CN118127133A - 基于电化学dna传感器的lamp检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于电化学DNA传感器检测领域，具体提供了一种基于电化学DNA传感器的LAMP检测方法，包括：电化学DNA传感器制备；通过核酸外切酶Ⅲ对LAMP产物进行预处理；通过电化学DNA传感器制备对预处理后的LAMP产物进行电信号检测。应用核酸外切酶Ⅲ对LAMP扩增产物进行处理，使得LAMP产物中靶标区域单链DNA暴露出来，增强电化学DNA传感器检测的灵敏度，整个检测过程无需洗涤，避免了复杂的操作，减少误差。
Description
技术领域
本发明涉及DNA传感器检测领域，具体涉及一种基于DNA传感器的LAMP检测方法。
背景技术
环介导等温扩增（LAMP）是一种在等温条件下对少量目标DNA快速特异扩增的技术。
相关技术中的LAMP检测技术都是基于变色反应和荧光染料探针技术。变色反应主要依赖于LAMP扩增反应过程中释放了副产物---氢离子，引起反应体系pH的变化，从而致使pH指示剂颜色的改变。这是一种间接的判断方法，判断结果仅依赖于肉眼颜色的变化，在反应过程中若因外界因素或样本溶液pH稳定性的破坏，会出现非扩增而产生的颜色变化，严重影响结果。荧光染料探针中的自发光荧光染料与pH指示剂原理大致相同，都依赖于反应过程中的副产物。另一种荧光染料探针是基于自身与LAMP扩增产物产生的DNA嵌入式结合，从而释放荧光信号，这是一种较为直接的对扩增DNA的检测方法，但LAMP反应会出现非特异性和非模板性的扩增产生DNA，嵌入式荧光探针无法区分。
上述问题是目前亟待解决的。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于电化学DNA传感器的LAMP检测方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于电化学DNA传感器的LAMP检测方法，包括：
电化学DNA传感器制备；
通过核酸外切酶Ⅲ对LAMP产物进行预处理；
通过电化学DNA传感器制备对预处理后的LAMP产物进行电信号检测。
进一步的，所述电化学DNA传感器制备的步骤，即，通过捕获探针和封闭剂在金电极表面通过金硫键自组装形成多功能单分子层，完成制备。
进一步的，所述封闭剂为6-巯基己醇MCH、巯基己烷HT、二乙基二硫代氨基甲酸钠DEDTC中的任意一种。
进一步的，所述通过核酸外切酶Ⅲ对LAMP产物进行预处理的步骤包括：
制备LAMP产物；
配置核酸外切酶Ⅲ反应液；
将核酸外切酶Ⅲ反应液与LAMP产物1：1混合，对LAMP产物的双链DNA进行切割，完成预处理。
进一步的，所述配置核酸外切酶Ⅲ反应液，即，将无酶水、核酸外切酶Ⅲ缓冲液以及核酸外切酶Ⅲ按照19：5：1的比例进行混合，完成核酸外切酶Ⅲ反应液的制备。
进一步的，所述将核酸外切酶Ⅲ反应液与LAMP产物1：1混合，对LAMP产物的双链DNA进行切割，完成预处理的步骤中，将所述将核酸外切酶Ⅲ反应液与LAMP产物1：1混合，将混合液在35-40℃下反应30-60分钟。
进一步的，所述通过电化学DNA传感器制备对预处理后的LAMP产物进行电信号检测的步骤包括：
在预处理后的LAMP产物加入信号探针，混匀溶液；
将溶液滴在电化学DNA传感器的电极检测区域，杂交培育；
电极冷却至室温，通过适配器连接至电化学工作站，进行数据测量。
进一步的，所述在预处理后的LAMP产物加入信号探针，混匀溶液的步骤中，溶液的浓度为15uM。
进一步的，所述将溶液滴在电化学DNA传感器的电极检测区域，杂交培育的步骤中，杂交培育的温度为30-50℃，时间为20-50分钟。
进一步的，所述电极冷却至室温，通过适配器连接至电化学工作站，进行数据测量的步骤中，数据测量的方法为循环伏安法、线性伏安法、方波伏安法中的任意一种。
本发明的有益效果是，本发明提供了一种基于电化学DNA传感器的LAMP检测方法，包括：电化学DNA传感器制备；通过核酸外切酶Ⅲ对LAMP产物进行预处理；通过电化学DNA传感器制备对预处理后的LAMP产物进行电信号检测。应用核酸外切酶Ⅲ对LAMP扩增产物进行处理，使得LAMP产物中靶标区域单链DNA暴露出来，增强电化学DNA传感器检测的灵敏度，整个检测过程无需洗涤，避免了复杂的操作，减少误差。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1是本发明实施例所提供的基于电化学DNA传感器的LAMP检测方法的流程图。
图2是图1中步骤S120的子步骤流程图。
图3是本发明实施例所提供的述基于电化学DNA传感器的LAMP检测方法检测HLA-B*15:02基因位点突变的LAMP反应的结果示意图。
具体实施方式
现在结合附图对本发明作进一步详细的说明。这些附图均为简化的示意图，仅以示意方式说明本发明的基本结构，因此其仅显示与本发明有关的构成。
实施例1
请参阅图1，本实施例提供了一种基于电化学DNA传感器的LAMP检测方法，应用核酸外切酶Ⅲ对LAMP扩增产物进行处理，使得LAMP产物中靶标区域单链DNA暴露出来，增强电化学DNA传感器检测的灵敏度，整个检测过程无需洗涤，避免了复杂的操作，减少误差。
具体来说，基于电化学DNA传感器的LAMP检测方法包括：
S110：电化学DNA传感器制备。
具体来说，通过捕获探针和封闭剂在金电极表面通过金硫键自组装形成多功能单分子层，完成制备。
其中，所述封闭剂为6-巯基己醇MCH、巯基己烷HT、二乙基二硫代氨基甲酸钠DEDTC中的任意一种。捕获探针为巯基烷烃修饰的单链DNA。
在其他实施例中，可以选择埋填法或内插法修饰电极。
S120：通过核酸外切酶Ⅲ对LAMP产物进行预处理。
请参阅图2，具体来说，步骤S120包括以下步骤：
S121：制备LAMP产物。
S122：配置核酸外切酶Ⅲ反应液。
具体来说，将无酶水、核酸外切酶Ⅲ缓冲液以及核酸外切酶Ⅲ按照19:5：1的比例进行混合，完成核酸外切酶Ⅲ反应液的制备。
S123：将核酸外切酶Ⅲ反应液与LAMP产物1：1混合，对LAMP产物的双链DNA进行切割，完成预处理。
具体来说，将混合液在35-40℃下反应30-60分钟。
S130：通过电化学DNA传感器制备对预处理后的LAMP产物进行电信号检测。
具体来说，步骤S130包括以下步骤：
S131：在预处理后的LAMP产物加入信号探针，混匀溶液。
其中，溶液的浓度为15uM。
S132：将溶液滴在电化学DNA传感器的电极检测区域，杂交培育。
其中，杂交培育的温度为30-50℃，时间为20-50分钟。
S133：电极冷却至室温，通过适配器连接至电化学工作站，进行数据测量。
其中，数据测量的方法为循环伏安法、线性伏安法、方波伏安法中的任意一种。
根据上述基于电化学DNA传感器的LAMP检测方法检测HLA-B*15:02基因位点突变的LAMP反应。实验过程如下：
配置巯基烷烃修饰的单链DNA和MCH的混合溶液(最终浓度分别为20uM和1mM)，滴涂2uL该溶液于工作电极区域，4℃下孵育过夜16h。
超纯水清洗电极3次，氮气吹干，去除巯基烷烃修饰的单链DNA和MCH。
选取阴性和阳性的gDNA样本以及超纯水作为假阳性样本对比，配置好LAMP反应体系，进行LAMP反应。对于超纯水的LAMP反应增加反应的时间直到反应表现为假阳性。
将上述三个LAMP产物中加入核酸外切酶Ⅲ（25uLLAMP产物+25uLExoⅢ反应液），40℃反应40分钟。
将上一步反应完成的每份溶液中加入信号探针（最终浓度为15uM）,混匀溶液，吸取12.5uL溶液滴在电极检测区域，42℃杂交40分钟。
电极冷却至室温，通过适配器连接至电化学工作站，选择方波伏安法，设置测试条件（起始电压0.1V，终止电压0.7V，方波幅值0.02V，频率1Hz），重复测量数据3次。
按照上述过程重复试验，作为平行样本。
两次实验的测试结果如图3所示。
从图3中，可以看出，阴性样本（N）和假阳性样本（FP）在两次实验中几乎一致，而阳性样本（P）与两者有着明显区分，可以有效辨别出LAMP反应的假阳性，提高LAMP检测技术的准确性。
综上所述，本发明提供了一种基于电化学DNA传感器的LAMP检测方法，包括：电化学DNA传感器制备；通过核酸外切酶Ⅲ对LAMP产物进行预处理；通过电化学DNA传感器制备对预处理后的LAMP产物进行电信号检测。应用核酸外切酶Ⅲ对LAMP扩增产物进行处理，使得LAMP产物中靶标区域单链DNA暴露出来，增强电化学DNA传感器检测的灵敏度，整个检测过程无需洗涤，避免了复杂的操作，减少误差。
本申请中选用的各个器件（未说明具体结构的部件）均为通用标准件或本领域技术人员知晓的部件，其结构和原理都为本技术人员均可通过技术手册得知或通过常规实验方法获知。并且，本申请所涉及的软件程序均为现有技术，本申请不涉及对软件程序作出任何改进。
在本发明实施例的描述中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
在本发明的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
在本申请所提供的几个实施例中，应该理解到，所揭露的系统、装置和方法，可以通过其它的方式实现。以上所描述的装置实施例仅仅是示意性的，例如，所述单元的划分，仅仅为一种逻辑功能划分，实际实现时可以有另外的划分方式，又例如，多个单元或组件可以结合或者可以集成到另一个系统，或一些特征可以忽略，或不执行。另一点，所显示或讨论的相互之间的耦合或直接耦合或通信连接可以是通过一些通信接口，装置或单元的间接耦合或通信连接，可以是电性，机械或其它的形式。
所述作为分离部件说明的单元可以是或者也可以不是物理上分开的，作为单元显示的部件可以是或者也可以不是物理单元，即可以位于一个地方，或者也可以分布到多个网络单元上。可以根据实际的需要选择其中的部分或者全部单元来实现本实施例方案的目的。
另外，在本发明各个实施例中的各功能单元可以集成在一个处理单元中，也可以是各个单元单独物理存在，也可以两个或两个以上单元集成在一个单元中。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。
Claims (9)
1.一种基于电化学DNA传感器的LAMP检测方法，其特征在于，包括：
电化学DNA传感器制备；
通过核酸外切酶Ⅲ对LAMP产物进行预处理；
通过电化学DNA传感器制备对预处理后的LAMP产物进行电信号检测；
所述通过核酸外切酶Ⅲ对LAMP产物进行预处理的步骤包括：
制备LAMP产物；
配置核酸外切酶Ⅲ反应液；
将核酸外切酶Ⅲ反应液与LAMP产物1：1混合，对LAMP产物的双链DNA进行切割，完成预处理。
2.如权利要求1所述的基于电化学DNA传感器的LAMP检测方法，其特征在于，
所述电化学DNA传感器制备的步骤，即，通过捕获探针和封闭剂在金电极表面通过金硫键自组装形成多功能单分子层，完成制备。
3.如权利要求2所述的基于电化学DNA传感器的LAMP检测方法，其特征在于，
所述封闭剂为6-巯基己醇MCH、巯基己烷HT、二乙基二硫代氨基甲酸钠DEDTC中的任意一种。
4.如权利要求1所述的基于电化学DNA传感器的LAMP检测方法，其特征在于，
所述配置核酸外切酶Ⅲ反应液，即，将无酶水、核酸外切酶Ⅲ缓冲液以及核酸外切酶Ⅲ按照19:5：1的比例进行混合，完成核酸外切酶Ⅲ反应液的制备。
5.如权利要求1所述的基于电化学DNA传感器的LAMP检测方法，其特征在于，
所述将核酸外切酶Ⅲ反应液与LAMP产物1：1混合，对LAMP产物的双链DNA进行切割，完成预处理的步骤中，将所述将核酸外切酶Ⅲ反应液与LAMP产物1：1混合，将混合液在35-40℃下反应30-60分钟。
6.如权利要求1所述的基于电化学DNA传感器的LAMP检测方法，其特征在于，所述通过电化学DNA传感器制备对预处理后的LAMP产物进行电信号检测的步骤包括：
在预处理后的LAMP产物加入信号探针，混匀溶液；
将溶液滴在电化学DNA传感器的电极检测区域，杂交培育；
电极冷却至室温，通过适配器连接至电化学工作站，进行数据测量。
7.如权利要求6所述的基于电化学DNA传感器的LAMP检测方法，其特征在于，所述在预处理后的LAMP产物加入信号探针，混匀溶液的步骤中，溶液的浓度为15uM。
8.如权利要求6所述的基于电化学DNA传感器的LAMP检测方法，其特征在于，所述将溶液滴在电化学DNA传感器的电极检测区域，杂交培育的步骤中，杂交培育的温度为30-50℃，时间为20-50分钟。
9.如权利要求6所述的基于电化学DNA传感器的LAMP检测方法，其特征在于，
所述电极冷却至室温，通过适配器连接至电化学工作站，进行数据测量的步骤中，数据测量的方法为循环伏安法、线性伏安法、方波伏安法中的任意一种。
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