2018-11-27 南京工业大学 lncRNA MEG3双重检测电化学基因传感器，其制备方法与应用
CN108680567A (zh) * 2018-05-30 2018-10-19 广西壮族自治区农业科学院农产品质量安全与检测技术研究所 一种基于功能化核酸的化学发光传感器对赭曲霉毒素a的测定方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Label-free and ultrasensitive electrochemical biosensor for the detection of EBV-related DNA based on AgDNCs@DNA/AgNCs nanocomposites and lambda exonuclease-assisted target recycling";Haiying Que et al.;《Biosensors and Bioelectronics》;20190819;第143卷;全文 *
"Silver-dendrimer nanocomposites as oligonucleotide labels for electrochemical stripping detection of DNA hybridization";Xin Jin et al.;《Biosensors and Bioelectronics》;20180214;第107卷;全文 *
"基于银纳米复合物和酶辅助靶标循环的EBV相关基因电化学传感检测新方法";阙海英;《中国优秀硕士学位论文全文数据库基础科学辑》;20201215;全文 *

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