CN104483275B - 一种生物巯化物的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物检测领域，涉及一种生物巯化物的检测方法。主要是利用在酸性条件下生物巯化物及显色剂3，3’，5，5’‑四甲基联苯胺竞争与银离子结合，从而抑制银离子引发的显色剂蓝色显色复合物的生成，在波长范围340nm‑780nm进行比色测定，用656nm处的吸收峰进行生物巯化物的检测。该方法在实现生物样本中生物巯化物快速测定的同时，兼具操作简单、成本低廉等优点，适用于血清、细胞裂解液等生物样本中生物巯化物的测定。
Description
技术领域
本发明属于生物检测领域，涉及一种用于检测样品中生物巯化物的方法。
背景技术
生物巯化物，包括半胱氨酸、同型半胱氨酸、谷胱甘肽等等，在生物体内各生化过程起着至关重要的作用。它在体内的含量对维持生物机体内氧化还原环境平衡等方面发挥着重要作用。近年来若干研究表明，生物机体内生物巯化物浓度的变化常与各类疾病息息相关，当其在生物体内表达过低时，常会引起生长趋缓、肝脏损伤等，而当其在机体内呈现高表达时又会引起阿尔兹海默病、帕金森综合症及心血管疾病的发生。因而，生物机体内生物巯化物的检测可以为这些疾病的临床诊断和治疗提供许多重要的信息。
现今检测生物巯化物的技术主要包括高效液相色谱法、毛细管电泳法、荧光光谱测定法等等。这些方法在检测灵敏度、选择性、检测时间和稳定性方面各有优势，但同时也存在操作繁琐、仪器设备昂贵等不足之处。因此，发明一种简单、直观、可行的生物巯化物检测方法显得非常迫切。
比色法是通过比较或测量有色物质溶液的颜色深浅度来确定待测组分含量的方法，常用的比色法有两种：目视比色法和光电比色法，两种方法都是以朗伯-比尔定律为基础。目视比色法，只需用眼睛观察就可得到直观的实验现象，光学比色法只需要使用紫外分光光度计就可以得到灵敏的实验结果，所需实验设备简单、操作简便。
发明内容
本发明的目的是为了建立一种生物巯化物的简便检测方法。该方法通过检测体系中一种常见显色剂3，3’，5，5’-四甲基联苯胺所形成的蓝色显色复合物的生成量，即可实现生物样本中生物巯化物的间接检测。
一种生物巯化物的检测方法，利用生物巯化物和银离子的强亲和力，在酸性条件下竞争原本可以使得显色剂3，3’，5，5’-四甲基联苯胺溶液显色的银离子，从而抑制显色剂蓝色复合物的生成，在波长656nm比色测定，通过制定的标准曲线，最终换算成生物巯化物的浓度。
所述的生物巯化物与显色剂3，3’，5，5’-四甲基联苯胺之间对银离子的竞争，显色剂3，3’，5，5’-四甲基联苯胺与银离子的终浓度分别是1mM及100μM。
本发明生物巯化物的检测方法，于室温(约25℃)、pH4.0条件下，加入生物巯化物样品 反应1小时，在波长340nm-780nm进行比色测定，利用656nm的吸收峰进行定量。
本发明生物巯化物的检测方法中，采用了一种常见的生物巯化物样品半胱氨酸(分析纯)为标准样品，测定标准曲线，然后再根据样品比色值结果测算实际生物巯化物的含量。
本发明的有益效果在于，建立了一个可用实际样本生物巯化物的检测方法，通过溶液颜色的变化实现生物样本中生物巯化物的快速检测的同时，兼具操作简单、成本低廉等优点，适用于血清、细胞裂解液等生物样本中生物巯化物的测定，在实际生产生活中有一定的应用价值。
附图说明
图1为100μM半胱氨酸及对照实验的紫外可见吸收光谱图。体系中包括1mM3，3’，5，5’-四甲基联苯胺、100μM银离子及(a)对照组，水；(b)对照组，半胱氨酸的巯基阻断剂N--乙基顺丁烯二酰亚胺(NEM)；(c)实验组，100μM半胱氨酸；(d)对照组，100μM半胱氨酸及巯基的阻断剂NEM。
图2为检测不同浓度半胱氨酸(从a到j分别为0.5μM、1μM、10μM、25μM、50μM、75μM、100μM、200μM、500μM、1000μM)时得到的紫外可见吸收光谱图。
图3为紫外吸收峰值(Abs656nm-753nm)与半胱氨酸浓度的关系图，插入图为半胱氨酸浓度在0.5μM-50μM范围内，紫外吸收峰值(Abs656nm-753nm)与半胱氨酸浓度的线性关系图，插入图为半胱氨酸的标准曲线。
图4为检测特异图，体系中含有20种不同氨基酸(从左到右分别为丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸)对应的紫外可见吸收光谱吸收峰值(Abs656nm-753nm)柱状图。
具体实施方式
实施例一：实验原理验证
称取TMB粉末，用无水乙醇于37度水浴溶解至浓度为10mM。称取AgNO3粉末、半胱氨酸粉末、巯基阻断剂NEM，用双蒸水分别溶解至浓度为1mM、10mM、10mM。配制1M醋酸-醋酸钠缓冲液，pH值4.0。分别进行以下四组实验：(a)800μL双蒸水；(b)750μL10mMNEM溶液，50μL双蒸水；(c)20μL10mM半胱氨酸溶液，780μL双蒸水；(d)20μL10mM半胱氨酸溶液，750μL10mMNEM溶液，30μL双蒸水，四个反应体系于室温放置1小时。1小时后，再往每组实验体系中加入200μL10mM TMB溶液，200μL1mM AgNO3 溶液，800μL1M醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.0)混合1小时后，肉眼观察实验现象并用紫外可见分光光度计进行检测，扫描波长从320nm-780nm。如图1中a曲线所示，当体系中存在TMB和Ag+时，溶液的颜色会从无色变成蓝色，即在656nm处出现一个吸收峰，而当体系中存在200μM半胱氨酸时，溶液的颜色显示为无色(图1，c曲线)。同时图1中b、d曲线则表明，当体系中的巯基被阻断剂阻断后，溶液颜色依然为蓝色，在656nm处有一个吸收峰，这就证明了体系中溶液颜色的变化是和巯基相关。
实施例二：不同浓度半胱氨酸的标准曲线
体系中加入200μL10mM TMB溶液，200μL1mM AgNO3溶液，800μL1M醋酸-醋酸钠缓冲液混合，再往体系中加入不同浓度的半胱氨酸(0.5μM、1μM、10μM、25μM、50μM、75μM、100μM、200μM、500μM、1000μM)的待测标准溶液，室温放置1小时后，肉眼观察实验现象并用紫外可见分光光度计进行320nm-780nm的扫描。如图2所示，随着半胱氨酸浓度的提高，在656nm的紫外吸收峰值逐渐减小，而当体系中半胱氨酸浓度为100μM(图2，曲线g)时，体系的颜色几乎是无色，反应在紫外可见吸收光谱上就是在656nm附近的吸收光谱几乎是一条直线。这主要是由于随着半胱氨酸浓度的增加，越来越多的Ag+与半胱氨酸上的巯基结合，进而抑制了Ag+引发的显色复合物的变色。图3为重复多次实验(n＝3)得出的紫外吸收峰差值与半胱氨酸浓度作图所得。图3中的插入图显示，当半胱氨酸的浓度在0.5μM-50μM之间变化时，半胱氨酸浓度与紫外吸收峰的变化值呈现良好的线性关系，可以作为半胱氨酸的定量检测的依据。
实施例三：检测方法特异性研究
体系中加入200μL10mM TMB溶液，200μL1mM AgNO3溶液，800μL1M醋酸-醋酸钠缓冲液混合，再往体系中加入各20种氨基酸(200μM)，室温放置1小时后，肉眼观察实验现象并用紫外可见分光光度计进行320nm-780nm的扫描。图4所示，在针对20种氨基酸的特异性实验中，只有半胱氨酸的紫外吸收峰值发生了明显的变化，即在颜色上，只有半胱氨酸样品组的颜色几乎呈现无色，其他氨基酸实验样本均显示为蓝色，即本方明方法只针对20氨基酸中的半胱氨酸的检测有效。
实施例四：实际生物样本中生物巯化物的检测
饲养奶牛，通过颈动脉取血的方式取得奶牛的新鲜血液，以3000×g离心10分钟得到新鲜的牛血浆。将离心所得的牛血浆稀释100倍后取50μL，与200μL10mM TMB溶液，200μL1mM AgNO3溶液，800μL1M醋酸-醋酸钠缓冲液及蒸馏水混合至总体积2mL，混匀后室温放至1小时，肉眼观察实验现象并用紫外分光光度计进行320nm-780nm的扫描。检测结果经分析后，如表1所示，所测牛血浆中生物巯化物的浓度为486μM。同时为了验证体系的实际 可操作性，我们往牛血浆中加了一定浓度的半胱氨酸(1250μM、2500μM)，根据本发明方法检测所得到的半胱氨酸浓度与实际加入的半胱氨酸浓度相符合(表1)，证明了该体系具有实际的操作性，有较好的可信度和重复度。
表1牛血清样品实测结果
Claims (4)
1.一种生物巯化物半胱氨酸的检测方法，其特征是在酸性条件下，生物巯化物半胱氨酸具有和银离子的强亲和力，可以竞争结合原本使显色剂3，3’，5，5’-四甲基联苯胺显色的银离子，抑制显色剂蓝色复合物的生成，根据随之产生的紫外-可见吸收光谱的变化，在波长656nm进行比色测定，通过制定的标准曲线，对样品中生物巯化物半胱氨酸的浓度进行分析。
2.根据权利要求1所述的一种生物巯化物半胱氨酸的检测方法，其特征是所述的生物巯化物半胱氨酸与显色剂3，3’，5，5’-四甲基联苯胺之间与银离子结合的竞争。
3.根据权利要求1所述的一种生物巯化物半胱氨酸的检测方法，其特征是终浓度分别为100μM及1mM的银离子与显色剂3，3’，5，5’-四甲基联苯胺溶液，于室温(约25℃)、pH4.0条件下，加入含有不同浓度的半胱氨酸标准溶液反应1小时，在波长340nm-780nm范围进行紫外-可见吸收光谱的测定，依据656nm的吸收峰值与半胱氨酸浓度绘制标准曲线。
4.根据权利要求1所述的一种生物巯化物半胱氨酸的检测方法，其特征是终浓度分别为100μM及1mM的银离子与显色剂3，3’，5，5’-四甲基联苯胺溶液，于室温(约25℃)、pH4.0条件下，与含有半胱氨酸的实际样品反应1小时，测定656nm吸收峰值，根据标准曲线计算实际样品中生物巯化物半胱氨酸的浓度。
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