CN109211821A - 一种抗坏血酸的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种抗坏血酸的检测方法,检测方法为:Ce(IV)离子能够使3,3′,5,5′‑四甲基联苯胺(TMB)发生氧化反应生成蓝色的TMB亚胺盐,当向Ce(IV)/TMB体系中加入微量抗坏血酸时,抗坏血酸与TMB亚胺盐发生还原反应,使体系蓝色变浅,且变浅的程度与抗坏血酸的浓度有成正比,构建线性关系,实现对抗坏血酸的检测。与现有技术相比,本发明方法操作简单,能快速实时的对抗坏血酸的浓度进行检测。而且,检测限低,对于抗坏血酸的检测限可低至0.08μM,并且,检测方法具有很好的选择性和抗干扰性。
Description
技术领域
本发明属于检测领域,具体涉及一种抗坏血酸的检测方法。
背景技术
抗坏血酸即维生素C,其广泛存在于水果、蔬菜、饮料、药物及人体中,是维持机体正常生理功能的重要维生素之一,但人体不能自身合成,只能从外界摄取,因此,开发设计一种可以检测低浓度抗坏血酸的方法具有重要的理论价值和应用价值。
目前,抗坏血酸的主要检测方法有催化动力学法、分光光度法、色谱法、毛细管电泳法、酶方法、荧光法等。其中,酶方法对实验条件的要求过高,酶的稳定性对于实验结果影响较大;气相色谱法不能直接用于检测抗坏血酸,所需的前期处理工作过于繁琐,且操作复杂。而分光光度法所需仪器价格便宜且操作简便。因此开发一种新的分光光度法检测抗坏血酸具有很重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗坏血酸的检测方法,将3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)溶液和硫酸高铈溶液混合,由于Ce(IV)的氧化作用,使3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)发生氧化反应立刻生成蓝色的TMB亚胺盐,使体系颜色从无色变为蓝色。然后,再往该体系中加入一定量的抗坏血酸,由于抗坏血酸的还原作用,使体系的TMB亚胺盐发生还原反应立刻生成无色的3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)。因此随着抗坏血酸浓度的增加,体系蓝色逐渐变浅,在一定的浓度范围内,体系蓝色变浅的程度与抗坏血酸的浓度有成正比,据此建立了一种检测抗坏血酸的方法。该方法操作简单,能快速实时的对抗坏血酸的浓度进行检测。
本发明具体技术方案如下:
一种抗坏血酸的检测方法,包括以下步骤:
将3,3′,5,5′-四甲基联苯胺溶液和Ce(IV)溶液混匀反应,再分别加入不同量的抗坏血酸溶液,然后调节体系pH,最后分别测量吸光度,构建吸光度与抗坏血酸浓度的线性关系,利用此线性关系检测未知浓度的抗坏血酸。
所述检测方法在22-27℃条件下进行。
进一步的,检测体系中Ce(IV)终浓度为53.33μM,3,3′,5,5′-四甲基联苯胺终浓度为13.3-106.7μM,优选为80μM。
进一步的,调节体系pH至3.0-6.7,优选的调节pH至5。
检测体系中,抗坏血酸终浓度分别为0μM、1.665μM、3.33μM、5μM、6.67μM、8.83μM、10μM和11.67μM。
进一步的,检测是的吸收波长在654nm处的吸光强度。
构建的线性关系为:线性方程A=0.447-50.0237C且线性相关系数R2为-0.998。
优选的,具体检测方法为:
将240μL 0.5mM的3,3′,5,5′-四甲基联苯胺溶液和80μL 1mM的Ce(IV)溶液混匀反应,体系变蓝色,再分别加入不同量的抗坏血酸溶液,然后各加入80μL 0.1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液调至PH=5,再加入去离子水定容至1.5mL,最后,使用紫外可见分光光度计测量654nm处的吸光度,构建吸光度与抗坏血酸浓度的线性关系,利用此线性关系检测未知浓度的抗坏血酸。
本发明检测原理:Ce(IV)离子能够使3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)发生氧化反应生成蓝色的TMB亚胺盐,当向Ce(IV)/TMB体系中加入微量抗坏血酸时,抗坏血酸与TMB亚胺盐发生还原反应,使体系蓝色变浅,且变浅的程度与抗坏血酸的浓度有成正比,构建线性关系,实现对抗坏血酸的检测。
与现有技术相比,本发明方法操作简单,能快速实时的对抗坏血酸的浓度进行检测。而且,检测限低,对于抗坏血酸的检测限可低至0.08μM,并且,检测方法具有很好的选择性和抗干扰性。
附图说明
图1为本发明抗坏血酸检测原理示意图;
图2为3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)浓度与吸光度的关系;
图3为654nm处的吸光强度的变化(△A)与PH的关系,抗坏血酸的浓度:7μM;
图4为不同浓度抗坏血酸与溶液吸光度的变化图,抗坏血酸浓度从上至下依次为0–11.67μM;
图5为抗坏血酸浓度在0–12μM范围内的线性关系;
图6为3,3’5,5’-四甲基联苯胺(TMB)溶液与Ce(IV)混合溶液对于抗坏血酸选择性和抗干扰性,干扰溶液浓度均为50μM,抗坏血酸浓度为7μM。
具体实施方式
本发明所用试剂配制:
3,3’5,5’-四甲基联苯胺(TMB)溶液的制备:
将0.0601g 3,3’5,5’-四甲基联苯胺(TMB)用95%乙醇溶解,并超声震荡3分钟,然后,将其转移至50ml容量瓶中并使用95%乙醇定容至刻度,即配制为5.0mM的3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)溶液,使用时将5.0mM的3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)溶液用去离子水稀释十倍使用,即3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)溶液的浓度为0.5mM。
柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液的配制:
取2.1013g柠檬酸(C6H8O7·H2O)和2.9421g柠檬酸钠(Na3C6H5O7.2H2O),用去离子水溶解,超声震荡3分钟,然后将其分别转移至100mL容量瓶并定容,即配制为0.1M的柠檬酸溶液和0.1M的柠檬酸钠溶液,将其配制为系列不同pH的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液。
实施例1
一种抗坏血酸的检测方法,包括以下步骤:
在25℃下,取240μL 0.5mM的3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)溶液和80μL 1mM硫酸高铈溶液于试管中混合,分别向试管中加入不同量的抗坏血酸溶液,再各加入80μL 0.1M的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液调至PH=5,再加入去离子水定容至1.5mL,检测体系中,抗坏血酸终浓度分别为0μM、1.665μM、3.33μM、5μM、6.67μM、8.83μM、10μM、11.67μM。最后使用紫外可见分光光度计测量其吸光度。向上述体系中加入抗坏血酸溶液后,体系的蓝色逐渐变浅,且变浅的程度与抗坏血酸的加入量有关。抗坏血酸在一定浓度范围内,溶液的吸光度与抗坏血酸的加入的浓度呈线性关系。图4位不同浓度抗坏血酸(从上至下依次为0–11.67μM)与溶液吸光度的变化图,用图4中654nm处的吸光强度与加入的抗坏血酸浓度作图,如图5所示,抗坏血酸浓度在0-12μM的浓度范围内,抗坏血酸浓度与溶液吸光度呈线性关系,得到抗坏血酸浓度与654nm处的吸光强度之间的线性方程A=0.447-50.0237C且线性相关系数R2为-0.998,对于抗坏血酸的检测限可低至0.08μM。
确检测条件优化:
3,3’5,5’-四甲基联苯胺(TMB)溶液最适浓度的确定:
取11只试管,各加入80μLCe(IV)(1mM)溶液,然后,向每只试管中分别加入40μL、50μL、60μL、70μL、80μL、120μL、160μL、200μL、240μL、280μL、320μL的3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)溶液(0.5mM),并用去离子水定容至1.5mL,该系列溶液中3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)的最终浓度依次为13.3μM、16.7μM、20μM、23.3μM、26.7μM、40μM、53.3μM、66.7μM、80μM、93.3μM、106.7μM,Ce(IV)的最终浓度为53.33μM),在Ce(IV)离子的氧化作用下,该系列溶液随3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)浓度的增加,其颜蓝色逐渐变深,其吸收波长在654nm处的吸光强度与3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)浓度关系如图2所示。由图2可知,当3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)终浓度大于或等于80μM时可以与53.33μM的Ce(IV)完全作用,本实验选择80μM为最佳3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)浓度浓度。
反应体系最适pH的优化:
为了最大限度地降低检测限,实现Ce(IV)/TMB体系对抗坏血酸高灵敏的检测,实验中对反应的pH值进行了优化,实验过程中的pH用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液调节(pH调节范围为3.0-6.7),结果如图3所示。从图中可以看出,随着pH的增大,体系吸收波长在654nm处的吸光强度的变化△A(△A=A0–A)先增大,后减小,在pH=5.0时△A达到最大。因此,反应最佳pH为5.0。其中,中A0为Ce(IV)/TMB体系的吸光度,A为Ce(IV)/TMB体系加入抗坏血酸的吸光度。
本发明方法选择性和抗干扰能力:
为了探究此种抗坏血酸检测方案的抗干扰能力,本实验选择了一些常见离子如图6所示来做干扰实验。其中,空白组为240μL 0.5mM的3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)溶液和80μL 1mM Ce(IV)溶液,并加入80μL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(0.1M)调至PH=5,加入去离子水定容至1.5mL,其余组为在空白组基础上,加入上述常见溶液,干扰溶液浓度均为50μM,抗坏血酸浓度为7μM。实验结果如图6所示,加入抗坏血酸使溶液吸光度下降最大,并且除抗坏血酸外,其他溶液对于该溶液的吸光度影响很小,几乎可以忽略。实验结果表明,该种检测方法具有很好的选择性和抗干扰性。
实际样品检测:
对自来水中的抗坏血酸进行了检测分析。水样品通过0.45mm的微孔膜过滤后再进行分析检测:在室温下,取240μL 0.5mM的3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)溶液和80μL 1mMCe(IV)溶液于试管中混合,分别向试管中加入不同量的抗坏血酸溶液,再各加入80μL 0.1M的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液调至PH=5,再加入去离子水定容至1.5mL,实验分析结果如下表1所示。
表1 TMB/Ce(IV)体系在实际样品中检测抗坏血酸
样品 | 加入量(μM) | 检测回收(μM) | 回收率(%) | 相对标准偏差(%) |
自来水 | 0.0 | 未检测出 | - | - |
自来水 | 10 | 9.82 | 98.2 | 2.2 |
表明本发明提供的方法可以很好的应用到实际样品检测中。
Claims (8)
1.一种抗坏血酸的检测方法,其特征在于,所述检测方法包括以下步骤:
将3,3′,5,5′-四甲基联苯胺溶液和Ce(IV)溶液混匀反应,再分别加入不同量的抗坏血酸溶液,然后调节体系pH,最后分别测量吸光度,构建吸光度与抗坏血酸浓度的线性关系,利用此线性关系检测未知浓度的抗坏血酸。
2.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,检测体系中Ce(IV)终浓度为53.33μM,3,3′,5,5′-四甲基联苯胺终浓度为13.3-106.7μM。
3.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,调节体系pH至3.0-6.7。
4.根据权利要求1或3所述的检测方法,其特征在于,调节体系pH至5。
5.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,构建的线性关系为:线性方程A=0.447-50.0237C且线性相关系数R2为-0.998。
6.根据权利要求1-5任一项所述的检测方法,其特征在于,检测方法为:将240μL 0.5mM的3,3′,5,5′-四甲基联苯胺溶液和80μL 1mM的Ce(IV)溶液混匀反应,体系变蓝色,再分别加入不同量的抗坏血酸溶液,然后各加入80μL 0.1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液调至PH=5,再加入去离子水定容至1.5mL,最后,使用紫外可见分光光度计测量654nm处的吸光度,构建吸光度与抗坏血酸浓度的线性关系,利用此线性关系检测未知浓度的抗坏血酸。
7.根据权利要求1或6所述的检测方法,其特征在于,检测体系中,抗坏血酸终浓度分别为0μM、1.665μM、3.33μM、5μM、6.67μM、8.83μM、10μM和11.67μM。
8.根据权利要求1-7任一项所述的检测方法,其特征在于,所述检测方法在22-27℃条件下进行。
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