CN104237353B - Ndm‑1 锁核酸探针修饰电极及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了NDM‑1锁核酸探针修饰电极及其制备方法和应用，具体是设计锁核酸修饰探针，固定在电极表面为特异性探针，其中锁核酸探针的5’端修饰有巯基，通过Au‑S键的化学键合可将其固定到电极表面，锁核酸探针与目标基因的部分序列相互补，本发明获得的电极为多重耐药菌的检测提供了全新思路和检测手段。
Description
技术领域
本发明属于电化学检测领域，具体涉及NDM-1锁核酸(Locked nucleic acid，LNA)探针修饰电极，还涉及该电极的制备方法和应用。
背景技术
目前研究报道的传感器表面固定的大多是DNA探针，存在诸多缺点。探针长度一般为20个碱基左右，DNA探针与较长的靶序列杂交时，结合力不高，碱基错配识别能力低。另外，由于单链DNA无法与未解旋的双链靶序列直接结合，所以待检测的标本需经PCR扩增后才能与之反应。同时，NDM-1探针的反应受离子强度的影响，酸性或碱性环境中DNA固定数量最多，而中性条件下杂交效果最好，固定双链探针比固定单链探针时杂交效果好，分析原因可能是单链固定时会对杂交产生更大的空间障碍。众多的研究者均未能很好地解决上述问题，从而无法提高DNA探针的特异性。而LNA的出现是解决以上问题的理想途径。
锁核酸是一种新型、特殊的双环状寡核苷酸衍生物，含有一个或多个2'-0,4'-C-亚甲基-B-D-呋喃核糖核酸单体，结构中核糖的2'-0,4'-C位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，连接成环形，呋喃糖的结构锁定在C3内型的N构型，形成了刚性的缩合结构，降低了核糖体构象的可塑性，增强了磷酸盐骨架局部结构的稳定性，从而形成刚性缩合结构。相比其他寡核苷酸，LNA具有诸多优势：(1)和DNA、RNA互补的双链有很强的热稳定性；(2)抗3′脱氧核苷酸酶降解的稳定性；(3)LNA-DNA杂交物能激活RNaseH；(4)与RNA/DNA杂交时，具有较强的碱基错配识别力；(6)水溶性好；(7)高效的自动寡聚化作用，合成方法简单。
NDM-1多重耐药菌是指携带NDM-1耐药基因的细菌。NDM-1耐药酶其全称是“新德里金属-β-内酰胺酶”，是一种高效耐药酶。研究显示，抗生素滥用是NDM-1出现的首要原因，目前DM-1多重耐药菌正在全球快速传播，其感染病例在全球均有分布，死亡率高。多重耐药菌所带来的风险越来越大，防控形势极为严峻，该类细菌对几乎所有抗生素都具有抗药性。NDM-1耐药基因可以在细菌之间传播，从而使对抗生素敏感的细菌获得耐药性。因此，研发NDM-1直接快速特异的检测方法，具有重要意义。
目前，NDM-1多重耐药菌的诊断主要包括筛查、表型确认和基因确证等3个步骤。表型筛查是在细菌药物敏感性测定中，以美洛培南或亚胺培南纸片法(K-B法)或最低抑菌浓度(MIC)测定法对肠杆菌科细菌产酶情况进行初步筛查；表型确认是采用双纸片协同实验或亚胺培南(美洛培南)/EDTA复合纸片，进行K-B法药敏试验来判定产金属酶；基因确证是采用NDM-1的基因特异引物进行PCR扩增及产物测序，确定菌株是否携带NDM-1基因。但这些诊断方法存在着费时烦琐、敏感性和特异性较低及检测成本高等缺陷。
电化学DNA生物传感器具有分析时间短、设备微型化、特异性强、灵敏度高、检测限低、使用简单以及成本低廉等显著优点。目前电化学生物传感器的研究主要是致力于提高传感器的特异性和灵敏度，而特异性和灵敏度在很大程度上受探针与互补链间的相互作用影响，因此，利用LNA探针提高电化学生物传感器的特异性是检测NDM-1的基因的关键。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供NDM-1锁核酸探针修饰电极；本发明的目的之二在于提供所述NDM-1锁核酸探针修饰电极的制备方法；本发明的目的之三在于提供含有检测NDM-1的电化学生物传感器；本发明的目的之四在于提供所述NDM-1锁核酸探针修饰电极或所述电化学传感器的应用；本发明的目的之五在于提供利用所述检测NDM-1的电化学生物传感器检测NDM-1基因的方法。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
1、NDM-1锁核酸探针修饰电极，所述电极是在金电极表面固定5’端修饰巯基的NDM-1LNA探针，最后封闭非特异性吸附位点而得。
优选的，所述5’端修饰巯基的NDM-1锁核酸探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2、所述NDM-1锁核酸探针修饰电极的制备方法，包括如下步骤：
a.将金电极打磨，抛光，清洁，干燥，得清洁的金电极，备用；
b.向步骤a所得清洁的金电极表面滴加含5’端修饰巯基的NDM-1 LNA探针的溶液，修饰后用巯基己醇溶液封闭，超纯水清洗得NDM-1锁核酸探针修饰电极。
优选的，步骤a是将金电极分别用0.3μm、0.05μm的Al2O3粉末打磨抛光，每次打磨后用水洗净，再分别于硝酸、丙酮和超纯水中各超声洗涤，干燥，备用。
优选的，步骤b是向步骤a所得清洁的金电极表面滴加5’端修饰巯基的NDM-1 LNA探针浓度为0.5～2.5μM的溶液，固定后用浓度为1mmol/L的巯基己醇溶液封闭，清洗得NDM-1锁核酸探针修饰电极。
更优选的，所述5’端修饰巯基的NDM-1 LNA探针的浓度为1.5μM。
更优选的，5’端修饰巯基的NDM-1 LNA探针固定的条件为37℃下恒温1小时。
3、检测NDM-1的电化学生物传感器，包括工作电极、对电极、参比电极和为测试底液；所述工作电极为所述NDM-1锁核酸探针修饰电极，所述对电极为铂电极，所述参比电极为饱和甘汞电极，所述为测试底液为pH 7.4的含2mmol/L K3Fe(CN)6-K4Fe(CN)6和5mmol/LKCl的PBS溶液。
4、所述NDM-1锁核酸探针修饰电极或所述检测NDM-1的电化学生物传感器在检测NDM-1基因中的应用。
5、利用所述检测NDM-1的电化学生物传感器检测NDM-1基因的方法，包括如下步骤：将NDM-1锁核酸探针修饰电极与样品溶液杂交后，然后以NDM-1锁核酸探针修饰电极为工作电极，铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，pH 7.4的含2mmol/L K3Fe(CN)6-K4Fe(CN)6和5mmol/L KCl的PBS溶液为测试底液构建电化学生物传感器，采用循环伏安法进行扫描测定，电位扫描范围为-0.3V～0.7V，电位扫描速率为50mv/s，根据杂交前后峰电流变化检测NDM-1基因。
本发明的有益效果在于：本研究利用锁核酸的高特异性，针对NDM-1全基因组，设计针对NDM-1基因的LNA，将NDM-1 LNA探针固定在金电极后获得NDM-1锁核酸探针修饰电极，然后与电化学技术相融合获得检测NDM-1基因的电化学生物传感器，从而构建检测NDM-1基因的技术平台，为多重耐药菌的检测提供简单、快速、灵敏、特异的检测工具。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
图1为不同修饰电极的循环伏安图。a：裸电极在pH 7.4含有2mmol/L K3Fe(CN)6-K4Fe(CN)6和5mmol/L KCl的PBS中循环伏安曲线；b：电极表面修饰LNA探针后在pH 7.4含有2mmol/L K3Fe(CN)6-K4Fe(CN)6和5mmol/L KCl的PBS中循环伏安曲线；c：LNA探针修饰、巯基己醇封闭后的电极在pH 7.4含有2mmol/L K3Fe(CN)6-K4Fe(CN)6和5mmol/L KCl的PBS中循环伏安曲线；d：检测液中加入NDM-1靶序列后，电极在pH 7.4含有2mmol/L K3Fe(CN)6-K4Fe(CN)6和5mmol/L KCl的PBS中循环伏安曲线；e：裸电极在pH 7.4不含2mmol/L K3Fe(CN)6-K4Fe(CN)6和5mmol/L KCl的PBS中的循环伏安曲线。
图2为不同浓度探针修饰电极的循环伏安图。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
本发明的思路是利用锁核酸的高特异性，针对NDM-1全基因组，设计并合成NDM-1LNA探针，并在LNA探针5’端修饰巯基，NDM-1 LNA探针的序列为5'-SH-(CH2)6-gcttttggtggctgcctgat-3'(SH代表巯基基团，下划线部分碱基经锁核酸修饰)(SEQ IDNO.1)，将LNA技术与电化学技术相融合创建了用于检测NDM-1基因的电化学DNA生物传感器。具体方法是：先设计针对NDM-1全系列的特异性LNA探针，并在LNA探针5’端修饰有巯基，利用Au-S键的化学键合可将锁核酸探针固定到电极表面；检测时利用特异性探针与目标基因的部分序列相互补，当杂交溶液中含有目标基因时，特异性探针与其对应的互补序列杂交形成复合物，该复合物在电极表面发生还原-氧化反应，从而产生电化学信号；如果杂交溶液中不含目标序列，则与特异性锁核酸探针不能发生杂交反应，所检测的目标基因无法通过杂交修饰到电极表面，其产生电化学信号的强度很弱，同时还可以通过检测电流信号大小来判断互补序列与错配序列。
实施例1
NDM-1锁核酸探针修饰电极的制备方法，包括如下步骤：
a.金电极的清洗：取直径为3mm的金电极，分别用0.3μm、0.05μm的Al2O3粉末打磨抛光成镜面，每次打磨后均用超纯水冲洗，再分别于硝酸、丙酮及超纯水中各超声洗涤5min，干燥，得清洗的金电极，备用。
b.LNA探针的固定：取20μL 5’端修饰巯基的浓度为1.5μmol/L的NDM-1 LNA探针溶液滴加于已清洗的金电极表面，然后于37℃下恒温箱中恒温1小时，使锁核酸通过Au-S键的化学键合将其修饰到电极的表面，再将电极浸入浓度为1mmol/L的巯基己醇溶液中封闭非特异性吸附位点1小时，封闭后用水清洗电极，即得锁核酸修饰NDM-1探针的NDM-1电极，4℃避光保存备用。
c.杂交反应：将NDM-1 LNA探针修饰电极分别浸泡在150μl终浓度为100μg/L的NDM-1靶序列溶液(pH7.40.1mol/L PBS)中，于37℃恒温杂交45分钟。
实施例2、组建检测NDM-1的电化学生物传感器
以NDM-1锁核酸探针修饰电极作为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极作为对电极组建检测NDM-1的电化学生物传感器。将制备好的电化学传感器联入电化学工作站，以pH 7.4的含2mmol/L K3Fe(CN)6-K4Fe(CN)6，5mmol KCl的PBS为测试底液，然后在室温下利用循环伏安法进行扫描测定，工作电位为-0.3V～0.7V，扫描速度为50mV/s。检测NDM-1的电化学生物传感器的检测原理为：利用NDM-1锁核酸探针修饰电极表面发生杂交反应后，生成的杂交复合物阻碍了电极表面的电子传递，使传感器响应电流变化值增大。该信号变化的大小ΔI与杂交反应的程度呈正相关，ΔI值越大，表明与电极表面固定的LNA探针结合的检测物越多。NDM-1锁核酸探针修饰电极测定的初始还原峰电流记为I0；当核酸杂交反应结束后，测定的还原峰电流并记为I；则峰电流在核酸杂交反应前后变化ΔI＝I－I0。以下以此原理为依据对NDM-1进行检测。
实施例3、检测NDM-1锁核酸探针修饰电极的电化学特性
利用循环伏安法表征电极在修饰及检测过程中的电化学特性，具体检测方法为：将不同阶段的电极按实施例2的方法组建电化学生物传感器后，分别将电极浸泡在150μLNDM-1靶序列终浓度为100μg/L的溶液(pH7.40.1mol/L磷酸盐溶液)中，在37℃恒温箱中杂交45分钟。杂交过程中传感器采用三电极体系测量传感器电流，获得的循环伏安曲线如图1所示。
其中，曲线a为裸金电极在pH7.4含有2mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]和5mmol/l KCl的PBS溶液中的循环伏安曲线，在PBS溶液中加入了氧化还原探针K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]，所以循环伏安曲线出现了一对准可逆的氧化还原峰；曲线b为NDM-1锁核酸探针修饰电极在pH7.4含有2mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]和5mmol/l KCl的PBS溶液中的循环伏安曲线，由于锁核酸探针的磷酸骨架带负电荷，溶液中的[Fe(CN)6]3-同样带有负电荷，同种电荷相排斥，导致[Fe(CN)6]3-的电子在金电极表面传递速度减慢，在一定程度上阻碍了溶液中导电离子在电极表面的电子传递，因此氧化还原峰的峰电流值有所降低，当LNA探针修饰电极后，为了防止LNA“倒伏”在电极表面而出现非特异吸附，而采用巯基己醇封闭非特异性吸附位点；曲线c为巯基己醇封闭后的循环伏安曲线，可见巯基己醇在封闭非特异性吸附位点的同时也阻碍了电子的传输，因此峰电流值进一步减小；曲线d为NDM-1锁核酸探针修饰电极与含100μg/L的NDM-1的溶液反应后的循环伏安曲线，由于电极表面的杂交复合物是没有电活性的生物大分子，进一步阻碍了电极表面的电子传输，与曲线c相比，氧化还原峰的峰电流在孵育前后响应电流明显降低；曲线e为锁核酸修饰NDM-1探针的NDM-1电极在pH7.4不含2mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]和5mmol/l KCl的PBS中的循环伏安曲线，由于体系中缺少氧化还原活性物质，在-0.3V～0.7V扫描范围内，LNA探针修饰电极在PBS溶液中未出现明显的氧化还原峰。以上实验结果表明，NDM-1锁核酸探针修饰电极能够检测NDM-1靶序列，并且组建的检测NDM-1的电化学生物传感器也能检测NDM-1靶序列。
一个检测周期结束后，再进行下一个LNA浓度的检测，操作步骤同上。通过检测反应前后响应电流的变化，检测终浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5μmol/L探针溶液进行杂交反应所引起的△I及反应所需时间。实验重复3次取平均值，以验证传感器的重复性。
实施例4、LNA探针最佳浓度的优化
为了确定LNA探针的最佳浓度，本实施例对LNA的浓度进行了优化实验。首先将LNA探针溶液配制成浓度分别为0.5μM、1.0μM、1.5μM、2.0μM、2.5μM的溶液，然后分别将它们修饰于金电极表面，制备成不同浓度NDM-1锁核酸探针修饰电极，并测定其循环伏安响应电流，实验结果见图2所示。结果显示，修饰LNA探针前后电极的循环伏安曲线有明显改变，说明探针已成功固定于电极上。从图2还可以看出，LNA修饰的电极的电流响应变化值随LNA探针浓度的增大呈先增大后下降的趋势，当LNA探针浓度由0.5μM依次增至1.5μM时，响应电流变化值呈上升的趋势；而当LNA探针浓度从1.5μM递增至2.5μM时，响应电流变化值则呈递减趋势；其中，当LNA探针浓度为1.5μM时，传感器的响应电流变化值最大。因此，LNA探针的最佳浓度为1.5μM。
实施例5、NDM-1电化学生物传感器的灵敏度和特异性试验
为了证实LNA探针的高特异性，选用LNA探针和DNA探针分别与几种不同匹配程度的靶序列进行杂交反应，具体序列如下(下划线部分碱基为错配碱基)：
(1)完全匹配(T1)：5'-atcaggcagccaccaaaagc-3'(SEQ ID NO.2)；
(2)一个碱基错配(T2)：5'-atcacgcagccaccaaaagc-3'(SEQ ID NO.3)；
(3)三个碱基错配(T3)：5'-atcaccgagccaccaaaagc-3'(SEQ ID NO.4)；
(4)五个碱基错配(T4)5'-atcaccgtcccaccaaaagc-3'(SEQ ID NO.5)；
上述四种不同靶序列，在最佳反应条件下，分别与固定在电极表面上的LNA及DNA探针进行杂交反应，比较几种不同情况下的电流变化差值△I之间的差异。结果显示，当与完全互补的靶序列(T1)杂交时，所引起的△I(峰电流变化差值)为11.33±0.47μA，而DNA探针杂交反应所引起的△I为10.27±0.40μA，二者相比具有显著性差异(P<0.05)。当靶序列有一个碱基错配(T2)时，LNA杂交所引起的△I值骤降至3.37±0.15μA，而DNA探针杂交反应引起的△I值仍有9.06±0.49μA，二者相比具有非常显著性差异(P<0.01)。当靶序列有三个碱基错配(T3)时LNA与靶序列结合峰电流的变化值极小，为0.7μA，但DNA探针的△I值却仍有6.90±0.36μA，二者相比具有非常显著性差异(P<0.01)。当靶序列有五个碱基错配(T4)时LNA已无法与靶序列结合而检测不到峰电流的变化，但DNA探针的△I值却仍有2.26±0.21μA，二者相比具有非常显著性差异(P<0.01)。LNA与对应的NDM-1探针相比，其特异性明显增强。产生上述结果的原因是LNA与核酸分子结合力强、特异性高，且LNA/DNA、LNA/RNA的结合较DNA/DNA、DNA/RNA的杂交分子具有更高的热稳定性。因此LNA与核酸序列的结合有着极高的特异性，LNA能够区分正确配对及错配的序列，LNA对互补DNA的错配容忍程度比相应的DNA/DNA更低，本实施例中用LNA分别与靶序列杂交时，发现与不同的靶序列发生杂交反应所引起的峰电流变化有显著差异，当与错配三个碱基的靶序列杂交，基本检测不到峰电流的改变，和上述理论基本符合，说明LNA对碱基错配的识别能力强，用LNA作探针可大大提高核酸杂交检测的特异性，同时由于LNA本身所具有的优越性，与普通的LNA相比可结合更多的靶序列，在一定程度上也可提高反应的灵敏度。两种探针与不同互补程度的靶序列杂交反应实时检测结果见表1。
表1、LNA和DNA探针与完全匹配及错配的靶序列杂交反应结果
由表1可知，LNA探针检测的灵敏度更高，因此LNA修饰的电极的灵敏度也较高，用于检测目的基因的效果更佳。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (9)
1.NDM-1锁核酸探针修饰的电极，其特征在于，所述电极是在金电极表面固定5’端修饰巯基的NDM-1 锁核酸探针，最后用巯基乙醇封闭非特异性吸附位点而得；所述NDM-1锁核酸探针的具体序列为：5'-SH-(CH2)6- gcttttggtggctgcctgat-3'，SH代表巯基基团，下划线部分碱基经锁核酸修饰。
2.权利要求1所述NDM-1锁核酸探针修饰的电极的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
a.将金电极打磨，抛光，清洁，干燥，得清洁的金电极，备用；
b.向步骤a所得清洁的金电极表面滴加含5’端修饰巯基的NDM-1 锁核酸探针溶液，修饰完成后用巯基己醇溶液封闭，超纯水清洗得NDM-1 锁核酸探针修饰的电极。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤a是将金电极分别用0.3μm、0.05μm 的Al2O3粉末打磨抛光，每次打磨后用超纯水洗净，再分别于硝酸、丙酮和超纯水中超声洗涤，干燥，备用。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤b是向步骤a所得清洁的金电极表面滴加浓度为0.5~2.5μM的5’端修饰巯基的NDM-1 锁核酸探针溶液，修饰后用浓度为1mmol/L的巯基己醇溶液封闭，清洗得NDM-1 锁核酸探针修饰的电极。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述5’端修饰巯基的NDM-1 锁核酸探针溶液的浓度为1.5μM。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：5’端修饰巯基的NDM-1 锁核酸探针固定的条件为37℃下恒温1小时。
7.检测NDM-1的电化学生物传感器，其特征在于：包括工作电极、对电极、参比电极和测试底液；所述工作电极为权利要求1所述NDM-1 锁核酸探针修饰的电极，所述对电极为铂电极，所述参比电极为饱和甘汞电极，所述测试底液为pH 7.4 的含2mmol/L K3Fe(CN)6-K4Fe(CN)6和5mmol/L KCl的PBS溶液。
8.权利要求1所述NDM-1 锁核酸探针修饰的电极或权利要求7所述检测NDM-1的电化学生物传感器在检测NDM-1基因中的应用。
9.利用权利要求7所述检测NDM-1的电化学生物传感器检测NDM-1基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：将NDM-1锁核酸探针修饰的电极与样品溶液杂交后，然后以NDM-1 锁核酸探针修饰的电极为工作电极，铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，pH 7.4 的含2mmol/L K3Fe(CN)6-K4Fe(CN)6和5mmol/L KCl的PBS溶液为测试底液构建电化学生物传感器，采用循环伏安法进行扫描测定，电位扫描范围为-0.3V~0.7V，电位扫描速率为50mv/s，根据杂交前后峰电流变化检测NDM-1基因。
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Legal Events
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| GR01 | Patent grant |