CN109238999A - 一种显色法检测抗坏血酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种显色法检测抗坏血酸的方法，用Ag(I)离子使3,3′,5,5′‑四甲基联苯胺(TMB)发生氧化反应，生成蓝色的TMB亚胺盐。但是，在Ag(I)/TMB这个氧化体系中加入微量的还原剂抗坏血酸时，抗坏血酸会与TMB亚胺盐发生还原反应，使体系蓝色变浅，且变浅的程度与抗坏血酸的浓度有成正比，据此据此建立了一种检测抗坏血酸的方法，与现有技术相比，该方法操作简单，能快速实时的对抗坏血酸的浓度进行检测，而且，可以用于检测微量的抗坏血酸，检测限可低至0.6μM，而且，检测准确度高，误差小。
Description
技术领域
本发明属于检测领域，具体涉及一种显色法检测抗坏血酸的方法。
背景技术
抗坏血酸又称为维生素C，它是人体需求量最多的一种维生素。抗坏血酸可以用来减轻抗坏血酸过氧化物酶基底的氧化应力，还参与许多重要的生物合成过程，是维持机体正常生理功能的重要维生素之一。但是人体却不能自身合成,只能从外界摄取，因此，开发设计一种可以检测低浓度抗坏血酸的方法具有重要的理论价值和应用价值。
目前，抗坏血酸的主要检测方法有催化动力学法、分光光度法、色谱法、毛细管电泳法、酶方法、荧光法等。其中，酶方法对实验条件的要求过高，酶的稳定性对于实验结果影响较大；气相色谱法不能直接用于检测抗坏血酸，所需的前期处理工作过于繁琐，且操作复杂，而分光光度法所需仪器价格便宜且操作简便。因此开发一种新的分光光度法检测抗坏血酸具有很重要的意义。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种显色法检测抗坏血酸的方法，用Ag(I)离子使3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)发生氧化反应，生成蓝色的TMB亚胺盐。但是，在Ag(I)/TMB这个氧化体系中加入微量的还原剂抗坏血酸时，抗坏血酸会与TMB亚胺盐发生还原反应，使体系蓝色变浅，且变浅的程度与抗坏血酸的浓度有成正比，据此据此建立了一种检测抗坏血酸的方法，该方法操作简单，能快速实时的对抗坏血酸的浓度进行检测，而且，可以用于检测微量的抗坏血酸。
本发明具体技术方案如下：
一种显色法检测抗坏血酸的方法，具体方法为：
将3,3′,5,5′-四甲基联苯胺溶液和Ag(I)溶液混合反应，再分别加入不同量的抗坏血酸溶液，最后分别测量吸光度，构建吸光度与抗坏血酸浓度的线性关系，利用此线性关系检测未知浓度的抗坏血酸。
进一步的，所述方法在22-26℃条件下进行。
进一步的，检测体系中Ag(I)终浓度为40μM，3,3′,5,5′-四甲基联苯胺终浓度大于30μM，优选为50μM。
进一步的，检测之前，调节体系pH至3.0-7，优选的调节pH至3.8。
检测体系中，抗坏血酸终浓度分别为0μM、1.665μM、3.33μM、5μM、6.67μM、8.83μM、10μM和11.67μM。
进一步的，检测是的吸收波长在653nm处的吸光强度。
构建的线性关系为A＝0.31757-0.02476C且线性相关系数R2为-0.995。
优选的，具体检测方法为：
将50μL 0.5mM的3,3′,5,5′-四甲基联苯胺溶液和60μL 1mM的Ag(I)溶液混合反应，体系变蓝色，再分别向体系中加入不同量的抗坏血酸溶液，然后各加入500μL 0.1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液调至pH＝3.8，再加入去离子水定容至1.5mL，最后，使用紫外可见分光光度计测量653nm处的吸光度，构建吸光度与抗坏血酸终浓度的线性关系，利用此线性关系检测未知浓度的抗坏血酸。
本发明分别取3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)溶液和硝酸银溶液混合，由于Ag(I)的氧化作用，3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)被氧化生成蓝色的TMB亚胺盐，使体系颜色从无色变为蓝色。然后，再往该体系中分别加入不同量的抗坏血酸，调节体系Ph，再加去离子定容混合摇匀。由于抗坏血酸的还原作用，使体系的TMB亚胺盐发生还原反应立刻生成无色的3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)。因此随着抗坏血酸浓度的增加，体系蓝色逐渐变浅，在一定的浓度范围内，体系蓝色变浅的程度与抗坏血酸的浓度有成正比，据此建立了一种检测抗坏血酸的方法，与现有技术相比，该方法操作简单，能快速实时的对抗坏血酸的浓度进行检测，检测限可低至0.6μM，而且，检测准确度高，误差小。
附图说明
图1为抗坏血酸检测示意图；
图2为体系中3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)终浓度与吸光度的关系；
图3为653nm处的吸光强度的变化(△A)与PH的关系，抗坏血酸的浓度:4μM；
图4为不同浓度抗坏血酸(从上至下依次为0–4.667μM)与溶液吸光度的变化图；
图5为抗坏血酸浓度在0–4.667μM范围内的线性关系；
图6为3,3’5,5’-四甲基联苯胺(TMB)溶液与Ag(I)混合溶液对于抗坏血酸选择性和抗干扰性，干扰溶液浓度均为53.3μM，抗坏血酸浓度为5.33μM。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步说明。
本发明所用试剂配制：
3,3’5,5’-四甲基联苯胺(TMB)溶液的制备：
将0.0601g 3,3’5,5’-四甲基联苯胺(TMB)用95％乙醇溶解，并超声震荡3分钟，然后将其转移至50ml容量瓶中并使用95％乙醇定容至刻度，即配制为5.0mM的3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)溶液，使用时将5.0mM的3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)溶液用去离子水稀释十倍使用，即3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)溶液的浓度为0.5mM。
柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液的配制：
取2.1013g柠檬酸(C6H8O7·H2O)和2.9421g柠檬酸钠(Na3C6H5O7.2H2O)，用去离子水溶解，超声震荡3分钟，然后将其分别转移至100mL容量瓶并定容，即配制为0.1M的柠檬酸溶液和0.1M的柠檬酸钠溶液，将其配制为系列不同pH的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液。
实施例1
一种显色法检测抗坏血酸的方法，具体方法为：
在25℃下，将50μL 0.5mM的3,3′,5,5′-四甲基联苯胺溶液和60μL1mM的硝酸银溶液混合反应1min，由于Ag(I)的氧化作用，3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)被氧化生成蓝色的TMB亚胺盐，体系变蓝色，重复上述体系10份，分别向体系中加入不同量的0.1mM抗坏血酸溶液，加入量分别为0μL、10μL、20μL、30μL、40μL、50μL、60μL和70μL，然后各加入500μL 0.1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液调至PH＝3.8，再各加入去离子水定容至1.5mL，体系中最终抗坏血酸浓度分别为:0μM、0.667μM、1.33μM、2μM、2.667μM、3.33μM、4μM、4.667μM，分别使用紫外可见分光光度计测量其653nm处的吸光度吸光度。构建吸光度与抗坏血酸终浓度的线性关系，利用此线性关系检测未知浓度的抗坏血酸。
加入抗坏血酸溶液后，体系的蓝色逐渐变浅，且变浅的程度与抗坏血酸的加入量有关。抗坏血酸在一定浓度范围内，溶液的吸光度与抗坏血酸的加入的浓度呈线性关系(图4,5)，用图4中653nm处的吸光强度与加入的抗坏血酸浓度作图，如图5所示，抗坏血酸浓度在0-4.667μM的浓度范围内，抗坏血酸浓度与溶液吸光度呈线性关系。线性方程A＝0.31757-0.02476C且线性相关系数R2为-0.995，对于抗坏血酸的检测限可低至0.6μM。
检测条件下优化：
取13份60μL 1mM硝酸银溶液于试管中，向其中分别加入0μL、15μL、30μL、45μL、60μL、75μL、90μL、105μL、120μL、135μL、150μL、165μL、180μL的0.5mM的3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)溶液，在分别用去离子水定容至1.5mL，该系列溶液中3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)的最终浓度依次为0μM、5.0μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM、45μM、50μM、55μM、60μM，Ag(I)的最终浓度为40μM，在Ag(I)离子的氧化作用下，该系列溶液随3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)浓度的增加，其颜蓝色逐渐变深，其吸收波长在653nm处的吸光强度与3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)浓度关系如图2所示。由图2可知，当3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)终浓度大于30μM时可以与40μM的Ag(I)完全作用，为保证反应完全，选择50μM为最佳3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)浓度浓度。
反应体系最适pH的确定：
为了最大限度地降低检测限，实现Ag(I)/TMB体系对抗坏血酸高灵敏的检测，实验中对反应的pH值进行了优化，实验过程中的pH用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液调节，pH调节范围为3.0～6.7，结果如图3所示。从图中可以看出，随着pH的增大，体系吸收波长在653nm处的吸光强度的变化△A(△A＝A0–A)(式中A0和A分别为Ag(I)/TMB体系的吸光度和Ag(I)/TMB体系加入抗坏血酸的吸光度)先增大，后减小，在pH＝3.8时△A达到最大。因此，反应最佳pH为3.8。上述实验过程中，只调节体系pH，体系中硝酸银浓度为40μM，3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)终浓度50μM，抗坏血酸的浓度4μM。
选择性实验：
一个稳定优良的检测方案，必须有较好的选择性和抗干扰能力。为了探究此种抗坏血酸检测方案的抗干扰能力，本实验选择了一些常见离子如图6所示来做干扰实验。其中，空白组为50μL 0.5mM的3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)溶液和60μL 1mM的硝酸银溶液，并加入100μL 0.1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液调至PH＝3.8，加入去离子水定容至1.5mL，其余组为在空白组基础上，分别加入Mg2+、Pb2+、Na+、Ni+、葡萄糖、牛血清蛋白、环糊精、肝素、肌苷、三聚氰胺和抗化学酸溶液，抗坏血酸浓度为5μM，其他干扰溶液浓度均为50μM，实验结果如图6所示，加入抗坏血酸使溶液吸光度下降最大，并且除抗坏血酸外，其他溶液对于该溶液的吸光度影响很小，几乎可以忽略。实验结果表明，该种检测方法具有很好的选择性和抗干扰性。
实际样品检测实验
由于TMB/Ag(I)体系具有良好的光谱应用前景，所以本实验在测定水溶液中抗坏血酸浓度的最佳分析条件下，对自来水中的抗坏血酸进行了检测分析。水样品通过0.45mm的微孔膜过滤后再进行分析检测，实验分析结果如下表1所示。
表1 TMB/Ag(I)体系在实际样品中检测抗坏血酸
| 样品 | 加入量(μM) | 检测回收(μM) | 回收率(％) | 相对标准偏差(％) |
| 自来水 | 0.0 | 未检测出 | - | - |
| 自来水 | 4 | 4.12 | 103.5 | 2.5 |
表明本实验所述方法可以很好的应用到实际样品检测中。
Claims (9)
1.一种显色法检测抗坏血酸的方法，其特征在于，所述方法具体为：
将3,3′,5,5′-四甲基联苯胺溶液和Ag(I)溶液混合反应，再分别加入不同量的抗坏血酸溶液，最后分别测量吸光度，构建吸光度与抗坏血酸浓度的线性关系，利用此线性关系检测未知浓度的抗坏血酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，检测体系中Ag(I)终浓度为40μM；3,3′,5,5′-四甲基联苯胺终浓度大于30μM。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，检测之前，调节体系pH至3.0-7。
4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，检测之前，调节体系pH至3.8。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，检测体系中，抗坏血酸终浓度分别为0μM、1.665μM、3.33μM、5μM、6.67μM、8.83μM、10μM和11.67μM。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，检测是的吸收波长在653nm处的吸光强度。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，构建的线性关系为A＝0.31757-0.02476C且线性相关系数R2为-0.995。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，具体检测方法为：
将50μL 0.5mM的3,3′,5,5′-四甲基联苯胺溶液和60μL 1mM的Ag(I)溶液混合反应，体系变蓝色，再分别向体系中加入不同量的抗坏血酸溶液，然后各加入500μL 0.1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液调至pH＝3.8，再加入去离子水定容至1.5mL，最后，使用紫外可见分光光度计测量653nm处的吸光度，构建吸光度与抗坏血酸终浓度的线性关系，利用此线性关系检测未知浓度的抗坏血酸。
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，所述方法在22-26℃条件下进行。
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