CN102539494B - 基于蛋白质控制组装界面的安培型dna电化学传感器 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种基于蛋白质控制组装界面的安培型DNA电化学传感器。包括电极、蛋白质、捕获探针DNA、信号探针DNA和辣根过氧化物酶，电极采用金电极，蛋白质采用牛血清白蛋白，捕获探针DNA采用5’端巯基修饰的单链DNA，信号探针DNA采用3’端生物素标记的单链DNA，辣根过氧化物酶采用亲和素标记，其特征是牛血清白蛋白在金电极表面形成有序组装的牛血清白蛋白分子层，利用牛血清白蛋白分子层中的牛血清白蛋白质分子之间的有序孔隙组装捕获探针DNA。对目标DNA进行检测，检测限为0.01pmol/L。与同类方法相比，该方法所构建的安培型DNA电化学传感器，灵敏度高，重现性好。

Description

基于蛋白质控制组装界面的安培型DNA电化学传感器

技术领域

本发明涉及基于蛋白质控制组装界面的安培型DNA电化学传感器的制备方法，属于生物传感技术领域。

背景技术

目前，利用电化学与酶催化技术相结合构建的安培型DNA电化学传感器已得到广泛的关注，并被应用于肿瘤等疾病的相关基因检测研究。其基本原理为：将单链DNA作为捕获探针，在其末端修饰巯基，通过巯基与金的结合以低温自组装的方式固定到金电极表面，这段捕获探针链可与目标DNA的一端杂交，被捕获的目标DNA的另一端则与信号探针链杂交，形成“三明治”结构。信号探针3’-端标记有生物素，能与辣根过氧化物酶上修饰的亲和素结合，使酶结合到“三明治”结构上。将结合了辣根过氧化物酶的电极置于含有3, 3', 5, 5'-四甲基联苯胺（TMB）和过氧化氢的底液中，则辣根过氧化物酶催化过氧化氢氧化3, 3', 5, 5'-四甲基联苯胺生成双偶氮联苯胺类物质，该产物在还原电位下产生电流信号。由于引入了酶催化放大体系，该方法在灵敏度上有较大的提高，但仍然存在重现性不理想的问题。

DNA捕获探针在传感器界面上的组装是构建DNA电化学传感器的关键。DNA探针的组装密度在很大程度上影响着其与互补链之间的相互作用，进而影响了传感器的性能。目前DNA电化学传感器一般采用直接自组装的方法，即在探针DNA末端修饰基团，通过所修饰基团与基体电极发生化学键合作用，使探针DNA固定到电极表面，然而该固定方法存在很大随机性，难以控制探针密度大小及其分布，因而引起杂交反应的随机性，是造成传感器重现性不佳的主要原因之一。

本发明设计了一种新的方法，在捕获探针组装前，先在电极表面组装一层球形蛋白质分子层，利用球形蛋白质分子之间的有序孔隙组装捕获探针，此时所组装的探针均匀分布在电极表面，使探针的密度得到了控制，减小了探针组装的随机性。利用该方法所构建的安培型DNA电化学传感器，灵敏度高，重现性好。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于蛋白质控制组装界面的安培型DNA电化学传感器。

本发明的另一目的是提供一种基于蛋白质控制组装界面的安培型DNA电化学传感器的制备方法。

本发明的又一目的是提供一种基于蛋白质控制组装界面的安培型DNA电化学传感器的对目标DNA的检测方法。

本发明的再一目的是提供一种基于蛋白质控制组装界面的安培型DNA电化学传感器的基因序列特异性检测。

本发明的目的是还提供了基于蛋白质控制组装界面的安培型DNA电化学传感器用于识别单碱基错配序列与完全互补序列。

本发明的目的是这样实现的，所述的基于蛋白质控制组装界面的安培型DNA电化学传感器，包括电极、蛋白质、捕获探针DNA、信号探针DNA和辣根过氧化物酶，电极采用金电极，蛋白质采用牛血清白蛋白，捕获探针DNA采用5’端巯基修饰的单链DNA，信号探针DNA采用3’端生物素标记的单链DNA，辣根过氧化物酶采用亲和素标记，其特征是牛血清白蛋白在金电极表面形成有序组装的牛血清白蛋白分子层，利用牛血清白蛋白分子层中的牛血清白蛋白质分子之间的有序孔隙组装捕获探针DNA，使探针的密度得到了控制，减小了探针组装的随机性

本发明所述的基于蛋白质控制组装界面的安培型DNA电化学传感器的制备方法，包括如下步骤：

（1）蛋白质控制组装界面的构建：将金电极浸泡在BSA溶液中，室温下组装后清洗，氮气吹干；

（2）捕获探针DNA的组装：取捕获探针DNA溶液，滴涂到经组装蛋白质后的金电极表面，室温放置后，冲洗电极表面，氮气吹干。

本发明所述的基于蛋白质控制组装界面的安培型DNA电化学传感器的制备方法，包括如下步骤：

（1）蛋白质控制组装界面的构建：将金电极浸泡在0.5 wt %的BSA溶液中，在室温下组装15 min后，用pH 7.40 的PBS缓冲液及双蒸水分别清洗，氮气吹干；

（2）捕获探针的组装：取捕获探针DNA溶液，滴涂到经组装蛋白质后的金电极表面，室温放置1 h后，以pH 7.40 PBS缓冲液、双蒸水分别冲洗电极表面，氮气吹干。

制备所述的基于蛋白质控制组装界面的安培型DNA电化学传感器的检测方法，包括以下步骤：

（1）将制备好的传感器置于100 μl含有一定浓度目标DNA和1 μmol/L信号探针的杂交溶液中，在50 ^?C下杂交 35 min后，取出并依次用pH 7.40 的PBS缓冲液，双蒸水清洗，氮气吹干；

（2）在电极表面滴加3 μl HRP-avidin 酶溶液，室温下反应15 min，用含有0.05 % Tween-20的PBS洗液搅拌清洗5 min； 

（3）将传感器浸入到500 μl含H₂O₂的 TMB底物溶液中，以铂丝电极为对电极，Ag/AgCl 为参比电极，记录电流-时间曲线，初始电位：0伏；采样间隔：0.1秒；采样时间：100秒。

制备所述的基于蛋白质控制组装界面的安培型DNA电化学传感器的基因序列特异性检测，其特征是：在捕获探针DNA检测目标DNA时，

（1）当目标DNA 与捕获探针DNA 及信号探针DNA互补时，发生杂交反应，即可在电极表面引入生物素，利用生物素与亲和素的相互作用，即可引入辣根过氧化物酶；将传感器置于含有底物TMB和 H₂O₂的测定溶液中，TMB在传感器表面被辣根过氧化物酶催化氧化，在0 V电位下可测定到TMB催化氧化产物的还原电流信号；

（2）当目标DNA 与捕获探针DNA不发生杂交反应时，则无法在电极表面引入辣根过氧化物酶；将传感器置于含有底物TMB和 H₂O₂的测定溶液中，在0 V电位下无法测定到TMB催化氧化产物的还原电流信号。

所述的基于蛋白质控制组装界面的安培型DNA电化学传感器的基因序列特异性检测，其特征是：当互补序列目标DNA的浓度在0.01 pmol/L~10 nmol/L范围内，电流信号随着目标序列浓度的增加而逐渐增大，检测限为0.01 pmol/L。

制备所述的基于蛋白质控制组装界面的安培型DNA电化学传感器用于识别单碱基错配序列与完全互补序列。

更详细的原理与检测过程如图1所示。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

（一）蛋白质组装界面的构建

将金电极浸没在牛血清白蛋白溶液中，在室温下组装后，用磷酸盐缓冲液及双蒸水分别清洗，氮气吹干。

（二）捕获探针组装

在蛋白质组装界面上滴涂捕获探针溶液，室温下放置组装后，以磷酸盐缓冲液及双蒸水分别清洗，氮气吹干。

（三）杂交

将制备好的传感器置于含有一定浓度的信号探针和目标DNA的杂交溶液中进行DNA杂交，取出并依次用磷酸盐缓冲液及双蒸水清洗，氮气吹干，在电极表面滴加辣根过氧化物酶-亲和素溶液，室温下反应，用含有Tween-20的磷酸盐洗液搅拌清洗后，立即进行电化学检测。

（四）电化学检测

以所制备的传感器作为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl 为参比电极。将工作电极浸入到含过氧化氢的TMB底物溶液中，记录电流时间曲线。

利用本发明对DNA的检测结果如图2，图3所示。

图2结果显示，按照完全互补序列（曲线a）、单碱基错配序列（曲线b）、完全错配序列（曲线c）的顺序安培电流值逐渐降低。当固定有捕获探针与完全互补的目标DNA杂交反应后，电流信号最强（曲线a），说明捕获探针能够很好的与其完全互补的碱基序列进行杂交，出现了强安培电流信号。单碱基错配的ssDNA的安培电流信号（曲线b）相对完全互补序列的信号（曲线a）有明显减弱，这说明捕获探针不能与存在一个碱基错配的序列进行完全杂交，故电流信号较低。此外，完全错配序列所产生的信号（曲线c）接近于背景电流，说明捕获探针不能与完全错配的碱基序列发生杂交，因此电极表面没有结合上带有生物素的信号探针，辣根过氧化物酶（HRP）就不能通过亲和作用结合到电极上。以上结果表明：该方法构建的安培型电化学DNA生物传感器有很好的特异性，能实现对DNA链错配序列的识别和检测。

从图3结果可以看出利用所构建的安培型DNA电化学传感器对特定基因序列进行定量检测，观察电流值随目标序列浓度的变化。在0.01 pM~10 nM范围内，电流信号随着目标序列浓度的增加而逐渐增大，检测限为0.02 pM。结果表明，这种基于蛋白质组装界面的新型DNA电化学传感器对互补ssDNA序列识别具有较高的灵敏度。

对浓度为10 nM的互补链DNA进行了检测，不同电极重复实验8次，结果RSD为4.0%；对浓度为1 nM的互补链DNA进行了检测，不同电极重复实验8次，结果RSD为2.6%。实验结果充分表明新型电化学DNA传感器具有很好的重现性。

由上述技术方案可知，本发明所述的基于蛋白质组装界面的安培型电化学DNA传感器对于识别互补序列具有高度的灵敏性，可对特定基因序列进行定量检测，重现性好。

附图说明

图1为基于蛋白质组装界面的安培型DNA电化学传感器的原理图。

其中：图中的电极标记为1，牛血清白蛋白（BSA）标记为2，捕获探针DNA标记为3，目标DNA标记为4，信号探针DNA标记为5，辣根过氧化物酶标记为6。

图2为捕获探针与（a）完全互补、（b）单碱基错配、（c）完全错配DNA杂交后的电流-时间曲线图。

图3为电流值与目标DNA浓度的关系图。

具体实施方式

如图1所示，本发明所述的基于蛋白质控制组装界面的安培型DNA电化学传感器，包括电极、牛血清白蛋白、捕获探针DNA、信号探针DNA和辣根过氧化物酶-亲和素，辣根过氧化物酶-亲和素指辣根过氧化物酶采用亲和素标记，电极优选金电极1，捕获探针DNA  3优选巯基修饰的单链DNA，信号探针DNA  5优选生物素修饰的单链DNA。先在金电极表面有序组装一层牛血清白蛋白分子层，利用蛋白质分子之间的有序孔隙组装捕获探针，此时所组装的探针均匀分布在电极表面，使探针的密度得到了控制，减小了探针组装的随机性。当目标DNA 2与捕获探针DNA 3及信号探针DNA发生杂交反应后，即可在电极表面引入连接在信号探针上的生物素，利用生物素与辣根过氧化物酶-亲和素的相互作用，即可引入连接在辣根过氧化物酶-亲和素上的辣根过氧化物酶。将传感器置于含有底物TMB和 H₂O₂的测定溶液中，TMB可在传感器表面被辣根过氧化物酶催化氧化，在固定电位下测定TMB催化氧化产物的还原电流信号，该电流信号与目标DNA的浓度相关。

实施例1：

基于蛋白质组装界面的安培型DNA电化学传感器的制备步骤如下：

（1）金电极用Piranha溶液（30 wt %的H₂O₂与浓度98wt%的浓H₂SO₄，以1:3的体积比混合）超声10 min，用去离子水超声清洗2次，每次5 min，然后分别用0.3 μm、0.05 μm Al₂O₃和水的混合物抛光至镜面，依次用乙醇、蒸馏水超声清洗。将超声好的电极置于0.5 M H₂SO₄中，在0~1.6 V电位范围循环伏安扫描至稳定，用双蒸水清洗，N₂吹干后待用；

（2）将步骤（1）处理好的裸金电极浸没在0.5 wt %的BSA溶液中，在室温下组装15 min后，用pH 7.40 的PBS缓冲液及双蒸水分别清洗，氮气吹干，取4 μl 捕获探针DNA（1 μmol/L，寡核苷酸，由宝生生物工程有限公司合成）溶液，滴涂到电极表面，室温放置1 h后，以pH 7.40 PBS缓冲液、双蒸水分别冲洗电极表面，氮气吹干。

实施例2：

基于蛋白质组装界面的安培型DNA电化学传感器对目标DNA的检测步骤如下：

（1）实施例1获得的固定在电极表面的捕获探针DNA（5’- SH-(CH₂)₆-T₁₀-CTTCA GAACT GCTGC TCTGG GTCTC AATGG - 3’）与完全互补DNA序列（5’-ACCAC GTGGC CAGTG GCGCC GGGGA GGCAG CCATT GAGAC CCAGA GCAGC AGTTC TGAAG - 3’）及信号探针DNA（5’-CTGCC TCCCC GGCGC CACTG GCCAC GTGGT- Biotin - 3’）（寡核苷酸，由宝生生物工程有限公司合成）在杂交缓冲溶液（由10 mmol/L Na₂HPO₄-NaH₂PO₄和1 mol/L NaCl配制，并用H₃PO₄和NaOH调节pH至7.40，实验用水为双蒸水）中50 ℃水浴杂交35 min，形成双链DNA，依次用pH 7.40 的PBS缓冲液，双蒸水清洗，氮气吹干。在电极表面滴加3 μl HRP-avidin 溶液（0.5 U/mL），室温下反应15 min，用含有0.05 wt % Tween-20的PBS洗液搅拌清洗5 min后，立即进行电化学检测；

（2）将步骤（1）制得的电极浸入到500 μl TMB底物溶液（K-blue，Neogen corporation)中，以铂丝电极为对电极，Ag/AgCl 为参比电极，记录电流-时间曲线（初始电位：0伏；采样间隔：0.1秒；采样时间：100秒）。测定结果见图2的曲线a。

图2结果显示，当固定有捕获探针与完全互补的目标DNA杂交反应后，电流信号最强（曲线a），说明捕获探针能够很好的与其完全互补的碱基序列进行杂交，出现了强安培电流信号。

实施例3：

基于蛋白质组装界面的安培型DNA电化学传感器对目标DNA的检测步骤如下：

（1）实施例1获得的固定在电极表面的捕获探针DNA（5’- SH-(CH₂)₆-T₁₀-CTTCA GAACT GCTGC TCTGG GTCTC AATGG - 3’）与单碱基错配DNA序列（5’-ACCAC GTGGC CAGTC GCGCC GGGGA GGCAG CCATT GAGAC CCAGA GCAGC AGTTC TGAAG - 3’）及信号探针DNA（5’-CTGCC TCCCC GGCGC CACTG GCCAC GTGGT- Biotin - 3’）（寡核苷酸，由宝生生物工程有限公司合成）在杂交缓冲溶液（由10 mmol/L Na₂HPO₄-NaH₂PO₄和1 mol/L NaCl配制，并用H₃PO₄和NaOH调节pH至7.40，实验用水为双蒸水）中50 ℃水浴杂交35 min，依次用pH 7.40 的PBS缓冲液，双蒸水清洗，氮气吹干。在电极表面滴加3 μl HRP-avidin 溶液（0.5 U/mL），室温下反应15 min，用含有0.05 wt % Tween-20的PBS洗液搅拌清洗5 min后，立即进行电化学检测；

（2）将步骤（1）制得的电极浸入到500 μl TMB底物溶液（K-blue，Neogen corporation)中，以铂丝电极为对电极，Ag/AgCl 为参比电极，记录电流-时间曲线（初始电位：0伏；采样间隔：0.1秒；采样时间：100秒）。测定结果见图2的曲线b。

图2结果显示，单碱基错配的ssDNA的安培电流信号（曲线b）相对完全互补序列的信号（曲线a）有明显减弱，这说明捕获探针不能与存在一个碱基错配的序列进行完全杂交，故电流信号较低。

实施例4：

基于蛋白质组装界面的安培型DNA电化学传感器对目标DNA的检测步骤如下：

（1）实施例1获得的固定在电极表面的捕获探针DNA（5’- SH-(CH₂)₆-T₁₀-CTTCA GAACT GCTGC TCTGG GTCTC AATGG - 3’）与完全错配DNA序列（5’-CGGCA AACCA GTCAC ATATA AAATT CCATC AGTCG CTATG GGTCT CTTAG TCGGA AACCT - 3’）及信号探针DNA（5’-CTGCC TCCCC GGCGC CACTG GCCAC GTGGT- Biotin - 3’）（寡核苷酸，由宝生生物工程有限公司合成）在杂交缓冲溶液（由10 mmol/L Na₂HPO₄-NaH₂PO₄和1 mol/L NaCl配制，并用H₃PO₄和NaOH调节pH至7.40，实验用水为双蒸水）中50 ℃水浴杂交35 min，依次用pH 7.40 的PBS缓冲液，双蒸水清洗，氮气吹干。在电极表面滴加3 μl HRP-avidin 溶液（0.5 U/mL），室温下反应15 min，用含有0.05 wt % Tween-20的PBS洗液搅拌清洗5 min后，立即进行电化学检测。

（2）将步骤（1）制得的电极浸入到500 μl TMB底物溶液（K-blue，Neogen corporation)中，以铂丝电极为对电极，Ag/AgCl 为参比电极，记录电流-时间曲线（初始电位：0伏；采样间隔：0.1秒；采样时间：100秒）。测定结果见图2的曲线c。

图2结果显示，完全错配序列所产生的信号（曲线c）接近于背景电流，说明捕获探针不能与完全错配的碱基序列发生杂交，因此电极表面没有结合上带有生物素的信号探针，HRP就不能通过亲和作用结合到电极上。

以上实施例2、3、4表明：该方法构建的安培型电化学DNA生物传感器有很好的特异性，能实现对DNA链错配序列的识别和检测。

实施例5：

基于蛋白质组装界面的安培型DNA电化学传感器的制备以及对PML/RARα融合基因的检测步骤如下：

（1）金电极用Piranha溶液（30 wt %的H₂O₂与浓度98 wt %的浓H₂SO₄，以1:3的体积比混合）超声10 min，用去离子水超声清洗2次，每次5 min，然后分别用0.3 μm、0.05 μm Al₂O₃和水的混合物抛光至镜面，依次用乙醇、蒸馏水超声清洗。将超声好的电极置于0.5 M H₂SO₄中，在0~1.6 V电位范围循环伏安扫描至稳定，用双蒸水清洗，N₂吹干后待用；

（2）将处理好的裸金电极浸泡在0.5 wt %的BSA溶液中，在室温下组装15 min后，用pH 7.40 的PBS缓冲液及双蒸水分别清洗，氮气吹干；

（3）5’端巯基标记的捕获探针序列为：5’- SH-(CH₂)₆-T₁₀ CTTCA GAACT GCTGC TCTGG GTCTC AATGG - 3’，配制成1 μmol/L的溶液；

（4）取4 μl 步骤（3）的捕获探针DNA溶液，滴涂到经组装蛋白质后的金电极表面，室温放置1 h后，以pH 7.40 PBS缓冲液、双蒸水分别冲洗电极表面，氮气吹干；

（5）3’端生物素标记的信号探针序列为：5’-CTGCC TCCCC GGCGC CACTG G CCAC GTGGT- Biotin - 3’；

（6）将步骤（4）制备好的传感器置于100 μl含有一定浓度目标DNA（5’-ACCAC GTGGC CAGTG GCGCC GGGGA GGCAG CCATT GAGAC CCAGA GCAGC AGTTC TGAAG - 3’）和1 μmol/L信号探针的杂交溶液中，在50 ^?C下杂交 35 min后，取出并依次用pH 7.40 的PBS缓冲液，双蒸水清洗，氮气吹干；

（7）在步骤（6）制得的电极表面滴加3 μl HRP-avidin 酶储备液（5 U/mL），室温下反应15 min，用含有0.05 % Tween-20的PBS洗液搅拌清洗5 min； 

（8）将步骤（7）制得的电极浸入到500 μl TMB底物溶液（K-blue，Neogen corporation)中，以铂丝电极为对电极，Ag/AgCl 为参比电极，记录电流-时间曲线（初始电位：0伏；采样间隔：0.1秒；采样时间：100秒）。电流与目标DNA浓度的关系见图3。

从图3结果可以看出利用所构建的安培型DNA电化学传感器对PML/RARα融合基因进行定量检测，观察电流值随目标序列浓度的变化。在0.01 pmol/L~10 nmol/L范围内，电流信号随着目标序列浓度的增加而逐渐增大，检测限为0.02 pmol/L。结果表明，这种基于蛋白质组装界面的新型DNA电化学传感器对互补ssDNA序列识别具有较高的灵敏度。

如下表1所示，对浓度为10 nmol/L的互补链DNA进行了检测，不同电极重复实验8次，结果RSD为4.0%；对浓度为1 nmol/L的互补链DNA进行了检测，不同电极重复实验8次，结果RSD为2.6%。实验结果充分表明新型电化学DNA传感器具有很好的重现性。 

表1

Claims (1)

1.一种基于蛋白质控制组装界面的安培型DNA电化学传感器，包括电极、蛋白质、捕获探针DNA、信号探针DNA和辣根过氧化物酶，电极采用金电极，蛋白质采用牛血清白蛋白，捕获探针DNA采用5’端巯基修饰的单链DNA，信号探针DNA采用3’端生物素标记的单链DNA，辣根过氧化物酶采用亲和素标记，其特征是:牛血清白蛋白在金电极表面形成有序组装的牛血清白蛋白分子层，利用牛血清白蛋白分子层中的牛血清白蛋白质分子之间的有序孔隙组装捕获探针DNA。

2.一种制备如权利要求1所述的基于蛋白质控制组装界面的安培型DNA电化学传感器的方法，包括如下步骤：

（1）蛋白质控制组装界面的构建：将金电极浸泡在BSA溶液中，室温下组装后清洗，氮气吹干；

（2）捕获探针DNA的组装：取捕获探针DNA溶液，滴涂到经组装蛋白质后的金电极表面，室温放置后，冲洗电极表面，氮气吹干。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征是：

（1）蛋白质控制组装界面的构建：将金电极浸泡在0.5 wt %的BSA溶液中，在室温下组装15 min后，用pH 7.40 的PBS缓冲液及双蒸水分别清洗，氮气吹干；

（2）捕获探针的组装：取捕获探针DNA溶液，滴涂到经组装蛋白质后的金电极表面，室温放置1 h后，以pH 7.40 PBS缓冲液、双蒸水分别冲洗电极表面，氮气吹干。

4.一种利用如权利要求1所述的基于蛋白质控制组装界面的安培型DNA电化学传感器的检测方法，包括以下步骤：

（1）将制备好的传感器置于100 μl含有一定浓度目标DNA和1 μmol/L信号探针的杂交溶液中，该杂交溶液为由10 mmol/L Na₂HPO₄-NaH₂PO₄和1 mol/L NaCl配制，并用H₃PO₄和NaOH调节pH至7.40，实验用水为双蒸水，在50 ^?C下杂交 35 min后，取出并依次用pH 7.40 的PBS缓冲液，双蒸水清洗，氮气吹干；

（2）在电极表面滴加3 μl 浓度为0.5 U/mL的HRP-avidin 酶溶液，室温下反应15 min，用含有0.05 % Tween-20的PBS洗液搅拌清洗5 min； 

（3）将传感器浸入到500 μl含H₂O₂的 TMB底物溶液中，以铂丝电极为对电极，Ag/AgCl 为参比电极，记录电流-时间曲线，初始电位：0伏；采样间隔：0.1秒；采样时间：100秒。

5.一种利用如权利要求1所述的基于蛋白质控制组装界面的安培型DNA电化学传感器的基因序列特异性检测方法，其特征是：在捕获探针DNA检测目标DNA时，

（1）当目标DNA 与捕获探针DNA 及信号探针DNA互补时，发生杂交反应，即可在电极表面引入生物素，利用生物素与亲和素的相互作用，即可引入辣根过氧化物酶；将传感器置于含有底物TMB和 H₂O₂的测定溶液中，TMB在传感器表面被辣根过氧化物酶催化氧化，在0 V电位下可测定到TMB催化氧化产物的还原电流信号；

（2）当目标DNA 与捕获探针DNA不发生杂交反应时，则无法在电极表面引入辣根过氧化物酶；将传感器置于含有底物TMB和 H₂O₂的测定溶液中，在0 V电位下无法测定到TMB催化氧化产物的还原电流信号。

6.根据权利要求5所述的基于蛋白质控制组装界面的安培型DNA电化学传感器的基因序列特异性检测方法，其特征是：当互补序列目标DNA的浓度在0.01 pmol/L~10 nmol/L范围内，电流信号随着目标序列浓度的增加而逐渐增大，检测限为0.01 pmol/L。

7.权利要求1所述的基于蛋白质控制组装界面的安培型DNA电化学传感器在识别单碱基错配序列与完全互补序列中的应用。